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PROPÓSITO
Compreender as características gerais das bactérias, reconhecer os tipos de testes de
sensibilidade e distinguir as principais técnicas de coloração bacteriana é importante, pois
facilitará a execução de procedimentos na microbiologia clínica.
OBJETIVOS
MÓDULO 1
Descrever as características gerais das bactérias, as fases e os fatores que afetam o
crescimento bacteriano
MÓDULO 2
MÓDULO 3
INTRODUÇÃO
A Microbiologia é a ciência que estuda os organismos microscópicos, suas características e
atividades, sendo as bactérias, os fungos, as algas e os protozoários os principais organismos
estudados. Muitas bactérias são agentes infecciosos responsáveis por uma série de doenças
nos seres humanos, podendo levar ao óbito dos indivíduos. Além disso, existe um grupo de
bactérias multirresistentes aos antimicrobianos, não apresentando nenhum tipo de opção
terapêutica.
Você sabe por que algumas bactérias são classificadas como cocos gram-positivos e outras
gram-negativas? Você sabe a diferença entre meios de culturas enriquecidos e seletivos?
Como verifica-se a resistência aos antimicrobianos? Vamos juntos decifrar e explorar mais
sobre a microbiologia clínica?
MÓDULO 1
Descrever as características gerais das bactérias, as fases e os fatores que afetam o
crescimento bacteriano
MORFOLOGIA BACTERIANA
As bactérias podem apresentar diferentes morfologias, que caracterizam determinados gêneros
ou grupos de bactérias. A análise da morfologia bacteriana auxilia na identificação e condução
da escolha dos testes de identificação do tipo de bactéria, isolada a partir de espécimes
clínicos.
Enquanto células animais e vegetais podem ter até dezenas de micrômetros, a maioria das
bactérias estudadas nos laboratórios de microbiologia medem em torno 1,0 µm de diâmetro.
Fonte: angellodeco/Shutterstock
ΜM
Micrômetro: Unidade de comprimento onde 1,0 µm equivale a 1000 mm, ou seja, igual a
1 x 10-6 m).
Fonte: Sakurra/Shutterstock
Figura 1 - Morfologia das bactérias: cocos, bacilos e espiraladas.
COCOS
Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock
Bactérias em formas de cocos.
Bactérias com formato esférico ou oval e que, de acordo com a sua divisão celular, são
exemplos de cocos de importância médica, Staphylococcus aureus, Enterococcus spp,
Streptococcus sp., Neisseria sp. Esses cocos podem se apresentar em diferentes arranjos:
DIPLOCOCOS
Agrupamento de dois cocos. Os Streptococcus pneumoniae (pneumococo) são diplococos que
podem causar pneumonia, meningite, sinusite e infecção do ouvido médio. Outro exemplo é a
Neisseria gonorrhoeae agente etiológico da gonorreia.
ESTREPTOCOCOS
Vários cocos agrupados em cadeia, lembrando um colar de pérolas. As infecções
estreptocócicas, causadas por várias espécies de Streptococcus, podem desencadear diversos
sintomas, como: pneumonia, faringite, febre escarlatina, impetigo e celulite.
TÉTRADES
Agrupamento de 4 cocos de forma semelhante a um quadrado.
SARCINAS
Agrupamento de 8 cocos unidos de forma semelhante a um cubo. Exemplo: Sarcina ventriculi,
um importante patógeno em gatos, cachorros e bovinos. Em humanos, o potencial patogênico
ainda não é muito bem elucidado, mas tem sido isolado em biopsias gástricas e relacionados
com algumas doenças, como gastrite enfisematosa e perfuração gástrica.
Essa bactéria não é fácil de isolar e cultivar em laboratório de microbiologia. Assim, para o
diagnóstico de gastrite provocada por essa bactéria recomenda-se o exame histopatológico
com colorações de Hematoxilina e eosina.
ESTAFILOCOCOS
Cocos agrupados de forma semelhante ao cacho de uvas. Como exemplo, temos as infecções
por bactérias do gênero Staphylococcus aureus, que causam infecções cutâneas (foliculite,
impetigo, abcessos, celulite), pneumonia, infecções na corrente sanguínea e osteomielite.
BASTONETES OU BACILOS
São bactérias que apresentam um formato cilíndrico ou de bastão (bastonete), podendo ser
curtas ou longas e apresentar extremidade reta ou de ponta arredondada. Normalmente, os
bacilos não se agrupam em tantos arranjos como os cocos, apresentando-se, na maioria das
vezes, de forma isolada. Entretanto, podem apresentar-se, eventualmente, como diplobacilos
ou estreptobacilos.
DIPLOBACILOS
ESTREPTOBACILOS
Agrupamento em cadeia.
É importante destacar que, durante a análise microscópica, alguns bacilos podem ser
confundidos com cocos, isso ocorre pois são bacilos muito curtos. Esses bacilos curtos são
chamados de cocobacilos.
ESPIRALADAS
Fonte: Tatiana Shepeleva/Shutterstock
Bactérias espiraladas.
ESPIRILOS
São móveis (locomovem-se com ajuda de flagelos), apresentam formato espiral e corpo rígido.
Ex: Spirillum minus, que causa Febre da mordedura do rato em humanos e macacos.
