Você está na página 1de 46

CENTRO UNIVERSITÁRIO UNIMETROCAMP WYDEN

Curso de Farmácia

Hematologia Clínica

1
Dinâmica das aulas

Objetivo das aulas práticas

Cada aula prática só será iniciada após os alunos terem lido minuciosa e
cuidadosamente, o protocolo do assunto do dia. A seguir o professor ministrará
uma explanação teórica visando esclarecer ou explicar dúvidas ainda
persistentes e acompanhará todo o desenvolvimento da aula prática, auxiliado
pelos monitores e técnicos de laboratório.
Ao final das experiências da aula prática, o professor verificará os
resultados. Para a maioria das operações de laboratório existem instruções
específicas que cada aluno deve obedecer para sua segurança e de seus
colegas. Tais normas e procedimentos serão detalhados posteriormente.

Dinâmica das aulas práticas no Laboratório de Análises Clínicas


 Será exigido dos alunos o uso de EPI completo;
 Deverá ser apresentado, ao final de cada aula prática, um relatório com
descrição dos experimentos e resultados obtidos.

Avaliação

As avaliações serão por meio de provas teóricas, uma prova prática e


entrega de relatórios que deverão ser executados dentro de sala de aula. O
cronograma segue abaixo.

2
MODELO RELATÓRIO AULA PRÁTICA
1. Introdução
Breve relato sobre o assunto da aula prática.
2.Fundamento do método
Qual o embasamento da técnica aplicada.
3.Material
Materiais e reagentes usados.
4.Procedimento
Modo como à técnica foi desenvolvida
5.Resultados
Resultados apresentados
6.Conclusão
Conclusão a partir dos resultados apresentados

3
Aula Prática 1

Normas de segurança e microscopia

1. Usar branco;
2. Sempre usar EPIs (jaleco, luvas);
3. Cabelo preso;
4. Sapato fechado;
5. Proibido comer e ou beber no laboratório;
6. Cuidado ao manipular as amostras;
7. Cuidado ao manipular os microscópios.

MICROSCÓPIO

4
5
Profundidade = 0,1 mm
Área reticulada = 03 mm x 03 mm = 09 mm2 de superfície
Quadrado grande = 01 mm x 01 mm = 01 mm2 de superfície
Quadrado médio = 0,25 mm x 0,25 mm = 0,0625 mm2 de superfície
Quadrado pequeno = 0,05 mm x 0,05 mm = 0,0025 mm2 de superfície
Volume = 0,1 x 0,0025 = 0,00025 mm3
(profundidade x superfície)

6
Aula prática 2

COLETA DE SANGUE

Precauções universais devem ser seguidas na coleta de sangue e


todas as espécimes devem ser tratadas como potencialmente infecciosas.
Alguns fatores fisiológicos podem afetar os resultados dos testes.
Estes fatores incluem a postura (supino ou erecta), ritmo circadiano, exercícios,
stress e dieta. Há diminuição do volume plasmático ao passar-se do repouso
na horizontal à deambulação, o que aumenta as cifras hematimétricas em 2 a
5%; há também uma elevação no número de leucócitos da manhã para a tarde.
Estas diferenças são clinicamente irrelevantes, não impedindo a coleta de
sangue para hemograma em qualquer horário. Deve-se evitar a coleta após
exercícios físicos que causam aumento do número de leucócitos e após duas
horas de realizar as refeições ricas em gorduras.
Para o hemograma, utilizamos sangue colhido de veia periférica. As
veias superficiais da superfície anterior do braço são os sítios mais comuns
para a venopunção. As veias mais usadas são as veias cefálica, basílica e a
cubital média.
Deve-se utilizar seringas de plástico e agulhas descartáveis. Tubos a
vácuo e agulhas bipolares (vacutainer) bem como butterfly podem ser também
utilizados.
O local da punção deve ser limpo com álcool etílico ou isopropílico
70%. O garrote deve ser aplicado 10 cm aproximadamente acima do local da
punção e o garroteamento não pode exceder a 1 minuto.
O material colhido deve ser dispensado em tubos contendo sal
dissódico ou dipotássico do ácido etilenodiaminotetracético ( EDTA ) na
proporção de 1 mg por ml de sangue. Este é o anticoagulante de escolha para
realização do hemograma, pois preserva a morfologia celular por até 24 horas,
quando a amostra é armazenada à 4C. Excesso de EDTA ou escassez de
sangue causa desidratação dos eritrócitos e alteração do hematócrito. Excesso
de sangue ou escassez de EDTA acarreta falhas na coagulação, possibilitando

7
a formação de microcoágulos onde são consumidas células sanguíneas
diminuindo as suas contagens.

8
9
Aula Prática 3

Hemograma e hematócrito

Hemograma é o exame laboratorial de rotina para avaliação quantitativa


e qualitativa dos elementos figurados do sangue. É coadjuvante indispensável
das consultas médicas pois sofre alterações nas doenças hematológicas e em
variadas patologias.
O hemograma inclui o eritrograma e o leucograma.
No eritrograma estão incluídas as determinações:
 Contagem de eritrócitos
 Dosagem de hemoglobina
 Determinação do hematócrito
 Cálculo dos índices eritrocitométricos
 Observação microscópica dos eritrócitos
O leucograma compreende a contagem de leucócitos e a fórmula
leucocitária.
O hemograma não inclui a avaliação das plaquetas. Costuma-se relatar
aumento ou diminuição aparente do número destas células.
A observação microscópica de extensões sanguíneas coradas é
indispensável mesmo em laboratórios que possuam equipamentos
automatizados de última geração.
DETERMINAÇÃO DO HEMATÓCRITO

O hematócrito é o volume que os eritrócitos empacotados ocupam em


um dado volume de sangue. Sua determinação consiste na centrifugação do
sangue, medindo-se a percentagem de glóbulos vermelhos na coluna
sanguínea obtida.

Material e Reagentes:

1- Tubos capilares, de diâmetro uniforme, simples ou heparinizados.


2- Centrífuga para microhematócrito.

10
Procedimento Experimental:

1- Colher sangue capilar em tubo capilar heparinizado, ou encher um capilar


simples com sangue venoso colhido com anticoagulante por uma das
extremidades até que falte 1cm para encher o capilar;
2- Fechar a extremidade vazia do tubo fundindo o vidro com calor (bico de gás)
evitando atingir a coluna de sangue;
3- Colocar na centrífuga, com a extremidade fechada voltada para o circulo
externo e centrifugar a 11.000 rpm durante 5 minutos;
4- Ler no gráfico a percentagem da coluna de glóbulos vermelhos.

