DESCRIÇÃO

Conceitos gerais de bacteriologia, testes de sensibilidade e métodos de coloração.

PROPÓSITO
Compreender as características gerais das bactérias, reconhecer os tipos de testes de
sensibilidade e distinguir as principais técnicas de coloração bacteriana é importante, pois
facilitará a execução de procedimentos na microbiologia clínica.

OBJETIVOS

MÓDULO 1
Descrever as características gerais das bactérias, as fases e os fatores que afetam o
crescimento bacteriano

MÓDULO 2

Reconhecer os tipos de meios de cultura, bem como os testes de sensibilidade aos

antimicrobianos

MÓDULO 3

Distinguir os métodos de visualização e coloração na prática laboratorial

INTRODUÇÃO
A Microbiologia é a ciência que estuda os organismos microscópicos, suas características e
atividades, sendo as bactérias, os fungos, as algas e os protozoários os principais organismos
estudados. Muitas bactérias são agentes infecciosos responsáveis por uma série de doenças
nos seres humanos, podendo levar ao óbito dos indivíduos. Além disso, existe um grupo de
bactérias multirresistentes aos antimicrobianos, não apresentando nenhum tipo de opção
terapêutica.

A análise da morfologia, estrutura e metabolismo das bactérias é essencial para a

compreensão e a identificação correta do tipo bacteriano, seja através do crescimento
microbiano em meio de cultura adequado, ou através das técnicas de coloração, ou para
investigar resistência a um ou mais antibióticos utilizados na clínica por meio dos testes de
sensibilidade.

Você sabe por que algumas bactérias são classificadas como cocos gram-positivos e outras
gram-negativas? Você sabe a diferença entre meios de culturas enriquecidos e seletivos?
Como verifica-se a resistência aos antimicrobianos? Vamos juntos decifrar e explorar mais
sobre a microbiologia clínica?
MÓDULO 1
 Descrever as características gerais das bactérias, as fases e os fatores que afetam o
crescimento bacteriano

MORFOLOGIA BACTERIANA
As bactérias podem apresentar diferentes morfologias, que caracterizam determinados gêneros
ou grupos de bactérias. A análise da morfologia bacteriana auxilia na identificação e condução
da escolha dos testes de identificação do tipo de bactéria, isolada a partir de espécimes
clínicos.

As bactérias são classificadas morfologicamente de acordo com o tamanho, forma e arranjo e

consistem nos menores seres vivos, da ordem de milésimos de milímetro e, portanto, visíveis
apenas com a ajuda de um microscópio.

Enquanto células animais e vegetais podem ter até dezenas de micrômetros, a maioria das
bactérias estudadas nos laboratórios de microbiologia medem em torno 1,0 µm de diâmetro.

Fonte: angellodeco/Shutterstock
 ΜM

Micrômetro: Unidade de comprimento onde 1,0 µm equivale a 1000 mm, ou seja, igual a

1 x 10-6 m).

Você sabe quais são os formatos que as bactérias podem se apresentar?

As bactérias podem se apresentar em três morfologias (Figura 1):

Fonte: Sakurra/Shutterstock
 Figura 1 - Morfologia das bactérias: cocos, bacilos e espiraladas.

COCOS
Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock
 Bactérias em formas de cocos.

Bactérias com formato esférico ou oval e que, de acordo com a sua divisão celular, são
exemplos de cocos de importância médica, Staphylococcus aureus, Enterococcus spp,
Streptococcus sp., Neisseria sp. Esses cocos podem se apresentar em diferentes arranjos:

DIPLOCOCOS
Agrupamento de dois cocos. Os Streptococcus pneumoniae (pneumococo) são diplococos que
podem causar pneumonia, meningite, sinusite e infecção do ouvido médio. Outro exemplo é a
Neisseria gonorrhoeae agente etiológico da gonorreia.

ESTREPTOCOCOS
Vários cocos agrupados em cadeia, lembrando um colar de pérolas. As infecções
estreptocócicas, causadas por várias espécies de Streptococcus, podem desencadear diversos
sintomas, como: pneumonia, faringite, febre escarlatina, impetigo e celulite.

TÉTRADES
Agrupamento de 4 cocos de forma semelhante a um quadrado.

Exemplo: Micrococcus spp., normalmente, não são patogênicos e integram a microbiota.

O aparecimento em uma cultura de sangue (hemocultura) desse tipo de bactéria é sugestivo de

contaminação, que pode ter ocorrido no momento da coleta.

SARCINAS
Agrupamento de 8 cocos unidos de forma semelhante a um cubo. Exemplo: Sarcina ventriculi,
um importante patógeno em gatos, cachorros e bovinos. Em humanos, o potencial patogênico
ainda não é muito bem elucidado, mas tem sido isolado em biopsias gástricas e relacionados
com algumas doenças, como gastrite enfisematosa e perfuração gástrica.

Essa bactéria não é fácil de isolar e cultivar em laboratório de microbiologia. Assim, para o
diagnóstico de gastrite provocada por essa bactéria recomenda-se o exame histopatológico
com colorações de Hematoxilina e eosina.

ESTAFILOCOCOS
Cocos agrupados de forma semelhante ao cacho de uvas. Como exemplo, temos as infecções
por bactérias do gênero Staphylococcus aureus, que causam infecções cutâneas (foliculite,
impetigo, abcessos, celulite), pneumonia, infecções na corrente sanguínea e osteomielite.

BASTONETES OU BACILOS

Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock

 Bastonetes.

São bactérias que apresentam um formato cilíndrico ou de bastão (bastonete), podendo ser
curtas ou longas e apresentar extremidade reta ou de ponta arredondada. Normalmente, os
bacilos não se agrupam em tantos arranjos como os cocos, apresentando-se, na maioria das
vezes, de forma isolada. Entretanto, podem apresentar-se, eventualmente, como diplobacilos
ou estreptobacilos.

DIPLOBACILOS

Agrupamento de dois bacilos.

Em alguns casos, como o da Corynebacterium diphtheriae causadora da difteria, os

bastonetes podem também apresentar arranjos diferenciados, como crescimento em
paliçada ou letras chinesas.

ESTREPTOBACILOS

Agrupamento em cadeia.

Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock

 C. diphteriae.

Fonte: SIRIKWAN DOKUTA/Shutterstock

 Bacilos gram-positivos com agrupamento de letras chinesas.

Algumas doenças causadas por bactérias em formato de bastonete ou bacilos, são:

Tétano - Clostridium tetani

Tuberculose - Mycobacterium tuberculosis

Difteria - Bacilo diftérico

Hanseníase (lepra) - Mycobacterium leprae

É importante destacar que, durante a análise microscópica, alguns bacilos podem ser
confundidos com cocos, isso ocorre pois são bacilos muito curtos. Esses bacilos curtos são
chamados de cocobacilos.

ESPIRALADAS
Fonte: Tatiana Shepeleva/Shutterstock
 Bactérias espiraladas.

Bactérias com formato espiralado ou helicoidal e que ocorrem, predominantemente, como

células isoladas. Elas podem ser divididas em espirilos, espiroquetas e vibriões, conforme
observado na Figura 2.

Fonte: Olga Bolbot/Shutterstock

 Figura 2 - Formas de bactérias espiraladas.

ESPIRILOS
São móveis (locomovem-se com ajuda de flagelos), apresentam formato espiral e corpo rígido.
Ex: Spirillum minus, que causa Febre da mordedura do rato em humanos e macacos.

ESPIROQUETAS
São móveis, mas se locomovem por contrações citoplasmáticas, apresentam formato em
espiral e são mais flexíveis; Ex: Treponema pallidum.
O T. pallium é o agente etiológico da sífilis, uma infecção bacteriana de transmissão sexual e
vertical. Quando não tratada, pode evoluir para formas mais graves, comprometendo
especialmente os sistemas nervoso e cardiovascular. Para o diagnóstico da sífilis, podemos
utilizar:

Métodos diretos a partir de materiais coletados das lesões primárias causadas por essa
bactéria, que permite a visualização do treponema vivo e móvel.

Pode ser feito com material fixado seguido de coloração (pelo método de Fontana de
Tribondeau), mas é de difícil visualização.

Pelos testes imunológicos para detecção de anticorpos-antitreponêmicos (mais

empregado).

VIBRIÕES
São móveis (locomovem-se com ajuda de flagelos) apresentam formato de vírgula. Ex: Vibrio
cholerae, também conhecido como vibrião colérico, é o agente causador da cólera.

CITOLOGIA BACTERIANA
As bactérias pertencem ao grupo dos procariotos e, portanto, não possuem membrana nuclear
(carioteca), bem como não possuem todo o conjunto de organelas das células eucarióticas.
Entretanto, possuem elementos estruturais de grande importância, como a parede celular, que
pode ser corada, permitindo o profissional da saúde identificar e diferenciar os principais
grupos de bactérias.

PAREDE CELULAR

Você sabe por que a parede celular é uma estrutura tão relevante para as bactérias?

Ela é importante na divisão celular, é responsável pela forma, rigidez da bactéria e confere
proteção osmótica entre os meios externo e interno.
A parede celular possui uma espessura de, aproximadamente, 10 a 20 µm, é porosa,
permitindo a passagem de metabólitos para a membrana plasmática, é formada por camadas
rígidas de peptidoglicanos (mureína), e envolve a membrana citoplasmática da maioria dos
procariotos.

As bactérias são classificadas em gram-positivas ou em gram-negativas, de acordo com a cor

de sua parede celular após a realização da coloração de Gram.

A divisão desses dois grupos de bactérias é essencial em um laboratório de microbiologia

clínica. A identificação microscópica de bactérias gram-positivas ou gram-negativas, além de
direcionar os testes de identificação, também permitem que o médico inicie o tratamento
empiricamente, antes mesmo de sair o resultado da cultura e do antibiograma, que demora, no
mínimo, 48 horas.

BACTÉRIA GRAM-POSITIVA

Possui uma parede celular mais espessa, com múltiplas camadas de peptideoglicanos (Figura
3), revestindo a membrana citoplasmática. Além disso, possui outros componentes, como os:

ÁCIDOS TEICOICOS
ÁCIDOS LIPOTEICOICOS

ÁCIDOS TEICOICOS

Polímeros de fosfato de poliol, ligados covalentemente ao peptideoglicano, essenciais para a

viabilidade da célula e considerados fatores importantes na virulência.