ESPIROQUETAS
São móveis, mas se locomovem por contrações citoplasmáticas, apresentam formato em
espiral e são mais flexíveis; Ex: Treponema pallidum.
O T. pallium é o agente etiológico da sífilis, uma infecção bacteriana de transmissão sexual e
vertical. Quando não tratada, pode evoluir para formas mais graves, comprometendo
especialmente os sistemas nervoso e cardiovascular. Para o diagnóstico da sífilis, podemos
utilizar:
Métodos diretos a partir de materiais coletados das lesões primárias causadas por essa
bactéria, que permite a visualização do treponema vivo e móvel.
Pode ser feito com material fixado seguido de coloração (pelo método de Fontana de
Tribondeau), mas é de difícil visualização.
VIBRIÕES
São móveis (locomovem-se com ajuda de flagelos) apresentam formato de vírgula. Ex: Vibrio
cholerae, também conhecido como vibrião colérico, é o agente causador da cólera.
CITOLOGIA BACTERIANA
As bactérias pertencem ao grupo dos procariotos e, portanto, não possuem membrana nuclear
(carioteca), bem como não possuem todo o conjunto de organelas das células eucarióticas.
Entretanto, possuem elementos estruturais de grande importância, como a parede celular, que
pode ser corada, permitindo o profissional da saúde identificar e diferenciar os principais
grupos de bactérias.
PAREDE CELULAR
Você sabe por que a parede celular é uma estrutura tão relevante para as bactérias?
Ela é importante na divisão celular, é responsável pela forma, rigidez da bactéria e confere
proteção osmótica entre os meios externo e interno.
A parede celular possui uma espessura de, aproximadamente, 10 a 20 µm, é porosa,
permitindo a passagem de metabólitos para a membrana plasmática, é formada por camadas
rígidas de peptidoglicanos (mureína), e envolve a membrana citoplasmática da maioria dos
procariotos.
BACTÉRIA GRAM-POSITIVA
Possui uma parede celular mais espessa, com múltiplas camadas de peptideoglicanos (Figura
3), revestindo a membrana citoplasmática. Além disso, possui outros componentes, como os:
ÁCIDOS TEICOICOS
ÁCIDOS LIPOTEICOICOS
ÁCIDOS TEICOICOS
ÁCIDOS LIPOTEICOICOS
Fonte: Designua/Shutterstock
Figura 3 - Estrutura básica da parede celular gram-positiva.
BACTÉRIA GRAM-NEGATIVA
Apresenta a parede celular com uma estrutura mais complexa e, quimicamente, diferente
quando comparada à parede celular de gram-positiva (ver Figura 4). Esta parede celular é
composta de uma fina camada de peptideoglicanos (5-10% do peso da parede celular) e
externamente a esta fina camada, encontramos uma membrana externa.
ATENÇÃO
MEMBRANA EXTERNA
A membrana externa além de manter a estrutura bacteriana é uma barreira de permeabilidade,
confere proteção contra condições ambientais adversas, como as do sistema digestivo do
hospedeiro e resistência a alguns antimicrobianos como a penicilina. Essa membrana é
formada por uma dupla camada lipídica, onde a camada interna é constituída basicamente de
fosfolipídios e a camada externa possui uma molécula anfipática, o lipopolissacarídeo (LPS) ou
endotoxina e proteínas.
O LPS é essencial para a viabilidade das bactérias, funciona como um potente indutor de
respostas imunológicas, ativando linfócitos B e induzindo a produção de citocinas por
macrófagos, células dendríticas e outras células. Por outro lado, provoca febre e pode causar
choque endotoxêmico, sendo chamado também de endotoxina. As proteínas permitem a
difusão de metabolitos pequenos, antibióticos hidrofílicos, têm função estrutural e atuam como
receptoras para bacteriófagos e outros ligantes.
LPS
As bactérias gram-negativas podem causar uma série de infecções graves nos seres humanos,
como peritonite, pneumonia, infecções urinárias, meningite, dentre outras. É importante
ressaltar que essas bactérias estão cada vez mais resistentes aos antimicrobianos disponíveis
para utilização terapêutica.
Fonte: Designua/Shutterstock
Figura 4 - Estrutura básica da parede celular Gram-negativa.
ATENÇÃO
Exceções bacterianas
2) Micoplasmas: São as menores bactérias encontradas na natureza (cerca de 0,3 µm), não
apresentam parede celular e incorporam esteróis do hospedeiro em sua membrana (Figura 6).
O Mycoplasma pneumoniae é um agente causador comum de pneumonia.
ESTERÓIS
Fonte: Designua/Shutterstock
Figura 6: Citologia do Micoplasma.
MEMBRANA CELULAR OU MEMBRANA
CITOPLASMÁTICA BACTERIANA
ATENÇÃO
Algumas bactérias, como o Vibrio cholerae, podem possuir mais de um DNA; e outras, como a
Borrelia burgdorferi, possuem um DNA linear).
ELEMENTOS ACESSÓRIOS
São estruturas que podem estar ou não presentes em determinadas bactérias. Vários desses
elementos acessórios são importantes na virulência, patogenicidade e resistência bacteriana.
Fonte: Wikipedia
Estrutura celular bacteriana.
