Comparao das tcnicas de PCR-RT e ELISA para diagnstico de HIV-1

Martins, C.M.; Oricchio, J.G.; Scalco, R.A.; Gouva, A.F.

Abstract

The Standardization of diagnostic techniques for HIV was extremely important to the development of new prophylatics treatments and educational measures. HIV is a viral that is transmited mainly by blood, sexual contact and mother-son. The methods most commonly used for diagnosis (RT PCR and ELISA) were compared according to their efficency, specificity and specially its indications and costs. Discussing the use of the tests in clinical laboratories, blood banks and hospitals. Each test has its indications and its advantages.

Resumo

A padronizao de tecnicas diagnosticas para HIV foi extermamente importante para o desenvolvimetno de novos tratamentos e medidas profilaticas educacionais. O HIV um virus que se transmite principalmente por sangue, contato sexual e me-filho. Comparamos os metodos mais utilizados para diagnostico de HIV (PCR RT e ELISA) de acordo com sua efuiciencia, especificidade e principalmente suas indicaes e custos. Discutindo o emprego dos testes estudados em laboratorios de analises clinicas, banco de sangue e hospitais. Cada teste possui sua indicao e suas vantagens.

1. INTRODUO 1.1 HIV Human Immunodeficiency Virus.

O Vrus da Imunodeficincia Humana, conhecido como HIV (sigla originada do ingls Human Immunodeficiency Virus), um vrus pertencente famlia Retroviridae, subfamlia Lentiviridae, gnero Lentivrus e causador da AIDS (nome derivado da sigla em ingls para Sndrome da Imunodeficincia Adquirida). A primeira indicao de que a AIDS poderia ser causada por um retrovrus foi feita em 1983, no Instituto Pasteur, por Barre-Sinoussi. Existem dois retrovrus capazes de levar Sndrome de Imunodeficincia Adquirida, o HIV-1 e o HIV-2. O HIV-1 o mais comum, sem restries geogrficas, portanto, encontrado em populaes de todos os pases. J o HIV-2 tem sido descrito em diferentes regies do mundo, porm, sempre, em indivduos que tiveram algum contato com o continente africano ou sua populao evidenciando, assim, como sendo um vrus originrio da frica, mas que, atualmente, no se restringe ao continente africano. O HIV-1 possui as estruturas de um lentivrus, gnero que tem forma de cone e possui ncleo composto por protenas. No caso do HIV, a protena a p24. Seu genoma est descrito em nove genes individuais e por duas estruturas idnticas, denominadas de repeties terminais nas extremidades 3 e 5. (BENTWICH et al., 2000)

Figura 1 - Organizao e Estrutura Genmica HIV 1. Localizao dos principais antgenos do vrus HIV, os mais pesquisados em testes de deteco de antgenos e os antgenos responsveis pela produo de anticorpos detectados em testes de pesquisa de anticorpos.

A transmisso do vrus HIV feita atravs do vrus livre ou pelo contato entre clulas contaminadas. Por isso, a transmisso por contato genital a mais frequente, pois essa regio do corpo costuma conter mais clulas epiteliais e de defesa, que so mais contaminadas pelo vrus. Alm disso, estudos mostram que estas clulas infectadas transferem o vrus para as clulas epiteliais com mais facilidade na presena de lquido seminal, pois o contato clula-clula estimulado provavelmente por fatores presentes no smen. Relacionar-se com um parceiro contaminado sem preservativos, porm, no atesta que tenha ocorrido a contaminao. A quantidade de clulas infectadas no fluido genital tambm interfere na probabilidade de contrair o vrus, explicando, assim, as variaes na transmisso entre diferentes parceiros sexuais. Outras razes para alguns indivduos no serem infectados ainda esto sendo estudadas. Contudo, no ter sido infectado aps uma relao sexual sem proteo no torna o indivduo imune ao vrus, que pode ser contaminado se for exposto a uma nova situao de risco com o mesmo ou outro parceiro. (MUCIACCIA et al., 2007) Recentemente, um estudo mostrou que necessria uma porta de entrada no canal vaginal ou no canal anal, como leses, aumentando as chances de transmisso. Esta informao ajuda a explicar os altos nveis de contaminao entre heterossexuais na frica. No continente, so frequentes os casos de lceras vaginais causadas por doenas venreas, que so associadas transmisso de HIV. A transmisso totalmente influenciada pela quantidade de vrus presente em certo fluido corpreo de um infectado, e tambm pelo tipo de contato com este fluido. Estudos epidemiolgicos realizados em 1982 indicaram que as principais vias de transmisso da AIDS so contatos sexuais e por sangue contaminado. A sndrome foi descrita primeiramente como uma doena que atingia homossexuais e usurios de drogas intravenosas, mas logo foi includo o contato ntimo heterossexual como uma via de transmisso. Atualmente, foi comprovado que as atividades heterossexuais so as responsveis pelo maior nmero de infeces pelo mundo.