ÁCIDOS LIPOTEICOICOS

Possuem um ácido graxo e estão ancorados na membrana plasmática. São considerados

antígenos de superfície, permitem a distinção dos sorotipos bacterianos e a aderência nas
superfícies das células hospedeiras.
 VIRULÊNCIA

A capacidade de um microrganismo de produzir danos que são fatais ou graves, podendo

levar ao óbito (diferente de Patogenicidade que é a capacidade de uma bactéria de
desenvolver uma doença (dano) em um determinado organismo). São exemplos de
fatores de virulências: capacidade de multiplicar, produção de toxinas, produção de
proteínas e enzimas que auxiliam a fuga dos mecanismos de defesa do organismo,
dentre outros.

Dentre as bactérias gram-positivas, temos as que são partes da microbiota normal do

organismo e que, geralmente, não causam doenças e temos aquelas que são patogênicas,
causando difteria, carbúnculo, listeriose, septicemia, pneumonia, entre outros tipos de infecção.

Fonte: Designua/Shutterstock
 Figura 3 - Estrutura básica da parede celular gram-positiva.

BACTÉRIA GRAM-NEGATIVA

Apresenta a parede celular com uma estrutura mais complexa e, quimicamente, diferente
quando comparada à parede celular de gram-positiva (ver Figura 4). Esta parede celular é
composta de uma fina camada de peptideoglicanos (5-10% do peso da parede celular) e
externamente a esta fina camada, encontramos uma membrana externa.
 ATENÇÃO

1) O espaço entre membranas é conhecido como espaço periplasmático.

2) A membrana externa está presente apenas nas bactérias gram-negativas.

MEMBRANA EXTERNA
A membrana externa além de manter a estrutura bacteriana é uma barreira de permeabilidade,
confere proteção contra condições ambientais adversas, como as do sistema digestivo do
hospedeiro e resistência a alguns antimicrobianos como a penicilina. Essa membrana é
formada por uma dupla camada lipídica, onde a camada interna é constituída basicamente de
fosfolipídios e a camada externa possui uma molécula anfipática, o lipopolissacarídeo (LPS) ou
endotoxina e proteínas.

O LPS é essencial para a viabilidade das bactérias, funciona como um potente indutor de
respostas imunológicas, ativando linfócitos B e induzindo a produção de citocinas por
macrófagos, células dendríticas e outras células. Por outro lado, provoca febre e pode causar
choque endotoxêmico, sendo chamado também de endotoxina. As proteínas permitem a
difusão de metabolitos pequenos, antibióticos hidrofílicos, têm função estrutural e atuam como
receptoras para bacteriófagos e outros ligantes.

LPS

O LPS é composto de três secções estruturais: o Lipídeo A, o núcleo polissacarídeo e o

antígeno O. O lipídeo A é responsável pelos efeitos tóxicos do LPS.

As bactérias gram-negativas podem causar uma série de infecções graves nos seres humanos,
como peritonite, pneumonia, infecções urinárias, meningite, dentre outras. É importante
ressaltar que essas bactérias estão cada vez mais resistentes aos antimicrobianos disponíveis
para utilização terapêutica.
Fonte: Designua/Shutterstock
 Figura 4 - Estrutura básica da parede celular Gram-negativa.

 ATENÇÃO

Exceções bacterianas

1) Micobactérias: Bacilos que apresentam a camada de peptideoglicanos da parede celular

com estrutura um pouco diferente, pois é formada por polímeros de arabinogalactano e
revestida por uma capa lipídica cerosa de ácidos micólicos. Devido ao caráter hidrofóbico da
parede celular destas bactérias, a coloração pelo método de Gram não é a de escolha quando
se deseja pesquisar esse tipo de bactéria. No entanto, elas poderão ser diferenciadas pela
característica de álcool-ácido resistência (coloração de Ziehl Neelsen). Exemplo.
Mycobacterium tuberculosis (bacilo da tuberculose). (Figura 5).
Fonte: Wikimedia
 Figura 5 - Estrutura da parede celular de micobactérias.

2) Micoplasmas: São as menores bactérias encontradas na natureza (cerca de 0,3 µm), não
apresentam parede celular e incorporam esteróis do hospedeiro em sua membrana (Figura 6).
O Mycoplasma pneumoniae é um agente causador comum de pneumonia.

ESTERÓIS

Esteróis conferem a membrana celular fluidez e permeabilidade. Essas moléculas estão

presentes na maioria das células eucariotas, na forma de colesterol.

Fonte: Designua/Shutterstock
 Figura 6: Citologia do Micoplasma.
MEMBRANA CELULAR OU MEMBRANA
CITOPLASMÁTICA BACTERIANA

A membrana citoplasmática das bactérias é semipermeável, seletiva, contém várias enzimas,

limita o citoplasma, é constituída de fosfolipídios e proteínas e, portanto, considerada
semelhante à membrana plasmática dos organismos eucarióticos, exceto pelo fato de não
possuírem esteróis.

Citoplasma: O citoplasma da célula bacteriana pode ser dividido em diferentes regiões:

Citoplasmática: rica em RNA; partículas proteicas e ribossomos (responsáveis pela

síntese proteica).

Cromatínica: rica em DNA circular dupla fita.

Porção fluída, com nutrientes dissolvidos.

 ATENÇÃO

Algumas bactérias, como o Vibrio cholerae, podem possuir mais de um DNA; e outras, como a
Borrelia burgdorferi, possuem um DNA linear).

ELEMENTOS ACESSÓRIOS

São estruturas que podem estar ou não presentes em determinadas bactérias. Vários desses
elementos acessórios são importantes na virulência, patogenicidade e resistência bacteriana.
Fonte: Wikipedia
 Estrutura celular bacteriana.

GLICOCÁLICE
O glicocálice consiste em um revestimento de polissacarídeos. Quando o glicocálice apresenta
estrutura uniforme e encontra-se firmemente aderido à parede celular é denominado de
cápsula. Quando as camadas de polissacarídeos possuem pouca aderência e apresentam
espessura não uniforme, são chamadas de camada viscosa. Essa estrutura, além de fornecer
um envoltório protetor, evita a fagocitose pelas células de defesa do organismo, atua como
reservatório de nutrientes e, principalmente, auxilia na aderência bacteriana a algumas
superfícies. Exemplo: o Streptococcus mutans, que através da cápsula fixa e perfura o esmalte
dentário.

A determinação dos constituintes da cápsula é fundamental na identificação de certas bactérias

patogênicas, uma vez que algumas cápsulas são compostas de polipeptídios, ao invés de
polissacarídeos, como ocorre com o Bacillus anthracis (agente do carbúnculo/ antrax).

PLASMÍDEO
Corresponde a um DNA circular extracromossomal, capaz de se replicar de forma autônoma,
localizado no citoplasma da célula bacteriana e que não é responsável por características
essenciais da bactéria. Podem se apresentar em várias cópias, além de possuir a capacidade
de conferir vantagens adaptativas (por exemplo, resistência a antibióticos), podendo, inclusive,
ser transferidos para outras bactérias.

GRÂNULOS OU INCLUSÕES CITOPLASMÁTICAS

São grânulos cuja função é de armazenamento, podendo ser de glicogênio, amido, fosfatos,
enxofre etc. e podem ser visualizados através de colorações especiais, pois, geralmente, são
refringentes.

FLAGELOS
São estruturas de locomoção presentes em algumas bactérias, formadas por subunidades
proteicas acopladas na forma helicoidal (flagelina) e que permitem às bactérias “irem” em
busca de nutrientes ou fugir de substâncias tóxicas. O flagelo fica ancorado na membrana
citoplasmática através do seu corpo basal (similar a um gancho), possui um comprimento
geralmente muito maior que o da célula, e podem ser únicos ou múltiplos, polares (apenas nas
extremidades) ou peritríquios (em todo corpo bacteriano). Embora os flagelos não possam ser
visualizados, normalmente, no microscópio óptico, existem técnicas de coloração que os
tornam visíveis no microscópio óptico e os microbiologistas usam como auxílio no diagnóstico.

Durante a identificação de uma bactéria, a avaliação da motilidade pode ser utilizada para
diferenciar espécies de bactérias. Exemplo: Em uma cultura de fezes (coprocultura), a
presença de bactérias gram-negativas imóveis é indicativa de Shigella sp. e móveis de
Salmonella sp.

PILI E FÍMBRIAS
As fímbrias são estruturas filamentosas, que lembram fios de cabelo no lado de fora da
bactéria, compostas por subunidades proteicas (pilina), que se projetam a partir da superfície
de uma célula e, geralmente, estão em maior quantidade do que os flagelos. As fímbrias
auxiliam na colonização das membranas de mucosas como ocorre no caso da Neisseria
gonorrhoeae, agente causador da gonorreia e, no caso da E. coli, nas células do trato urinário.
Os pili sexuais de uma bactéria se ligam a outras bactérias permitindo a transferência de
material genético na conjugação bacteriana. Esse pili sexuais são codificados por um
plasmídeo.

ESPOROS (ENDOSPOROS)
Produzidos por alguns gêneros de bactérias, como Bacillus e Clostridium, os esporos são uma
estrutura resistente a agentes físicos e químicos, que é formada em resposta ao meio
ambiente, quando este se torna inadequado para a sobrevivência da bactéria (ex.: escassez de
água ou nutrientes). A resistência da forma esporulada possibilita que a bactéria sobreviva por
longos anos em ambientes desfavoráveis, podendo reverter à forma vegetativa quando o local
se tornar viável novamente para sua sobrevida. Cada célula forma um único esporo, que é
liberado quando a bactéria morre.
FATORES DE VIRULÊNCIA E
PATOGENICIDADE DE BACTÉRIAS

FASES DE CRESCIMENTO E FATORES QUE

AFETAM O CRESCIMENTO BACTERIANO
As bactérias, quando inoculadas em meio de cultura adequado e em condições apropriadas,
iniciam processo de duplicação bacteriana, no qual por divisão binária, ocorre aumento da
população de forma logarítmica. O tempo de geração, ou seja, o tempo necessário para que
uma bactéria se duplique varia de acordo com a espécie bacteriana, podendo ser
extremamente curto (E. coli ± 15 minutos) ou bastante longo (M. tuberculosis ± 932 minutos).

 SAIBA MAIS

Para uma cultura de micobactéria ser considerada negativa, temos que esperar, no mínimo, 45
dias de incubação e não ser visualizado nenhum crescimento.

Compreender que o crescimento bacteriano em um meio de cultura apresenta 4 fases, cada

uma com suas características peculiares, é de extrema importância para a escolha do meio de
cultura ideal e das técnicas para isolar e identificar as bactérias em uma rotina laboratorial.
Vamos conhecer essas fases?