GLICOCÁLICE
O glicocálice consiste em um revestimento de polissacarídeos. Quando o glicocálice apresenta
estrutura uniforme e encontra-se firmemente aderido à parede celular é denominado de
cápsula. Quando as camadas de polissacarídeos possuem pouca aderência e apresentam
espessura não uniforme, são chamadas de camada viscosa. Essa estrutura, além de fornecer
um envoltório protetor, evita a fagocitose pelas células de defesa do organismo, atua como
reservatório de nutrientes e, principalmente, auxilia na aderência bacteriana a algumas
superfícies. Exemplo: o Streptococcus mutans, que através da cápsula fixa e perfura o esmalte
dentário.
PLASMÍDEO
Corresponde a um DNA circular extracromossomal, capaz de se replicar de forma autônoma,
localizado no citoplasma da célula bacteriana e que não é responsável por características
essenciais da bactéria. Podem se apresentar em várias cópias, além de possuir a capacidade
de conferir vantagens adaptativas (por exemplo, resistência a antibióticos), podendo, inclusive,
ser transferidos para outras bactérias.
FLAGELOS
São estruturas de locomoção presentes em algumas bactérias, formadas por subunidades
proteicas acopladas na forma helicoidal (flagelina) e que permitem às bactérias “irem” em
busca de nutrientes ou fugir de substâncias tóxicas. O flagelo fica ancorado na membrana
citoplasmática através do seu corpo basal (similar a um gancho), possui um comprimento
geralmente muito maior que o da célula, e podem ser únicos ou múltiplos, polares (apenas nas
extremidades) ou peritríquios (em todo corpo bacteriano). Embora os flagelos não possam ser
visualizados, normalmente, no microscópio óptico, existem técnicas de coloração que os
tornam visíveis no microscópio óptico e os microbiologistas usam como auxílio no diagnóstico.
Durante a identificação de uma bactéria, a avaliação da motilidade pode ser utilizada para
diferenciar espécies de bactérias. Exemplo: Em uma cultura de fezes (coprocultura), a
presença de bactérias gram-negativas imóveis é indicativa de Shigella sp. e móveis de
Salmonella sp.
PILI E FÍMBRIAS
As fímbrias são estruturas filamentosas, que lembram fios de cabelo no lado de fora da
bactéria, compostas por subunidades proteicas (pilina), que se projetam a partir da superfície
de uma célula e, geralmente, estão em maior quantidade do que os flagelos. As fímbrias
auxiliam na colonização das membranas de mucosas como ocorre no caso da Neisseria
gonorrhoeae, agente causador da gonorreia e, no caso da E. coli, nas células do trato urinário.
Os pili sexuais de uma bactéria se ligam a outras bactérias permitindo a transferência de
material genético na conjugação bacteriana. Esse pili sexuais são codificados por um
plasmídeo.
ESPOROS (ENDOSPOROS)
Produzidos por alguns gêneros de bactérias, como Bacillus e Clostridium, os esporos são uma
estrutura resistente a agentes físicos e químicos, que é formada em resposta ao meio
ambiente, quando este se torna inadequado para a sobrevivência da bactéria (ex.: escassez de
água ou nutrientes). A resistência da forma esporulada possibilita que a bactéria sobreviva por
longos anos em ambientes desfavoráveis, podendo reverter à forma vegetativa quando o local
se tornar viável novamente para sua sobrevida. Cada célula forma um único esporo, que é
liberado quando a bactéria morre.
FATORES DE VIRULÊNCIA E
PATOGENICIDADE DE BACTÉRIAS
SAIBA MAIS
Para uma cultura de micobactéria ser considerada negativa, temos que esperar, no mínimo, 45
dias de incubação e não ser visualizado nenhum crescimento.
Fonte: Wikimedia
FASE LAG
FASE LOGARÍTMICA (FASE LOG OU EXPONENCIAL)
FASE ESTACIONÁRIA OU FASE PLATÔ
FASE DE DECLÍNIO OU MORTE
FASE LAG
Quando bactérias são adicionadas a um meio de cultura (semeadas), elas necessitam de um
tempo para se adaptar ao novo ambiente antes de começar a se dividir. Neste momento, não
há reprodução e a população permanece temporariamente inalterada. É importante ressaltar
que, nesta fase, as células não estão em latência, uma vez que aumentam no tamanho e
fisiologicamente estão muito ativas.
Nesta fase, as células iniciam a divisão que ocorre de forma exponencial, regular e constante.
A velocidade de crescimento é máxima nesta fase, e varia de acordo com a cepa e com as
condições ambientais.
Etapa que ocorre morte bacteriana, pois há falta de nutrientes e de espaço, aliada à toxidez do
ambiente que levam os microrganismos a morrerem mais rápido do que produzirem novas
células (a morte bacteriana nesta fase se dará de forma exponencial ou logarítmica). Sendo
assim, há uma progressiva morte celular até a cultura se tornar estéril.
TEMPERATURA
BACTÉRIAS PSICRÓFILAS
Crescem melhor de 12°C e 20°C.
BACTÉRIAS MESÓFILAS
Crescem melhor de 25°C a 40°C. Neste grupo, está a maioria dos patógenos bacterianos de
importância clínica, já que nesta faixa encontra-se a temperatura do corpo humano.