Valores de Referência:

Sexo Masculino : 40-54% ou 0,40-0,54 L/L

Sexo Feminino : 37-47% ou 0,37-0,47 L/L

CONTAGEM GLOBAL DE ERITRÓCITOS

A contagem de glóbulos consiste em diluir o sangue em uma proporção


exata, em diluente específico e examinar em microscópio, por meio de câmaras
especiais, uma pequena quantidade da amostra. Conta-se as células e calcula-
se o número destas por volume de sangue.

Material e Reagentes:

 Micropipeta;
 Câmara de Neubauer;
 Microscópio;
 Solução diluente (líquido de Hayem):

11
Bicloreto de mercúrio........................... 0,25 g

Cloreto de sódio................................... 0,5 g

Sulfato de sódio................................... 2,5 g

Água destilada qsp.............................. 100 ml

Procedimento Experimental:

1- Aspirar 50 µL de sangue e transferir para um tubo;


2- Acrescentar 10 mL do diluente. Temos assim uma diluição 1:200.
3- Homogeneizar e preencher a área reticulada da câmara.
4- Deixar sedimentar por 3 minutos e contar ao microscópio com aumento de
400x.
5- Contar no retículo central 5 pequenos quadrados.
3
6- Aplicar a fórmula para determinar o número de eritrócitos por mm de
sangue.
3
no. de glóbulos contados nos 5 quadrados = no. de glóbulos em 0,1 mm
3
no. de eritrócitos/mm = no. de glóbulos contados nos 5 quadrados x 5 x 10 x
200.
3
Portanto : no. de eritrócitos/mm = no. de glóbulos contados x 10.000.
Valores de referência:
3 12
Sexo masculino : 4.600.000 a 6.200.000/mm ou 4,6 a 6,2 x 10 /L
3 12
Sexo feminino : 4.200.000 a 5.200.000/mm ou 4,2 a 5,2 x 10 /L

Alterações Morfológicas dos Eritrócitos e Suas Principais Causas


ANISOCITOSE
Os eritrócitos de tamanho normal são chamados NORMÓCITOS e
apresentam diâmetro com cerca de 6,5 – 8,5μ (média 7,5μ).
Quando alterados em relação ao tamanho são denominados:
• Micrócito: apresenta-se menor que o normal, com diâmetro abaixo de 6μ;
origina-se de microeritroblastos e é a forma alterada mais comum; geralmente
ocorre nas DEFICIÊNCIAS de FERRO e nas TALASSEMIAS;

12
• Macrócito: apresenta-se maior que o normal, com diâmetro de 8,5 - 10μ;
origina-se de macroeritoblastos e geralmente ocorre por DEFICIÊNCIA de
VITAMINA B12 e de ÁCIDO FÓLICO;
• Megalócito: apresenta-se bem maior que o normal, com diâmetro acima de
10 μ; geralmente apresenta forma ovalada e origina-se de megaloblastos,
ocorrendo nas ANEMIAS MEGALOBLÁSTICAS.

POIQUILOCITOSE
O eritrócito normalmente possui a forma de um disco bicôncavo. Quando
visto de frente apresenta uma região central mais clara (halo) do que a da zona
periférica. Isto decorre em virtude da distribuição da hemoglobina no interior do
disco. Quanto às alterações de forma as hemácias podem ser:
Hemácia em Alvo (“target cell”) ou codócito: a hemácia apresenta
dupla biconcavidade de tal maneira que, quando projetada em um plano, a
hemoglobina é visualizada em uma pequena faixa periférica e, geralmente, na
parte central, o que lhe dá o aspecto “em alvo”. Ocorre em alta porcentagem na
Anemia de COOLEY ou TALASSEMIA “Major” (Talassemia onde ocorre um
aumento da Hemoglobina fetal); em menor quantidade na TALASSEMIA “
Minor”, embora também possa ser encontrada em outras Anemias Hemolíticas,
em algumas DOENÇAS HEPÁTICAS, e outras.

13
Aula Prática 4

DETERMINAÇÃO DE HEMOGLOBINA

A hemoglobina é oxidada a metemoglobina pelo ferrocianeto de


potássio. O cianeto de potássio converte metemoglobina em
cianometemoglobina, cuja absorbância em 540 nm, é diretamente proporcional
a concentração de hemoglobina. Todas as formas de hemoglobina são
convertidas a cianometemoglobina, com exceção da sulfoemoglobina.

Materiais e reagentes

 Kit para dosagem de hemoglobina


 Padrão de hemoglobina
 Amostra de sangue
 Micropipeta
 Espectrofotômetro

Procedimento Experimental

 Preparar solução de trabalho: Em balão volumétrico de 1.000 mL


adicionar todo conteúdo de R1 e completar o volume com água
destilada;
 Transferir 2,5 mL do reagente de trabalho para tubo de ensaio e 10 µL da
amostra;
 Homogeneizar e esperar 5 minutos;
 Realizar a leitura em 540nm, acertando o zero com o reagente de
trabalho.

14
Aula Prática 5

CONTAGEM GLOBAL DE LEUCÓCITOS

Baseia-se no mesmo princípio da contagem de eritrócitos.

Material e Reagentes :

1- Micropipeta;
2- Câmara de contagem tipo Neubauer;
3- Microscópio;
4- Solução diluente (líquido de Turk):

Ácido acético glacial............................ 10 ml

Violeta de genciana 10 ml
1%........................
1000 ml
Água destilada
qsp...............................

Procedimento Experimental:

1- Aspirar 50μL de sangue;


2- Aspirar 1mL da solução diluente (líquido de Turk). Temos assim uma
solução 1:20;
3- Homogenizar e preencher a área reticulada;
4- Deixar sedimentar por 3 minutos e contar ao microscópio com
aumento de 100x;
5- Contar todas as células coradas nos 4 quadrados externos do retículo
da câmara de Neubauer.
3
6- Aplicar a fórmula para determinar o número de leucócitos por mm de
sangue:
no.de leucócitos/mm3 = no.de glóbulos contados x 50

Valores Normais : 4.500 a 11.000/mm3 ou 4,5x109 a 11x109/L

Aula Prática 6

COLORAÇÃO DAS EXTENSÕES SANGUÍNEAS PARA


CONTAGEM DIFERENCIAL
15
Consiste em fazer uma contagem dos diferentes tipos de leucócitos em
um esfregaço sanguíneo. Os esfregaços de sangue corados fornecem dados
valiosos no estudo das doenças hematológicas e demais sistema do
organismo.
O diagnóstico das leucemias, anemias, hemorragias e infecções por
hematozoários. São exemplos comuns da utilidade desse estudo.