Fonte: Wikimedia

FASE LAG
FASE LOGARÍTMICA (FASE LOG OU EXPONENCIAL)
FASE ESTACIONÁRIA OU FASE PLATÔ
FASE DE DECLÍNIO OU MORTE

FASE LAG
Quando bactérias são adicionadas a um meio de cultura (semeadas), elas necessitam de um
tempo para se adaptar ao novo ambiente antes de começar a se dividir. Neste momento, não
há reprodução e a população permanece temporariamente inalterada. É importante ressaltar
que, nesta fase, as células não estão em latência, uma vez que aumentam no tamanho e
fisiologicamente estão muito ativas.

FASE LOGARÍTMICA (FASE LOG OU EXPONENCIAL)

Nesta fase, as células iniciam a divisão que ocorre de forma exponencial, regular e constante.
A velocidade de crescimento é máxima nesta fase, e varia de acordo com a cepa e com as
condições ambientais.

FASE ESTACIONÁRIA OU FASE PLATÔ

Em determinando momento do crescimento bacteriano, haverá carência de nutrientes e

produção de substâncias tóxicas no meio, dessa forma, o número absoluto de bactérias no
meio de cultura permanecerá constante, resultado do equilíbrio entre bactérias que ainda estão
se duplicando e bactérias que estão morrendo.

FASE DE DECLÍNIO OU MORTE

Etapa que ocorre morte bacteriana, pois há falta de nutrientes e de espaço, aliada à toxidez do
ambiente que levam os microrganismos a morrerem mais rápido do que produzirem novas
células (a morte bacteriana nesta fase se dará de forma exponencial ou logarítmica). Sendo
assim, há uma progressiva morte celular até a cultura se tornar estéril.

FATORES AMBIENTAIS QUE AFETAM O

CRESCIMENTO BACTERIANO
Além de nutrientes apropriados, é necessário conhecer as condições físicas ambientais ideais
para o crescimento bacteriano em meio de cultura. Dentre estes, os principais fatores são:

TEMPERATURA

A temperatura ótima de crescimento é aquela que possibilita o maior crescimento, durante o

menor tempo e varia para cada gênero. As bactérias, no geral, são classificadas de acordo
com sua temperatura ótima de crescimento em:

BACTÉRIAS PSICRÓFILAS
Crescem melhor de 12°C e 20°C.

BACTÉRIAS MESÓFILAS
Crescem melhor de 25°C a 40°C. Neste grupo, está a maioria dos patógenos bacterianos de
importância clínica, já que nesta faixa encontra-se a temperatura do corpo humano.

BACTÉRIAS TERMÓFILAS
Crescem melhor de 45°C a 60°C.

 SAIBA MAIS

A temperatura de crescimento também pode ser usada durante a identificação bacteriana.

Exemplo: A N. gonorrhoeae e N. Meningitis não crescem na temperatura de 22°C, mas as
outras espécies de Neisseria sp. são capazes de crescer.

OXIGÊNIO

As bactérias podem ser divididas de acordo com a necessidade e a tolerância ao oxigênio:

BACTÉRIAS AERÓBIAS ESTRITAS
Só crescem na presença de oxigênio. Ex.: Acinetobacter sp.

BACTÉRIAS ANAERÓBIAS FACULTATIVAS

Crescem tanto na presença quanto na ausência de oxigênio. Ex.: E. coli.

BACTÉRIAS MICROAERÓFILAS
Só crescem em ambiente contendo baixas concentrações de oxigênio (menores que as
encontradas no ar atmosférico). Ex.: Campylobacter sp.

BACTÉRIAS ANAERÓBIAS ESTRITAS

Só conseguem crescer na ausência de oxigênio. Em contato com O2, o crescimento dessas
bactérias é inibido ou ocorre morte bacteriana. Ex.: Clostridium botulinum e Neisseria sp.

 SAIBA MAIS

Quanto às espécies de Neisseria, o ideal é semear imediatamente após a coleta em meio

sólido, levar para a estufa 36 °C em jarra com vela ou com gerador de CO2 e umidade.

PH

Normalmente, a grande maioria das bactérias cresce bem em meios com pH neutro, em torno
de 6,5 a 7,5, apesar de muitas espécies tolerarem variações de pH entre 4,0 e 9,0. Os meios
de cultura geralmente são tamponados para impedir mudanças bruscas de pH, decorrentes do
próprio metabolismo das bactérias.

PRESSÃO OSMÓTICA
A pressão osmótica é a pressão que deve ser exercida sobre um sistema para evitar que a
passagem de água por osmose, ou seja, para o meio mais concentrado ocorra. A parede
celular, além da rigidez, impede a entrada excessiva de água. Dessa forma, a pressão
osmótica dos meios de cultura pode afetar diretamente a viabilidade das bactérias. Meios de
cultura com pressões osmóticas menores comparado ao interior da bactéria, normalmente, não
afetam sua viabilidade. De forma diferente, meios de cultura com pressões osmóticas maiores
causam perda de água intracelular, trazendo efeito bacteriostático ou bactericida.

BACTERIOSTÁTICO

Bacteriostáticos são substâncias que inibem o crescimento e a reprodução bacteriana

sem provocar sua morte imediata, sendo reversível o efeito, uma vez retirada a droga.

BACTERICIDA

Bactericidas são substâncias capazes de matar ou lesar irreversivelmente as bactérias.

 SAIBA MAIS

Halofismo - Certas bactérias isoladas de salmouras, pacotes de sal, alimentos e água do mar,
chamadas bactérias halofílicas ou halófitas obrigatórias, crescem apenas quando o meio
contém uma concentração inusitadamente elevada de sal (10% a 15%). Isto representa uma
resposta especial do microrganismo à pressão osmótica.

VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. (ADAPTADA DE IF RS -2018). AS POPULAÇÕES BACTERIANAS
SEGUEM UMA SÉRIE DE FASES DE CRESCIMENTO: LAG, LOGARÍTMICA
OU EXPONENCIAL, ESTACIONÁRIA E DE DECLÍNIO OU MORTE
CELULAR. ANALISE AS ASSERTIVAS ABAIXO:

I. A POPULAÇÃO REDUZ SEGUINDO TAXA LOGARÍTMICA.

II. OCORRE AUMENTO EXPONENCIAL DA POPULAÇÃO.
III. HÁ INTENSA ATIVIDADE DE PREPARAÇÃO PARA O CRESCIMENTO
POPULACIONAL, MAS SEM AUMENTO DA POPULAÇÃO BACTERIANA.
IV. AS MORTES MICROBIANAS SÃO EQUILIBRADAS PELA PRODUÇÃO
DE NOVAS CÉLULAS.

ASSINALE ÚNICA ALTERNATIVA CORRETA QUE RELACIONA

CORRETAMENTE AS ASSERTIVAS I, II, III E IV. COM AS FASES LAG, LOG,
ESTACIONÁRIA E DE MORTE CELULAR:

A) Declínio (I), Log (II), Lag (III), Estacionária (IV)

B) Estacionária (I), Lag (II), Log (III), Declínio (IV)

C) Estacionária (I), Log (II, Lag (III), Declínio (IV)

D) Declínio (I), Lag (II), Log (III), Estacionária (IV)

2. APRENDEMOS QUE A CITOLOGIA BACTERIANA PREVÊ ALGUNS

COMPONENTES BACTERIANOS COMO OBRIGATÓRIOS E OUTROS
COMO ELEMENTOS ACESSÓRIOS, PODENDO OU NÃO ESTAR
PRESENTES EM ALGUNS GRUPOS DE BACTÉRIAS E QUE,
FREQUENTEMENTE, ESTÃO ASSOCIADOS À VIRULÊNCIA,
PATOGENICIDADE, MOTILIDADE, ENTRE OUTRAS FUNÇÕES. ASSINALE
A AFIRMATIVA ABAIXO QUE CONTENHA APENAS EXEMPLOS DE
ELEMENTOS ACESSÓRIOS BACTERIANOS.

A) Parede Celular, Ribossomos, Glicocálice e Fímbrias sexuais.

B) Glicocálice, Plasmídeos, Flagelos e Ribossomos.

C) Plasmídeos, Grânulos citoplasmáticos, Citoplasma e Endosporos.

D) Pili, endósporos, Plasmídeos e Glicocálice.

GABARITO

1. (Adaptada de IF RS -2018). As populações bacterianas seguem uma série de fases de

crescimento: lag, logarítmica ou exponencial, estacionária e de declínio ou morte celular.
Analise as assertivas abaixo:

I. A população reduz seguindo taxa logarítmica.

II. Ocorre aumento exponencial da população.
III. Há intensa atividade de preparação para o crescimento populacional, mas sem
aumento da população bacteriana.
IV. As mortes microbianas são equilibradas pela produção de novas células.

Assinale única alternativa CORRETA que relaciona corretamente as assertivas I, II, III e
IV. com as fases lag, log, estacionária e de morte celular:

A alternativa "A " está correta.

A fase em que a população é reduzida de forma logarítmica – declínio. A fase de aumento

exponencial da população – log. A fase de preparação para o crescimento populacional, mas
sem aumento da população é a lag. A fase onde ocorre equilíbrio entre as mortes microbianas
e a produção de novas células é a estacionária.

2. Aprendemos que a citologia bacteriana prevê alguns componentes bacterianos como

obrigatórios e outros como elementos acessórios, podendo ou não estar presentes em
alguns grupos de bactérias e que, frequentemente, estão associados à virulência,
patogenicidade, motilidade, entre outras funções. Assinale a afirmativa abaixo que
contenha apenas exemplos de elementos acessórios bacterianos.

A alternativa "D " está correta.

Dentre os elementos acessórios estudados neste módulo, temos: plasmídeos, grânulos

citoplasmáticos, fímbrias, glicocálice, esporos e flagelos. Já os componentes obrigatórios,
temos: as membranas celulares, a parede celular (exceção dos micoplasmas), material
genético e ribossomos.

MÓDULO 2
 Reconhecer os tipos de meios de cultura, bem como os testes de sensibilidade aos
antimicrobianos

MEIOS DE CULTURA: COMPOSIÇÃO E

CLASSIFICAÇÃO
Os meios de cultura são capazes de fornecer os nutrientes necessários para o crescimento e
desenvolvimento de microrganismos fora do seu habitat natural. Os meios de cultura
apresentam em sua composição diferentes macronutrientes (carbono, oxigênio, nitrogênio,
enxofre, fósforo e hidrogênio) e micronutrientes (ferro, zinco, manganês, cálcio, potássio, sódio,
cobre, cloro, cobalto, molibdênio, selênio, magnésio, entre tantos outros), necessários à síntese
biológica de novos organismos. Nos laboratórios clínicos, os meios de cultivo podem ser
comprados totalmente prontos ou então serem preparados.
Fonte: angellodeco/Shutterstock

MEIO DE CULTURA

É qualquer substância, sólida, semissólida ou líquida que possua um conjunto de fontes

de nutrientes e que seja utilizada para o cultivo de microrganismos.