BACTÉRIAS TERMÓFILAS
Crescem melhor de 45°C a 60°C.
SAIBA MAIS
OXIGÊNIO
BACTÉRIAS MICROAERÓFILAS
Só crescem em ambiente contendo baixas concentrações de oxigênio (menores que as
encontradas no ar atmosférico). Ex.: Campylobacter sp.
SAIBA MAIS
PH
Normalmente, a grande maioria das bactérias cresce bem em meios com pH neutro, em torno
de 6,5 a 7,5, apesar de muitas espécies tolerarem variações de pH entre 4,0 e 9,0. Os meios
de cultura geralmente são tamponados para impedir mudanças bruscas de pH, decorrentes do
próprio metabolismo das bactérias.
PRESSÃO OSMÓTICA
A pressão osmótica é a pressão que deve ser exercida sobre um sistema para evitar que a
passagem de água por osmose, ou seja, para o meio mais concentrado ocorra. A parede
celular, além da rigidez, impede a entrada excessiva de água. Dessa forma, a pressão
osmótica dos meios de cultura pode afetar diretamente a viabilidade das bactérias. Meios de
cultura com pressões osmóticas menores comparado ao interior da bactéria, normalmente, não
afetam sua viabilidade. De forma diferente, meios de cultura com pressões osmóticas maiores
causam perda de água intracelular, trazendo efeito bacteriostático ou bactericida.
BACTERIOSTÁTICO
BACTERICIDA
SAIBA MAIS
Halofismo - Certas bactérias isoladas de salmouras, pacotes de sal, alimentos e água do mar,
chamadas bactérias halofílicas ou halófitas obrigatórias, crescem apenas quando o meio
contém uma concentração inusitadamente elevada de sal (10% a 15%). Isto representa uma
resposta especial do microrganismo à pressão osmótica.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. (ADAPTADA DE IF RS -2018). AS POPULAÇÕES BACTERIANAS
SEGUEM UMA SÉRIE DE FASES DE CRESCIMENTO: LAG, LOGARÍTMICA
OU EXPONENCIAL, ESTACIONÁRIA E DE DECLÍNIO OU MORTE
CELULAR. ANALISE AS ASSERTIVAS ABAIXO:
GABARITO
Assinale única alternativa CORRETA que relaciona corretamente as assertivas I, II, III e
IV. com as fases lag, log, estacionária e de morte celular:
MÓDULO 2
Reconhecer os tipos de meios de cultura, bem como os testes de sensibilidade aos
antimicrobianos
MEIO DE CULTURA
Após a coleta de uma amostra biológica, destinada para a cultura e/ou antibiograma, essa será
semeada em meios de culturas capazes de suprir as bactérias com as exigências nutricionais
mínimas, dentro das condições ambientais necessárias para o cultivo, possibilitando o
crescimento microbiano e a formação e visualização de colônias.
Durante a semeadura de uma amostra biológica, por exemplo, o líquor, em casos de suspeita
de meningite, deve-se conhecer os principais agente etiológicos dessa doença para escolher
os meios apropriados (com nutrientes específicos e pH), as condições ideais de crescimento,
como a presença e quantidade de oxigênio ou até mesmo a sua ausência. Todos esses
aspectos são essenciais para auxiliar na identificação bacteriana e na conclusão diagnóstica.
Vamos juntos conhecer um pouco mais sobre a classificação dos meios de culturas.
CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA
Os meios de cultura são classificados a partir do seu estado físico, da sua composição e do
seu objetivo de utilização.
Fonte: SomprasongWittayanupakorn/Shutterstock
Microbiologista cultivando bactéria em uma placa de Petri contendo meio de cultura.
Você provavelmente já preparou gelatina na sua casa, correto? Lembra da sua consistência?
É válido lembrar que, para obtenção de um meio de cultura ideal contendo ágar, deve-se, após
sua adição, aquecer a solução para dissolver o ágar em água fervente até a solução ficar
homogênea. Entretanto, não devemos ferver ou aquecer a solução diversas vezes, pois
podemos provocar alteração no valor nutritivo, no percentual de água e outros parâmetros que
interferiam no crescimento.
Fonte: Yayah_Ai/Shutterstock
MEIOS SÓLIDOS
Obtidos a partir da adição de 1,0 g a 3,0 g % de ágar. A maioria dos microrganismos crescem
formando colônias. Ex: Ágar nutritivo.
MEIOS SEMISSÓLIDOS
Obtidos, na maioria das vezes, após adição de 0,1 g a 0,7 g %”, separando o 0,7 de g. Dentre
as finalidades, temos a visualização da motilidade bacteriana ou, muitas vezes, servir como
base de meio de transporte. Ex: Meio SIM (meio de detecção da produção de enxofre,
motilidade e produção de indol) e Cary & Blair.
Exemplo de Meio semi-sólido (SIM) mostrando uma bactéria que não apresenta motilidade.
Fonte: NonSitth/Shutterstock
MEIOS LÍQUIDOS
Não apresentam ágar, são conhecidos como “caldos” e utilizados para ativação das culturas,
repiques de microrganismos, provas bioquímicas, dentre outros. Ex: caldo tetrationato e
selenito-cistina para cultivo de salmonelas, caldo tioglicolato para Clostridium perfringens.