Material e Reagentes :

1. Lâminas de vidro;
2. Sangue com EDTA ou citrato;
3. May-Grunwald;
4. Giemsa

Procedimento Experimental:

TÉCNICA PARA CONFECÇÃO DO ESFREGAÇO SANGUÍNEO


1. Colocar uma gotícula de sangue em uma lâmina de vidro previamente
limpa e seca. A gota de sangue não deve ser muito grande; quanto
maior a gota, tanto mais espesso será o esfregaço.
2. Com o auxílio de outra lâmina, colocar a gota de sangue em contato
com uma de suas bordas, de modo que forme um ângulo de 45º.
3. Mantendo o ângulo de 45º, fazer o esfregaço rapidamente, antes que
comece a coagulação do sangue.
4. Secar o esfregaço.
.

TÉCNICA DE COLORAÇÃO DO ESFREGAÇO SANGUÍNEO

16
1. Adicionar 20 gotas de corante May-Grunwald sobre a extensão já seca
por 3 minutos (o metanol age como fixador);
2. Acrescentar volume igual de água neutra destilada pH = 6,8 ou tampão
fosfato. Misturar ligeiramente e deixar por 2 minutos (como alternativa
poderá lavar rapidamente o esfregaço);
3. Derramar o corante e sem lavar recobrir com Giemsa diluído (1 gota/1
mL de água destilada) deixar por 15 minutos;
4. Lavar com água corrente, limpar a parte inferior da lâmina com algodão
ou gaze e secar ao ar.
Obs.: O pH ótimo da água para coloração é 6,8.

CONTAGEM DIFERENCIAL

Valores Normais Relativa (%) Absoluta (mm3)

neutrófilos bastonetes 0-5 0-700

neutrófilos segmentados 50-70 1800-7000

Eosinófilos 1-4 50-450

Basófilos 0-1 0-100

Linfócitos 20-40 1000-4800

Monócitos 3-7 150-800

17
SÉRIE GRANULOCÍTICA
MORFOLOGIA
1. Mieloblasto – Este é o membro identificável mais precocemente da série
granulocítica. Tem um núcleo grande redondo contendo cromatina fina
pontilhada e um ou mais nucléolos. Seu citoplasma é azul e não tem grânulos.
2. Promielócito – A cromatina nuclear está começando a condensar, mas ainda
se veem os nucléolos. O citoplasma ainda á azul; no entanto, grânulos
primários, que se coram como grânulos azurrófilos, estão presentes agora.

18
3. Mielócito – O núcleo ainda é redondo, mas os nucléolos não estão mais
visíveis, e a cromatina está mais condensada. A cor azul do citoplasma da
célula imatura está dando lugar à cor rosa amarelada da célula madura. Os
grânulos azurrófilos podem ser ainda visíveis, mas são menos proeminentes.
Grânulos secundários, isto é, grânulos finos neutrofílicos, também estão
presentes.
4. Metamielócito – O núcleo se tornou denteado e sua cromatina está bem
condensada. O citoplasma é uniformemente rosa amarelado e preenchido com
grânulos secundários. Embora ainda presentes, os grânulos primários não são
mais visíveis.
5. Bastonete – O núcleo tornou-se tão denteado que assumiu a forma
crescente. Com a maturação posterior, aparecem constrições no núcleo.
6 Granulócito segmentado – Este é o granulócito maduro. As constrições do
núcleo do bastonete se estreitaram em finos filamentos de cromatina que
separam o núcleo em dois a quatro lobos.
7. Granulócito eosinófilo – Procede de etapas de maturação semelhantes às do
neutrófilo. O mielócito, metamielócito, bastonete e segmentado eosinófilo são
semelhantes aos neutrófilos diferenciando nas granulações que são
granulações eosinófilas: são grandes 0,4 a 0,8 micras de diâmetro, de forma
esférica ou ovóide (maiores que dos neutrófilos); de cor laranja. O segmentado
eosinófilo apresenta em sua maioria (70%) dois lobos ligados por uma fina
ponte nuclear.
8. Granulócitos basófilo – Apresentam etapas de maturação idênticas as das
outras séries. As granulações ditas basófilas são na realidade metacromáticas.
São grandes, redondas, atingindo por vezes 2 micras de diâmetro. O
segmentado basófilo tem um diâmetro de 10 a 14 micra sendo, pois, o menor
dos granulócitos. O núcleo é dificilmente visualizado, mascarado pelos
grânulos, que são em geral abundantes. O citoplasma é vermelho. As
granulações são de cores escuras (azul ou negro). Nos tecidos darão origem
ao Mastócito.

19
SÉRIE MONOCÍTICA
A linhagem monocítica começa na medula óssea, passa pelo sangue sob a
forma de monócitos e geralmente termina nos macrófagos teciduais.
MORFOLOGIA
1. Monoblasto – Tem 12 a 20 micra de diâmetro, com núcleo redondo ou oval
volumoso, com coloração purpúrea clara e cromatina disposta em delicada
rede, citoplasma basófilo sem grânulos. Apresenta de 3 a 5 nucleolos. Se
distingue do mieloblasto e linfoblasto pela citoquímica. É a primeira célula
reconhecida da linhagem monocítica. Encontrada em condições normais na
medula óssea. Este dara origem por diferenciação ao Promonócito.
2. Promonócito – É um pouco menor que o monoblasto. Citoplasma basófilo,
cromatina delicada. Núcleo com chanfradura e nucléolos.
3. Monócito – É a maior das células normais circulando no sangue. Tem 12 a
20 micra de diâmetro, exibe núcleo de um oval irregular, por vezes reniforme,
com cromatina purpúrea clara, citoplasma azul pálido acinzentado, não
apresenta nucléolos. Os monócitos gastam apenas um curto tempo na medula
óssea. É difícil distinguir seus precursores. Depois de circularem de 20 a 40
horas deixam o sangue periférico para penetrar nos tecidos onde amadurecem
e realizam suas funções principais. O período de vida extra vascular pode ser
de alguns meses a vários anos. Nos tecidos transformam-se em macrófagos
cujo papel é remover antígenos particulados por fagocitose e células
apresentadoras de antígeno, cuja principal função é de apresentar antígeno ao
linfócito. As células fagocíticas derivadas do monócito mais células reticulares
dos tecidos formam uma rede conhecida como Sistema mononuclear
fagocitário, que são encontrados em muitos órgãos.
LINFOPOESE
Os linfócitos são oriundos da Medula óssea. Originam-se também nos órgãos
linfóides, a partir de células tronco trazidas da medula óssea pelo sangue, que
se fixam proliferam nos órgãos linfóides.Stem Cell pluripotente dá origem ao
progenitor linfóide que origina célula precursora comissionada linfóide. Destas
a primeira reconhecida como da linhagem linfocítica é o Linfoblasto que se