Após a coleta de uma amostra biológica, destinada para a cultura e/ou antibiograma, essa será
semeada em meios de culturas capazes de suprir as bactérias com as exigências nutricionais
mínimas, dentro das condições ambientais necessárias para o cultivo, possibilitando o
crescimento microbiano e a formação e visualização de colônias.

Durante a semeadura de uma amostra biológica, por exemplo, o líquor, em casos de suspeita
de meningite, deve-se conhecer os principais agente etiológicos dessa doença para escolher
os meios apropriados (com nutrientes específicos e pH), as condições ideais de crescimento,
como a presença e quantidade de oxigênio ou até mesmo a sua ausência. Todos esses
aspectos são essenciais para auxiliar na identificação bacteriana e na conclusão diagnóstica.

Vamos juntos conhecer um pouco mais sobre a classificação dos meios de culturas.
CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA

Os meios de cultura são classificados a partir do seu estado físico, da sua composição e do
seu objetivo de utilização.

Fonte: SomprasongWittayanupakorn/Shutterstock
 Microbiologista cultivando bactéria em uma placa de Petri contendo meio de cultura.

1) DE ACORDO COM O SEU ESTADO FÍSICO:

Você provavelmente já preparou gelatina na sua casa, correto? Lembra da sua consistência?

Para obtermos diferentes consistências nos meios de cultura, adicionamos ágar-ágar, um

polissacarídeo complexo obtido de alga marinha vermelha e que atua como agente
solidificante, muito semelhante à maneira como a gelatina é utilizada na sua cozinha.

É válido lembrar que, para obtenção de um meio de cultura ideal contendo ágar, deve-se, após
sua adição, aquecer a solução para dissolver o ágar em água fervente até a solução ficar
homogênea. Entretanto, não devemos ferver ou aquecer a solução diversas vezes, pois
podemos provocar alteração no valor nutritivo, no percentual de água e outros parâmetros que
interferiam no crescimento.
Fonte: Yayah_Ai/Shutterstock

MEIOS SÓLIDOS

Obtidos a partir da adição de 1,0 g a 3,0 g % de ágar. A maioria dos microrganismos crescem
formando colônias. Ex: Ágar nutritivo.

 Exemplo de preparação de meio de cultivo sólido. Após preparo, autoclavagem, o meio é

depositado nas placas para solidificar, em ambiente estéril.
Fonte: MyFavoriteTime/Shutterstock

MEIOS SEMISSÓLIDOS

Obtidos, na maioria das vezes, após adição de 0,1 g a 0,7 g %”, separando o 0,7 de g. Dentre
as finalidades, temos a visualização da motilidade bacteriana ou, muitas vezes, servir como
base de meio de transporte. Ex: Meio SIM (meio de detecção da produção de enxofre,
motilidade e produção de indol) e Cary & Blair.

 Exemplo de Meio semi-sólido (SIM) mostrando uma bactéria que não apresenta motilidade.
Fonte: NonSitth/Shutterstock

MEIOS LÍQUIDOS

Não apresentam ágar, são conhecidos como “caldos” e utilizados para ativação das culturas,
repiques de microrganismos, provas bioquímicas, dentre outros. Ex: caldo tetrationato e
selenito-cistina para cultivo de salmonelas, caldo tioglicolato para Clostridium perfringens.

 Meios de culturas líquidos

2) DE ACORDO COM A COMPOSIÇÃO QUÍMICA

MEIOS QUIMICAMENTE DEFINIDOS

MEIOS COMPLEXOS

MEIOS QUIMICAMENTE DEFINIDOS

A composição química de todos os seus constituintes é conhecida (definidos). Ex: Meio AR-
103.

MEIOS COMPLEXOS

A exata constituição do meio de cultura não é conhecida. Esses meios apresentam em sua
composição soro, sangue, extratos moídos ou digeridos de órgãos animais (corações, fígados,
cérebros), peixes, leveduras, e vegetais ou outro componente que não se tem total
conhecimento da composição química. Ex: Ágar sangue.

3) DE ACORDO COM O OBJETIVO DA UTILIZAÇÃO

MEIOS ENRIQUECIDOS OU RICOS

São os meios que contêm um grande suprimento de nutrientes pela adição de diversas
substâncias como sangue, soro, extratos de tecidos animais ou vegetais ao caldo ou até
mesmo ágar nutritivos, para permitir o crescimento de bactérias fastidiosas (nutricionalmente
exigentes), como Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp.

 EXEMPLO

O ágar-sangue (ágar nutriente com 5% de eritrócitos de carneiro) e o ágar-chocolate (ágar

nutriente com hemoglobina em pó) são exemplos de meios enriquecidos utilizados de forma
rotineira nos laboratórios de bacteriologia clínica.
Fonte: Jarun Ontakrai/Shutterstock
 Colônias de bactérias crescidas em meio ágar sangue

MEIOS SELETIVOS

São meios que apresentam em sua composição substâncias químicas específicas (inibidores)
adicionadas ao caldo ou ao ágar nutritivo que previnem o crescimento de um determinado
grupo de bactérias. É importante ressaltar que os inibidores atuam em um grupo específico de
bactéria, favorecendo apenas o crescimento da bactéria de interesse.

 EXEMPLO

O ágar MacConkey é um meio seletivo pois tem em sua composição sais biliares e cristais
violeta que inibe o crescimento da maioria das bactérias gram-positivas, permitindo o
crescimento apenas das bactérias gram-negativas.

MEIOS DIFERENCIAIS OU INDICADORES

Contêm certos reagentes ou substâncias no meio que permitem a distinção de diferentes tipos
de bactérias.

 EXEMPLO

O Ágar MacConkey, além de um meio de cultura seletivo, é, frequentemente, utilizado para

diferenciar bacilos gram-negativos isolados de amostras fecais. As bactérias gram-negativas
que fermentam a lactose (um ingrediente do ágar MacConkey) produzem colônias rosas
(Figura 7A), como E. coli, enquanto aquelas incapazes de fermentar a lactose produzem
colônias incolores e amarelas (Figura 7B), como Acinetobacter baumanii.

COLÔNIAS ROSAS

Bactérias gram-negativas que fermentam a lactose crescem produzindo colônias rosas.

Fonte: NonSitth/Shutterstock
Fonte: REJO JACOB JOSEPH/Shutterstock
 Figura 7 - Diferença da coloração das colônias de bactérias gram-negativas fermentadoras
e não fermentadoras de lactose em Agar MacConkey.

Agora que você conheceu esse meio de cultura, imagina por que temos essa diferença?

Como mencionado anteriormente, a lactose é um nutriente presente no Ágar MacConkey e,

além desse nutriente, o meio apresenta um indicador de pH (que permite a alteração da
coloração do meio de acordo com o pH). Bactérias que são capazes de metabolizar a lactose
produzem ácidos mistos que alteram o pH do meio que fica com uma cor rosa/ avermelhado.
De forma diferente, as bactérias que não fermentam a lactose, utilizam como fonte de energia a
peptona. A peptona, ao ser metabolizada, produz amônia, que eleva o pH do meio e torna as
colônias e o meio amarelados/ sem cor.

 EXEMPLO

Outro exemplo de meio seletivo é o ágar manitol salgado. Esse meio de cultivo é composto de
manitol e alta concentração de sal (7,5% de NaCL). Na rotina laboratorial ele é utilizado para o
isolamento de Staphylococcus aureus a partir de diferentes amostras biológicas. Todas as
espécies de Staphylococcus são capazes de crescer nesse meio, mas o S. aureus é capaz de
fermentar o manitol presente no meio, produzindo ácido, que torna o meio e as colônias
amareladas. As outras espécies de estafilococos, como os Staphylococcus epidermidis e o
Bacillus subtillis não metabolizam o manitol, apresentando assim colônias brancas.
Fonte: OneMashi/Shutterstock
 S.aureus e S.epidermidis cultivadas em ágar manitol.

MEIOS DE TRANSPORTE

Geralmente, são semissólidos e possuem o mínimo de nutrientes para a manutenção das

bactérias, durante o tempo de transporte, sem que estas se reproduzam ou acidifiquem o meio.
Atualmente, para auxiliar na coleta de algumas amostras biológicas destinadas à cultura e à
antibiograma, como secreções vaginais, é utilizado um Swab. Após a coleta, eles são
armazenados em um tubo que contém o meio de transporte (ex: meio Stuart – permite uma
boa conservação de bactérias patogênicas como Salmonella spp. e Shigella spp.)

SWAB
 Fonte: MedstockPhotos/Shutterstock
 Swab com meio de transporte que pode ser usado para coleta de amostras de
secreção vaginal.

TESTE DE SENSIBILIDADE AOS

ANTIMICROBIANOS (TSA)
Uma tarefa importante do laboratório de microbiologia clínica é a realização de testes de
sensibilidade aos antimicrobianos a partir de isolados bacterianos. Os objetivos dos testes são
detectar uma possível resistência aos antibióticos em patógenos comuns, nortear a escolha do
antibiótico mais adequado a fim de predizer o sucesso do esquema terapêutico para infecções
específicas.

Os testes usados incluem macrodiluição em tubos, microdiluição em caldo e o método de disco

difusão. O método de disco difusão fornece flexibilidade e apresenta baixo custo. Cada método
tem pontos fortes e fracos, incluindo organismos que podem ser testados com precisão pelo
método. Alguns métodos fornecem resultados quantitativos (por exemplo, concentração
inibitória mínima) e todos fornecem avaliações qualitativas usando as categorias de suscetível,
intermediário ou resistente.

Fonte: aslysun/Shutterstock

Em geral esses métodos são recomendados para ajudar a direcionar o tratamento do paciente.
É importante ressaltar que a detecção precisa dos mecanismos de resistências das bactérias
são utilizados para fins epidemiológicos e medidas de contenção destas bactérias resistentes.

Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (2008): o TSA é sempre realizado na

avaliação das seguintes bactérias:

Enterobactérias

Pseudomonas spp.

Acinetobacter spp.

Staphylococcus spp.

Enterococcus spp.

Streptococcus pneumoniae

Streptococcus do grupo viridans e beta-hemolítico

 Haemophilus influenzae

Complexo Burkholderia cepacia

Stenotrophomonas maltophilia

Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis

 ATENÇÃO

A padronização das etapas relacionadas à realização dos TSA (da escolha dos antibióticos até
a interpretação dos resultados) é feita por organizações especializadas, que elaboram
documentos, os quais apresentam com riqueza de detalhes como realizar e interpretar os
testes de sensibilidade. Tais organizações são:

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, EUA)

European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST, Europa)

Brazilian Committee on Antimicrobial Susceptibility testing (BrCAST, Brasil)

British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC, Reino Unido)

Comité de L’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA-SFM, França)

A seguir, verificaremos as diferentes técnicas empregadas na realização dos TSA, trazendo

algumas de suas vantagens e desvantagens.

