DESCRIÇÃO

Conceitos gerais de bacteriologia, testes de sensibilidade e métodos de coloração.

PROPÓSITO
Compreender as características gerais das bactérias, reconhecer os tipos de testes de
sensibilidade e distinguir as principais técnicas de coloração bacteriana é importante, pois
facilitará a execução de procedimentos na microbiologia clínica.

OBJETIVOS

MÓDULO 1
Descrever as características gerais das bactérias, as fases e os fatores que afetam o
crescimento bacteriano

MÓDULO 2

Reconhecer os tipos de meios de cultura, bem como os testes de sensibilidade aos

antimicrobianos

MÓDULO 3

Distinguir os métodos de visualização e coloração na prática laboratorial

INTRODUÇÃO
A Microbiologia é a ciência que estuda os organismos microscópicos, suas características e
atividades, sendo as bactérias, os fungos, as algas e os protozoários os principais organismos
estudados. Muitas bactérias são agentes infecciosos responsáveis por uma série de doenças
nos seres humanos, podendo levar ao óbito dos indivíduos. Além disso, existe um grupo de
bactérias multirresistentes aos antimicrobianos, não apresentando nenhum tipo de opção
terapêutica.

A análise da morfologia, estrutura e metabolismo das bactérias é essencial para a

compreensão e a identificação correta do tipo bacteriano, seja através do crescimento
microbiano em meio de cultura adequado, ou através das técnicas de coloração, ou para
investigar resistência a um ou mais antibióticos utilizados na clínica por meio dos testes de
sensibilidade.

Você sabe por que algumas bactérias são classificadas como cocos gram-positivos e outras
gram-negativas? Você sabe a diferença entre meios de culturas enriquecidos e seletivos?
Como verifica-se a resistência aos antimicrobianos? Vamos juntos decifrar e explorar mais
sobre a microbiologia clínica?
MÓDULO 1
 Descrever as características gerais das bactérias, as fases e os fatores que afetam o
crescimento bacteriano

MORFOLOGIA BACTERIANA
As bactérias podem apresentar diferentes morfologias, que caracterizam determinados gêneros
ou grupos de bactérias. A análise da morfologia bacteriana auxilia na identificação e condução
da escolha dos testes de identificação do tipo de bactéria, isolada a partir de espécimes
clínicos.

As bactérias são classificadas morfologicamente de acordo com o tamanho, forma e arranjo e

consistem nos menores seres vivos, da ordem de milésimos de milímetro e, portanto, visíveis
apenas com a ajuda de um microscópio.

Enquanto células animais e vegetais podem ter até dezenas de micrômetros, a maioria das
bactérias estudadas nos laboratórios de microbiologia medem em torno 1,0 µm de diâmetro.

Fonte: angellodeco/Shutterstock
 ΜM

Micrômetro: Unidade de comprimento onde 1,0 µm equivale a 1000 mm, ou seja, igual a

1 x 10-6 m).

Você sabe quais são os formatos que as bactérias podem se apresentar?

As bactérias podem se apresentar em três morfologias (Figura 1):

Fonte: Sakurra/Shutterstock
 Figura 1 - Morfologia das bactérias: cocos, bacilos e espiraladas.

COCOS
Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock
 Bactérias em formas de cocos.

Bactérias com formato esférico ou oval e que, de acordo com a sua divisão celular, são
exemplos de cocos de importância médica, Staphylococcus aureus, Enterococcus spp,
Streptococcus sp., Neisseria sp. Esses cocos podem se apresentar em diferentes arranjos:

DIPLOCOCOS
Agrupamento de dois cocos. Os Streptococcus pneumoniae (pneumococo) são diplococos que
podem causar pneumonia, meningite, sinusite e infecção do ouvido médio. Outro exemplo é a
Neisseria gonorrhoeae agente etiológico da gonorreia.

ESTREPTOCOCOS
Vários cocos agrupados em cadeia, lembrando um colar de pérolas. As infecções
estreptocócicas, causadas por várias espécies de Streptococcus, podem desencadear diversos
sintomas, como: pneumonia, faringite, febre escarlatina, impetigo e celulite.

TÉTRADES
Agrupamento de 4 cocos de forma semelhante a um quadrado.

Exemplo: Micrococcus spp., normalmente, não são patogênicos e integram a microbiota.

O aparecimento em uma cultura de sangue (hemocultura) desse tipo de bactéria é sugestivo de

contaminação, que pode ter ocorrido no momento da coleta.

SARCINAS
Agrupamento de 8 cocos unidos de forma semelhante a um cubo. Exemplo: Sarcina ventriculi,
um importante patógeno em gatos, cachorros e bovinos. Em humanos, o potencial patogênico
ainda não é muito bem elucidado, mas tem sido isolado em biopsias gástricas e relacionados
com algumas doenças, como gastrite enfisematosa e perfuração gástrica.

Essa bactéria não é fácil de isolar e cultivar em laboratório de microbiologia. Assim, para o
diagnóstico de gastrite provocada por essa bactéria recomenda-se o exame histopatológico
com colorações de Hematoxilina e eosina.

ESTAFILOCOCOS
Cocos agrupados de forma semelhante ao cacho de uvas. Como exemplo, temos as infecções
por bactérias do gênero Staphylococcus aureus, que causam infecções cutâneas (foliculite,
impetigo, abcessos, celulite), pneumonia, infecções na corrente sanguínea e osteomielite.

BASTONETES OU BACILOS

Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock

 Bastonetes.

São bactérias que apresentam um formato cilíndrico ou de bastão (bastonete), podendo ser
curtas ou longas e apresentar extremidade reta ou de ponta arredondada. Normalmente, os
bacilos não se agrupam em tantos arranjos como os cocos, apresentando-se, na maioria das
vezes, de forma isolada. Entretanto, podem apresentar-se, eventualmente, como diplobacilos
ou estreptobacilos.

DIPLOBACILOS

Agrupamento de dois bacilos.

Em alguns casos, como o da Corynebacterium diphtheriae causadora da difteria, os

bastonetes podem também apresentar arranjos diferenciados, como crescimento em
paliçada ou letras chinesas.

ESTREPTOBACILOS

Agrupamento em cadeia.

Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock

 C. diphteriae.

Fonte: SIRIKWAN DOKUTA/Shutterstock

 Bacilos gram-positivos com agrupamento de letras chinesas.

Algumas doenças causadas por bactérias em formato de bastonete ou bacilos, são:

Tétano - Clostridium tetani

Tuberculose - Mycobacterium tuberculosis

Difteria - Bacilo diftérico

Hanseníase (lepra) - Mycobacterium leprae

É importante destacar que, durante a análise microscópica, alguns bacilos podem ser
confundidos com cocos, isso ocorre pois são bacilos muito curtos. Esses bacilos curtos são
chamados de cocobacilos.

ESPIRALADAS
Fonte: Tatiana Shepeleva/Shutterstock
 Bactérias espiraladas.

Bactérias com formato espiralado ou helicoidal e que ocorrem, predominantemente, como

células isoladas. Elas podem ser divididas em espirilos, espiroquetas e vibriões, conforme
observado na Figura 2.

Fonte: Olga Bolbot/Shutterstock

 Figura 2 - Formas de bactérias espiraladas.

ESPIRILOS
São móveis (locomovem-se com ajuda de flagelos), apresentam formato espiral e corpo rígido.
Ex: Spirillum minus, que causa Febre da mordedura do rato em humanos e macacos.

ESPIROQUETAS
São móveis, mas se locomovem por contrações citoplasmáticas, apresentam formato em
espiral e são mais flexíveis; Ex: Treponema pallidum.
O T. pallium é o agente etiológico da sífilis, uma infecção bacteriana de transmissão sexual e
vertical. Quando não tratada, pode evoluir para formas mais graves, comprometendo
especialmente os sistemas nervoso e cardiovascular. Para o diagnóstico da sífilis, podemos
utilizar:

Métodos diretos a partir de materiais coletados das lesões primárias causadas por essa
bactéria, que permite a visualização do treponema vivo e móvel.

Pode ser feito com material fixado seguido de coloração (pelo método de Fontana de
Tribondeau), mas é de difícil visualização.

Pelos testes imunológicos para detecção de anticorpos-antitreponêmicos (mais

empregado).

VIBRIÕES
São móveis (locomovem-se com ajuda de flagelos) apresentam formato de vírgula. Ex: Vibrio
cholerae, também conhecido como vibrião colérico, é o agente causador da cólera.

CITOLOGIA BACTERIANA
As bactérias pertencem ao grupo dos procariotos e, portanto, não possuem membrana nuclear
(carioteca), bem como não possuem todo o conjunto de organelas das células eucarióticas.
Entretanto, possuem elementos estruturais de grande importância, como a parede celular, que
pode ser corada, permitindo o profissional da saúde identificar e diferenciar os principais
grupos de bactérias.

PAREDE CELULAR

Você sabe por que a parede celular é uma estrutura tão relevante para as bactérias?

Ela é importante na divisão celular, é responsável pela forma, rigidez da bactéria e confere
proteção osmótica entre os meios externo e interno.
A parede celular possui uma espessura de, aproximadamente, 10 a 20 µm, é porosa,
permitindo a passagem de metabólitos para a membrana plasmática, é formada por camadas
rígidas de peptidoglicanos (mureína), e envolve a membrana citoplasmática da maioria dos
procariotos.

As bactérias são classificadas em gram-positivas ou em gram-negativas, de acordo com a cor

de sua parede celular após a realização da coloração de Gram.

A divisão desses dois grupos de bactérias é essencial em um laboratório de microbiologia

clínica. A identificação microscópica de bactérias gram-positivas ou gram-negativas, além de
direcionar os testes de identificação, também permitem que o médico inicie o tratamento
empiricamente, antes mesmo de sair o resultado da cultura e do antibiograma, que demora, no
mínimo, 48 horas.

BACTÉRIA GRAM-POSITIVA

Possui uma parede celular mais espessa, com múltiplas camadas de peptideoglicanos (Figura
3), revestindo a membrana citoplasmática. Além disso, possui outros componentes, como os:

ÁCIDOS TEICOICOS
ÁCIDOS LIPOTEICOICOS

ÁCIDOS TEICOICOS

Polímeros de fosfato de poliol, ligados covalentemente ao peptideoglicano, essenciais para a

viabilidade da célula e considerados fatores importantes na virulência.