20
diferencia em Prolinfócito e este em Linfócitos. A célula precursora
comossionada no timo é processada em linfócito T que iria para o sangue
periférico e para os órgãos linfóides secundários (baço, nódulos linfáticos;
Tonsilas, linfonodos e medula óssea). Constituem 65 a 75% dos linfócitos do
sangue.
Os linfócitos T ou Timócitos apresentam as funções: Imunidade celular e
regulação da síntese de anticorpos. Os estímulos capazes de ativar os
linfócitos T são: vírus, fungos, tecidos transplantados, células tumorais e
protozoários.
São três tipos de linfócitos T:
A – Linfócitos T auxiliares (Helper) CD4: Induzem os linfócitos B a produzirem
as imunoglobulinas, mantém o desenvolvimento de células T citotóxicas,
potencializam a ação dos macrófagos.
B – Linfócitos T supressores CD8: Suprimem respostas dos linfócitos B aos
antígenos além do necessário (resposta imune excessiva).
C – Linfócitos T Citotóxicos ou citolíticos CD8: Atacam ligando-se as células ou
partículas antigênicas estranhas, lisando-as.
As células T de memória reagem com muita rapidez à reintrodução do antígeno
e estimulam o aparecimento dos linfócitos T citotóxicos.
A célula precursora comissionada, na medula óssea dará origem aos linfócitos
B. Estes vão para o sangue periférico e para os órgãos linfóides secundários,
onde entram em contato com um antígeno e se transformam em imunoblasto
que origina os linfócitos B de memória e Plasmócitos.
Os linfócitos B – Função: Atuam na imunidade humoral, produzindo anticorpos,
seja sob a forma de linfócito ou após sua diferenciação em plasmócito
(anticorpos IgG, IgA ou IgE com alta afinidade). Uma vez produzidos os
plasmócitos tem vida curta, por isso à medida que diminui a estimulação pelo
antígeno, a produção de anticorpos declina. Algumas células B, não se
diferenciam em plasmócitos, mas persistem como células B de memória com
IgG específica na sua membrana, podendo numa segunda exposição ao
antígeno iniciar uma resposta aumentada.

21
Os linfócitos NK ou natural Killer ou célula “null”: São linfócitos sem marcadores
específicos para linfócitos T ou B. São células nulas não B não T.
Função: São citotóxicas e agem contra células tumorais ou que contenham
partículas virais que ao contrário dos linfócitos T e B, não necessitam de
ativação (imunização) ou sensibilização prévia por parte dos antígenos das
células alvo.
Embora os linfócitos apresentem diferentes funções, em condições normais, a
resposta imune ao estímulo antigênico resulta da cooperação de todos os tipos.
Os linfócitos B e T não são distinguíveis pela sua morfologia na microscopia
ótica. Os linfócitos T forma rosetas com hemácias de carneiro. Os linfócitos B
possuem imunoglobulinas de superfície.
MORFOLOGIA
O estudo das células precursoras dos linfócitos é particularmente difícil, e a
distinção celular se baseia, sobretudo no tamanho das células, na estrutura da
cromatina e na presença de nucléolos visíveis no esfregaço. À medida que as
células da linhagem linfocítica amadurecem, sua cromatina torna-se mais
compacta, os nucléolos menos visíveis e a célula diminui de volume. A célula
mais jovem da linhagem é o linfoblasto, que forma o prolinfócito e estes os
linfócitos maduros.
1. Linfoblasto – O núcleo é prevalente e apresenta uma relação núcleo
citoplasmática de 6:1. A cromatina nuclear é púrpura profundo; sua distribuição
é menos delicada que a do mieloblasto. Os nucléolos são em número de um a
dois. Citoplasma azul intenso, com halo claro perinuclear. Sua distinção do
mieloblasto somente é possível com coloração citoquímica. Ácido Periódico de
Schiff POSITIVO.
2. Prolinfócito - É menor que o linfoblasto: tem o citoplasma baófilo, podendo
conter granulações azurófilas. Cromatina condensada, porém menos que
linfócitos. Os nucléolos não são facilmente visíveis. O prolinfócito dá origem ao
linfócito circulante.
3. Linfócitos – Duas formas de linfócitos são vistas no sangue periférico: O
grande linfócito com um diâmetro de 8 a 16 micra e o pequeno linfócito cujo

22
diâmetro oscila entre 7 a 9 micra. São células redondas, com núcleo também
redondo, o qual é em geral ligeiramente excêntrico. Cromatina intensamente
purpúrea, compacta. Ausência de nucléolos. Citoplasma azul claro, por vezes
abundante.
No pequeno linfócito o citoplasma pode apresentar-se apenas como um fino
anel perinuclear.
LINFÓCITOS ATÍPICOS
O linfócito atípico é um leucócito não maligno que pode ser encontrado no
sangue periférico em resposta a alguns estímulos antigênicos. Nos locais de
inflamação ele atua como os linfócitos normais, desempenhando um papel na
resposta imune, tanto na primária quanto na auxiliar.
Ele apresenta variações nos detalhes morfológicos e nas características dos
marcadores de superfície, mostrando constituir uma mistura heterogênea de
tipos celulares. Em algumas situações ele é facilmente identificado como sendo
uma célula intermediária entre o linfócito e o plasmócito, oportunidade na qual
pode ser denominado linfócito plasmocitóide ou plasmócito linfocitóide.
Em outras, a morfologia é variável caso a caso: o tamanho é aumentado, a
forma pode mostrar periferia angulosa com aspecto recortado ou poliédrico,
citoplasma abundante variando desde azul escuro até cinza pálido, com
condensação da basofilia na periferia da célula e eventual microvacuolização; o
núcleo de forma variada pode ter localização excêntrica, eventual imagem de
nucléolo, lobulação, e cromatina fina e delicada. Estudos anteriores indicavam
ser estas células tanto do tipo B quanto T. Os estudos mais recentes sugerem
que estes linfócitos atípicos são linfócitos T ativados produzidos em resposta a
linfócitos B infectados. A histoquímica e a microscopia eletrônica são
consistentes em demonstrar síntese de DNA nessas células.