Independentemente da técnica escolhida pelo laboratório de microbiologia, todas as etapas

devem ser rigorosamente controladas. O bom emprego do controle de qualidade é a melhor
forma de garantir a confiabilidade e reprodutibilidade dos resultados. Além disso, deve ser feito
seguindo as normas de biossegurança.
MACRODILUIÇÃO EM TUBOS

Um dos primeiros testes de susceptibilidade antimicrobiana desenvolvido foi a macrodiluição

em tubos. Este procedimento envolve:

Preparar diluições seriadas de antimicrobianos (por exemplo, 1, 2, 4, 8 e 16

microgramas/mL) em meio de cultura líquido.

Inocular os tubos contendo antimicrobianos com uma suspensão bacteriana padronizada

em torno de 5 X 105 UFC (Unidade Formadora de Colônia ) /mL.

Incubar por de 18 a 24 horas, a 35°C.

Examinar a presença de turbidez, que evidencia o crescimento microbiano. O primeiro

tubo da série que apresentar aparência límpida (sem turbidez) representa a concentração
inibitória mínima (CIM ou MIC).

CIM OU MIC

A sensibilidade dos microrganismos aos antimicrobianos é representada pela

concentração inibitória mínima (CIM ou MIC) de cada microrganismo para cada
antimicrobiano, que corresponde à menor concentração do antimicrobiano capaz de inibir
o desenvolvimento visível do microrganismo.
Fonte: ANVISA
 Macrodiluição em tubos. Nesse exemplo está ilustrado um antibiótico testado nas
concentrações 0, 0,25, ,0,5, 1, 2 4 e 8 µg/mL.

A vantagem da macrodiluição em tubo é a geração de um resultado quantitativo (CIM ou MIC).

As desvantagens correspondem ao trabalho manual que leva a possibilidade de erros durante
o preparo de soluções de antibióticos para cada antibiótico testado, a quantidade relativamente
grande de reagentes e o espaço necessário para cada teste.

MICRODILUIÇÃO EM CALDO

A técnica de microdiluição em caldo é a técnica de macrodiluição, realizada em placas estéreis

de 96 poços. Essa adaptação tornou esse teste mais prático e popular. A seguir, o passo a
passo desta técnica:

PASSO 1
PASSO 2
PASSO 3
PASSO 4
PASSO 1

Preparar diluições seriadas de antimicrobianos (até 8 diluições logarítmicas) de até 12

antimicrobianos.

PASSO 2

Inocular as bactérias a serem testadas obtendo-se uma concentração bacteriana final de

aproximadamente 5 x 104 - 105 UFC/mL por poço.

PASSO 3

Incubar as placas (também chamadas de painéis) de microdiluição a 35 ± 2ºC por 18 a 24

horas (dependendo do gênero bacteriano e do antimicrobiano testado).

PASSO 4

Realizar a leitura da placa visualmente e, de preferência, com luminosidade ambiente, para

facilitar a leitura, observando a turbidez.

 SAIBA MAIS

Poucos laboratórios de microbiologia clínica preparam suas próprias placas. Normalmente, os

laboratórios compram painéis, com os antibióticos já liofilizados ou congelados nas diluições
necessárias, de fornecedores comerciais. Além disso, alguns laboratórios clínicos utilizam a
metodologia automatizada, que realiza essa análise através do MIC.

Vantagens do procedimento de microdiluição incluem a geração de um resultado quantitativo

(CIM ou MIC), a reprodutibilidade dos resultados, a conveniência de poder utilizar painéis pré-
preparados, e a economia de reagentes e espaço que ocorre devido à miniaturização do teste.
A geração de relatórios computadorizados também é possível se um leitor de painel for
utilizado. A principal desvantagem do método de microdiluição é a inflexibilidade das seleções
de drogas disponíveis em painéis comerciais padrão, além do custo de cada placa de
microdiluição.

PROVA DE SENSIBILIDADE COM DISCOS DE

PAPEL EM MEIO SÓLIDO

O teste de disco-difusão em ágar, também chamado de técnica de Kirby-Bauer em

homenagem aos microbiologistas que descreveram este teste em 1966, é um dos métodos de
sensibilidade mais simples, prático, confiável e mais utilizado nos laboratórios de microbiologia,
fornecendo resultados qualitativos. A seguir, o passo a passo desta técnica.

Fonte: eczserapyilmaz/Shutterstock
 Teste de disco-difusão em ágar.

TÉCNICA
 Toda a etapa deve ser realizada de forma estéril, seguindo as normas de biossegurança
do laboratório.

Fonte do protocolo da técnica: (adaptado do NCCLS ‘M2-A8—Performance Standards for

Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard—Eighth Edition (ISBN 1-
56238-485-6). Cópias da atual edição podem ser obtidas no seguinte endereço: NCCLS,
940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898, USA):

Vamos ao passo a passo:

Método do crescimento

PASSO 1
Após crescimento em placa de ágar (24 horas), selecionar de três a cinco colônias, bem
isoladas, do mesmo tipo morfológico. A superfície de cada colônia é tocada com uma alça, e os
microrganismos são transferidos para um tubo contendo 4-5 mL de NaCL 0,9% (salina) estéril.

PASSO 2
Incuba-se a cultura na salina até alcançar a turbidez de uma solução padrão de McFarland
0,5.

DEFINIÇÃO DE ESCALA DE MACFARLAND:

Escala de nefelométrica de turvação. Essa é uma escala que possibilita verificar a

concentração bacteriana pela intensidade de turvação do meio. Quanto maior a turvação
do meio, maior a concentração bacteriana, maior opacidade e mais difícil é a passagem
de luz.

Essa escala é composta de 11 tubos numerados de 0,5 a 10, onde o tubo 0,5 (indica uma

concentração bacteriana de 1,0 a 2,0 x 108 colônias/mL. e o tubo 10 -30 x 108

colônias/mL). Ao preparar uma suspensão de bactérias para realização do antibiograma é
feito a comparação visual com os tubos padrão da escala. A leitura é feita a olho nu
utilizando um cartão de fundo branco com linhas pretas no fundo, ou então através de um
espectrofotômetro.
 Fonte: Imagem adaptada
 Escala de MacFarland. Imagem adaptada.

Inoculação das placas de teste

PASSO 1
Após a preparação da suspensão bacteriana, mergulha-se um swab de algodão estéril na
suspensão. Essa etapa deve ser realizada em até 15 minutos após ajustar a turbidez da
suspensão. O swab deve ser girado várias vezes e apertado firmemente contra a parede
interna do tubo, acima do nível do líquido, o que ajuda a retirar qualquer excesso de inóculo no
swab.

PASSO 2
A superfície da placa de ágar Müeller-Hinton é inoculada esfregando o swab em toda a
superfície estéril do ágar. Repete-se o procedimento esfregando outras duas vezes, girando a
placa aproximadamente 60° cada vez, a fim de assegurar a distribuição uniforme do inóculo.
Após a distribuição, passa-se um swab na margem de toda a placa de ágar, completando pelo
menos uma volta completa.

PASSO 3
A tampa pode ser deixada entreaberta de três a cinco minutos de maneira a permitir que
qualquer excesso de umidade seja absorvido antes de se aplicar os discos impregnados de
droga. No entanto, a placa não pode ultrapassar 15 minutos aberta.

Devemos evitar inóculos com alta concentração de bactérias. Nunca devemos usar culturas em
caldo, não diluídas, do dia anterior, ou outros inóculos não padronizados para semear nessas
placas.

ÁGAR MÜELLER-HINTON

Meio de cultura preconizado para os testes de sensibilidade da maioria das bactérias de

interesse médico.

Aplicação de discos a placas de ágar inoculadas

PASSO 1
O conjunto de antibióticos é previamente definido. Esses são discos de papeis de filtros
impregnados com concentrações definidas de antibióticos. Os discos de antibióticos são
colocados na superfície de placa de ágar anteriormente semeada, com auxílio de uma pinça ou
com um dispensador. Ao ser colocado, cada disco deve ser pressionado de maneira a
assegurar o contato completo do disco com a superfície de ágar. Os discos devem ser
distribuídos mantendo a distância entre os centros de pelo menos 24 mm. Em geral, deve-se
colocar 12 discos, no máximo, em uma placa de 150 mm, ou cinco discos em uma placa de
100 mm.

Algumas drogas difundem-se quase instantaneamente quando em contato com o meio. O disco
não deve ser reaplicado após ter entrado em contato com a superfície de ágar. Em vez disso,
coloque um novo disco em outra parte da placa.

PASSO 2
As placas devem ser invertidas e colocadas em uma estufa, a 35° C, até 15 minutos após a
aplicação dos discos. No entanto, no caso das cepas de Haemophilus spp., N. gonorrhoeae e
dos estreptococos, as placas não devem ser incubadas em atmosfera enriquecida com CO2,

porque os padrões de interpretação foram estabelecidos usando incubação em ar ambiente, e

o CO2 irá alterar significativamente o tamanho dos halos de inibição de alguns antibióticos.

Leitura das placas e interpretação dos resultados

PASSO 1
A leitura é realizada após 18 a 24 horas de incubação. Inicialmente, analisamos a superfície da
placa para verificar se a semeadura foi satisfatória. Em seguida, os halos (diâmetros) devem
ser medidos, em milímetros, com auxílio de paquímetro ou uma régua. Para isso, a placa deve
ser invertida, e a régua ou o paquímetro apoiado na parte de trás da placa. As medidas devem
ser feitas contra uma fonte luminosa.

FONTE LUMINOSA

Normalmente, o teste de sensibilidade das espécies de estreptococos é feito adicionando

sangue à base de ágar Müeller-Hinton . Nesse caso, os halos deverão ser medidos a
partir da superfície superior do ágar iluminada com luz refletida, uma vez retirada a
tampa. E não confundir o halo de hemólise, característico nessas bactérias com halo de
inibição.

Se a placa foi satisfatoriamente semeada, e o inóculo era correto, os halos de inibição

resultantes serão uniformemente circulares e haverá um tapete confluente de
crescimento. Se colônias individuais forem aparentes, o inóculo era demasiado leve e o
teste deverá ser repetido.

O halo de inibição é a área sem crescimento detectável a olho nu.

Cuidado:

O crescimento de pequenas colônias, detectável apenas com lente de aumento, na

margem do halo de inibição do crescimento deve ser ignorado.