Trs principais conceitos de transmisso so mantidos at os dias de hoje: sangue, contato sexual e me-filho. Outros fluidos corpreos como saliva, lgrimas, aspirado bronco-pulmonar, urina, fezes, lquido sinovial e lquido amnitico j foram testados, mas a presena do vrus livre ou de clulas infectadas no foi detectada. Porm, j houve casos relatados de transmisso do vrus via leite materno, principalmente quando a me

infectada aps o parto. Nesse caso, a carga viral do leite materno pode se elevar pela falta de uma resposta imune antiviral substancial da me. (BENTWICH et al., 2000) Nos anos anteriores aos exames de deteco de anticorpos anti-HIV, hemoflicos e usurios de transfuses sanguneas podiam ser infectados por sangue e produtos derivados contaminados, como bolsas de sangue, fatores VII e IX. Com a prtica de exames de triagem do sangue, o risco de infeco por transfuso foi reduzido para cerca de 1/225000 unidades transfundidas. As chances de infeco do receptor aumentam substancialmente se o doador desenvolver AIDS de dois a trs anos aps a doao. Estudos comprovam que a carga viral de um doador recm-infectado interfere diretamente nas chances de contaminao do receptor.

Conhecendo a fisiopatologia da doena e as principais vias de transmisso, possvel padronizar tcnicas diagnsticas, detectar o vrus e, com isso, definir as medidas profilticas a serem tomadas. O desenvolvimento dessas tcnicas melhora o controle da transmisso do vrus, a triagem de doadores de sangue e derivados e, ainda, auxilia os estudos de novos tratamentos e medicaes para os infectados.

1.2 Testes utilizados para diagnstico de HIV-1

Um dos mtodos laboratoriais para detectar o HIV-1 em pacientes a cultura do vrus atravs do cocultivo de clulas mononucleares do sangue perifrico, plasma ou clulas ganglionares, com estimulao de Peripheral Blood Mononuclear Cells-PBMCs de doadores no infectados. Em condies apropriadas, em um sistema de cultura in vitro, feita uma infeco viral explosiva, ocasionando a produo de milhes de virions. A cultura lida como positiva pela formao de sinccios (isto , clulas gigantes, multinucleares, resultantes da fuso clula-clula), deteco da atividade da transcriptase reversa ou presena do antgeno p24 no sobrenadante da cultura, eventos estes que traduzem replicao viral. (HOUN HY, et al,. 1987) Este mtodo tem um alto custo, exige uma equipe de tcnicos treinados e condies laboratoriais de isolamento e segurana (confinamento PII ou PIII). Alm disso, o resultado demorado, pois s conhecido aps um intervalo que varia entre quinze e trinta dias. Por isso, sua indicao, atualmente, vem se restringindo rea de pesquisa clnica. Essa tcnica apresenta defeitos de reprodutibilidade ligados variabilidade das

clulas mononucleares dos doadores. A seleo de cepas de replicao rpida, in vitro, pode provocar um vis de medio. Devido a todos esses fatores, outros mtodos tm sido desenvolvidos para deteco da infeco pelo HIV, com o intuito de um diagnstico mais eficaz e prematuro. (ROUET et al., 2001),(ROUET; ROUZIOUX, 2007).

Atualmente, os testes mais utilizados no diagnstico de HIV-1 podem ser divididos em trs tipos:

- Testes de deteco de anticorpos; - Testes de deteco de antgenos; - Reao em Cadeia da Polimerase com Transcrio Reversa PCR-RT.