ÁCIDOS LIPOTEICOICOS

Possuem um ácido graxo e estão ancorados na membrana plasmática. São considerados

antígenos de superfície, permitem a distinção dos sorotipos bacterianos e a aderência nas
superfícies das células hospedeiras.
 VIRULÊNCIA

A capacidade de um microrganismo de produzir danos que são fatais ou graves, podendo

levar ao óbito (diferente de Patogenicidade que é a capacidade de uma bactéria de
desenvolver uma doença (dano) em um determinado organismo). São exemplos de
fatores de virulências: capacidade de multiplicar, produção de toxinas, produção de
proteínas e enzimas que auxiliam a fuga dos mecanismos de defesa do organismo,
dentre outros.

Dentre as bactérias gram-positivas, temos as que são partes da microbiota normal do

organismo e que, geralmente, não causam doenças e temos aquelas que são patogênicas,
causando difteria, carbúnculo, listeriose, septicemia, pneumonia, entre outros tipos de infecção.

Fonte: Designua/Shutterstock
 Figura 3 - Estrutura básica da parede celular gram-positiva.

BACTÉRIA GRAM-NEGATIVA

Apresenta a parede celular com uma estrutura mais complexa e, quimicamente, diferente
quando comparada à parede celular de gram-positiva (ver Figura 4). Esta parede celular é
composta de uma fina camada de peptideoglicanos (5-10% do peso da parede celular) e
externamente a esta fina camada, encontramos uma membrana externa.
 ATENÇÃO

1) O espaço entre membranas é conhecido como espaço periplasmático.

2) A membrana externa está presente apenas nas bactérias gram-negativas.

MEMBRANA EXTERNA
A membrana externa além de manter a estrutura bacteriana é uma barreira de permeabilidade,
confere proteção contra condições ambientais adversas, como as do sistema digestivo do
hospedeiro e resistência a alguns antimicrobianos como a penicilina. Essa membrana é
formada por uma dupla camada lipídica, onde a camada interna é constituída basicamente de
fosfolipídios e a camada externa possui uma molécula anfipática, o lipopolissacarídeo (LPS) ou
endotoxina e proteínas.

O LPS é essencial para a viabilidade das bactérias, funciona como um potente indutor de
respostas imunológicas, ativando linfócitos B e induzindo a produção de citocinas por
macrófagos, células dendríticas e outras células. Por outro lado, provoca febre e pode causar
choque endotoxêmico, sendo chamado também de endotoxina. As proteínas permitem a
difusão de metabolitos pequenos, antibióticos hidrofílicos, têm função estrutural e atuam como
receptoras para bacteriófagos e outros ligantes.

LPS

O LPS é composto de três secções estruturais: o Lipídeo A, o núcleo polissacarídeo e o

antígeno O. O lipídeo A é responsável pelos efeitos tóxicos do LPS.

As bactérias gram-negativas podem causar uma série de infecções graves nos seres humanos,
como peritonite, pneumonia, infecções urinárias, meningite, dentre outras. É importante
ressaltar que essas bactérias estão cada vez mais resistentes aos antimicrobianos disponíveis
para utilização terapêutica.
Fonte: Designua/Shutterstock
 Figura 4 - Estrutura básica da parede celular Gram-negativa.

 ATENÇÃO

Exceções bacterianas

1) Micobactérias: Bacilos que apresentam a camada de peptideoglicanos da parede celular

com estrutura um pouco diferente, pois é formada por polímeros de arabinogalactano e
revestida por uma capa lipídica cerosa de ácidos micólicos. Devido ao caráter hidrofóbico da
parede celular destas bactérias, a coloração pelo método de Gram não é a de escolha quando
se deseja pesquisar esse tipo de bactéria. No entanto, elas poderão ser diferenciadas pela
característica de álcool-ácido resistência (coloração de Ziehl Neelsen). Exemplo.
Mycobacterium tuberculosis (bacilo da tuberculose). (Figura 5).
Fonte: Wikimedia
 Figura 5 - Estrutura da parede celular de micobactérias.

2) Micoplasmas: São as menores bactérias encontradas na natureza (cerca de 0,3 µm), não
apresentam parede celular e incorporam esteróis do hospedeiro em sua membrana (Figura 6).
O Mycoplasma pneumoniae é um agente causador comum de pneumonia.

ESTERÓIS

Esteróis conferem a membrana celular fluidez e permeabilidade. Essas moléculas estão

presentes na maioria das células eucariotas, na forma de colesterol.

Fonte: Designua/Shutterstock
 Figura 6: Citologia do Micoplasma.
MEMBRANA CELULAR OU MEMBRANA
CITOPLASMÁTICA BACTERIANA

A membrana citoplasmática das bactérias é semipermeável, seletiva, contém várias enzimas,

limita o citoplasma, é constituída de fosfolipídios e proteínas e, portanto, considerada
semelhante à membrana plasmática dos organismos eucarióticos, exceto pelo fato de não
possuírem esteróis.

Citoplasma: O citoplasma da célula bacteriana pode ser dividido em diferentes regiões:

Citoplasmática: rica em RNA; partículas proteicas e ribossomos (responsáveis pela

síntese proteica).

Cromatínica: rica em DNA circular dupla fita.

Porção fluída, com nutrientes dissolvidos.

 ATENÇÃO

Algumas bactérias, como o Vibrio cholerae, podem possuir mais de um DNA; e outras, como a
Borrelia burgdorferi, possuem um DNA linear).

ELEMENTOS ACESSÓRIOS

São estruturas que podem estar ou não presentes em determinadas bactérias. Vários desses
elementos acessórios são importantes na virulência, patogenicidade e resistência bacteriana.
Fonte: Wikipedia
 Estrutura celular bacteriana.

GLICOCÁLICE
O glicocálice consiste em um revestimento de polissacarídeos. Quando o glicocálice apresenta
estrutura uniforme e encontra-se firmemente aderido à parede celular é denominado de
cápsula. Quando as camadas de polissacarídeos possuem pouca aderência e apresentam
espessura não uniforme, são chamadas de camada viscosa. Essa estrutura, além de fornecer
um envoltório protetor, evita a fagocitose pelas células de defesa do organismo, atua como
reservatório de nutrientes e, principalmente, auxilia na aderência bacteriana a algumas
superfícies. Exemplo: o Streptococcus mutans, que através da cápsula fixa e perfura o esmalte
dentário.

A determinação dos constituintes da cápsula é fundamental na identificação de certas bactérias

patogênicas, uma vez que algumas cápsulas são compostas de polipeptídios, ao invés de
polissacarídeos, como ocorre com o Bacillus anthracis (agente do carbúnculo/ antrax).

PLASMÍDEO
Corresponde a um DNA circular extracromossomal, capaz de se replicar de forma autônoma,
localizado no citoplasma da célula bacteriana e que não é responsável por características
essenciais da bactéria. Podem se apresentar em várias cópias, além de possuir a capacidade
de conferir vantagens adaptativas (por exemplo, resistência a antibióticos), podendo, inclusive,
ser transferidos para outras bactérias.

GRÂNULOS OU INCLUSÕES CITOPLASMÁTICAS

São grânulos cuja função é de armazenamento, podendo ser de glicogênio, amido, fosfatos,
enxofre etc. e podem ser visualizados através de colorações especiais, pois, geralmente, são
refringentes.

FLAGELOS
São estruturas de locomoção presentes em algumas bactérias, formadas por subunidades
proteicas acopladas na forma helicoidal (flagelina) e que permitem às bactérias “irem” em
busca de nutrientes ou fugir de substâncias tóxicas. O flagelo fica ancorado na membrana
citoplasmática através do seu corpo basal (similar a um gancho), possui um comprimento
geralmente muito maior que o da célula, e podem ser únicos ou múltiplos, polares (apenas nas
extremidades) ou peritríquios (em todo corpo bacteriano). Embora os flagelos não possam ser
visualizados, normalmente, no microscópio óptico, existem técnicas de coloração que os
tornam visíveis no microscópio óptico e os microbiologistas usam como auxílio no diagnóstico.

Durante a identificação de uma bactéria, a avaliação da motilidade pode ser utilizada para
diferenciar espécies de bactérias. Exemplo: Em uma cultura de fezes (coprocultura), a
presença de bactérias gram-negativas imóveis é indicativa de Shigella sp. e móveis de
Salmonella sp.

PILI E FÍMBRIAS
As fímbrias são estruturas filamentosas, que lembram fios de cabelo no lado de fora da
bactéria, compostas por subunidades proteicas (pilina), que se projetam a partir da superfície
de uma célula e, geralmente, estão em maior quantidade do que os flagelos. As fímbrias
auxiliam na colonização das membranas de mucosas como ocorre no caso da Neisseria
gonorrhoeae, agente causador da gonorreia e, no caso da E. coli, nas células do trato urinário.
Os pili sexuais de uma bactéria se ligam a outras bactérias permitindo a transferência de
material genético na conjugação bacteriana. Esse pili sexuais são codificados por um
plasmídeo.

ESPOROS (ENDOSPOROS)
Produzidos por alguns gêneros de bactérias, como Bacillus e Clostridium, os esporos são uma
estrutura resistente a agentes físicos e químicos, que é formada em resposta ao meio
ambiente, quando este se torna inadequado para a sobrevivência da bactéria (ex.: escassez de
água ou nutrientes). A resistência da forma esporulada possibilita que a bactéria sobreviva por
longos anos em ambientes desfavoráveis, podendo reverter à forma vegetativa quando o local
se tornar viável novamente para sua sobrevida. Cada célula forma um único esporo, que é
liberado quando a bactéria morre.
FATORES DE VIRULÊNCIA E
PATOGENICIDADE DE BACTÉRIAS

FASES DE CRESCIMENTO E FATORES QUE

AFETAM O CRESCIMENTO BACTERIANO
As bactérias, quando inoculadas em meio de cultura adequado e em condições apropriadas,
iniciam processo de duplicação bacteriana, no qual por divisão binária, ocorre aumento da
população de forma logarítmica. O tempo de geração, ou seja, o tempo necessário para que
uma bactéria se duplique varia de acordo com a espécie bacteriana, podendo ser
extremamente curto (E. coli ± 15 minutos) ou bastante longo (M. tuberculosis ± 932 minutos).