Crescimento discreto de colônias dentro de um halo de inibição, o teste deverá ser

repetido com uma cultura ou subcultura pura de uma única colônia, isolada da placa de
cultura primária. Se pequenas colônias continuarem a crescer no halo de inibição, o halo
de inibição livre de colônias deve ser medido.

PASSO 2
Com a medida de cada halo (diâmetro) a bactéria testada é classificada, como sensível,
intermediário, ou resistente em relação aos agentes antimicrobianos testados, usando como
comparação o tamanho dos halos preconizados pelas organizações internacionais (CLSI,
BSAC e BrCAST).

Vantagens desse método: Simplicidade do teste; não requer nenhum equipamento especial;
os resultados categóricos facilmente interpretados; flexibilidade na seleção de discos para
teste; baixo custo e de fácil execução.

Desvantagens: Teste manual, sem automação; não pode ser utilizado para verificar a
resistência a alguns microrganismos, pois falta padronização do método.

Exemplo: Para avaliar o perfil de sensibilidade do S. pneumoniae versus ceftriaxona, deve ser
feito o teste do MIC (quantitativo). De acordo com o CLSI (2018), esse método não pode ser
mais utilizado para verificar o perfil de sensibilidade da polimixina B nas bactérias gram
negativas, pois a polimixina apresenta baixa difusão no Agar, sendo preconizado a
microdiluição.

Qual é a acurácia aceitável de um teste de suscetibilidade?

Quando desejamos mediar a acurácia de um novo método de suscetibilidade, é importante

testar um número representativo de cepas bacterianas resistentes a diferentes antibióticos e de
cepas suscetíveis no novo método de suscetibilidade e no método padronizado. A partir desses
resultados, conseguimos comparar e verificar se o método em estudo é capaz de detectar as
bactérias que são verdadeiramente resistentes e sensíveis e determinar a taxa de erros que
podem ser esperados em um ambiente de laboratório clínico.

O surgimento de novos mecanismos de resistências antimicrobianas, incluindo alguns que

podem ser difíceis de detectar (por exemplo, susceptibilidade intermediária à vancomicina em
S. aureus e produção de carbapenemase em alguns organismos gram-negativos) requer que
o desempenho dos dispositivos de susceptibilidade seja constantemente reavaliado e
atualizado quando necessário.

ACURÁCIA

Refere-se ao grau em que o teste é capaz de determinar o verdadeiro valor do que está
sendo medido.
 CARBAPENEMASE

Enzimas capazes de clivar os antibióticos da classe carbapenêmicos. Em infecções por

bactérias gram-negativas resistentes à grande maioria dos antibióticos, os antibióticos
carbapenêmicos (Imipinem e Meropenem) representam a única escolha para o
tratamento eficaz. No entanto, nos últimos anos, algumas bactérias adquiriram resistência
a esses antibióticos, diminuindo assim a possibilidade terapêutica e a necessidade de
busca de novas drogas e métodos rápidos de confirmação da resistência bacteriana.

TESTE DE SENSIBILIDADE NA PRÁTICA

VERIFICANDO O APRENDIZADO

1. APRENDEMOS QUE OS MEIOS DE CULTURA SÃO COMPOSTOS DE

NUTRIENTES NECESSÁRIOS PARA O CULTIVO DE MICRORGANISMOS E
PODEM SER CLASSIFICADOS COMO SÓLIDOS, SEMISSÓLIDOS OU
LÍQUIDOS. ALÉM DISSO, ALGUNS MEIOS CONTÊM SUBSTÂNCIAS
QUÍMICAS ESPECÍFICAS ADICIONADAS AO CALDO OU AO ÁGAR
NUTRITIVO QUE PREVINEM O CRESCIMENTO DE UM DETERMINADO
GRUPO DE BACTÉRIAS SEM AGIR SOBRE OUTRO. ESSES MEIOS DE
CULTURA SÃO CHAMADOS DE:

A) Diferenciais

B) Seletivos

C) Enriquecidos

D) De transporte

2. ESTUDAMOS QUE O ANTIBIOGRAMA PERMITE A IDENTIFICAÇÃO DA

SENSIBILIDADE DE BACTÉRIAS ISOLADAS A UM PAINEL DE
ANTIBIÓTICOS. EM RELAÇÃO AO TESTE DE SENSIBILIDADE DE DISCO-
DIFUSÃO EM ÁGAR, ASSINALE A AFIRMATIVA QUE CONTENHA UMA
VANTAGEM DESTE TESTE:
A) Pode ser feito de forma automatizada.

B) É um método quantitativo.

C) Flexibilidade quanto à escolha dos antimicrobianos.

D) Requer utilização de equipamentos especiais.

GABARITO

1. Aprendemos que os meios de cultura são compostos de nutrientes necessários para o

cultivo de microrganismos e podem ser classificados como sólidos, semissólidos ou
líquidos. Além disso, alguns meios contêm substâncias químicas específicas
adicionadas ao caldo ou ao ágar nutritivo que previnem o crescimento de um
determinado grupo de bactérias sem agir sobre outro. Esses meios de cultura são
chamados de:

A alternativa "B " está correta.

Meios seletivos são os que contém substâncias que inibem o desenvolvimento de

determinados grupos de microrganismos, permitindo o crescimento de outros.

2. Estudamos que o antibiograma permite a identificação da sensibilidade de bactérias

isoladas a um painel de antibióticos. Em relação ao teste de sensibilidade de disco-
difusão em ágar, assinale a afirmativa que contenha uma vantagem deste teste:

A alternativa "C " está correta.

O teste de sensibilidade de disco-difusão em ágar não pode ser feito de forma automatizada, é
um método qualitativo e não requer utilização de equipamentos especiais. Entretanto, permite
ao microbiologista uma ampla escolha de antibióticos a serem utilizados, proporcionando,
portanto, flexibilidade quanto à escolha.

MÓDULO 3
 Distinguir os métodos de visualização e coloração na prática laboratorial
INTRODUÇÃO
Vimos no módulo 1 que as características das células bacterianas, bem como sua morfologia,
são essenciais para entendermos e aplicarmos as técnicas de coloração bacterianas. No
entanto, uma vez que as bactérias são seres microscópios, não podemos enxergá-las a olho
nu, e necessitamos do auxílio dos microscópios:

Óptico – permitem aumentos de até 1000 vezes.

Eletrônicos – permitem aumentos de 10.000 vezes (varredura) e 1.000.000 vezes

(transmissão).

No dia a dia dos microbiologistas, a forma mais comum de se examinar os microrganismos é

utilizando técnicas associadas ao microscópio óptico.

Fonte: Konstantin Kolosov/Shutterstock

TODA BACTÉRIA PRECISA SER CORADA PARA

SER VISUALIZADA?
SIM NÃO

A RESPOSTA CORRETA É “NÃO”!

De uma maneira geral, as bactérias vivas podem ser observadas quanto à forma e
movimentos, a partir de material biológico em suspensão (uma gota) entre lâmina e
lamínula (sem formar bolha). Esta preparação é conhecida como a fresco e exige um
bom manuseio do microscópio por parte do microbiologista, uma vez que é necessário
fazer ajustes de intensidade da luz, regular bem o condensador, se possível empregar
filtros para uma melhora na qualidade da imagem a ser visualizada e, geralmente, utilizar
um microscópio de campo escuro.

CORRETO!

De uma maneira geral, as bactérias vivas podem ser observadas quanto à forma e
movimentos, a partir de material biológico em suspensão (uma gota) entre lâmina e
lamínula (sem formar bolha). Esta preparação é conhecida como a fresco e exige um
bom manuseio do microscópio por parte do microbiologista, uma vez que é necessário
fazer ajustes de intensidade da luz, regular bem o condensador, se possível empregar
filtros para uma melhora na qualidade da imagem a ser visualizada e, geralmente, utilizar
um microscópio de campo escuro.

E quando preferimos este tipo de preparo?

Quando nossa intenção é visualizar a mobilidade e a morfologia de bactérias espiraladas, as

quais sob fixação ficam distorcidas, ou até mesmo observar alterações na divisão celular e
formação de esporos.

Como é de se esperar, na preparação a fresco, por não utilizar corantes, as bactérias são
vistas sem cor (incolores), mesmos que estas sejam capazes de produzir cor quando
cultivadas em meios de cultura específicos. Para uma melhor visualização da morfologia e
citologia bacteriana, vários corantes passaram a ser utilizados e os microrganismos são
corados após os microrganismos serem fixados na lâmina (mortos), na maioria das vezes, pelo
calor, etapa chamada de fixação. A fixação permite que a bactéria fique aderida à lâmina e
evita que as bactérias sejam lavadas e perdidas durante a coloração. No entanto, antes da
etapa de fixação e coloração, devemos lembrar da importância da realização de um bom
esfregaço, que deve ser:

Pouco espesso

Bem homogêneo

Realizado em área de segurança biológica, a partir de um caldo ou material diluído em

solução salina, espalhado com alça bacteriológica em lâmina limpa e seca

 ATENÇÃO

Todas as manipulações devem ser feitas seguindo as normas de biossegurança e, de forma

estéril, para não haver contaminação das amostras e resultados falso positivos. Ao final, todos
os resíduos produzidos devem ser autoclavados antes de descartados.

As técnicas de coloração podem ser classificadas de acordo com o número de corantes

utilizados em:

Coloração simples: Quando utilizamos apenas um único corante para observar a

morfologia bacteriana;

Coloração diferencial: Quando utilizamos mais de um corante, além de mordentes e do

diferenciador para identificar diferenças entre grupos de bactérias. Dentre os métodos
(colorações) diferenciais, também chamados de seletivos, de maior importância dentro de
laboratórios de Microbiologia Clínica, temos os de Gram, de Ziehl-Neelsen e de Albert-
Laybourn. Além destes, destaca-se ainda o método de Fontana-Tribondeau, que,
embora não seja diferencial, ainda é utilizado por alguns microbiologistas. Também
existem métodos de coloração pouco utilizados, mas que podem ser úteis quando há
necessidade de evidenciar algumas estruturas bacterianas, como a coloração de flagelos,
esporos e cápsula.
 MORDENTE

Substância utilizada durante a fixação que tem a função de manter a durabilidade da

coloração.

COLORAÇÃO DE GRAM

Esta técnica foi desenvolvida em 1884, pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim
Gram, e é a mais utilizada em bacteriologia por permitir distinguir bactérias gram-positivas de
bactérias gram-negativas. Diferenças nas características químicas e estruturais das paredes
celulares, bem como na permeabilidade aos reagentes químicos nestes dois grupos de
bactérias levam a diferenças de coloração.

Fonte: Schira/Shutterstock
 Coloração de GRAM. À esquerda, bactérias gram-negativas. Á direita, bactérias gram-
positivas.