CAUSAS DE LINFÓCITOS ATIPICOS


Os detalhes característicos dos linfócitos atípicos são facilmente identificados
ao microscópio pelo examinador experimentado, mas com a difusão do uso dos
contadores eletrônicos automáticos estas células podem estar sendo sub-

23
relatadas. Deve-se ressaltar, contudo, que a presença e o número de linfócitos
atípicos são informações úteis e em algumas situações vitais, pois podem
orientar o diagnóstico para uma patologia particular, como é o caso da
síndrome mononucleose-símile (mononucleose, citomegalovirose, HIV, herpes
simples, rubéola, toxoplasmose, adenovirose e hepatite A e B).

24
Aula Prática 7

CONTAGEM DE RETICULÓCITOS

O reticulócito é o último estágio de eritrócito imaturo e ainda contém


RNA citoplasmático remanescente.
A visualização dos reticulócitos se faz pela coloração deste RNA
residual com corantes supravitais. Coloração supravital é aquela realizada após
a morte somática e antes da morte molecular da célula. A contagem de
reticulócitos é um meio simples de avaliar a velocidade de produção de células
vermelhas ou seja a atividade eritropoética da medula óssea.

Material e Reagentes :

1- Tubos de ensaio;
2- Lâminas de vidro;
3- Solução corante:
azul cresil brilhante................................1,0 g
solução fisiológica 0,9%.........................100 ml
4- Microscópio;
5-Micropipeta.

Procedimento Experimental:

1- Colocar 50µL de sangue e 50µL do azul de cresil em tube de ensaio;


o
2- Misturar e incubar a 37 C por 30 minutos;
3- Após este tempo, fazer esfregaço, secar.
4- Examinar em objetiva de imersão, em óleo.
5- Contar os eritrócitos que contêm grânulos ou retículos em 10 campos
distindos.
6- Somar os 10 campos e dividir o valor obtido por 10.

Valores Normais

0,5 a 2,0 %

24.000 - 84.000 / mm3 ou 24 a 84.109 / L

25
Correção da contagem de reticulócitos:

Em amostras com hematócrito baixo, a porcentagem de reticulócitos


pode estar falsamente elevada porque o sangue total contem poucos
eritrócitos.
Um fator de correção é usado, considerando que o hematócrito médio
normal é 0,45 L/L.
reticulócito corrigido = reticulócito ( % ) x Hematócrito ( L/L )

0,45

26
Aula Prática 8

HEMOSTASIA : TÉCNICAS GERAIS DE COAGULAÇÃO

CUIDADOS

- Excesso de manipulação da agulha promove liberação de


tromboplastina tecidual, contaminando a amostra e causando ativação pró-
coagulante. Uma punção atraumática é essencial.
- Evitar formação de bolhas de ar durante a coleta do material e
distribuição no tubo.
- A homogeinização deve ser suave promovendo a anticoagulação do
sangue. Qualquer microcoágulo formado invalida o teste.

Preparo da Amostras de Plasma

- Centrifugar as amostras de sangue imediatamente após a coleta.


- A velocidade de centrifugação é de 3000 rpm por 10 minutos.
- Após a centrifugação das amostras, deve-se observar o aspecto do
plasma. A lipidemia, icterícia e hemólise alteram os resultados dos testes,
principalmente quando se utilizam coagulômetros com leitura óptica. No caso
de hemólise, o tempo de coagulação apresenta-se encurtado devido à
liberação de substâncias pró-coagulantes, ADP e fosfolípides da membrana da
hemácea. Já no caso de função plaquetária, a hemólise promove
hipoagregação devido à liberação de adenosina.
- Ao pipetar o plasma tomar cuidado para não colher a camada rica em
plaquetas, aspirando os 3/4 superiores do plasma.
- Realizar os testes logo após a coleta devido a labilidade dos fatores de
coagulação.
-

27
CONTAGEM DE PLAQUETAS

Procedimento Experimental:
DILUIÇÃO
1. 0,4 mL de oxalato de amônio 1%.
2. 20 μL de sangue com EDTA.
3. Preencher a câmara de Newbauer e deixar em câmara úmida por 10
minutos. (Placa de Petri com algodão embebido em água)
4. Contar na área central para glóbulos vermelhos (H1, H2, H3, H4, H5)
Plaquetas p/mm3sg = nº células contadas x 5 x 10 x diluição(1/20) = Plaquetas
contadas x 1000
VR: 150.000 a 400.000 mm3 sg
INTERPRETAÇÃO
Trombocitose: aumento do nº de plaqueta
Trombocitopenia: diminuição do nº de plaqueta

28
Aula Prática 9

TEMPO DE SANGRAMENTO

Tempo de sangramento é o tempo necessário para cessar uma


hemorragia provocada por pequena incisão praticada artificialmente.
É um teste utilizado na detecção das alterações do fator vascular e das
plaquetas. Depende da integridade do vaso e da adesividade e agregabilidade
das plaquetas no local da punção.
As alterações mais intensas do tempo de sangramento são observadas
nas púrpuras trombocitopênicas e nas trombopáticas.

Método de Duke
Após a assepsia da face lateral interna do dedo mínimo ou do lóbulo da
orelha se pratica uma incisão de 3 a 4 mm de profundidade com um estilete
descartável. O dedo apresenta a vantagem, em relação ao lóbulo da orelha, de
ser mais fácil de manipular e não depende tanto das variações de temperatura
ambiente e das constricções vasculares emotivas.
Espremendo a base do dedo enxuga-se a primeira gota de sangue e
aciona-se o cronômetro. A cada 30 segundos, com um papel de filtro, absorve-
se a gota formada. A última gota deixa apenas um sinal puntiforme com cerca
de 1 mm de diâmetro. O tempo de sangramento é o tempo decorrido entre a
primeira e a última gota. Deve-se tomar cuidado de encostar o papel de filtro
sem tocar a pele, para evitar a remoção do trombo plaquetário que está se
formando.