Estes testes so realizados de acordo com o caso de cada paciente, sendo utilizados para diferentes etapas do diagnstico e tratamento. (HECHT et al., 2002) 1.2.1. Teste de deteco de anticorpos

Testes de anticorpo so projetados especificamente para a rotina de deteco de HIV em adultos. So baratos e muito precisos. Mas eles apresentam resultados falsos negativos durante o perodo de janela imunolgica, que varia de trs semanas a seis meses, a partir do momento da infeco at que o sistema imune produza quantidades detectveis de anticorpos. O teste de deteco de anticorpo mais utilizado o chamado ELISA (Enzyme-like immunosorbant assay), que funciona com a deteco de anticorpos utilizando uma conjugao de anticorpos, antgenos e enzimas.

Figura 2 - Esquema do mtodo ELISA, mostrando sua placa sensibilizada com antgenos especficos que se ligam nos anticorpos presentes na amostra. A cor da reao alterada com um anticorpo marcado com enzima.

Outro teste de anticorpos muito utilizado chamado de Western-Blot. Mais especfico que o ELISA, esse teste usa eletroforese de protenas de diferentes pesos moleculares como anticorpos e protenas polimerases. A interpretao deste teste baseada nos diferentes padres das bandas que aparecem no gel da eletroforese. Um paciente considerado HIV positivo quando so observados mais de trs padres de bandas condizentes a anticorpos anti-HIV.

Figura 3 - Gel "HIV - Western Blot" banding patterns. A primeira fita mostra o padro dos antgenos virais separados por peso molecular. A segunda fita mostra o padro de um paciente considerado reagente. A terceira fita mostra o padro de um paciente considerado no reagente.

1.2.2. Testes de deteco de antgenos

Existem testes que, ao invs de buscar nas amostras os anticorpos produzidos pelo paciente infectado, buscam epitopos ou parte do material gentico do patgeno em questo. Para infectados pelo HIV-1, existe um teste chamado p24 antigen assay, que busca exatamente uma protena que compe o vrus HIV chamada p24, sendo detectadas todas as protenas desligadas e livres no plasma do paciente. Este ensaio no utilizado com muita frequncia para determinar se um paciente foi ou no infectado pelo vrus HIV, pois os nveis de antgenos livres possuem muita variao, de acordo com a carga viral e com os diferentes estgios da infeco pelo HIV. A protena p24 pode ser detectada na primeira fase da infeco, quando o vrus ainda est na fase de replicao. A partir do momento em que o sistema imunolgico do paciente comea a produzir anticorpos, os nveis de p24 livres caem bruscamente e se mantm baixos at o ltimo estgio da doena, quando volta a ser encontrada uma grande quantidade de p24 livre.

A pesquisa da protena p24 importante para o monitoramento desses pacientes, podendo identificar em qual estgio o paciente se encontra da infeco, possibilitando, assim, a criao de uma estratgia de tratamento mais especfica para a sua doena e o estgio em que ela se encontra. Este teste tambm utilizado para monitorar o funcionamento e a eficcia de antivirais como o AZT (Zidovudine), ddI (didanosine) e ddC (zalcitabine). Se os agentes antivirais esto se mostrando efetivos e eficazes, os nveis de p24 diminuem. Pelo fato deste ensaio pesquisar o antgeno ao invs do anticorpo, ele somente utilizado como teste primrio para diagnstico de HIV em crianas com mais de dois meses de idade. Nesses pacientes mais eficaz a busca do antgeno do que a do anticorpo, pois crianas no so boas respondedoras ao vrus HIV-1.

1.2.3. Reao em Cadeia da Polimerase com Transcrio Reversa PCR-RT

Outro teste confirmatrio para infectados com o vrus HIV-1 o PCR-RT (Reao em Cadeia Polimerase com Transcrio Reversa). Normalmente, utilizado por pesquisadores ou quando necessria uma confirmao de uma amostra clnica. O protocolo do exame se baseia na clonagem de uma sequncia desenhada de DNA que ocorre em ciclos. Para utilizar esta tcnica para diagnstico de HIV, dois primers (sequncias idnticas de DNA contidas no material gentico do vrus) so utilizados para sinalizar uma regio do DNA ou RNA do vrus. Esta regio sinalizada ser amplificada, ou seja, copiada por vrias vezes seguidas at criar, no final de 90 ciclos, um nmero de mais de um bilho de cpias do DNA alvo pesquisado. Em cada ciclo da reao acontecem processos envolvendo enzimas, primers e nucleotdeos livres. A enzima polimerase a enzima responsvel pela leitura e cpia da sequncia de DNA ou RNA sinalizada pelos primers. O PCR-RT amplifica o material gentico do vrus cido ribonuclico (RNA) ou at mesmo o cido desoxirribonuclico (DNA) nas clulas infectadas pelo HIV.