Como realizamos essa coloração? Vamos conhecer?

Na técnica de Gram, utilizamos:

 Corante básico (violeta genciana, cristal-violeta, metilvioleta).

Mordente (solução iodo-iodetada, conhecida como lugol) que aumenta a afinidade da

célula pelo primeiro corante utilizado (corante básico). Ocorre assim a ligação do corante
com o lugol e a formação de um composto roxo, insolúvel que cora o espaço
protoplasmático e a parede celular de roxo.

Agente descolorante (álcool a 95% ou álcool-acetona).

Nas bactérias gram-positivas, as quais o corante está fortemente retido devido à

espessa camada de peptideoglicanos, este não é facilmente removido pela ação
do agente descolorante.

Nas bactérias gram-negativas, nas quais o agente descolorante remove a

membrana externa da parede destas bactérias, e devido à fina camada de
peptideoglicanos, estas bactérias não conseguem reter o corante.

Segundo corante básico (safranina ou fucsina) que cora as bactérias gram-negativas,

recentemente descoradas, de vermelhas. As gram-positivas permanecem roxas.

 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal

Dessa forma, ao final da coloração de gram, as bactérias gram-positivas serão visualizadas no

microscópio com cor roxa e as gram-negativas com cor vermelha. De uma forma geral, a
literatura científica evidencia que, geralmente, os cocos de importância médica são gram-
positivos (exceção do gênero Neisseria), e os bastonetes gram-negativos (exceção dos
gêneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus e Clostridium).

 ATENÇÃO

É muito importante a utilização de culturas jovens para evitar resultados falsos.

A COLORAÇÃO DE GRAM NA PRÁTICA

COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
No módulo 1, você aprendeu que existem bactérias cuja parede celular fogem da classificação
como gram-positivas e gram-negativas, pois possuem acima da camada de peptideoglicanos,
uma camada denominada Micolato Arabinogalactano, formada por polímeros de
arabinogalactano (açúcares) e revestida por uma porção lipídica de ácidos micólicos. Esta
constituição torna a parede celular hidrofóbica, dificultando a penetração de corantes aquosos,
bem como a ação do lugol e, portanto, impedindo a identificação e a diferenciação desse tipo
de bactéria através da coloração de Gram.

Entretanto, em 1882, um bacteriologista chamado Franz Ziehl e um patologista alemão

Friedrich Carl Adolf Neelsen, evidenciaram que alguns gêneros bacterianos, como
Micobacterium e Nocardia são capazes de resistir a descoloração com uma solução de álcool-
ácido, após tratamento com fucsina fenicada aquecida, de forma que permanecem vermelhas,
diferentemente de outras bactérias, que, por não possuírem esta propriedade, apresentam a
cor do corante de fundo, normalmente, feita com azul de metileno.

Fonte: Wikipedia
 Friedrich Carl Adolf Neelsen

Sendo assim, estes gêneros receberam a denominação de BAAR (Bacilos-Álcool-Ácido-

Resistente), e esta capacidade de álcool-ácido-resistência está relacionada à hidrofobicidade
da parede celular, assegurada pela presença de lipídeos como o ácido micólico. Quanto à
coloração, esta ficou conhecida como coloração de Ziehl-Neelsen.

Como realizamos essa coloração? Vamos conhecer?

Na técnica de Ziehl-Neelsen, após a confecção do esfregaço, fixamos os esfregaços no calor.

Após este passo, é depositado a solução de fucsina de Zieel e aquecemos o corante até a
emissão de vapores (sem ferver), esse procedimento deve ser feito 3 vezes e deve durar até 5
minutos. Em seguida, lavamos a lâmina com água e realizamos a descoloração com solução
de álcool-ácido clorídrico a 1%. Na sequência, o esfregaço deve ser coberto com azul de
metileno, por meio minuto, a lâmina é lavada com água corrente e, após secar, está pronta
para ser observada no microscópio óptico (objetiva 100 X). Os BAAR serão visualizados como
bastonetes finos, vermelhos, sobre fundo corado em azul.

Fonte: Douglas Olivares/Shutterstock

 Bacilos (rosa) evidenciados pela coloração de Ziehl-Neelsen
em um paciente com tuberculose pulmonar avançada e AIDS, amostra escarro.

 SAIBA MAIS

A análise do escarro pela coloração de BAAR é um método simples, barato e muito importante
para o diagnóstico da tuberculose, pois confere um resultado precoce (quando realizado de
forma correta). Além disso, permite o acompanhamento a evolução do tratamento de pacientes
com essa doença. Pacientes com sinais e sintomas (febre vespertina, tosse persistente por
mais de 3 semanas, emagrecimento, com imagem no raio x) que apresentam bacilos gram-
negativos no escarro em amostras coradas pela ZH indicam a presença do M. tuberculosis. No
entanto, é importante destacar que outras micobactérias se coram por essa técnica e esse
método. Para diferenciar as espécies, é necessário cultura.

Essa técnica pode ser realizada em outras amostras, como: urina, líquidos pleurais, lavado
bronco alveolar, aspirado traqueal, biópsias e líquor.
COLORAÇÃO DE ALBERT-LAYBOURN
Algumas bactérias apresentam corpúsculos citoplasmáticos (corpúsculos metacromáticos ou
corpúsculos de Babes Ernst) nas suas extremidades e que podem ser corados pelo Lugol forte
(com cor marrom), em contraste com o corpo do bacilo, que se cora em esverdeado/azulado
pela solução de Laybourn. Esta técnica é uma técnica simples que foi sugerida em 1920 por
Henry Albert e, posteriormente, foi modificada por Ross Laybourn, em 1924.

Os corpúsculos citoplasmáticos são encontrados no gênero Corynebacterium diphtheriae,

agente causador de sintomas clínicos característicos da difteria. Desta forma, a pesquisa por
bacilos metacromáticos cuidadosamente coletados da oro e nasofaringe serve como um
método auxiliar no diagnóstico da difteria.

DIFTERIA

A difteria (ou crupe) é uma doença de origem bacterina, que acomete as amígdalas,
laringe, faringe, nariz, conjuntiva e pele, causando amidalite com o aparecimento de
placas bacterianas bem amareladas, dificuldades respiratórias e até mesmo parada
respiratória com óbito. Essa doença é causada pela bactéria Corynebacterium diphtheriae
e pode ser transmitida por meio das vias respiratórias ou então através de contato físico.
Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock
 Ilustração microscópica de Corynebacterium diphtheria.

Como é feita essa coloração?

Após a obtenção do esfregaço, este é corado com a solução de Albert-Layborn durante 5

minutos. Após esse período, o corante deve ser retirado e a lâmina coberta com a solução de
Lugol forte, por 2 minutos. Em seguida, com as lâminas secas, elas podem ser analisadas no
microscópio. O resultado é considerado positivo quando há presença de grânulos
metacromáticos no citoplasma de bacilos com morfologia em paliçada/letras chinesas. Tais
achados sugerem bacilo diftérico e devem ser comunicados imediatamente ao médico.

COLORAÇÃO DE FONTANA TRIBONDEAU

O método foi desenvolvido em 1920, com objetivo de auxiliar a visualização de bactérias
espiraladas (Leptospira interrogans e treponemas). Essas bactérias são muito delgadas e não
coram completamente pela coloração de Gram. Esta coloração não é considerada verdadeira,
pois consiste em uma técnica de impregnação pela prata. Atualmente, os laboratórios têm
utilizado mais a microscopia de campo escuro a fresco para visualizá-las.

Como realizamos essa coloração? Vamos conhecer?

A partir de esfregaços finos, derramar sobre a lâmina algumas gotas da solução fixadora
(renová-la 3 vezes, por 30 segundos). Em seguida, cobrir com solução mordente, aquecendo a
lâmina até emitir vapores. Após 30 segundos, lavar em água corrente, acrescentar o nitrato de
prata amoniacal, aquecendo rapidamente a lâmina até ocorrer novamente a emissão de
vapores, deixando agir por 30 segundos (a preparação toma a cor marrom). Lavar bem em
água corrente, secar com papel de filtro e examinar a lâmina ao microscópio com a objetiva de
imersão (x100). As espiroquetas aparecem amarronzadas/negras, sobre um fundo amarelo-
castanho ou marrom claro.

COLORAÇÃO PARA FLAGELOS

Como visto no módulo 1, os flagelos são estruturas bacterianas responsáveis pela locomoção e
são constituídos por moléculas proteicas denominadas flagelinas. Entretanto, como são finos,
delicados e se despolimerizam com facilidade, é necessário aplicar algumas técnicas para
aumentar o diâmetro dos flagelos, de forma a torná-los visíveis pela microscopia. A
demonstração do flagelo ocorre devido à ligação do corante ao ácido tânico, tornando-o mais
espesso.

Fonte: microbiologybook.org
 Flagelos.

Como é feita a coloração? Vamos entender?

Segundo o protocolo descrito por Teva e colaboradores (2009):

Cultivar a bactéria em estudo, de acordo com suas preferências físicas, em uma placa de
ágar infusão de cérebro-coração (BHI) ou em ágar tríptico de soja (com ou sem sangue).

Coletar delicadamente uma alíquota do crescimento com uma alça de platina e transferi-
la para um tubo, contendo cerca de 3 mL de água destilada. Inverter o tubo uma vez
para homogeneizar a suspensão. Colocar uma gota desta suspensão sobre uma lâmina

inclinada a 45o e deixar secar ao ar.

Cobrir a lâmina com uma mistura de corantes, que inclui fucsina e ácido tânico (fórmula
abaixo), e deixar por 5 minutos, até que um brilho metálico esverdeado cubra metade da
área. Não deixar o corante secar sobre a lâmina.

Retirar o corante, enxaguando com água. Secar e observar ao microscópio, com objetiva
de imersão.

 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal

COLORAÇÃO PARA ESPOROS COM VERDE

MALAQUITA (WIRTZ-CONKLIN)
Os esporos ou endósporos bacterianos consistem em uma parede espessa formada por vários
envoltórios, no interior de algumas bactérias, altamente resistente ao calor, à dessecação e a
outros agentes químicos e físicos, permitindo que a bactéria entre em um estado de latência
por longos períodos. Este processo ocorre quando a bactéria está em condições adversas à
sua sobrevivência.
Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock
 Bactéria C. difficile. Bactéria formadora de esporos.

A parede do esporo é impermeável, mas pode ser atravessada por corantes (como o verde de
malaquita) quando submetidos ao aquecimento, o que confere aos esporos uma cor verde
intensa. Associado a isso, essa estrutura não consegue ser descorada pela ação do álcool,
mas as outras estruturas podem ser descoradas. Para melhorar a visualização e como
contraste (contracorante), utiliza-se a safranina, que cora outras estruturas em vermelho,
facilitando a diferenciação dos esporos.