Valor Normal : 1 a 3 minutos

PROVA DO LAÇO

É também conhecida como prova de fragilidade capilar. Consiste em se


promover um obstáculo ao retorno venoso e se observar o número de
petéquias cutâneas que aparecem por unidade de superfície numa zona
diferente do local de obstrução.

29
Técnica :
Coloca-se o manguito do aparelho de pressão no braço, insufla-se
mantendo uma pressão média entre a mínima e a máxima do paciente (em
geral entre 70-100 mmHg para adultos) durante cinco minutos.
Desenha-se um quadrado de 2,5 cm na fase medial do antebraço, logo
abaixo da prega do cotovelo. Anota-se o número de petéquias formadas no
final dos 5 minutos que se seguem, após retirar o manguito.
Uma contagem superior a 10 é patológica. A presença de 1 a 2
petéquias é ligeira alteração. Para interpretação segura deste teste, há
necessidade de levar em consideração os dados clínicos e as outras provas
laboratoriais.
A positividade indica fragilidade vascular por alteração do próprio vaso
ou por alteração da quantidade ou qualidade das plaquetas.

RETRAÇÃO DO COÁGULO

Mede a retração da fibrina, após a coagulação do sangue, pela


quantidade de soro que é expelida pelo coágulo. É um método excelente para
avaliar a capacidade funcional das plaquetas.
A retração não é influenciada pelo volume de sangue, pelo diâmetro do
o
tubo, pela temperatura e pelo tempo. Seu ótimo é a 4 C. porém, para fins
o
práticos, ela é completada a 37 C.

A. Método de Mc Farlane :
Coloca-se 1 ml de sangue em um tubo de fundo cônico graduado,
arrolha-se o tubo para evitar a evaporação e deixa-se no banho maria a 37oC
por 2 horas. Após este tempo, verifica-se o volume total de sangue, despreza-
se o coágulo e verifica-se o volume do soro. No caso do coágulo ser frouxo e
liberar muitos glóbulos, faz-se a correção do resultado descontando-se o
volume ocupado pelas hemácias, após centrifugação do soro.

30
A retração é representada em porcentagem do soro liberado em relação
ao volume total de sangue. Com esse método os resultados normais variam de
40 a 50%.

B. Método de Bunting-Disdisheim :
Atualmente é o mais usado porque leva em conta o valor do
hematócrito.
O procedimento técnico é o mesmo.

Cálculo :

RC% = Volume do soro (x100) x 100

(100 - Ht) x volume sangue total

Valores Normais : 40 - 94%

Obs.: A vantagem deste método é corrigir as distorções da R.C. em função do


hematócrito (Anemias : Ht diminuído  RC aumentada; Policitemias : Ht
aumentado  RC diminuída).

31
Aula Prática 10

TEMPO DE PROTROMBINA

Este teste avalia a eficiência do sistema extrínseco da coagulação pelo


método de Quick. Quando, a um plasma citratado, se adiciona tromboplastina
cerebral e cálcio, o processo de coagulação do cálcio dependerá da
concentração dos fatores VII, X, II e I ou da presença de inibidores. A
sensibilidade do teste é maior na deficiência dos fatores V, VII e X do que a da
tromboplastina. Somente diante de fibrinogênio muito baixo e/ou inibidor da
reação trombina-fibrinogênio é que obter-se-á um TP prolongado.
É um teste usado de rotina no controle dos anticoagulantes orais (anti-
vitamina k). A presença de anticoagulantes orais tipo heparina, prolongam o
teste independente das concentrações destes fatores.

Procedimento Experimental:
1. Aqueça num banho-maria a 37oC, por 4 minutos pelo menos, um tubo
contendo 50 μL.
2. Coloque 100 μL do reagente e dispare o cronometro e mantenha o tubo
em movimento para observar a formação do coágulo.
3. Assim que se observar a formação do coágulo pare o cronômetro.

Resultados :
Os resultados podem ser expressos em % de atividade, através de uma
curva de atividade de tromboplastina ou em tabela para leitura obtida desta
curva.
Valores Normais : Tempo: 10 a 14 segundos
Relação TD/TN = 1,0 a 1,2
atividade 100% a 70%

32
Interpretação :
Tempos de protrombina prolongados serão devidos a qualquer bloqueio
na síntese dos fatores VII, X, IX e II consequentes à administração de
anticoagulantes orais (anti-vitamina k) ou à problemas hepáticos e/ou
desnutrição.

33
34
TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADA

Este teste avalia a eficiência do sistema intrínseco da coagulação. O


plasma citratado é recalcificado e na presença de uma quantidade ótima de um
substituto plaquetário (cefalina) e um ativador (caulim ou celite) coagula. Este
último promove a ativação dos fatores sensíveis ao contato, a saber : XII, XI, IX
e VII.

Procedimento Experimental:

1. Incubar a 37°C 50 µL da amostra e 50 µL do reagente 1


2. Após 4 minutos acrescentar 50 µL do reagente 2 e disparar o
cronômetro;
3. Movimentar o tubo ate observar a formação do coágulo e parar o
cronômetro.

Valores Normais : 30 a 40 segundos

Interpretação :
Plasmas completamente deficientes em fatores VIII e IX dão tempos
prolongados, na média de 150 a 200 segundos e deficiências moderadas de
qualquer fator da coagulação prolongarão este tempo. Deste modo, valores
prolongados são encontrados em paciente fazendo uso de anticoagulante oral
ou heparina, na presença de inibidores específicos ou de interferência, na
deficiência da vitamina K ( diminuição dos fatores IX e X ) e nas doenças
hepáticas. Valores abaixo do normal são devidos à coleta inadequada com
ativação dos fatores de coagulação, de hemólise in vitro na amostra, lipidemia
e hiperreatividade dos fatores.