 SAIBA MAIS

Para uma cultura de micobactéria ser considerada negativa, temos que esperar, no mínimo, 45
dias de incubação e não ser visualizado nenhum crescimento.

Compreender que o crescimento bacteriano em um meio de cultura apresenta 4 fases, cada

uma com suas características peculiares, é de extrema importância para a escolha do meio de
cultura ideal e das técnicas para isolar e identificar as bactérias em uma rotina laboratorial.
Vamos conhecer essas fases?

Fonte: Wikimedia

FASE LAG
FASE LOGARÍTMICA (FASE LOG OU EXPONENCIAL)
FASE ESTACIONÁRIA OU FASE PLATÔ
FASE DE DECLÍNIO OU MORTE

FASE LAG
Quando bactérias são adicionadas a um meio de cultura (semeadas), elas necessitam de um
tempo para se adaptar ao novo ambiente antes de começar a se dividir. Neste momento, não
há reprodução e a população permanece temporariamente inalterada. É importante ressaltar
que, nesta fase, as células não estão em latência, uma vez que aumentam no tamanho e
fisiologicamente estão muito ativas.

FASE LOGARÍTMICA (FASE LOG OU EXPONENCIAL)

Nesta fase, as células iniciam a divisão que ocorre de forma exponencial, regular e constante.
A velocidade de crescimento é máxima nesta fase, e varia de acordo com a cepa e com as
condições ambientais.

FASE ESTACIONÁRIA OU FASE PLATÔ

Em determinando momento do crescimento bacteriano, haverá carência de nutrientes e

produção de substâncias tóxicas no meio, dessa forma, o número absoluto de bactérias no
meio de cultura permanecerá constante, resultado do equilíbrio entre bactérias que ainda estão
se duplicando e bactérias que estão morrendo.

FASE DE DECLÍNIO OU MORTE

Etapa que ocorre morte bacteriana, pois há falta de nutrientes e de espaço, aliada à toxidez do
ambiente que levam os microrganismos a morrerem mais rápido do que produzirem novas
células (a morte bacteriana nesta fase se dará de forma exponencial ou logarítmica). Sendo
assim, há uma progressiva morte celular até a cultura se tornar estéril.

FATORES AMBIENTAIS QUE AFETAM O

CRESCIMENTO BACTERIANO
Além de nutrientes apropriados, é necessário conhecer as condições físicas ambientais ideais
para o crescimento bacteriano em meio de cultura. Dentre estes, os principais fatores são:

TEMPERATURA

A temperatura ótima de crescimento é aquela que possibilita o maior crescimento, durante o

menor tempo e varia para cada gênero. As bactérias, no geral, são classificadas de acordo
com sua temperatura ótima de crescimento em:

BACTÉRIAS PSICRÓFILAS
Crescem melhor de 12°C e 20°C.

BACTÉRIAS MESÓFILAS
Crescem melhor de 25°C a 40°C. Neste grupo, está a maioria dos patógenos bacterianos de
importância clínica, já que nesta faixa encontra-se a temperatura do corpo humano.

BACTÉRIAS TERMÓFILAS
Crescem melhor de 45°C a 60°C.

 SAIBA MAIS

A temperatura de crescimento também pode ser usada durante a identificação bacteriana.

Exemplo: A N. gonorrhoeae e N. Meningitis não crescem na temperatura de 22°C, mas as
outras espécies de Neisseria sp. são capazes de crescer.

OXIGÊNIO

As bactérias podem ser divididas de acordo com a necessidade e a tolerância ao oxigênio:

BACTÉRIAS AERÓBIAS ESTRITAS
Só crescem na presença de oxigênio. Ex.: Acinetobacter sp.

BACTÉRIAS ANAERÓBIAS FACULTATIVAS

Crescem tanto na presença quanto na ausência de oxigênio. Ex.: E. coli.

BACTÉRIAS MICROAERÓFILAS
Só crescem em ambiente contendo baixas concentrações de oxigênio (menores que as
encontradas no ar atmosférico). Ex.: Campylobacter sp.

BACTÉRIAS ANAERÓBIAS ESTRITAS

Só conseguem crescer na ausência de oxigênio. Em contato com O2, o crescimento dessas
bactérias é inibido ou ocorre morte bacteriana. Ex.: Clostridium botulinum e Neisseria sp.

 SAIBA MAIS

Quanto às espécies de Neisseria, o ideal é semear imediatamente após a coleta em meio

sólido, levar para a estufa 36 °C em jarra com vela ou com gerador de CO2 e umidade.

PH

Normalmente, a grande maioria das bactérias cresce bem em meios com pH neutro, em torno
de 6,5 a 7,5, apesar de muitas espécies tolerarem variações de pH entre 4,0 e 9,0. Os meios
de cultura geralmente são tamponados para impedir mudanças bruscas de pH, decorrentes do
próprio metabolismo das bactérias.

PRESSÃO OSMÓTICA
A pressão osmótica é a pressão que deve ser exercida sobre um sistema para evitar que a
passagem de água por osmose, ou seja, para o meio mais concentrado ocorra. A parede
celular, além da rigidez, impede a entrada excessiva de água. Dessa forma, a pressão
osmótica dos meios de cultura pode afetar diretamente a viabilidade das bactérias. Meios de
cultura com pressões osmóticas menores comparado ao interior da bactéria, normalmente, não
afetam sua viabilidade. De forma diferente, meios de cultura com pressões osmóticas maiores
causam perda de água intracelular, trazendo efeito bacteriostático ou bactericida.

BACTERIOSTÁTICO

Bacteriostáticos são substâncias que inibem o crescimento e a reprodução bacteriana

sem provocar sua morte imediata, sendo reversível o efeito, uma vez retirada a droga.

BACTERICIDA

Bactericidas são substâncias capazes de matar ou lesar irreversivelmente as bactérias.

 SAIBA MAIS

Halofismo - Certas bactérias isoladas de salmouras, pacotes de sal, alimentos e água do mar,
chamadas bactérias halofílicas ou halófitas obrigatórias, crescem apenas quando o meio
contém uma concentração inusitadamente elevada de sal (10% a 15%). Isto representa uma
resposta especial do microrganismo à pressão osmótica.

VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. (ADAPTADA DE IF RS -2018). AS POPULAÇÕES BACTERIANAS
SEGUEM UMA SÉRIE DE FASES DE CRESCIMENTO: LAG, LOGARÍTMICA
OU EXPONENCIAL, ESTACIONÁRIA E DE DECLÍNIO OU MORTE
CELULAR. ANALISE AS ASSERTIVAS ABAIXO:

I. A POPULAÇÃO REDUZ SEGUINDO TAXA LOGARÍTMICA.

II. OCORRE AUMENTO EXPONENCIAL DA POPULAÇÃO.
III. HÁ INTENSA ATIVIDADE DE PREPARAÇÃO PARA O CRESCIMENTO
POPULACIONAL, MAS SEM AUMENTO DA POPULAÇÃO BACTERIANA.
IV. AS MORTES MICROBIANAS SÃO EQUILIBRADAS PELA PRODUÇÃO
DE NOVAS CÉLULAS.

ASSINALE ÚNICA ALTERNATIVA CORRETA QUE RELACIONA

CORRETAMENTE AS ASSERTIVAS I, II, III E IV. COM AS FASES LAG, LOG,
ESTACIONÁRIA E DE MORTE CELULAR:

A) Declínio (I), Log (II), Lag (III), Estacionária (IV)

B) Estacionária (I), Lag (II), Log (III), Declínio (IV)

C) Estacionária (I), Log (II, Lag (III), Declínio (IV)

D) Declínio (I), Lag (II), Log (III), Estacionária (IV)

2. APRENDEMOS QUE A CITOLOGIA BACTERIANA PREVÊ ALGUNS

COMPONENTES BACTERIANOS COMO OBRIGATÓRIOS E OUTROS
COMO ELEMENTOS ACESSÓRIOS, PODENDO OU NÃO ESTAR
PRESENTES EM ALGUNS GRUPOS DE BACTÉRIAS E QUE,
FREQUENTEMENTE, ESTÃO ASSOCIADOS À VIRULÊNCIA,
PATOGENICIDADE, MOTILIDADE, ENTRE OUTRAS FUNÇÕES. ASSINALE
A AFIRMATIVA ABAIXO QUE CONTENHA APENAS EXEMPLOS DE
ELEMENTOS ACESSÓRIOS BACTERIANOS.

A) Parede Celular, Ribossomos, Glicocálice e Fímbrias sexuais.

B) Glicocálice, Plasmídeos, Flagelos e Ribossomos.

C) Plasmídeos, Grânulos citoplasmáticos, Citoplasma e Endosporos.

D) Pili, endósporos, Plasmídeos e Glicocálice.

GABARITO

1. (Adaptada de IF RS -2018). As populações bacterianas seguem uma série de fases de

crescimento: lag, logarítmica ou exponencial, estacionária e de declínio ou morte celular.
Analise as assertivas abaixo:

I. A população reduz seguindo taxa logarítmica.

II. Ocorre aumento exponencial da população.
III. Há intensa atividade de preparação para o crescimento populacional, mas sem
aumento da população bacteriana.
IV. As mortes microbianas são equilibradas pela produção de novas células.

Assinale única alternativa CORRETA que relaciona corretamente as assertivas I, II, III e
IV. com as fases lag, log, estacionária e de morte celular:

A alternativa "A " está correta.

A fase em que a população é reduzida de forma logarítmica – declínio. A fase de aumento

exponencial da população – log. A fase de preparação para o crescimento populacional, mas
sem aumento da população é a lag. A fase onde ocorre equilíbrio entre as mortes microbianas
e a produção de novas células é a estacionária.

2. Aprendemos que a citologia bacteriana prevê alguns componentes bacterianos como

obrigatórios e outros como elementos acessórios, podendo ou não estar presentes em
alguns grupos de bactérias e que, frequentemente, estão associados à virulência,
patogenicidade, motilidade, entre outras funções. Assinale a afirmativa abaixo que
contenha apenas exemplos de elementos acessórios bacterianos.

A alternativa "D " está correta.

