BIOTECNOLOGIA

BIOtecnologia

• Agropecuária (melhoramento
vegetal e animal)
• Medicina
• Indústria farmacêutica...
Há mais de 6000 anos:

Egípcios utilizavam leveduras

para produção de pão e bebidas
fermentadas
BIOtecnologia HOJE

Descoberta
do DNA e
processos
celulares
Década de 70: Enzimas de restrição

Defesa de bactérias
contra DNA de
bacteriófagos
 Plasmídeos bacterianos

DNA circular com capacidade de se

reproduzir independentemente do
DNA cromossomal
Enzimas de restrição

Plasmídeos

DNA Recombinante
A transformação pode ter inúmeros objetivos:
•Frutos que demoram a amadurecer
•Vegetais ou animais que produzam vacinas
•Vegetais adaptados a ambientes inóspitos
•Alimentos mais nutritivos
•Plantas resistentes a agrotóxicos ou predadores
CLONAGEM CELULAR
Células
bacterianas

Transformação:
- Choque térmico
- Eletroporação
Biblioteca de genes.

Biblioteca genômica.

É uma coleção de clones que contém pelo menos uma cópia de cada
seqüência de DNA do genoma de um indivíduo. O DNA genômico é
digerido completamente com uma enzima de restrição e os fragmentos de
DNA resultantes são clonados em um plasmídeo, fago ou cosmídeo.

Biblioteca de cDNA.

Dada uma população de RNAm de uma célula, é possível fazer cópias de

DNA destes RNAm. Primeiro a enzima transcriptase reversa (TR) faz uma
fita simples de DNA que é cópia do RNAm; em seguida outras enzimas
são utilizadas para fazer uma fita dupla de DNA denominada então de
DNA complementar (cDNA). Este cDNA pode ser inserido em um vetor de
clonagem e os cDNAs resultantes são uma representação do RNAm
original. Representa os genes que estavam ativos na célula da qual o
RNAm foi retirado.
 BIBLIOTECA GENÔMICA

CLIVAR COM
ENZIMA DE
RESTRIÇÃO
Fragmentos
DNA de interesse de DNA
FRAGMENTOS INSERIDOS EM
PLASMIDEOS USANDO LIGASE

Moléculas de DNA
recombinante

INTRODUÇÃO DOS
PLASMÍDEOS NA BACTÉRIA

Biblioteca genômica
 BIBLIOTECA cDNA
1) Extração de mRNA

mRNA

Passos: 2) Síntese de cDNA*

1) Extração de mRNA
2) Síntese de cDNA
3) Ligação em vetores
4) Inserção em bactérias
5) Multiplicação (clones) *cDNA: DNA complementar ao mRNA
Transformação de células não bacterianas.

Métodos para introduzir DNA em fungos, animais e plantas são necessários se

células desses organismos serão utilizadas como hospedeiras para clonagem de
genes. A maior barreira para a absorção do DNA é a parede celular.

Células animais:

Células animais cultivadas normalmente não apresentam parede celular, o que

permite a absorção de DNA rapidamente por precipitação do DNA na superfície
celular com fosfato de cálcio.

DNA não ligado a um vetor pode também ser integrado nos cromossomos do
hospedeiro através da técnica de microinjeção, onde uma seringa muito fina
injeta o DNA diretamente no núcleo da célula a ser transformada.

Células vegetais:

Para células vegetais, a remoção da parede é feita por enzimas que sob
condições ideais permitem a obtenção de protoplastos intactos. Protoplastos
geralmente absorvem DNA rapidamente (pode ser estimulada por eletroporação).
Após a transformação pode ser possível induzir a regeneração da parede celular,
divisão e regeneração de um organismo transformado.
Se um plasmídeo é introduzido no protoplasto carregando um determinado
gene, esse gene pode ser integrado no DNA cromossomal da planta onde será
mantido, sendo transmitido às progênies. Este sistema de clonagem é
chamado de transferência direta de genes.

No caso de plantas, dois métodos principais vêm sendo utilizados com

bastante sucesso: Transformação com Agrobacterium tumefaciens e biolística.
Agrobacterium tumefaciens.

Esta bactéria do solo infecta vários tipos de plantas causando a “crown gall
disease”. Plantas com feridas no caule podem ser invadidas pela bactéria, que
por sua vez causa a proliferação cancerosa na região do caule.

A capacidade de causar esta proliferação está associada a presença de um

plasmídeo Ti dentro da célula da bactéria. Após a infecção, parte da molécula do
plasmídeo Ti é integrada ao DNA cromossomal da planta. Este segmento é
denominado de T-DNA ( 30kb) que é mantido de forma estável na célula vegetal
e passando para as células filhas como parte integral dos cromossomos. Os
genes do T-DNA são responsáveis pelas propriedades cancerosas e de
transformação de células.
Biolística.

A técnica de biolística envolve o bombardeamento de células com DNA

recombinante. Para isto, um determinado plasmídeo contendo o gene a ser
transferido é ligado a partículas (ouro) e projetas com pressão sob o tecido a ser
transformado (células gaméticas ou somáticas em cultura). As células
transformadas são então utilizadas para regeneração de plantas ou fecundação de
outros gametas.
 Transformação – Célula Alvo

Todos os protocolos de transformação introduzem o

DNA nas células de plantas em cultura de tecidos
Cultura de tecidos permite a regeneração de
plantas férteis a partir de uma única célula;
Grande número de células alvo na forma de
calo;
Estabelecimento, manutenção e regeneração
de plantas é bastante trabalhoso e com um alto
grau de dificuldade;
Métodos estão limitados a alguns genótipos,
geralmente de variedades não comerciais;
Pode introduzir mutações não desejáveis.
 Transformação – Seleção Células em cultura
(seleção)
1 in 1000 células terá o DNA integrado no
genoma;
Células transformadas são marcadas pela
cointrodução de um gene de resistência a
agentes seletivos;
Células transformadas são selecionadas pela
morte de células não transformadas pelo agente Ensaio resistência a
seletivo; herbicida
Transgênico Não Transgênico
2 principais agentes seletivos: Resistente Susceptível
•antibióticos
•herbicidas

Marcadores seletivos auxiliam os passo

seguintes de estudos sobre a herança do
transgene.
 Construção da variedade transgênica
Retrocruzamento e seleção (6 - 8 gerações)

Linha Variedade
transgênica comercial
Linhagem transgênica
Biotecnologia
comercial
Teste de campo

Resistencia ao herbicida

Não-transgenicos

Transgenicos
Teste final dos transgênicos
Aceitação do consumidor

Milho RoundUp Ready

Antes Depois
 Flavr Savr (Calgene)
Tomate transgênico Tomate tradicional

O tomate transgênico O tomate tradicional

amadurece na planta,
ficando com mais sabor.
Mantém-se firme após a
colheita.
tem de ser colhido
O tomate tradicional é verde, para não ser
vaporizado com esmagado durante o
etileno para induzir a transporte.
maturação.
SUPERMERCADO
 The Golden Rice
Deficiência em vitamina A é um grande problema de saúde pública
Arroz faltam enzimas da via do β-caroteno

Inserção de 1 gene de bactéria e 2 genes do narciso