Como é feita a coloração? Vamos entender?

Segundo o protocolo descrito por Teva e colaboradores (2009):

Técnica para coloração de esporos

Preparar esfregaço e fixar pelo calor.

Cobrir o esfregaço com o corante verde malaquita.

Aquecer água em um béquer, até a emissão de vapores. Colocar a lâmina sobre este
 béquer, mantendo o corante aquecido por 5 minutos. Alternativamente, cobrir a lâmina
com verde malaquita e aproximar de uma chama até que desprenda vapor, sem deixar
que o corante ferva. Afastar do fogo e, após 1 a 2 minutos, repetir a operação por 3 a 4
vezes.

Lavar suavemente com água, evitando o choque térmico, que poderá quebrar a lâmina.

Adicionar a solução de safranina por 30 segundos.

Lavar e secar.

Observar ao microscópio com objetiva de imersão.

 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal

COLORAÇÃO DE CÁPSULA

Como aprendemos, a cápsula envolve a parede celular, é produzida por algumas espécies
bactérias e representa uma estrutura muito importante para a patogenicidade da bactéria. Isso
porque, confere a ação antifagocitária, ou seja, funciona como um mecanismo de fuga da ação
da fagocitose pelas células do sistema imunológico do indivíduo.

A cápsula é uma camada gelatinosa composta de açúcares ou polipeptídeos, com caráter

hidrossolúvel, que pode ser facilmente removida durante as etapas de lavagem durante a
coloração, o que dificulta a sua coloração. Além disso, a fixação dos esfregaços pelo calor,
amplamente utilizado para as outras colorações, pode levar a contração da célula e a formação
de um halo ao redor do microrganismo, que pode ser facilmente confundido com a cápsula.
Entretanto, é possível visualizar bactérias produtoras de cápsula a partir da coloração pela tinta
da china. Essa coloração é conhecida como coloração negativa, pois a cápsula rejeita as
partículas do corante. Se as bactérias apresentarem cápsula, será possível verificar
microrganismos descoradas envoltas por um halo (cápsula) sobre um fundo negro.

Vamos conhecer um pouco mais a coloração da tinta da China?

A seguir, o protocolo descrito por Teva e colaboradores (2009):

Método da tinta da China (coloração negativa)

As colônias suspeitas devem ser cultivadas em caldo rico (BHI).

Colocar 1 ou 2 gotas de cultura em uma lâmina.

Depositar na lâmina uma gota de tinta da China ao lado das gotas de cultura.

Cobrir com uma lamínula, comprimindo-a entre folhas de papel de filtro, para se obter
uma quantidade bem tênue de corante e material.

Observar ao microscópio óptico (40X).

 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal

VERIFICANDO O APRENDIZADO

1. VERIFICAMOS QUE A COLORAÇÃO DE GRAM É UMA TÉCNICA

SIMPLES, RÁPIDA E SE BASEIA NA COMPOSIÇÃO DA PAREDE
CELULAR DAS BACTÉRIAS. A RESPEITO DESTA TÉCNICA, ASSINALE A
AFIRMATIVA CORRETA:
A) As bactérias gram-negativas após o tratamento com álcool-acetona permanecem roxas.

B) As bactérias gram-negativas apresentam uma parede celular constituída por uma fina
camada de peptideoglicanos revestida por ácido micólico e uma membrana externa.

C) Os bacilos álcool ácido resistentes são preferencialmente corados pela técnica de Gram.

D) O lugol aumenta a afinidade da bactéria para o corante cristal violeta induzindo a formação
de um composto roxo nas bactérias gram-positivas.

2. ESTUDAMOS QUE A COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN É UMA

TÉCNICA QUE PERMITE A COLORAÇÃO DE UM GRUPO DE BACTÉRIAS
QUE POSSUEM PAREDE CELULAR CONSTITUÍDA POR
PEPTIDEOGLICANOS, SEGUIDA DE UMA CAMADA FORMADA POR
POLÍMEROS DE ARABINOGALACTANO E REVESTIDA POR UMA
PORÇÃO LIPÍDICA DE ÁCIDOS MICÓLICOS. A RESPEITO DESTA
TÉCNICA, QUAL MICRORGANISMO É CORADO POR ESTE MÉTODO DE
COLORAÇÃO?

A) Streptococcus sp.

B) Treponema sp.

C) Mycobacterium tuberculosis

D) Corynebacterium diphtheria

GABARITO

1. Verificamos que a coloração de Gram é uma técnica simples, rápida e se baseia na

composição da parede celular das bactérias. A respeito desta técnica, assinale a
afirmativa CORRETA:

A alternativa "D " está correta.

As bactérias gram-negativas após o tratamento com álcool-acetona perdem a cor corando com
o corante de fundo (Safranina ou fucsina de Gram). As bactérias gram-negativas apresentam
parede celular constituída por uma fina camada de peptideoglicanos, uma membrana externa e
lipopolissacarídeos. Os bacilos álcool ácido resistentes são corados pela técnica de ZIEHL-
NEELSEN.

2. Estudamos que a coloração de Ziehl-Neelsen é uma técnica que permite a coloração

de um grupo de bactérias que possuem parede celular constituída por peptideoglicanos,
seguida de uma camada formada por polímeros de arabinogalactano e revestida por uma
porção lipídica de ácidos micólicos. A respeito desta técnica, qual microrganismo é
corado por este método de coloração?

A alternativa "C " está correta.

Os Bacilos-Álcool-Ácido-Resistente (BAAR) possuem a capacidade de álcool-ácido-resistência

relacionada à hidrofobicidade da parede celular, assegurada pela presença de lipídeos como o
ácido micólico e podem ser visualizadas pela coloração de Ziehl-Neelsen. Um exemplo de
BAARs são o grupo das micobactérias, como M. tuberculosis.

CONCLUSÃO

CONSIDERAÇÕES FINAIS
Ao longo desta jornada, compreendemos as características gerais das bactérias e
relacionamos a sua morfologia e estruturas celulares com as diferentes técnicas de coloração,
importantes e muito utilizadas nos laboratórios clínicos para identificação ou distinção de
grupos bacterianos. Além disso, entendemos como os diferentes meios de cultura são úteis
para identificação e crescimento bacteriano, bem como as vantagens e desvantagens de cada
tipo de teste de sensibilidade a antimicrobianos, os quais permitem investigar resistência a um
ou mais antibióticos utilizados na clínica.
REFERÊNCIAS
JORGENSEN, J. H.; FERRARO, M. J. Antimicrobial Susceptibility Testing: A Review of General
Principles and Contemporary Practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 2009. p. 1749–
1755.

MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M. & PARKER, J. Microbiologia de Brock. 10 ed. São Paulo:
Pearson Education, 2008.

MURRAY, P.R; ROSENTHAL, K.S; PFALLER, M.A. Morfologia Bacteriana e Estrutura e Síntese
da Parede Celular. In: Microbiologia médica. 5. ed. Elsevier, 2006. cap. 3, p. 11-24.

MURRAY, P.R; ROSENTHAL, K.S; PFALLER, M.A. Morfologia Bacteriana e Estrutura e Síntese
da Parede Celular. In: Microbiologia médica. 5 ed. Elsevier, 2006. cap. 4, p. 25-34.

NCCLS. M2-A8—Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved

Standard—Eighth Edition (ISBN 1-56238-485-6).

OPLUSTIL, C.P.; ZOCCOLI, C.M.; TOBOUTI, N.R.; SINTO, I.S. Procedimentos básicos em
microbiologia clínica. 2 ed. São Paulo: Sarvier, 2004.

TEVA, A.; MORAES, A.M.L.; RIBEIRO, F.C.; et al. Bacteriologia. In: MOLINARO, E.M.;
CAPUTO, L.F.G.; AMENDOEIRA, M.R.R. (Orgs). Conceitos e Métodos para formação de
profissionais em laboratórios de saúde: v 4. Rio de Janeiro: EPSJV; IOC, 2009. cap.3,
p.221-398.

TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R. & CASE, C. L. Microbiologia. 12 ed. São Paulo: Artmed,
2017.

ROSSI, F. Cocos Gram-positivos: Staphylococcus aureus, Enterococcus spp. e Streptococcus

pneumoniae e os principais mecanismos de resistência. In: Rossi F. & Andreazzi D.B. (Orgs).
Interpretando o antibiograma. São Paulo: Atheneu, 2005. p. 27-63.

EXPLORE+
Para saber mais sobre os assuntos explorados neste tema:

Pesquise:

Como o Dr. Alvin Fox, Professor da University of South Carolina School of Medicine
aborda as características bacterianas no artigo A célula bacteriana.

Como Denise Spolidorio, Cristiane Duque e Helvécio Póvoa abordam as características

da morfologia e citologia bacteriana no capítulo 1 - Morfologia microbiana, do livro
Microbiologia e Imunologia Geral e Odontológica.

Como Ana Cristina Gales, Eliete Aguiar de Miranda Frigatto e Soraya Sgambatti de
Andrade abordam os Testes de Sensibilidade aos Antimicrobianos – módulo 5.

Visite o site do Brazilian Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (BrCast) que

tem como missão determinar e rever os pontos de corte para interpretação dos testes de
sensibilidades no Brasil. Além disso, ele disponibiliza os pontos de cortes dos
antimicrobianos e manuais de forma gratuita.

Assista:

Reino Monera - O crescimento bacteriano e a função exponencial, vídeo que aborda as

fases do crescimento microbiano.

Cultivando microrganismos, vídeo que aborda condições do crescimento bacteriano.

Exigências nutricionais – Microbiologia, vídeo que aborda os principais meios de cultura e

sua preparação em laboratório.

Coloração de Gram, animação que explica todo o passo a passo da coloração.

 Coloração de Ziehl Neelsen: Baciloscopia (Microbiologia) - Bio Aulas, vídeo que aborda
as principais características da coloração de BAAR.

Coloração de Ziehl-Neelsen, vídeo produzido pelo CONECTAMICRO da UFF que aborda

a fundamentação teórica e como realizar esta técnica de coloração utilizada para
visualização de bacilos álcool-ácido resistentes.

Leia:

A notícia Qual a finalidade dos meios de cultura em microbiologia? Publicado por KASVI
distribuidora.

O capítulo 3 do manual da Anvisa: Descrição dos meios de cultura empregados nos

exames microbiológicos.

O artigo científico escrito por Angelo Trento intitulado Colorações usadas em

Microbiologia.

CONTEUDISTA
Alice Maria de Magalhães Ornelas

 CURRÍCULO LATTES