Diferentemente do ELISA e do Western Blot, o PCR-RT detecta os nucleotdeos do prprio vrus, buscando diretamente a presena do vrus na amostra. Isso torna o teste altamente especfico, pois testa evidncias diretas da existncia do vrus e no a existncia de anticorpos contra este vrus. O PCR-RT se diferencia dos testes que detectam antgenos, pois a tcnica consegue detectar o material gentico do vrus dentro de sua clula hospedeira, o que os outros testes que buscam antgenos no so capazes, pois s detectam os antgenos livres (ou seja, fora das clulas). Crianas recm-nascidas de mes infectadas podem carregar anticorpos contra o vrus sem necessariamente carregar o vrus, o que causaria um falso positivo nos resultados dos exames ELISA e Western Blot. Assim, o teste de PCR-RT se mostraria mais adequado para esses pacientes.

2. OBJETIVOS

Comparar as tcnicas de diagnstico de HIV mais utilizadas, PCR-RT e ELISA, quanto a sua eficincia, indicao e custo.

3. Discusso

3.1. PCR- RT

Utilizado como teste de confirmao para amostras tipadas como positivas pelo ELISA, o PCR-RT , atualmente, o teste mais utilizado para a busca de antgeno nas rotinas de diagnsticos e nos centros de pesquisa. (CHRONISTER, 1995) O PCR-RT consiste na busca de protenas especficas e conhecidas do vrus a ser pesquisado, amplificando sua quantidade de um para um bilho de fragmentos de DNA estudado. Desta forma, no existe a necessidade de uma resposta imunolgica anterior para se detectar a presena do vrus na amostra colhida, reduzindo, assim, a janela imunolgica e o tempo de invisibilidade do vrus. Com a tcnica de PCR qualitativo para HIV, possvel detectar a presena do vrus aps quatro dias de infeco (podendo variar de paciente para paciente). (PEREIRA et al., 2002) A partir da informao de que o PCR busca genes para protenas especficas virais, podemos contar, tambm, com uma avaliao quantitativa e no s qualitativa, ou seja, possvel determinar a presena ou no do vrus e a carga viral, a fase da infeco e a eficcia de tratamentos alternativos em testes. O PCR-RT, acima descrito, indicado para algumas situaes diagnsticas: confirmar o resultado do teste ELISA, caso tenha sido positivo; determinar a carga viral em pacientes portadores do HIV; estudos feitos por laboratrios de pesquisa relacionados ao vrus HIV. Alm de ser usado em exames diagnsticos, o PCR-RT tambm tem a funo de purificar, amplificar e sensibilizar placas de ELISA com antgenos especficos que sero utilizadas para deteco de anticorpos. O exame conhecido como Golden Standard para HIV pela Organizao Mundial da Sade o Western Blottling. Mas quando uma amostra titulada como positiva nestes testes, a rotina dos laboratrios utilizar das tcnicas de PCR para confirmao do diagnstico. O PCR-RT um teste relativamente caro, que exige uma mo-de-obra

especializada e equipamentos especficos para realizao dos ciclos das reaes. A possibilidade de erros humanos considervel, contando que so utilizados valores baixssimos de reagentes e amostras, sendo necessria a utilizao de pipetas extremamente precisas e muito bem calibradas. (REZENDE, 2002),(PEREIRA et al.,
2002),(PINHATA et al., 1994),(ROUET et al., 2001)(ZAZZI et al., 1993).