Dentre os elementos acessórios estudados neste módulo, temos: plasmídeos, grânulos

citoplasmáticos, fímbrias, glicocálice, esporos e flagelos. Já os componentes obrigatórios,
temos: as membranas celulares, a parede celular (exceção dos micoplasmas), material
genético e ribossomos.

MÓDULO 2
 Reconhecer os tipos de meios de cultura, bem como os testes de sensibilidade aos
antimicrobianos

MEIOS DE CULTURA: COMPOSIÇÃO E

CLASSIFICAÇÃO
Os meios de cultura são capazes de fornecer os nutrientes necessários para o crescimento e
desenvolvimento de microrganismos fora do seu habitat natural. Os meios de cultura
apresentam em sua composição diferentes macronutrientes (carbono, oxigênio, nitrogênio,
enxofre, fósforo e hidrogênio) e micronutrientes (ferro, zinco, manganês, cálcio, potássio, sódio,
cobre, cloro, cobalto, molibdênio, selênio, magnésio, entre tantos outros), necessários à síntese
biológica de novos organismos. Nos laboratórios clínicos, os meios de cultivo podem ser
comprados totalmente prontos ou então serem preparados.
Fonte: angellodeco/Shutterstock

MEIO DE CULTURA

É qualquer substância, sólida, semissólida ou líquida que possua um conjunto de fontes

de nutrientes e que seja utilizada para o cultivo de microrganismos.

Após a coleta de uma amostra biológica, destinada para a cultura e/ou antibiograma, essa será
semeada em meios de culturas capazes de suprir as bactérias com as exigências nutricionais
mínimas, dentro das condições ambientais necessárias para o cultivo, possibilitando o
crescimento microbiano e a formação e visualização de colônias.

Durante a semeadura de uma amostra biológica, por exemplo, o líquor, em casos de suspeita
de meningite, deve-se conhecer os principais agente etiológicos dessa doença para escolher
os meios apropriados (com nutrientes específicos e pH), as condições ideais de crescimento,
como a presença e quantidade de oxigênio ou até mesmo a sua ausência. Todos esses
aspectos são essenciais para auxiliar na identificação bacteriana e na conclusão diagnóstica.

Vamos juntos conhecer um pouco mais sobre a classificação dos meios de culturas.
CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA

Os meios de cultura são classificados a partir do seu estado físico, da sua composição e do
seu objetivo de utilização.

Fonte: SomprasongWittayanupakorn/Shutterstock
 Microbiologista cultivando bactéria em uma placa de Petri contendo meio de cultura.

1) DE ACORDO COM O SEU ESTADO FÍSICO:

Você provavelmente já preparou gelatina na sua casa, correto? Lembra da sua consistência?

Para obtermos diferentes consistências nos meios de cultura, adicionamos ágar-ágar, um

polissacarídeo complexo obtido de alga marinha vermelha e que atua como agente
solidificante, muito semelhante à maneira como a gelatina é utilizada na sua cozinha.

É válido lembrar que, para obtenção de um meio de cultura ideal contendo ágar, deve-se, após
sua adição, aquecer a solução para dissolver o ágar em água fervente até a solução ficar
homogênea. Entretanto, não devemos ferver ou aquecer a solução diversas vezes, pois
podemos provocar alteração no valor nutritivo, no percentual de água e outros parâmetros que
interferiam no crescimento.
Fonte: Yayah_Ai/Shutterstock

MEIOS SÓLIDOS

Obtidos a partir da adição de 1,0 g a 3,0 g % de ágar. A maioria dos microrganismos crescem
formando colônias. Ex: Ágar nutritivo.

 Exemplo de preparação de meio de cultivo sólido. Após preparo, autoclavagem, o meio é

depositado nas placas para solidificar, em ambiente estéril.
Fonte: MyFavoriteTime/Shutterstock

MEIOS SEMISSÓLIDOS

Obtidos, na maioria das vezes, após adição de 0,1 g a 0,7 g %”, separando o 0,7 de g. Dentre
as finalidades, temos a visualização da motilidade bacteriana ou, muitas vezes, servir como
base de meio de transporte. Ex: Meio SIM (meio de detecção da produção de enxofre,
motilidade e produção de indol) e Cary & Blair.

 Exemplo de Meio semi-sólido (SIM) mostrando uma bactéria que não apresenta motilidade.
Fonte: NonSitth/Shutterstock

MEIOS LÍQUIDOS

Não apresentam ágar, são conhecidos como “caldos” e utilizados para ativação das culturas,
repiques de microrganismos, provas bioquímicas, dentre outros. Ex: caldo tetrationato e
selenito-cistina para cultivo de salmonelas, caldo tioglicolato para Clostridium perfringens.

 Meios de culturas líquidos

2) DE ACORDO COM A COMPOSIÇÃO QUÍMICA

MEIOS QUIMICAMENTE DEFINIDOS

MEIOS COMPLEXOS

MEIOS QUIMICAMENTE DEFINIDOS

A composição química de todos os seus constituintes é conhecida (definidos). Ex: Meio AR-
103.

MEIOS COMPLEXOS

A exata constituição do meio de cultura não é conhecida. Esses meios apresentam em sua
composição soro, sangue, extratos moídos ou digeridos de órgãos animais (corações, fígados,
cérebros), peixes, leveduras, e vegetais ou outro componente que não se tem total
conhecimento da composição química. Ex: Ágar sangue.

3) DE ACORDO COM O OBJETIVO DA UTILIZAÇÃO

MEIOS ENRIQUECIDOS OU RICOS

São os meios que contêm um grande suprimento de nutrientes pela adição de diversas
substâncias como sangue, soro, extratos de tecidos animais ou vegetais ao caldo ou até
mesmo ágar nutritivos, para permitir o crescimento de bactérias fastidiosas (nutricionalmente
exigentes), como Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp.

 EXEMPLO

O ágar-sangue (ágar nutriente com 5% de eritrócitos de carneiro) e o ágar-chocolate (ágar

nutriente com hemoglobina em pó) são exemplos de meios enriquecidos utilizados de forma
rotineira nos laboratórios de bacteriologia clínica.
Fonte: Jarun Ontakrai/Shutterstock
 Colônias de bactérias crescidas em meio ágar sangue

MEIOS SELETIVOS

São meios que apresentam em sua composição substâncias químicas específicas (inibidores)
adicionadas ao caldo ou ao ágar nutritivo que previnem o crescimento de um determinado
grupo de bactérias. É importante ressaltar que os inibidores atuam em um grupo específico de
bactéria, favorecendo apenas o crescimento da bactéria de interesse.

 EXEMPLO

O ágar MacConkey é um meio seletivo pois tem em sua composição sais biliares e cristais
violeta que inibe o crescimento da maioria das bactérias gram-positivas, permitindo o
crescimento apenas das bactérias gram-negativas.

MEIOS DIFERENCIAIS OU INDICADORES

Contêm certos reagentes ou substâncias no meio que permitem a distinção de diferentes tipos
de bactérias.

 EXEMPLO

O Ágar MacConkey, além de um meio de cultura seletivo, é, frequentemente, utilizado para

diferenciar bacilos gram-negativos isolados de amostras fecais. As bactérias gram-negativas
que fermentam a lactose (um ingrediente do ágar MacConkey) produzem colônias rosas
(Figura 7A), como E. coli, enquanto aquelas incapazes de fermentar a lactose produzem
colônias incolores e amarelas (Figura 7B), como Acinetobacter baumanii.

COLÔNIAS ROSAS

Bactérias gram-negativas que fermentam a lactose crescem produzindo colônias rosas.

Fonte: NonSitth/Shutterstock
Fonte: REJO JACOB JOSEPH/Shutterstock
 Figura 7 - Diferença da coloração das colônias de bactérias gram-negativas fermentadoras
e não fermentadoras de lactose em Agar MacConkey.

Agora que você conheceu esse meio de cultura, imagina por que temos essa diferença?

Como mencionado anteriormente, a lactose é um nutriente presente no Ágar MacConkey e,

além desse nutriente, o meio apresenta um indicador de pH (que permite a alteração da
coloração do meio de acordo com o pH). Bactérias que são capazes de metabolizar a lactose
produzem ácidos mistos que alteram o pH do meio que fica com uma cor rosa/ avermelhado.
De forma diferente, as bactérias que não fermentam a lactose, utilizam como fonte de energia a
peptona. A peptona, ao ser metabolizada, produz amônia, que eleva o pH do meio e torna as
colônias e o meio amarelados/ sem cor.

 EXEMPLO

Outro exemplo de meio seletivo é o ágar manitol salgado. Esse meio de cultivo é composto de
manitol e alta concentração de sal (7,5% de NaCL). Na rotina laboratorial ele é utilizado para o
isolamento de Staphylococcus aureus a partir de diferentes amostras biológicas. Todas as
espécies de Staphylococcus são capazes de crescer nesse meio, mas o S. aureus é capaz de
fermentar o manitol presente no meio, produzindo ácido, que torna o meio e as colônias
amareladas. As outras espécies de estafilococos, como os Staphylococcus epidermidis e o
Bacillus subtillis não metabolizam o manitol, apresentando assim colônias brancas.
Fonte: OneMashi/Shutterstock
 S.aureus e S.epidermidis cultivadas em ágar manitol.

MEIOS DE TRANSPORTE

Geralmente, são semissólidos e possuem o mínimo de nutrientes para a manutenção das

bactérias, durante o tempo de transporte, sem que estas se reproduzam ou acidifiquem o meio.
Atualmente, para auxiliar na coleta de algumas amostras biológicas destinadas à cultura e à
antibiograma, como secreções vaginais, é utilizado um Swab. Após a coleta, eles são
armazenados em um tubo que contém o meio de transporte (ex: meio Stuart – permite uma
boa conservação de bactérias patogênicas como Salmonella spp. e Shigella spp.)

SWAB
 Fonte: MedstockPhotos/Shutterstock
 Swab com meio de transporte que pode ser usado para coleta de amostras de
secreção vaginal.

TESTE DE SENSIBILIDADE AOS

ANTIMICROBIANOS (TSA)
Uma tarefa importante do laboratório de microbiologia clínica é a realização de testes de
sensibilidade aos antimicrobianos a partir de isolados bacterianos. Os objetivos dos testes são
detectar uma possível resistência aos antibióticos em patógenos comuns, nortear a escolha do
antibiótico mais adequado a fim de predizer o sucesso do esquema terapêutico para infecções
específicas.