35
Aula Prática 13

VELOCIDADE DE SEDIMENTAÇÃO GLOBULAR


OU HEMOSSEDIMENTAÇÃO

O teste mede a velocidade em que os eritrócitos sedimentam em plasma


autólogo. O International Committee for Standardization in Hematology (ICSH,
1993) recomenda, como método de referência, a determinação da
sedimentação com sangue colhido com EDTA e não diluído e, como método de
trabalho (rotina), a utilização do sangue diluído ou não, conforme descrito
abaixo.

Reagentes e equipamentos :

1- Sangue total citratado ou com EDTA


2- Pipeta de Westergren.
3- Rack (suporte) para pipeta de Westergren.

Procedimento Experimental:

1- Colher o sangue em punção atraumática e, sempre que possível, em


30 segundos, sem causar excessiva estase venosa. O teste deve ser realizado
em até 4 horas após a coleta.
2- Homogeinizar a amostra por inversões suaves e preencher a pipeta
de Westergren até a marca 0.
3- Colocar a pipeta no suporte, em posição rigorosamente vertical (+ 1o)
e manter à temperatura ambiente. Manter o suporte livre de vibrações. Marcar
a distância que o menisco dos eritrócitos desceu após 1 hora.

Valores Normais :

Homens : 0 - 10 mm

Mulheres : 0 - 20 mm

Crianças: 0 - 13 mm
36
Aula Prática 14
IMUNOHEMATOLOGIA

I- Determinação dos grupos sanguíneos A, B, O - Classificação direta


A classificação direta dos grupos sanguíneos do Sistema ABO é feita
através da detecção dos antígenos presentes nos eritrócitos humanos
utilizando reagentes anti-A e anti-B.

Procedimento Experimental:

a) Teste em lâmina:

1- Pode-se empregar sangue total ou uma suspensão a 10% das


hemácias a classificar, em solução salina fisiológica.
2- Colocar uma gota de soro anti-A e uma gota de soro anti-B em uma
lâmina.
3- Adicionar 1 gota de sangue ou suspensão de hemácias a cada um
dos soros classificadores.
4- Misturar bem com movimentos oscilatórios.
5- Os teste que não apresentarem aglutinação deverão ser observados
por 2 minutos e não mais.

b) Teste em tubo :

1- Preparar uma suspensão a 5% das hemácias a classificar, em


soluçào salina fisiológica.
2- Colocar, em um tubo de ensaio, 1 gota do soro anti-A e, num segundo
tubo, 1 gota do soro anti-B.
3- Acrescentar a cada um dos tubos, 1 gota de suspensão de hemácias
a 5%. Misturar bem.
4- Centrifugar (1 minuto a 3000 rpm).
5- Ressuspender o "botão" de hemácias, agitando delicadamente os
tubos e observar a presença ou não de aglutinação.

37
II- Determinação do Antígeno Rho (anti-D)
O sistema Rh é o mais complexo dos sistemas eritrocitários possuindo
cinco antígenos D,C,c,E,e. Rotineiramente, sua fenotipagem envolve apenas a
pesquisa do antígeno D.

a) Teste em lâmina :

1- Pode-se empregar sangue total.


2- Colocar em uma lâmina uma gota de soro anti-Rho (anti-D).
3- Acrescentar 2 gotas de suspensão de hemácias ou sangue total.
4- Misturar bem. Agitar a lâmina para a frente e para trás.
5- Os testes que não apresentarem aglutinação deverão ser observados
por 2 minutos e não mais.

b) Teste em tubo :

1- Preparar uma suspensão a 5% das hemácias em solução salina


fisiológica.
2- Colocar em um tubo de ensaio uma gota de soro anti-Rho (anti-D) e
em um segundo tubo (que servirá de controle) colocar uma gota de albumina
bovina a 22% ou controle Rh.
3- Acrescentar a cada um dos tubos, 50μL de suspensão de hemácias a
5%.
4- Misturar bem e centrifugar (1 minuto a 3000rpm) ambos os tubos.
5- Ressuspender o "botão"de hemácias agitando delicadamente o tubo e
observar a presença ou não de aglutinação.

III - Determinação do Antígeno Du

1- O tubo em que o teste de Rh deu negativo encuba-se por 15 minutos


em banho maria a 37°C. Junto com o tubo controle
2- Lavar as hemácias, dos tubos, com salina fisiológica por 3 vezes.
Decantar completamente a salina após a última lavagem.

38
3- Adicionar 2 gotas do soro de Coombs ou de soro anti-humano a cada
tubo.
4- Agitar para misturar e centrifugar (1 minuto a 3000 rpm).
5- Ressuspender o "botão"de hemácias, agitando delicadamente os
tubos e observar a presença ou não de aglutinação.

Interpretação :

 Se não houver aglutinação em ambos os tubos, o sangue é Rh negativo.


 Se a aglutinação for possível apenas na amostra onde se acrescentou o
soro anti-D, o sangue é Du positivo e deverá ser classificado como Rh
positivo.

39
Aula Prática

COOMBS DIRETO (Teste da Antiglobulina Direto-TAD) (tubo)

Material e Reagentes:
 Amostras a serem testadas
 Solução fisiológica 9%
 Tubo de ensaio
 Laminas

Procedimento Experimental
1- Preparar uma suspensão 5% de hemácias a testar
2- Lavar 50 μL desta suspensão 3-4 vezes com salina
3- Adicionar SAGH (Soro de Coombs)
4- Centrifugar, ler e anotar resultados

INTERPRETAÇÃO
Coombs positivo: presença de aglutinação
Coombs negativo: ausência de aglutinação

COOMBS INDIRETO (Teste da Antiglobulina Indireto – TAI)


Procedimento Experimental:

a) Preparar suspensão de 5% de O positivo


1- Transferir 500 μL de amostra de O positivo conhecido para tubo
de ensaio e lavar três vezes com soro fisiológico;
2- Transferir 50 μL da papa de hemácias para outro tubo e
acrescentar 1 mL de soro fisiológico.
b) Teste de coombs indireto
1- Em um tubo de ensaio colocar 100 μL do soro a ser testado e 100
μL da suspensão de O;
2- Incubar de 30-45 minutos em banho maria a 37°C

40
3- Lavar por três vezes a mistura (1 minuto a 3000 rpm)
4- Pingar 2 gotas de reagente soro de coombs
5- Centrifugar
6- Ler o resultado com movimentos lentos no tubo.