3.2. ELISA

O teste conhecido como ELISA, Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay, j descrito pelo nome, um imuno-ensaio utilizando ezimas e anticorpos anti-anticorpos humanos, para detectar a presena de produo de resposta imunolgica para determinado vrus ou patgeno. O ELISA, hoje em dia, o exame mais realizado para deteco do vrus HIV em laboratrios de rotina, bancos de sangue e hospitais em geral. um teste extremamente confivel, quando realizado nas condies predefinidas, de acordo com o procedimento e ao do teste. O ELISA um teste que detecta o anticorpo produzido pelo paciente em resposta a uma infeco do vrus a ser pesquisado. Essa produo de anticorpos leva algum tempo para ser suficientemente grande, a ponto de ser detectada em um teste de laboratrio. Esse perodo de invisibilidade do teste chama-se janela imunolgica, que fase em que o exame no detecta a presena de anticorpos, que denunciariam a existncia do vrus, e o paciente infectado pode obter um falso negativo como resultado. Nessas condies no podemos incluir esses falsos negativos como erros do teste ou erros humanos, pois a janela imunolgica varia de paciente para paciente, cada um com sua resposta imunolgica prpria. (RIBEIRO et al., 1993)(PERRE, 2006).(REZENDE,
2002)(MACHADO; COSTA, 1999)

Com essas informaes, possvel perceber que o ELISA um teste confivel, desde que realizado com acompanhamento mdico, estudo do caso e avaliao das melhores opes de diagnstico. Por exemplo: se um paciente relata situao de risco ocorrida h sete dias e gostaria de realizar um teste para deteco de HIV, o ELISA til para atestar se o paciente tinha ou no o vrus at a situao de risco. Porm, ele no detecta se houve contaminao na ocasio apontada pelo paciente em um nico teste. Para obter um resultado fidedigno sobre a situao do suposto paciente, necessria a realizao de sucessivos testes ELISA, que podem se prolongar de trinta

dias a seis meses, at ser possvel obter um resultado confivel de que o resultado negativo do paciente no devido janela imunolgica. (HOUN HY, et al,. 1987) As principais utilizaes do ELISA, hoje em dia, so para fins diagnsticos em geral, em laboratrios de rotina e anlises clnicas; em laboratrios de pesquisa; tipagem de bolsas sanguneas em bancos de sangue e em hospitais em geral.

3.3 Protocolo PCR-RT

3.3.1 Extrao de RNA Seguir protocolo especfico para cada kit.

3.3.2 Sntese de cDNA 1. Num tubo de 500l fazer a seguinte mistura: Componentes Hexanucleotideos aleatrios RNA DEPC H2O Tabela 1 2. Incubar a 65C durante 5min e, posteriormente, colocar no gelo. 3. Preparar a mistura de reao de acordo com o nmero de reaes a fazer e agitar suavemente em vortex: Componente Quantidade / 1 reaco Quantidade / 1 reaco 4 l 1l 1l 2 l 1l 1l Quantidade 1 l 100ng q.b.p. 10 l

5x cDNA Synthesis Buffer* DTT 0,1M DEPC-H2O dNTP Mix 10mM RNaseOUT 40U/l ThermoScrip (15 U/l)

Tabela 2 *agitar 5s em vortex antes de utilizar

4. Pipetar 10l da mistura de reao para cada tubo de reao em gelo e misturar com pipetagens sucessivas. 5. Transferir os tubos para o aparelho de PCR pr-aquecido temperatura apropriada para a sntese de cDNA e incubar com o seguinte programa: 25C, 10min 50C, 50min 85C, 5min. 6. Adicionar 1l de RNase H e incubar a 37C durante 20min. 7. Guardar o cDNA a -20C.

3.3.3 PCR 1. Num microtubo de 1,5ml em gelo, preparar a seguinte mistura de reao de PCR (master mix):

Componente Quantidade / Tampo de PCR (s/ Mg) 10x MgCl2 50mM dNTP Mix 10mM Primer 1 10M Primer 2 10M Platinum Taq DNA Polymerase (5U/l) gua ultra-pura Tabela 3

Quantidade / 1 reao 5l 1,5l 1l 1l 1l 0,4 l 34,1 l

2. Num microtubo de 0,2ml misturar, em gelo: Componente Padro interno Quantidade (2primer 4l 2l

pair/8competimer) cDNA Tabela 4 3. Transferir 44l da master mix para o microtubo de 0,2l e misturar pipetando vrias vezes com a micropipeta suavemente. 4. Ligar o aparelho de PCR e iniciar o programa de amplificao. Transferir os microtubos preparados em 3 para o bloco de aquecimento do aparelho somente quando a temperatura estiver a 94C. Fechar a tampa e ajust-la

para contatar com a tampa dos microtubos. 5. Programa de PCR:

94C - 2min 55C 30seg 72C 45seg 33x 94C 30seg 72C 5min 6. Analisar 10l da mistura de PCR por eletroforese em gel de agarose 1,5%. (OCONNELL,
2002)

3.4 Protocolo Elisa

Protocolos de execuo variam muito de kit para kit. Materiais de empresas diferentes podem apresentar protocolos diferentes. Este teste consiste em uma placa pr-sensibilizada com o antgeno p24 (protena pertencente ao cdigo gentico do vrus que causa produo de anticorpo quando em contato com o sistema imunolgico do infectado), que ser submetida ao plasma do paciente a ser testado. Este antgeno presente na placa se ligara ao anticorpo presente no plasma do paciente infectado, mudando a estrutura deste anticorpo. Junto com o kit, existe um anticorpo especifico que se liga no complexo antgenoanticorpo deixando este complexo colorido. necessrio analisar as concentraes das amostras em vista de evitar falsos resultados por motivos de concentraes das amostras. Um exemplo de protocolo de ELISA descrito abaixo. Adicionar 1/10 de volume de soluo de lysing amostra e homogenizar com ajuda do vortex. Incubar em 37C por 1 hora. Lavar a placa trs vezes com soluo tampo. Fazer as diluies padres sugeridas para a amostra e pipetar 100l da amostra lisada em cada poo da placa. Selar a placa e incubar em 37C por 2 horas ou durante a noite em 4C. Lavar a placa trs vezes com soluo tampo. Adicionar 8l do soro de coelho antip24 a 10.4 ml do diluente preliminar. Pipetar mais 100 l da soluo preliminar em cada poo. Selar a placa e incubar em 37C por 1 hora. Lavar a placa trs vezes com soluo tampo. Adicionar 40l do anti-IgG de coelho marcado a 12 ml do diluente secundrio e

pipetar 100 l da soluo em cada poo da placa. Selar a placa e incubar em 37C por 1 hora. Lavar a placa trs vezes com soluo tampo. Pipetar 100 l da soluo carcaa em cada poo da placa. Selar a placa e incubar temperatura ambiente por 30 minutos. 100 l de stop solution em cada poo da placa e ler em 450nm. Referncia em 650nm.

3.5 Sensibilidade e especificidade

Para se utilizar um teste diagnstico, primeiramente, necessrio determinar os ndices de especificidade e de sensibilidade. A especificidade de um teste a capacidade que ele tem de detectar somente o anticorpo/antgeno que se deseja pesquisar, excluindo reaes cruzadas e ligaes com protenas que no so especficas do teste. Fazendo isso, a probabilidade de um diagnstico falso positivo reduzida, pois no h o risco de detectar anticorpos/antgenos que no os que se tm a inteno de descobrir. J a sensibilidade a capacidade que o teste possui de detectar quantidades pequenas de anticorpo/antgeno presentes na amostra, diminuindo a probabilidade de resultar em um falso negativo. De acordo com os kits de ELISA e PCR-RT determinado que esses so os dois testes com os maiores ndices de especificidade e sensibilidade para deteco de HIV. Esse ponto da discusso, portanto, constata a eficincia de ambos. (HOUN HY, et al,. 1987) 3.6 Reprodutibilidade (erro humano)

Um dos ndices de certificao de um teste a reprodutibilidade. Trata-se da capacidade que um teste tem de obter os mesmos resultados a partir de amostras iguais, estudadas por tcnicos diferentes e em diferentes laboratrios. Dentro da

reprodutibilidade, h um ponto a ser discutido: o erro humano. Os testes comparados neste trabalho possuem protocolos, mtodos, reagentes e suas quantidades bem distintos. Por isso, para evitar o erro humano, indispensvel que os profissionais que lidam com ambos os testes sejam capacitados para tais funes. Porm, o ELISA um teste relativamente simples, normalmente realizado por tcnicos de laboratrio de anlises clnicas, sem a necessidade de que esse profissional seja especializado no exame.