Os testes usados incluem macrodiluição em tubos, microdiluição em caldo e o método de disco

difusão. O método de disco difusão fornece flexibilidade e apresenta baixo custo. Cada método
tem pontos fortes e fracos, incluindo organismos que podem ser testados com precisão pelo
método. Alguns métodos fornecem resultados quantitativos (por exemplo, concentração
inibitória mínima) e todos fornecem avaliações qualitativas usando as categorias de suscetível,
intermediário ou resistente.

Fonte: aslysun/Shutterstock

Em geral esses métodos são recomendados para ajudar a direcionar o tratamento do paciente.
É importante ressaltar que a detecção precisa dos mecanismos de resistências das bactérias
são utilizados para fins epidemiológicos e medidas de contenção destas bactérias resistentes.

Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (2008): o TSA é sempre realizado na

avaliação das seguintes bactérias:

Enterobactérias

Pseudomonas spp.

Acinetobacter spp.

Staphylococcus spp.

Enterococcus spp.

Streptococcus pneumoniae

Streptococcus do grupo viridans e beta-hemolítico

 Haemophilus influenzae

Complexo Burkholderia cepacia

Stenotrophomonas maltophilia

Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis

 ATENÇÃO

A padronização das etapas relacionadas à realização dos TSA (da escolha dos antibióticos até
a interpretação dos resultados) é feita por organizações especializadas, que elaboram
documentos, os quais apresentam com riqueza de detalhes como realizar e interpretar os
testes de sensibilidade. Tais organizações são:

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, EUA)

European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST, Europa)

Brazilian Committee on Antimicrobial Susceptibility testing (BrCAST, Brasil)

British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC, Reino Unido)

Comité de L’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA-SFM, França)

A seguir, verificaremos as diferentes técnicas empregadas na realização dos TSA, trazendo

algumas de suas vantagens e desvantagens.

Independentemente da técnica escolhida pelo laboratório de microbiologia, todas as etapas

devem ser rigorosamente controladas. O bom emprego do controle de qualidade é a melhor
forma de garantir a confiabilidade e reprodutibilidade dos resultados. Além disso, deve ser feito
seguindo as normas de biossegurança.
MACRODILUIÇÃO EM TUBOS

Um dos primeiros testes de susceptibilidade antimicrobiana desenvolvido foi a macrodiluição

em tubos. Este procedimento envolve:

Preparar diluições seriadas de antimicrobianos (por exemplo, 1, 2, 4, 8 e 16

microgramas/mL) em meio de cultura líquido.

Inocular os tubos contendo antimicrobianos com uma suspensão bacteriana padronizada

em torno de 5 X 105 UFC (Unidade Formadora de Colônia ) /mL.

Incubar por de 18 a 24 horas, a 35°C.

Examinar a presença de turbidez, que evidencia o crescimento microbiano. O primeiro

tubo da série que apresentar aparência límpida (sem turbidez) representa a concentração
inibitória mínima (CIM ou MIC).

CIM OU MIC

A sensibilidade dos microrganismos aos antimicrobianos é representada pela

concentração inibitória mínima (CIM ou MIC) de cada microrganismo para cada
antimicrobiano, que corresponde à menor concentração do antimicrobiano capaz de inibir
o desenvolvimento visível do microrganismo.
Fonte: ANVISA
 Macrodiluição em tubos. Nesse exemplo está ilustrado um antibiótico testado nas
concentrações 0, 0,25, ,0,5, 1, 2 4 e 8 µg/mL.

A vantagem da macrodiluição em tubo é a geração de um resultado quantitativo (CIM ou MIC).

As desvantagens correspondem ao trabalho manual que leva a possibilidade de erros durante
o preparo de soluções de antibióticos para cada antibiótico testado, a quantidade relativamente
grande de reagentes e o espaço necessário para cada teste.

MICRODILUIÇÃO EM CALDO

A técnica de microdiluição em caldo é a técnica de macrodiluição, realizada em placas estéreis

de 96 poços. Essa adaptação tornou esse teste mais prático e popular. A seguir, o passo a
passo desta técnica:

PASSO 1
PASSO 2
PASSO 3
PASSO 4
PASSO 1

Preparar diluições seriadas de antimicrobianos (até 8 diluições logarítmicas) de até 12

antimicrobianos.

PASSO 2

Inocular as bactérias a serem testadas obtendo-se uma concentração bacteriana final de

aproximadamente 5 x 104 - 105 UFC/mL por poço.

PASSO 3

Incubar as placas (também chamadas de painéis) de microdiluição a 35 ± 2ºC por 18 a 24

horas (dependendo do gênero bacteriano e do antimicrobiano testado).

PASSO 4

Realizar a leitura da placa visualmente e, de preferência, com luminosidade ambiente, para

facilitar a leitura, observando a turbidez.

 SAIBA MAIS

Poucos laboratórios de microbiologia clínica preparam suas próprias placas. Normalmente, os

laboratórios compram painéis, com os antibióticos já liofilizados ou congelados nas diluições
necessárias, de fornecedores comerciais. Além disso, alguns laboratórios clínicos utilizam a
metodologia automatizada, que realiza essa análise através do MIC.

Vantagens do procedimento de microdiluição incluem a geração de um resultado quantitativo

(CIM ou MIC), a reprodutibilidade dos resultados, a conveniência de poder utilizar painéis pré-
preparados, e a economia de reagentes e espaço que ocorre devido à miniaturização do teste.
A geração de relatórios computadorizados também é possível se um leitor de painel for
utilizado. A principal desvantagem do método de microdiluição é a inflexibilidade das seleções
de drogas disponíveis em painéis comerciais padrão, além do custo de cada placa de
microdiluição.

PROVA DE SENSIBILIDADE COM DISCOS DE

PAPEL EM MEIO SÓLIDO

O teste de disco-difusão em ágar, também chamado de técnica de Kirby-Bauer em

homenagem aos microbiologistas que descreveram este teste em 1966, é um dos métodos de
sensibilidade mais simples, prático, confiável e mais utilizado nos laboratórios de microbiologia,
fornecendo resultados qualitativos. A seguir, o passo a passo desta técnica.

Fonte: eczserapyilmaz/Shutterstock
 Teste de disco-difusão em ágar.

TÉCNICA
 Toda a etapa deve ser realizada de forma estéril, seguindo as normas de biossegurança
do laboratório.

Fonte do protocolo da técnica: (adaptado do NCCLS ‘M2-A8—Performance Standards for

Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard—Eighth Edition (ISBN 1-
56238-485-6). Cópias da atual edição podem ser obtidas no seguinte endereço: NCCLS,
940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898, USA):

Vamos ao passo a passo:

Método do crescimento

PASSO 1
Após crescimento em placa de ágar (24 horas), selecionar de três a cinco colônias, bem
isoladas, do mesmo tipo morfológico. A superfície de cada colônia é tocada com uma alça, e os
microrganismos são transferidos para um tubo contendo 4-5 mL de NaCL 0,9% (salina) estéril.

PASSO 2
Incuba-se a cultura na salina até alcançar a turbidez de uma solução padrão de McFarland
0,5.

DEFINIÇÃO DE ESCALA DE MACFARLAND:

Escala de nefelométrica de turvação. Essa é uma escala que possibilita verificar a

concentração bacteriana pela intensidade de turvação do meio. Quanto maior a turvação
do meio, maior a concentração bacteriana, maior opacidade e mais difícil é a passagem
de luz.

Essa escala é composta de 11 tubos numerados de 0,5 a 10, onde o tubo 0,5 (indica uma

concentração bacteriana de 1,0 a 2,0 x 108 colônias/mL. e o tubo 10 -30 x 108

colônias/mL). Ao preparar uma suspensão de bactérias para realização do antibiograma é
feito a comparação visual com os tubos padrão da escala. A leitura é feita a olho nu
utilizando um cartão de fundo branco com linhas pretas no fundo, ou então através de um
espectrofotômetro.
 Fonte: Imagem adaptada
 Escala de MacFarland. Imagem adaptada.

Inoculação das placas de teste

PASSO 1
Após a preparação da suspensão bacteriana, mergulha-se um swab de algodão estéril na
suspensão. Essa etapa deve ser realizada em até 15 minutos após ajustar a turbidez da
suspensão. O swab deve ser girado várias vezes e apertado firmemente contra a parede
interna do tubo, acima do nível do líquido, o que ajuda a retirar qualquer excesso de inóculo no
swab.

PASSO 2
A superfície da placa de ágar Müeller-Hinton é inoculada esfregando o swab em toda a
superfície estéril do ágar. Repete-se o procedimento esfregando outras duas vezes, girando a
placa aproximadamente 60° cada vez, a fim de assegurar a distribuição uniforme do inóculo.
Após a distribuição, passa-se um swab na margem de toda a placa de ágar, completando pelo
menos uma volta completa.

PASSO 3
A tampa pode ser deixada entreaberta de três a cinco minutos de maneira a permitir que
qualquer excesso de umidade seja absorvido antes de se aplicar os discos impregnados de
droga. No entanto, a placa não pode ultrapassar 15 minutos aberta.

Devemos evitar inóculos com alta concentração de bactérias. Nunca devemos usar culturas em
caldo, não diluídas, do dia anterior, ou outros inóculos não padronizados para semear nessas
placas.

ÁGAR MÜELLER-HINTON

Meio de cultura preconizado para os testes de sensibilidade da maioria das bactérias de

interesse médico.

Aplicação de discos a placas de ágar inoculadas

PASSO 1
O conjunto de antibióticos é previamente definido. Esses são discos de papeis de filtros
impregnados com concentrações definidas de antibióticos. Os discos de antibióticos são
colocados na superfície de placa de ágar anteriormente semeada, com auxílio de uma pinça ou
com um dispensador. Ao ser colocado, cada disco deve ser pressionado de maneira a
assegurar o contato completo do disco com a superfície de ágar. Os discos devem ser
distribuídos mantendo a distância entre os centros de pelo menos 24 mm. Em geral, deve-se
colocar 12 discos, no máximo, em uma placa de 150 mm, ou cinco discos em uma placa de
100 mm.

Algumas drogas difundem-se quase instantaneamente quando em contato com o meio. O disco
não deve ser reaplicado após ter entrado em contato com a superfície de ágar. Em vez disso,
coloque um novo disco em outra parte da placa.