MEIOS COMPLEXOS
A exata constituição do meio de cultura não é conhecida. Esses meios apresentam em sua
composição soro, sangue, extratos moídos ou digeridos de órgãos animais (corações, fígados,
cérebros), peixes, leveduras, e vegetais ou outro componente que não se tem total
conhecimento da composição química. Ex: Ágar sangue.
São os meios que contêm um grande suprimento de nutrientes pela adição de diversas
substâncias como sangue, soro, extratos de tecidos animais ou vegetais ao caldo ou até
mesmo ágar nutritivos, para permitir o crescimento de bactérias fastidiosas (nutricionalmente
exigentes), como Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp.
EXEMPLO
MEIOS SELETIVOS
São meios que apresentam em sua composição substâncias químicas específicas (inibidores)
adicionadas ao caldo ou ao ágar nutritivo que previnem o crescimento de um determinado
grupo de bactérias. É importante ressaltar que os inibidores atuam em um grupo específico de
bactéria, favorecendo apenas o crescimento da bactéria de interesse.
EXEMPLO
O ágar MacConkey é um meio seletivo pois tem em sua composição sais biliares e cristais
violeta que inibe o crescimento da maioria das bactérias gram-positivas, permitindo o
crescimento apenas das bactérias gram-negativas.
EXEMPLO
COLÔNIAS ROSAS
Fonte: NonSitth/Shutterstock
Fonte: REJO JACOB JOSEPH/Shutterstock
Figura 7 - Diferença da coloração das colônias de bactérias gram-negativas fermentadoras
e não fermentadoras de lactose em Agar MacConkey.
Agora que você conheceu esse meio de cultura, imagina por que temos essa diferença?
EXEMPLO
Outro exemplo de meio seletivo é o ágar manitol salgado. Esse meio de cultivo é composto de
manitol e alta concentração de sal (7,5% de NaCL). Na rotina laboratorial ele é utilizado para o
isolamento de Staphylococcus aureus a partir de diferentes amostras biológicas. Todas as
espécies de Staphylococcus são capazes de crescer nesse meio, mas o S. aureus é capaz de
fermentar o manitol presente no meio, produzindo ácido, que torna o meio e as colônias
amareladas. As outras espécies de estafilococos, como os Staphylococcus epidermidis e o
Bacillus subtillis não metabolizam o manitol, apresentando assim colônias brancas.
Fonte: OneMashi/Shutterstock
S.aureus e S.epidermidis cultivadas em ágar manitol.
MEIOS DE TRANSPORTE
SWAB
Fonte: MedstockPhotos/Shutterstock
Swab com meio de transporte que pode ser usado para coleta de amostras de
secreção vaginal.
Fonte: aslysun/Shutterstock
Em geral esses métodos são recomendados para ajudar a direcionar o tratamento do paciente.
É importante ressaltar que a detecção precisa dos mecanismos de resistências das bactérias
são utilizados para fins epidemiológicos e medidas de contenção destas bactérias resistentes.
Enterobactérias
Pseudomonas spp.
Acinetobacter spp.
Staphylococcus spp.
Enterococcus spp.
Streptococcus pneumoniae
Stenotrophomonas maltophilia
ATENÇÃO
A padronização das etapas relacionadas à realização dos TSA (da escolha dos antibióticos até
a interpretação dos resultados) é feita por organizações especializadas, que elaboram
documentos, os quais apresentam com riqueza de detalhes como realizar e interpretar os
testes de sensibilidade. Tais organizações são:
CIM OU MIC
MICRODILUIÇÃO EM CALDO
PASSO 1
PASSO 2
PASSO 3
PASSO 4
PASSO 1
PASSO 2
PASSO 3
PASSO 4
SAIBA MAIS
Fonte: eczserapyilmaz/Shutterstock
Teste de disco-difusão em ágar.
TÉCNICA
Toda a etapa deve ser realizada de forma estéril, seguindo as normas de biossegurança
do laboratório.
Método do crescimento
PASSO 1
Após crescimento em placa de ágar (24 horas), selecionar de três a cinco colônias, bem
isoladas, do mesmo tipo morfológico. A superfície de cada colônia é tocada com uma alça, e os
microrganismos são transferidos para um tubo contendo 4-5 mL de NaCL 0,9% (salina) estéril.
PASSO 2
Incuba-se a cultura na salina até alcançar a turbidez de uma solução padrão de McFarland
0,5.
Essa escala é composta de 11 tubos numerados de 0,5 a 10, onde o tubo 0,5 (indica uma
PASSO 1
Após a preparação da suspensão bacteriana, mergulha-se um swab de algodão estéril na
suspensão. Essa etapa deve ser realizada em até 15 minutos após ajustar a turbidez da
suspensão. O swab deve ser girado várias vezes e apertado firmemente contra a parede
interna do tubo, acima do nível do líquido, o que ajuda a retirar qualquer excesso de inóculo no
swab.
PASSO 2
A superfície da placa de ágar Müeller-Hinton é inoculada esfregando o swab em toda a
superfície estéril do ágar. Repete-se o procedimento esfregando outras duas vezes, girando a
placa aproximadamente 60° cada vez, a fim de assegurar a distribuição uniforme do inóculo.