J o PCR-RT requer mo-de-obra especializada, pelo fato de se utilizarem volumes muito baixos de reagentes e haver grande risco de contaminao de amostras. Alm disso, o profissional que executa o PCR-RT precisa estar capacitado para interpretar os padres de bandas e grficos gerados pela reao de PCR. Esta diferena de mo-de-obra utilizada no interfere na reprodutibilidade de cada um dos testes, pois os laboratrios que oferecem os servios de PCR-RT, sem exceo, precisam contratar profissionais capazes de realizar o procedimento eficazmente. Porm, essas diferenas entre os protocolos fazem com que os custos de cada teste variem. No ELISA, o laboratrio precisa dispor de pouco material alm do que est incluso no kit adquirido, alm de profissionais menos onerosos, pois no precisam ser especializados. No PCR-RT, o laboratrio necessita de aparelhos de ltima gerao para que a reao acontea, reagentes mais especficos e caros e mo-de-obra especializada, portanto, mais cara.

3.7 Banco de sangue

A maioria dos bancos de sangue realiza uma rgida entrevista com os doadores para controlar a qualidade das bolsas coletadas. O objetivo desse procedimento descartar a possibilidade de coletar sangue de um doador possivelmente contaminado ou que esteve em situaes de risco como manter relaes sexuais sem a utilizao de preservativos, consumo de drogas com agulhas compartilhadas ou a realizao de tatuagens e piercings (que podem ter sido feitos com material infectado). Posteriormente, realizada uma bateria de exames sorolgicos para atestar a segurana do material colhido, antes que ele seja armazenado no banco de sangue e, por fim, transfundido. Entre esses exames, est a sorologia para HIV-1. O teste utilizado nessa pesquisa nos bancos de sangue o ELISA imunoensaio anti-anti-p24 (j descrito acima). Porm, esse procedimento no pode ser considerado fidedigno. Seu resultado, para ser confivel, depende de que o potencial doador tenha respondido entrevista com absoluta veracidade. Caso esse paciente, que omite sua exposio ao risco, tenha sido contaminado, o teste sorolgico no ser capaz de detectar a presena do vrus. Isso ocorre graas ao perodo de janela imunolgica. Com isso, h o risco do banco de sangue liberar uma bolsa contaminada com o HIV para transfuses sanguneas.

Atualmente, muitas pessoas utilizam os servios do banco de sangue como um laboratrio gratuito de sorologias. Esse comportamento comumente visto em So Paulo. Aps passar por situaes de risco, pacientes procuram um banco para doao interessados apenas nos resultados das sorologias. Desconhecendo a janela imunolgica do teste, o indivduo omite informaes essenciais durante a entrevista, invalidando o resultado do exame. Com isso, ele origina dois problemas. Primeiro, coloca um possvel receptor de sangue em risco, pois uma bolsa contaminada pode acabar sendo liberada para o uso. Alm disso, acreditando em um resultado falho, torna-se um potencial vetor de transmisso do vrus na sociedade. Em um banco de sangue localizado no Estado de So Paulo foi realizada a triagem de uma doadora, resultando todos os testes negativos. A bolsa ento foi liberada para transfuses. Alguns meses aps essa doao, a mesma doadora retornou ao banco de sangue para realizar outra doao e foi constatado na triagem como HIV positiva. Testes de biologia molecular foram realizados na primeira amostra evidenciando que a primeira bolsa, j transfundida, estava contaminada pelo vrus HIV. Casos como esse, provam a necessidade da adaptao do setor de triagem dos bancos de sangue com tcnicas de biologia molecular para maior segurana do doador e do receptor.

4. Concluso

Com as informaes discutidas acima, chegamos concluso de que os testes comparados so eficientes, reprodutveis, sensveis e especficos. Porm, cada teste caminha em conjunto com uma serie de indicaes e acompanhamentos. ELISA o teste de escolha para deteco e triagem de pacientes com situaes de riscos, com a correta avaliao e acompanhamento mdico, seguindo as indicaes para que no se obtenha falsos negativos devidos janela imunolgica do teste. Repetindo o teste no minimo tes vezes no periodo de seis meses. O PCR ainda considerado um teste confirmatrio, com um perodo de janela imunolgica reduzido. Deve ser usado em casos de pesquisas nicas (de uma s amostra), onde no se pode saber se o paciente na data da coleta estava dentro do perodo de janela imunolgica. O PCR tambm utilizado na determinao da carga viral de pacientes HIV positivos, sendo o nico teste capaz de realizar este tipo de estudo quantitativo com tal preciso. Bancos de sangue deveriam, por questo de qualidade e precauo, utilizar a biologia molecular na triagem das bolsas de sangue, mesmo com o aumento do custo deste setor.

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