PASSO 2
As placas devem ser invertidas e colocadas em uma estufa, a 35° C, até 15 minutos após a
aplicação dos discos. No entanto, no caso das cepas de Haemophilus spp., N. gonorrhoeae e
dos estreptococos, as placas não devem ser incubadas em atmosfera enriquecida com CO2,

porque os padrões de interpretação foram estabelecidos usando incubação em ar ambiente, e

o CO2 irá alterar significativamente o tamanho dos halos de inibição de alguns antibióticos.

Leitura das placas e interpretação dos resultados

PASSO 1
A leitura é realizada após 18 a 24 horas de incubação. Inicialmente, analisamos a superfície da
placa para verificar se a semeadura foi satisfatória. Em seguida, os halos (diâmetros) devem
ser medidos, em milímetros, com auxílio de paquímetro ou uma régua. Para isso, a placa deve
ser invertida, e a régua ou o paquímetro apoiado na parte de trás da placa. As medidas devem
ser feitas contra uma fonte luminosa.

FONTE LUMINOSA

Normalmente, o teste de sensibilidade das espécies de estreptococos é feito adicionando

sangue à base de ágar Müeller-Hinton . Nesse caso, os halos deverão ser medidos a
partir da superfície superior do ágar iluminada com luz refletida, uma vez retirada a
tampa. E não confundir o halo de hemólise, característico nessas bactérias com halo de
inibição.

Se a placa foi satisfatoriamente semeada, e o inóculo era correto, os halos de inibição

resultantes serão uniformemente circulares e haverá um tapete confluente de
crescimento. Se colônias individuais forem aparentes, o inóculo era demasiado leve e o
teste deverá ser repetido.

O halo de inibição é a área sem crescimento detectável a olho nu.

Cuidado:

O crescimento de pequenas colônias, detectável apenas com lente de aumento, na

margem do halo de inibição do crescimento deve ser ignorado.

Crescimento discreto de colônias dentro de um halo de inibição, o teste deverá ser

repetido com uma cultura ou subcultura pura de uma única colônia, isolada da placa de
cultura primária. Se pequenas colônias continuarem a crescer no halo de inibição, o halo
de inibição livre de colônias deve ser medido.

PASSO 2
Com a medida de cada halo (diâmetro) a bactéria testada é classificada, como sensível,
intermediário, ou resistente em relação aos agentes antimicrobianos testados, usando como
comparação o tamanho dos halos preconizados pelas organizações internacionais (CLSI,
BSAC e BrCAST).

Vantagens desse método: Simplicidade do teste; não requer nenhum equipamento especial;
os resultados categóricos facilmente interpretados; flexibilidade na seleção de discos para
teste; baixo custo e de fácil execução.

Desvantagens: Teste manual, sem automação; não pode ser utilizado para verificar a
resistência a alguns microrganismos, pois falta padronização do método.

Exemplo: Para avaliar o perfil de sensibilidade do S. pneumoniae versus ceftriaxona, deve ser
feito o teste do MIC (quantitativo). De acordo com o CLSI (2018), esse método não pode ser
mais utilizado para verificar o perfil de sensibilidade da polimixina B nas bactérias gram
negativas, pois a polimixina apresenta baixa difusão no Agar, sendo preconizado a
microdiluição.

Qual é a acurácia aceitável de um teste de suscetibilidade?

Quando desejamos mediar a acurácia de um novo método de suscetibilidade, é importante

testar um número representativo de cepas bacterianas resistentes a diferentes antibióticos e de
cepas suscetíveis no novo método de suscetibilidade e no método padronizado. A partir desses
resultados, conseguimos comparar e verificar se o método em estudo é capaz de detectar as
bactérias que são verdadeiramente resistentes e sensíveis e determinar a taxa de erros que
podem ser esperados em um ambiente de laboratório clínico.

O surgimento de novos mecanismos de resistências antimicrobianas, incluindo alguns que

podem ser difíceis de detectar (por exemplo, susceptibilidade intermediária à vancomicina em
S. aureus e produção de carbapenemase em alguns organismos gram-negativos) requer que
o desempenho dos dispositivos de susceptibilidade seja constantemente reavaliado e
atualizado quando necessário.

ACURÁCIA

Refere-se ao grau em que o teste é capaz de determinar o verdadeiro valor do que está
sendo medido.
 CARBAPENEMASE

Enzimas capazes de clivar os antibióticos da classe carbapenêmicos. Em infecções por

bactérias gram-negativas resistentes à grande maioria dos antibióticos, os antibióticos
carbapenêmicos (Imipinem e Meropenem) representam a única escolha para o
tratamento eficaz. No entanto, nos últimos anos, algumas bactérias adquiriram resistência
a esses antibióticos, diminuindo assim a possibilidade terapêutica e a necessidade de
busca de novas drogas e métodos rápidos de confirmação da resistência bacteriana.

TESTE DE SENSIBILIDADE NA PRÁTICA

VERIFICANDO O APRENDIZADO

1. APRENDEMOS QUE OS MEIOS DE CULTURA SÃO COMPOSTOS DE

NUTRIENTES NECESSÁRIOS PARA O CULTIVO DE MICRORGANISMOS E
PODEM SER CLASSIFICADOS COMO SÓLIDOS, SEMISSÓLIDOS OU
LÍQUIDOS. ALÉM DISSO, ALGUNS MEIOS CONTÊM SUBSTÂNCIAS
QUÍMICAS ESPECÍFICAS ADICIONADAS AO CALDO OU AO ÁGAR
NUTRITIVO QUE PREVINEM O CRESCIMENTO DE UM DETERMINADO
GRUPO DE BACTÉRIAS SEM AGIR SOBRE OUTRO. ESSES MEIOS DE
CULTURA SÃO CHAMADOS DE:

A) Diferenciais

B) Seletivos

C) Enriquecidos

D) De transporte

2. ESTUDAMOS QUE O ANTIBIOGRAMA PERMITE A IDENTIFICAÇÃO DA

SENSIBILIDADE DE BACTÉRIAS ISOLADAS A UM PAINEL DE
ANTIBIÓTICOS. EM RELAÇÃO AO TESTE DE SENSIBILIDADE DE DISCO-
DIFUSÃO EM ÁGAR, ASSINALE A AFIRMATIVA QUE CONTENHA UMA
VANTAGEM DESTE TESTE:
A) Pode ser feito de forma automatizada.

B) É um método quantitativo.

C) Flexibilidade quanto à escolha dos antimicrobianos.

D) Requer utilização de equipamentos especiais.

GABARITO

1. Aprendemos que os meios de cultura são compostos de nutrientes necessários para o

cultivo de microrganismos e podem ser classificados como sólidos, semissólidos ou
líquidos. Além disso, alguns meios contêm substâncias químicas específicas
adicionadas ao caldo ou ao ágar nutritivo que previnem o crescimento de um
determinado grupo de bactérias sem agir sobre outro. Esses meios de cultura são
chamados de:

A alternativa "B " está correta.

Meios seletivos são os que contém substâncias que inibem o desenvolvimento de

determinados grupos de microrganismos, permitindo o crescimento de outros.

2. Estudamos que o antibiograma permite a identificação da sensibilidade de bactérias

isoladas a um painel de antibióticos. Em relação ao teste de sensibilidade de disco-
difusão em ágar, assinale a afirmativa que contenha uma vantagem deste teste:

A alternativa "C " está correta.

O teste de sensibilidade de disco-difusão em ágar não pode ser feito de forma automatizada, é
um método qualitativo e não requer utilização de equipamentos especiais. Entretanto, permite
ao microbiologista uma ampla escolha de antibióticos a serem utilizados, proporcionando,
portanto, flexibilidade quanto à escolha.

MÓDULO 3
 Distinguir os métodos de visualização e coloração na prática laboratorial
INTRODUÇÃO
Vimos no módulo 1 que as características das células bacterianas, bem como sua morfologia,
são essenciais para entendermos e aplicarmos as técnicas de coloração bacterianas. No
entanto, uma vez que as bactérias são seres microscópios, não podemos enxergá-las a olho
nu, e necessitamos do auxílio dos microscópios:

Óptico – permitem aumentos de até 1000 vezes.

Eletrônicos – permitem aumentos de 10.000 vezes (varredura) e 1.000.000 vezes

(transmissão).

No dia a dia dos microbiologistas, a forma mais comum de se examinar os microrganismos é

utilizando técnicas associadas ao microscópio óptico.

Fonte: Konstantin Kolosov/Shutterstock

TODA BACTÉRIA PRECISA SER CORADA PARA

SER VISUALIZADA?
SIM NÃO

A RESPOSTA CORRETA É “NÃO”!

De uma maneira geral, as bactérias vivas podem ser observadas quanto à forma e
movimentos, a partir de material biológico em suspensão (uma gota) entre lâmina e
lamínula (sem formar bolha). Esta preparação é conhecida como a fresco e exige um
bom manuseio do microscópio por parte do microbiologista, uma vez que é necessário
fazer ajustes de intensidade da luz, regular bem o condensador, se possível empregar
filtros para uma melhora na qualidade da imagem a ser visualizada e, geralmente, utilizar
um microscópio de campo escuro.

CORRETO!

De uma maneira geral, as bactérias vivas podem ser observadas quanto à forma e
movimentos, a partir de material biológico em suspensão (uma gota) entre lâmina e
lamínula (sem formar bolha). Esta preparação é conhecida como a fresco e exige um
bom manuseio do microscópio por parte do microbiologista, uma vez que é necessário
fazer ajustes de intensidade da luz, regular bem o condensador, se possível empregar
filtros para uma melhora na qualidade da imagem a ser visualizada e, geralmente, utilizar
um microscópio de campo escuro.

E quando preferimos este tipo de preparo?

Quando nossa intenção é visualizar a mobilidade e a morfologia de bactérias espiraladas, as

quais sob fixação ficam distorcidas, ou até mesmo observar alterações na divisão celular e
formação de esporos.