Após a distribuição, passa-se um swab na margem de toda a placa de ágar, completando pelo
menos uma volta completa.
PASSO 3
A tampa pode ser deixada entreaberta de três a cinco minutos de maneira a permitir que
qualquer excesso de umidade seja absorvido antes de se aplicar os discos impregnados de
droga. No entanto, a placa não pode ultrapassar 15 minutos aberta.
Devemos evitar inóculos com alta concentração de bactérias. Nunca devemos usar culturas em
caldo, não diluídas, do dia anterior, ou outros inóculos não padronizados para semear nessas
placas.
ÁGAR MÜELLER-HINTON
PASSO 1
O conjunto de antibióticos é previamente definido. Esses são discos de papeis de filtros
impregnados com concentrações definidas de antibióticos. Os discos de antibióticos são
colocados na superfície de placa de ágar anteriormente semeada, com auxílio de uma pinça ou
com um dispensador. Ao ser colocado, cada disco deve ser pressionado de maneira a
assegurar o contato completo do disco com a superfície de ágar. Os discos devem ser
distribuídos mantendo a distância entre os centros de pelo menos 24 mm. Em geral, deve-se
colocar 12 discos, no máximo, em uma placa de 150 mm, ou cinco discos em uma placa de
100 mm.
Algumas drogas difundem-se quase instantaneamente quando em contato com o meio. O disco
não deve ser reaplicado após ter entrado em contato com a superfície de ágar. Em vez disso,
coloque um novo disco em outra parte da placa.
PASSO 2
As placas devem ser invertidas e colocadas em uma estufa, a 35° C, até 15 minutos após a
aplicação dos discos. No entanto, no caso das cepas de Haemophilus spp., N. gonorrhoeae e
dos estreptococos, as placas não devem ser incubadas em atmosfera enriquecida com CO2,
PASSO 1
A leitura é realizada após 18 a 24 horas de incubação. Inicialmente, analisamos a superfície da
placa para verificar se a semeadura foi satisfatória. Em seguida, os halos (diâmetros) devem
ser medidos, em milímetros, com auxílio de paquímetro ou uma régua. Para isso, a placa deve
ser invertida, e a régua ou o paquímetro apoiado na parte de trás da placa. As medidas devem
ser feitas contra uma fonte luminosa.
FONTE LUMINOSA
Cuidado:
PASSO 2
Com a medida de cada halo (diâmetro) a bactéria testada é classificada, como sensível,
intermediário, ou resistente em relação aos agentes antimicrobianos testados, usando como
comparação o tamanho dos halos preconizados pelas organizações internacionais (CLSI,
BSAC e BrCAST).
Vantagens desse método: Simplicidade do teste; não requer nenhum equipamento especial;
os resultados categóricos facilmente interpretados; flexibilidade na seleção de discos para
teste; baixo custo e de fácil execução.
Desvantagens: Teste manual, sem automação; não pode ser utilizado para verificar a
resistência a alguns microrganismos, pois falta padronização do método.
Exemplo: Para avaliar o perfil de sensibilidade do S. pneumoniae versus ceftriaxona, deve ser
feito o teste do MIC (quantitativo). De acordo com o CLSI (2018), esse método não pode ser
mais utilizado para verificar o perfil de sensibilidade da polimixina B nas bactérias gram
negativas, pois a polimixina apresenta baixa difusão no Agar, sendo preconizado a
microdiluição.
ACURÁCIA
Refere-se ao grau em que o teste é capaz de determinar o verdadeiro valor do que está
sendo medido.
CARBAPENEMASE
A) Diferenciais
B) Seletivos
C) Enriquecidos
D) De transporte
B) É um método quantitativo.
GABARITO
O teste de sensibilidade de disco-difusão em ágar não pode ser feito de forma automatizada, é
um método qualitativo e não requer utilização de equipamentos especiais. Entretanto, permite
ao microbiologista uma ampla escolha de antibióticos a serem utilizados, proporcionando,
portanto, flexibilidade quanto à escolha.
MÓDULO 3
Distinguir os métodos de visualização e coloração na prática laboratorial
INTRODUÇÃO
Vimos no módulo 1 que as características das células bacterianas, bem como sua morfologia,
são essenciais para entendermos e aplicarmos as técnicas de coloração bacterianas. No
entanto, uma vez que as bactérias são seres microscópios, não podemos enxergá-las a olho
nu, e necessitamos do auxílio dos microscópios:
De uma maneira geral, as bactérias vivas podem ser observadas quanto à forma e
movimentos, a partir de material biológico em suspensão (uma gota) entre lâmina e
lamínula (sem formar bolha). Esta preparação é conhecida como a fresco e exige um
bom manuseio do microscópio por parte do microbiologista, uma vez que é necessário
fazer ajustes de intensidade da luz, regular bem o condensador, se possível empregar
filtros para uma melhora na qualidade da imagem a ser visualizada e, geralmente, utilizar
um microscópio de campo escuro.
CORRETO!