INTERPRETAÇÃO
Coombs Indireto positivo: presença de aglutinação no tubo I ou II (ou I e II)
Coombs Indireto negativo: ausência de aglutinação nos tubos I e II

41
Aula Prática 12
ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA

Este é um teste de screening para detectar a presença de hemoglobinas


variantes. Eletroforese é o movimento de partículas carregadas em um campo
elétrico. Em pH alcalino, a hemoglobina é uma proteína carregada
negativamente e portanto migra para o anodo. Durante eletroforese, várias
hemoglobinas separam devido a diferenças nas cargas causadas por variações
estruturais da molécula, permitindo assim a detecção das diferentes
hemoglobinas.

Procedimento Experimental:

1- Preparo da solução de Hemoglobina :


1. Em um tubo de hemólise colocar 1 ml de sangue.
2. Centrifugar a 1500 rpm por 5 minutos. Desprezar o plasma.
3. Lavar os eritrócitos com solução salina fisiológica (NaCl 0,85%) até que
o sobrenadante fique límpido.
4. Adicionar, ao volume de glóbulos lavados, um volume igual de água
destilada. Agitar.
5. A seguir, adicionar um volume de clorofórmio, idêntico ao do
hemolisado. Agitar vigorosamente e centrifugar a 2000 rpm por 15
minutos.
6. Transferir a solução sobrenadante ou solução de hemoglobina para um
frasco limpo.
Esta solução terá concentração entre 10 e 15 g/100ml e pode ser estocada, em
geladeira, por até uma semana.

2- Eletroforese qualitativa :

Solução tampão :

Tampão Tris-EDTA-Borato pH 8,6

42
Tris-hidroximetil-aminometano............ 10,2 g

Sal dissódico do EDTA........................ 1,22 g

Ácido bórico........................................ 1,5 g

Água destilada 1000 ml


qsp...............................

Amostra :

Solução de hemoglobina diluída a uma concentração entre 3 a 5 g/100


ml

Procedimento :

1. Embeber as fitas de acetato de celulose, no tampão, por no mínimo 15


minutos e no máximo 6 horas.
2. Secar as fitas entre duas folhas de papel de filtro e colocá-las na cuba.
3. Aplicar as amostras de hemoglobina a 1 cm da extremidade da fita que
está em contato com o polo negativo.
4. Passar 300 volts por 35-40 minutos.
A análise das frações pode ser feita sem coloração.

Coloração e Transparentização :

 Corante Ponceau'S:
Ponceau'S............................................ 0,5 g
.
5,0 g
ácido tricloroacético.............................
100 ml
água destilada
qsp................................

1. Corar por 5 minutos.


2. Descolorir as fitas em ácido acético 5% em 3 ou 4 banhos sucessivos.
3. Desidratar as fitas em metanol puro por 1 minuto.
4. Para transparentização, imergir a fita, por 3 minutos, na seguinte
solução, preparada no momento do uso : ácido acético 1,7 ml; metanol
8,3 ml; glicerina 0,1 ml.
43
5. Após este tempo, colocar as fitas sobre placa de vidro; remover bolhas
de ar e excesso de solução; aquecer, em forno por 4 minutos.

3- Eletroforese quantitativa
Solução tampão :
Tampão Tris-EDTA-Borato pH 8,6

Amostra : Solução de hemoglobina (sem diluir)

Procedimento :

1. Aplicar, em fitas de acetato de celulose com 5,7 cm de largura, 20 l da


solução de hemoglobina. Pode-se usar fitas com 2,5 cm de largura;
neste caso usar 2 fitas para cada amostra e aplicar 10 l da solução de
hemoglobina em cada uma das fitas.
2. Passar 300 volts por 60 minutos.
3. Após a separação das frações de hemoglobina A 1 e A2, recortá-las com
tesoura e eluí-las em tubos contendo 3 ml de água destilada (Hb A 2) e
15 ml de água destilada (Hb A1).
4. Deixar eluindo por 2 a 6 horas. Usar, como branco, água destilada
contendo um pedaço de fita limpo.
5. Ler as absorbâncias em 540 nm.

Cálculo :

A Hb A x 100 = % Hb A
2 2

(A Hb A1) x 5 + A Hb A2

Valor Normal :

2,0 a 3,7% de Hb A2

44
Aula Prática 12

TESTE DE FALCIZAÇÃO

É um método auxiliar para detectar a presença de hemoglobina S.


Quando sangue total é misturado com um agente redutor, ocorre
deoxigenação, o que faz com que a molécula de Hb S assuma a forma tactóide
e forme os eritrócitos falciformes.

Reagentes e Equipamentos :

1- Solução de metabissulfito de sódio a 2%. Deve ser preparada no dia do


uso pois é estável por 8 horas.
2- Lâminas e lamínulas.
3- Microscópio.

Amostra : Sangue anticoagulado com EDTA

Procedimento Experimental:

1- Colocar sobre uma lâmina, uma gota de sangue e duas gotas de


metabissulfito de sódio. Misturar e cobrir com lamínula.
2- Selar a lamínula com esmalte ou similar.
3- Deixar a preparação à temperatura ambiente.
4- Observar, em objetiva seca, se houve formação de células falciformes
após 0,5 hora, 1, 2, 6 e 24 horas.

Interpretação:
Nos indivíduos homozigotos a falcização ocorre rapidamente enquanto
nos indivíduos heterozigotos pode demorar até 24 horas.

45
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1- BAIN, B. J. Blood Cells. A pratical guide - J. B. Lippincott, Philadelphia,


2nd ed, 1995.

2- FIMLS, A. S. - Hematology - A combined theoretical & technical


approach : W.B. Saunders. Co. , Philadelphia, 1989.

3- LIMA, A. O. et al. Métodos de Laboratório Aplicados à Clínica -


Técnicas e Interpretação. Guanabara kogan, Rio de Janeiro, 7a
ed., 1992.

4- WILLIANS, J. W. et al. Hematology. Mc Graw Hill, New York, 4th ed.,


1991.

5- HANDIN, R. I.; LUX, S. E.; STOSSEL, T. P. - Blood: Principles and


Practice of Hematology. J. B. Lippincott Co, Philadelphia, 1995.

6- FAILACE, R. Hemograma - Manual de Interpretação, Artes Médicas,


Porto Alegre, 3a ed, 1995.

7- RODAK, B. F. Diagnostic Hematology, W. B. Saunders Co,


Philadelphia, 1995.

46

Você também pode gostar