Como é de se esperar, na preparação a fresco, por não utilizar corantes, as bactérias são
vistas sem cor (incolores), mesmos que estas sejam capazes de produzir cor quando
cultivadas em meios de cultura específicos. Para uma melhor visualização da morfologia e
citologia bacteriana, vários corantes passaram a ser utilizados e os microrganismos são
corados após os microrganismos serem fixados na lâmina (mortos), na maioria das vezes, pelo
calor, etapa chamada de fixação. A fixação permite que a bactéria fique aderida à lâmina e
evita que as bactérias sejam lavadas e perdidas durante a coloração. No entanto, antes da
etapa de fixação e coloração, devemos lembrar da importância da realização de um bom
esfregaço, que deve ser:

Pouco espesso

Bem homogêneo

Realizado em área de segurança biológica, a partir de um caldo ou material diluído em

solução salina, espalhado com alça bacteriológica em lâmina limpa e seca

 ATENÇÃO

Todas as manipulações devem ser feitas seguindo as normas de biossegurança e, de forma

estéril, para não haver contaminação das amostras e resultados falso positivos. Ao final, todos
os resíduos produzidos devem ser autoclavados antes de descartados.

As técnicas de coloração podem ser classificadas de acordo com o número de corantes

utilizados em:

Coloração simples: Quando utilizamos apenas um único corante para observar a

morfologia bacteriana;

Coloração diferencial: Quando utilizamos mais de um corante, além de mordentes e do

diferenciador para identificar diferenças entre grupos de bactérias. Dentre os métodos
(colorações) diferenciais, também chamados de seletivos, de maior importância dentro de
laboratórios de Microbiologia Clínica, temos os de Gram, de Ziehl-Neelsen e de Albert-
Laybourn. Além destes, destaca-se ainda o método de Fontana-Tribondeau, que,
embora não seja diferencial, ainda é utilizado por alguns microbiologistas. Também
existem métodos de coloração pouco utilizados, mas que podem ser úteis quando há
necessidade de evidenciar algumas estruturas bacterianas, como a coloração de flagelos,
esporos e cápsula.
 MORDENTE

Substância utilizada durante a fixação que tem a função de manter a durabilidade da

coloração.

COLORAÇÃO DE GRAM

Esta técnica foi desenvolvida em 1884, pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim
Gram, e é a mais utilizada em bacteriologia por permitir distinguir bactérias gram-positivas de
bactérias gram-negativas. Diferenças nas características químicas e estruturais das paredes
celulares, bem como na permeabilidade aos reagentes químicos nestes dois grupos de
bactérias levam a diferenças de coloração.

Fonte: Schira/Shutterstock
 Coloração de GRAM. À esquerda, bactérias gram-negativas. Á direita, bactérias gram-
positivas.

Como realizamos essa coloração? Vamos conhecer?

Na técnica de Gram, utilizamos:

 Corante básico (violeta genciana, cristal-violeta, metilvioleta).

Mordente (solução iodo-iodetada, conhecida como lugol) que aumenta a afinidade da

célula pelo primeiro corante utilizado (corante básico). Ocorre assim a ligação do corante
com o lugol e a formação de um composto roxo, insolúvel que cora o espaço
protoplasmático e a parede celular de roxo.

Agente descolorante (álcool a 95% ou álcool-acetona).

Nas bactérias gram-positivas, as quais o corante está fortemente retido devido à

espessa camada de peptideoglicanos, este não é facilmente removido pela ação
do agente descolorante.

Nas bactérias gram-negativas, nas quais o agente descolorante remove a

membrana externa da parede destas bactérias, e devido à fina camada de
peptideoglicanos, estas bactérias não conseguem reter o corante.

Segundo corante básico (safranina ou fucsina) que cora as bactérias gram-negativas,

recentemente descoradas, de vermelhas. As gram-positivas permanecem roxas.

 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal

Dessa forma, ao final da coloração de gram, as bactérias gram-positivas serão visualizadas no

microscópio com cor roxa e as gram-negativas com cor vermelha. De uma forma geral, a
literatura científica evidencia que, geralmente, os cocos de importância médica são gram-
positivos (exceção do gênero Neisseria), e os bastonetes gram-negativos (exceção dos
gêneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus e Clostridium).

 ATENÇÃO

É muito importante a utilização de culturas jovens para evitar resultados falsos.

A COLORAÇÃO DE GRAM NA PRÁTICA

COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
No módulo 1, você aprendeu que existem bactérias cuja parede celular fogem da classificação
como gram-positivas e gram-negativas, pois possuem acima da camada de peptideoglicanos,
uma camada denominada Micolato Arabinogalactano, formada por polímeros de
arabinogalactano (açúcares) e revestida por uma porção lipídica de ácidos micólicos. Esta
constituição torna a parede celular hidrofóbica, dificultando a penetração de corantes aquosos,
bem como a ação do lugol e, portanto, impedindo a identificação e a diferenciação desse tipo
de bactéria através da coloração de Gram.

Entretanto, em 1882, um bacteriologista chamado Franz Ziehl e um patologista alemão

Friedrich Carl Adolf Neelsen, evidenciaram que alguns gêneros bacterianos, como
Micobacterium e Nocardia são capazes de resistir a descoloração com uma solução de álcool-
ácido, após tratamento com fucsina fenicada aquecida, de forma que permanecem vermelhas,
diferentemente de outras bactérias, que, por não possuírem esta propriedade, apresentam a
cor do corante de fundo, normalmente, feita com azul de metileno.

Fonte: Wikipedia
 Friedrich Carl Adolf Neelsen

Sendo assim, estes gêneros receberam a denominação de BAAR (Bacilos-Álcool-Ácido-

Resistente), e esta capacidade de álcool-ácido-resistência está relacionada à hidrofobicidade
da parede celular, assegurada pela presença de lipídeos como o ácido micólico. Quanto à
coloração, esta ficou conhecida como coloração de Ziehl-Neelsen.

Como realizamos essa coloração? Vamos conhecer?

Na técnica de Ziehl-Neelsen, após a confecção do esfregaço, fixamos os esfregaços no calor.

Após este passo, é depositado a solução de fucsina de Zieel e aquecemos o corante até a
emissão de vapores (sem ferver), esse procedimento deve ser feito 3 vezes e deve durar até 5
minutos. Em seguida, lavamos a lâmina com água e realizamos a descoloração com solução
de álcool-ácido clorídrico a 1%. Na sequência, o esfregaço deve ser coberto com azul de
metileno, por meio minuto, a lâmina é lavada com água corrente e, após secar, está pronta
para ser observada no microscópio óptico (objetiva 100 X). Os BAAR serão visualizados como
bastonetes finos, vermelhos, sobre fundo corado em azul.

Fonte: Douglas Olivares/Shutterstock

 Bacilos (rosa) evidenciados pela coloração de Ziehl-Neelsen
em um paciente com tuberculose pulmonar avançada e AIDS, amostra escarro.

 SAIBA MAIS

A análise do escarro pela coloração de BAAR é um método simples, barato e muito importante
para o diagnóstico da tuberculose, pois confere um resultado precoce (quando realizado de
forma correta). Além disso, permite o acompanhamento a evolução do tratamento de pacientes
com essa doença. Pacientes com sinais e sintomas (febre vespertina, tosse persistente por
mais de 3 semanas, emagrecimento, com imagem no raio x) que apresentam bacilos gram-
negativos no escarro em amostras coradas pela ZH indicam a presença do M. tuberculosis. No
entanto, é importante destacar que outras micobactérias se coram por essa técnica e esse
método. Para diferenciar as espécies, é necessário cultura.

Essa técnica pode ser realizada em outras amostras, como: urina, líquidos pleurais, lavado
bronco alveolar, aspirado traqueal, biópsias e líquor.
COLORAÇÃO DE ALBERT-LAYBOURN
Algumas bactérias apresentam corpúsculos citoplasmáticos (corpúsculos metacromáticos ou
corpúsculos de Babes Ernst) nas suas extremidades e que podem ser corados pelo Lugol forte
(com cor marrom), em contraste com o corpo do bacilo, que se cora em esverdeado/azulado
pela solução de Laybourn. Esta técnica é uma técnica simples que foi sugerida em 1920 por
Henry Albert e, posteriormente, foi modificada por Ross Laybourn, em 1924.

Os corpúsculos citoplasmáticos são encontrados no gênero Corynebacterium diphtheriae,

agente causador de sintomas clínicos característicos da difteria. Desta forma, a pesquisa por
bacilos metacromáticos cuidadosamente coletados da oro e nasofaringe serve como um
método auxiliar no diagnóstico da difteria.

DIFTERIA

A difteria (ou crupe) é uma doença de origem bacterina, que acomete as amígdalas,
laringe, faringe, nariz, conjuntiva e pele, causando amidalite com o aparecimento de
placas bacterianas bem amareladas, dificuldades respiratórias e até mesmo parada
respiratória com óbito. Essa doença é causada pela bactéria Corynebacterium diphtheriae
e pode ser transmitida por meio das vias respiratórias ou então através de contato físico.
Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock
 Ilustração microscópica de Corynebacterium diphtheria.

Como é feita essa coloração?

Após a obtenção do esfregaço, este é corado com a solução de Albert-Layborn durante 5

minutos. Após esse período, o corante deve ser retirado e a lâmina coberta com a solução de
Lugol forte, por 2 minutos. Em seguida, com as lâminas secas, elas podem ser analisadas no
microscópio. O resultado é considerado positivo quando há presença de grânulos
metacromáticos no citoplasma de bacilos com morfologia em paliçada/letras chinesas. Tais
achados sugerem bacilo diftérico e devem ser comunicados imediatamente ao médico.

COLORAÇÃO DE FONTANA TRIBONDEAU

O método foi desenvolvido em 1920, com objetivo de auxiliar a visualização de bactérias
espiraladas (Leptospira interrogans e treponemas). Essas bactérias são muito delgadas e não
coram completamente pela coloração de Gram. Esta coloração não é considerada verdadeira,
pois consiste em uma técnica de impregnação pela prata. Atualmente, os laboratórios têm
utilizado mais a microscopia de campo escuro a fresco para visualizá-las.

Como realizamos essa coloração? Vamos conhecer?

A partir de esfregaços finos, derramar sobre a lâmina algumas gotas da solução fixadora
(renová-la 3 vezes, por 30 segundos). Em seguida, cobrir com solução mordente, aquecendo a
lâmina até emitir vapores. Após 30 segundos, lavar em água corrente, acrescentar o nitrato de
prata amoniacal, aquecendo rapidamente a lâmina até ocorrer novamente a emissão de
vapores, deixando agir por 30 segundos (a preparação toma a cor marrom). Lavar bem em
água corrente, secar com papel de filtro e examinar a lâmina ao microscópio com a objetiva de
imersão (x100). As espiroquetas aparecem amarronzadas/negras, sobre um fundo amarelo-
castanho ou marrom claro.