De uma maneira geral, as bactérias vivas podem ser observadas quanto à forma e
movimentos, a partir de material biológico em suspensão (uma gota) entre lâmina e
lamínula (sem formar bolha). Esta preparação é conhecida como a fresco e exige um
bom manuseio do microscópio por parte do microbiologista, uma vez que é necessário
fazer ajustes de intensidade da luz, regular bem o condensador, se possível empregar
filtros para uma melhora na qualidade da imagem a ser visualizada e, geralmente, utilizar
um microscópio de campo escuro.
Como é de se esperar, na preparação a fresco, por não utilizar corantes, as bactérias são
vistas sem cor (incolores), mesmos que estas sejam capazes de produzir cor quando
cultivadas em meios de cultura específicos. Para uma melhor visualização da morfologia e
citologia bacteriana, vários corantes passaram a ser utilizados e os microrganismos são
corados após os microrganismos serem fixados na lâmina (mortos), na maioria das vezes, pelo
calor, etapa chamada de fixação. A fixação permite que a bactéria fique aderida à lâmina e
evita que as bactérias sejam lavadas e perdidas durante a coloração. No entanto, antes da
etapa de fixação e coloração, devemos lembrar da importância da realização de um bom
esfregaço, que deve ser:
Pouco espesso
Bem homogêneo
ATENÇÃO
COLORAÇÃO DE GRAM
Esta técnica foi desenvolvida em 1884, pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim
Gram, e é a mais utilizada em bacteriologia por permitir distinguir bactérias gram-positivas de
bactérias gram-negativas. Diferenças nas características químicas e estruturais das paredes
celulares, bem como na permeabilidade aos reagentes químicos nestes dois grupos de
bactérias levam a diferenças de coloração.
Fonte: Schira/Shutterstock
Coloração de GRAM. À esquerda, bactérias gram-negativas. Á direita, bactérias gram-
positivas.
ATENÇÃO
COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
No módulo 1, você aprendeu que existem bactérias cuja parede celular fogem da classificação
como gram-positivas e gram-negativas, pois possuem acima da camada de peptideoglicanos,
uma camada denominada Micolato Arabinogalactano, formada por polímeros de
arabinogalactano (açúcares) e revestida por uma porção lipídica de ácidos micólicos. Esta
constituição torna a parede celular hidrofóbica, dificultando a penetração de corantes aquosos,
bem como a ação do lugol e, portanto, impedindo a identificação e a diferenciação desse tipo
de bactéria através da coloração de Gram.
Fonte: Wikipedia
Friedrich Carl Adolf Neelsen
SAIBA MAIS
A análise do escarro pela coloração de BAAR é um método simples, barato e muito importante
para o diagnóstico da tuberculose, pois confere um resultado precoce (quando realizado de
forma correta). Além disso, permite o acompanhamento a evolução do tratamento de pacientes
com essa doença. Pacientes com sinais e sintomas (febre vespertina, tosse persistente por
mais de 3 semanas, emagrecimento, com imagem no raio x) que apresentam bacilos gram-
negativos no escarro em amostras coradas pela ZH indicam a presença do M. tuberculosis. No
entanto, é importante destacar que outras micobactérias se coram por essa técnica e esse
método. Para diferenciar as espécies, é necessário cultura.
Essa técnica pode ser realizada em outras amostras, como: urina, líquidos pleurais, lavado
bronco alveolar, aspirado traqueal, biópsias e líquor.
COLORAÇÃO DE ALBERT-LAYBOURN
Algumas bactérias apresentam corpúsculos citoplasmáticos (corpúsculos metacromáticos ou
corpúsculos de Babes Ernst) nas suas extremidades e que podem ser corados pelo Lugol forte
(com cor marrom), em contraste com o corpo do bacilo, que se cora em esverdeado/azulado
pela solução de Laybourn. Esta técnica é uma técnica simples que foi sugerida em 1920 por
Henry Albert e, posteriormente, foi modificada por Ross Laybourn, em 1924.
DIFTERIA
A difteria (ou crupe) é uma doença de origem bacterina, que acomete as amígdalas,
laringe, faringe, nariz, conjuntiva e pele, causando amidalite com o aparecimento de
placas bacterianas bem amareladas, dificuldades respiratórias e até mesmo parada
respiratória com óbito. Essa doença é causada pela bactéria Corynebacterium diphtheriae
e pode ser transmitida por meio das vias respiratórias ou então através de contato físico.
Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock
Ilustração microscópica de Corynebacterium diphtheria.
Fonte: microbiologybook.org
Flagelos.
Cultivar a bactéria em estudo, de acordo com suas preferências físicas, em uma placa de
ágar infusão de cérebro-coração (BHI) ou em ágar tríptico de soja (com ou sem sangue).
Coletar delicadamente uma alíquota do crescimento com uma alça de platina e transferi-
la para um tubo, contendo cerca de 3 mL de água destilada. Inverter o tubo uma vez
para homogeneizar a suspensão. Colocar uma gota desta suspensão sobre uma lâmina
Cobrir a lâmina com uma mistura de corantes, que inclui fucsina e ácido tânico (fórmula
abaixo), e deixar por 5 minutos, até que um brilho metálico esverdeado cubra metade da
área. Não deixar o corante secar sobre a lâmina.
Retirar o corante, enxaguando com água. Secar e observar ao microscópio, com objetiva
de imersão.
A parede do esporo é impermeável, mas pode ser atravessada por corantes (como o verde de
malaquita) quando submetidos ao aquecimento, o que confere aos esporos uma cor verde
intensa. Associado a isso, essa estrutura não consegue ser descorada pela ação do álcool,
mas as outras estruturas podem ser descoradas. Para melhorar a visualização e como
contraste (contracorante), utiliza-se a safranina, que cora outras estruturas em vermelho,
facilitando a diferenciação dos esporos.
Aquecer água em um béquer, até a emissão de vapores. Colocar a lâmina sobre este
béquer, mantendo o corante aquecido por 5 minutos. Alternativamente, cobrir a lâmina
com verde malaquita e aproximar de uma chama até que desprenda vapor, sem deixar
que o corante ferva. Afastar do fogo e, após 1 a 2 minutos, repetir a operação por 3 a 4
vezes.
Lavar suavemente com água, evitando o choque térmico, que poderá quebrar a lâmina.
Lavar e secar.
COLORAÇÃO DE CÁPSULA
Como aprendemos, a cápsula envolve a parede celular, é produzida por algumas espécies
bactérias e representa uma estrutura muito importante para a patogenicidade da bactéria. Isso
porque, confere a ação antifagocitária, ou seja, funciona como um mecanismo de fuga da ação
da fagocitose pelas células do sistema imunológico do indivíduo.
Depositar na lâmina uma gota de tinta da China ao lado das gotas de cultura.
Cobrir com uma lamínula, comprimindo-a entre folhas de papel de filtro, para se obter
uma quantidade bem tênue de corante e material.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
B) As bactérias gram-negativas apresentam uma parede celular constituída por uma fina
camada de peptideoglicanos revestida por ácido micólico e uma membrana externa.
C) Os bacilos álcool ácido resistentes são preferencialmente corados pela técnica de Gram.
D) O lugol aumenta a afinidade da bactéria para o corante cristal violeta induzindo a formação
de um composto roxo nas bactérias gram-positivas.
A) Streptococcus sp.
B) Treponema sp.
C) Mycobacterium tuberculosis
D) Corynebacterium diphtheria
GABARITO
As bactérias gram-negativas após o tratamento com álcool-acetona perdem a cor corando com
o corante de fundo (Safranina ou fucsina de Gram). As bactérias gram-negativas apresentam
parede celular constituída por uma fina camada de peptideoglicanos, uma membrana externa e
lipopolissacarídeos. Os bacilos álcool ácido resistentes são corados pela técnica de ZIEHL-
NEELSEN.
CONCLUSÃO
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Ao longo desta jornada, compreendemos as características gerais das bactérias e
relacionamos a sua morfologia e estruturas celulares com as diferentes técnicas de coloração,
importantes e muito utilizadas nos laboratórios clínicos para identificação ou distinção de
grupos bacterianos. Além disso, entendemos como os diferentes meios de cultura são úteis
para identificação e crescimento bacteriano, bem como as vantagens e desvantagens de cada
tipo de teste de sensibilidade a antimicrobianos, os quais permitem investigar resistência a um
ou mais antibióticos utilizados na clínica.
REFERÊNCIAS
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Principles and Contemporary Practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 2009. p. 1749–
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MURRAY, P.R; ROSENTHAL, K.S; PFALLER, M.A. Morfologia Bacteriana e Estrutura e Síntese
da Parede Celular. In: Microbiologia médica. 5. ed. Elsevier, 2006. cap. 3, p. 11-24.
MURRAY, P.R; ROSENTHAL, K.S; PFALLER, M.A. Morfologia Bacteriana e Estrutura e Síntese
da Parede Celular. In: Microbiologia médica. 5 ed. Elsevier, 2006. cap. 4, p. 25-34.
OPLUSTIL, C.P.; ZOCCOLI, C.M.; TOBOUTI, N.R.; SINTO, I.S. Procedimentos básicos em
microbiologia clínica. 2 ed. São Paulo: Sarvier, 2004.
TEVA, A.; MORAES, A.M.L.; RIBEIRO, F.C.; et al. Bacteriologia. In: MOLINARO, E.M.;
CAPUTO, L.F.G.; AMENDOEIRA, M.R.R. (Orgs). Conceitos e Métodos para formação de
profissionais em laboratórios de saúde: v 4. Rio de Janeiro: EPSJV; IOC, 2009. cap.3,
p.221-398.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R. & CASE, C. L. Microbiologia. 12 ed. São Paulo: Artmed,
2017.
EXPLORE+
Para saber mais sobre os assuntos explorados neste tema:
Pesquise:
Como o Dr. Alvin Fox, Professor da University of South Carolina School of Medicine
aborda as características bacterianas no artigo A célula bacteriana.
Como Ana Cristina Gales, Eliete Aguiar de Miranda Frigatto e Soraya Sgambatti de
Andrade abordam os Testes de Sensibilidade aos Antimicrobianos – módulo 5.
Assista:
Leia:
A notícia Qual a finalidade dos meios de cultura em microbiologia? Publicado por KASVI
distribuidora.
CONTEUDISTA
Alice Maria de Magalhães Ornelas
CURRÍCULO LATTES