COLORAÇÃO PARA FLAGELOS

Como visto no módulo 1, os flagelos são estruturas bacterianas responsáveis pela locomoção e
são constituídos por moléculas proteicas denominadas flagelinas. Entretanto, como são finos,
delicados e se despolimerizam com facilidade, é necessário aplicar algumas técnicas para
aumentar o diâmetro dos flagelos, de forma a torná-los visíveis pela microscopia. A
demonstração do flagelo ocorre devido à ligação do corante ao ácido tânico, tornando-o mais
espesso.

Fonte: microbiologybook.org
 Flagelos.

Como é feita a coloração? Vamos entender?

Segundo o protocolo descrito por Teva e colaboradores (2009):

Cultivar a bactéria em estudo, de acordo com suas preferências físicas, em uma placa de
ágar infusão de cérebro-coração (BHI) ou em ágar tríptico de soja (com ou sem sangue).

Coletar delicadamente uma alíquota do crescimento com uma alça de platina e transferi-
la para um tubo, contendo cerca de 3 mL de água destilada. Inverter o tubo uma vez
para homogeneizar a suspensão. Colocar uma gota desta suspensão sobre uma lâmina

inclinada a 45o e deixar secar ao ar.

Cobrir a lâmina com uma mistura de corantes, que inclui fucsina e ácido tânico (fórmula
abaixo), e deixar por 5 minutos, até que um brilho metálico esverdeado cubra metade da
área. Não deixar o corante secar sobre a lâmina.

Retirar o corante, enxaguando com água. Secar e observar ao microscópio, com objetiva
de imersão.

 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal

COLORAÇÃO PARA ESPOROS COM VERDE

MALAQUITA (WIRTZ-CONKLIN)
Os esporos ou endósporos bacterianos consistem em uma parede espessa formada por vários
envoltórios, no interior de algumas bactérias, altamente resistente ao calor, à dessecação e a
outros agentes químicos e físicos, permitindo que a bactéria entre em um estado de latência
por longos períodos. Este processo ocorre quando a bactéria está em condições adversas à
sua sobrevivência.
Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock
 Bactéria C. difficile. Bactéria formadora de esporos.

A parede do esporo é impermeável, mas pode ser atravessada por corantes (como o verde de
malaquita) quando submetidos ao aquecimento, o que confere aos esporos uma cor verde
intensa. Associado a isso, essa estrutura não consegue ser descorada pela ação do álcool,
mas as outras estruturas podem ser descoradas. Para melhorar a visualização e como
contraste (contracorante), utiliza-se a safranina, que cora outras estruturas em vermelho,
facilitando a diferenciação dos esporos.

Como é feita a coloração? Vamos entender?

Segundo o protocolo descrito por Teva e colaboradores (2009):

Técnica para coloração de esporos

Preparar esfregaço e fixar pelo calor.

Cobrir o esfregaço com o corante verde malaquita.

Aquecer água em um béquer, até a emissão de vapores. Colocar a lâmina sobre este
 béquer, mantendo o corante aquecido por 5 minutos. Alternativamente, cobrir a lâmina
com verde malaquita e aproximar de uma chama até que desprenda vapor, sem deixar
que o corante ferva. Afastar do fogo e, após 1 a 2 minutos, repetir a operação por 3 a 4
vezes.

Lavar suavemente com água, evitando o choque térmico, que poderá quebrar a lâmina.

Adicionar a solução de safranina por 30 segundos.

Lavar e secar.

Observar ao microscópio com objetiva de imersão.

 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal

COLORAÇÃO DE CÁPSULA

Como aprendemos, a cápsula envolve a parede celular, é produzida por algumas espécies
bactérias e representa uma estrutura muito importante para a patogenicidade da bactéria. Isso
porque, confere a ação antifagocitária, ou seja, funciona como um mecanismo de fuga da ação
da fagocitose pelas células do sistema imunológico do indivíduo.

A cápsula é uma camada gelatinosa composta de açúcares ou polipeptídeos, com caráter

hidrossolúvel, que pode ser facilmente removida durante as etapas de lavagem durante a
coloração, o que dificulta a sua coloração. Além disso, a fixação dos esfregaços pelo calor,
amplamente utilizado para as outras colorações, pode levar a contração da célula e a formação
de um halo ao redor do microrganismo, que pode ser facilmente confundido com a cápsula.
Entretanto, é possível visualizar bactérias produtoras de cápsula a partir da coloração pela tinta
da china. Essa coloração é conhecida como coloração negativa, pois a cápsula rejeita as
partículas do corante. Se as bactérias apresentarem cápsula, será possível verificar
microrganismos descoradas envoltas por um halo (cápsula) sobre um fundo negro.

Vamos conhecer um pouco mais a coloração da tinta da China?

A seguir, o protocolo descrito por Teva e colaboradores (2009):

Método da tinta da China (coloração negativa)

As colônias suspeitas devem ser cultivadas em caldo rico (BHI).

Colocar 1 ou 2 gotas de cultura em uma lâmina.

Depositar na lâmina uma gota de tinta da China ao lado das gotas de cultura.

Cobrir com uma lamínula, comprimindo-a entre folhas de papel de filtro, para se obter
uma quantidade bem tênue de corante e material.

Observar ao microscópio óptico (40X).

 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal

VERIFICANDO O APRENDIZADO

1. VERIFICAMOS QUE A COLORAÇÃO DE GRAM É UMA TÉCNICA

SIMPLES, RÁPIDA E SE BASEIA NA COMPOSIÇÃO DA PAREDE
CELULAR DAS BACTÉRIAS. A RESPEITO DESTA TÉCNICA, ASSINALE A
AFIRMATIVA CORRETA:
A) As bactérias gram-negativas após o tratamento com álcool-acetona permanecem roxas.

B) As bactérias gram-negativas apresentam uma parede celular constituída por uma fina
camada de peptideoglicanos revestida por ácido micólico e uma membrana externa.

C) Os bacilos álcool ácido resistentes são preferencialmente corados pela técnica de Gram.

D) O lugol aumenta a afinidade da bactéria para o corante cristal violeta induzindo a formação
de um composto roxo nas bactérias gram-positivas.

2. ESTUDAMOS QUE A COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN É UMA

TÉCNICA QUE PERMITE A COLORAÇÃO DE UM GRUPO DE BACTÉRIAS
QUE POSSUEM PAREDE CELULAR CONSTITUÍDA POR
PEPTIDEOGLICANOS, SEGUIDA DE UMA CAMADA FORMADA POR
POLÍMEROS DE ARABINOGALACTANO E REVESTIDA POR UMA
PORÇÃO LIPÍDICA DE ÁCIDOS MICÓLICOS. A RESPEITO DESTA
TÉCNICA, QUAL MICRORGANISMO É CORADO POR ESTE MÉTODO DE
COLORAÇÃO?

A) Streptococcus sp.

B) Treponema sp.

C) Mycobacterium tuberculosis

D) Corynebacterium diphtheria

GABARITO

1. Verificamos que a coloração de Gram é uma técnica simples, rápida e se baseia na

composição da parede celular das bactérias. A respeito desta técnica, assinale a
afirmativa CORRETA:

A alternativa "D " está correta.

As bactérias gram-negativas após o tratamento com álcool-acetona perdem a cor corando com
o corante de fundo (Safranina ou fucsina de Gram). As bactérias gram-negativas apresentam
parede celular constituída por uma fina camada de peptideoglicanos, uma membrana externa e
lipopolissacarídeos. Os bacilos álcool ácido resistentes são corados pela técnica de ZIEHL-
NEELSEN.

2. Estudamos que a coloração de Ziehl-Neelsen é uma técnica que permite a coloração

de um grupo de bactérias que possuem parede celular constituída por peptideoglicanos,
seguida de uma camada formada por polímeros de arabinogalactano e revestida por uma
porção lipídica de ácidos micólicos. A respeito desta técnica, qual microrganismo é
corado por este método de coloração?

A alternativa "C " está correta.

Os Bacilos-Álcool-Ácido-Resistente (BAAR) possuem a capacidade de álcool-ácido-resistência

relacionada à hidrofobicidade da parede celular, assegurada pela presença de lipídeos como o
ácido micólico e podem ser visualizadas pela coloração de Ziehl-Neelsen. Um exemplo de
BAARs são o grupo das micobactérias, como M. tuberculosis.

CONCLUSÃO

CONSIDERAÇÕES FINAIS
Ao longo desta jornada, compreendemos as características gerais das bactérias e
relacionamos a sua morfologia e estruturas celulares com as diferentes técnicas de coloração,
importantes e muito utilizadas nos laboratórios clínicos para identificação ou distinção de
grupos bacterianos. Além disso, entendemos como os diferentes meios de cultura são úteis
para identificação e crescimento bacteriano, bem como as vantagens e desvantagens de cada
tipo de teste de sensibilidade a antimicrobianos, os quais permitem investigar resistência a um
ou mais antibióticos utilizados na clínica.
REFERÊNCIAS
JORGENSEN, J. H.; FERRARO, M. J. Antimicrobial Susceptibility Testing: A Review of General
Principles and Contemporary Practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 2009. p. 1749–
1755.

MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M. & PARKER, J. Microbiologia de Brock. 10 ed. São Paulo:
Pearson Education, 2008.

MURRAY, P.R; ROSENTHAL, K.S; PFALLER, M.A. Morfologia Bacteriana e Estrutura e Síntese
da Parede Celular. In: Microbiologia médica. 5. ed. Elsevier, 2006. cap. 3, p. 11-24.

MURRAY, P.R; ROSENTHAL, K.S; PFALLER, M.A. Morfologia Bacteriana e Estrutura e Síntese
da Parede Celular. In: Microbiologia médica. 5 ed. Elsevier, 2006. cap. 4, p. 25-34.

NCCLS. M2-A8—Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved

Standard—Eighth Edition (ISBN 1-56238-485-6).

OPLUSTIL, C.P.; ZOCCOLI, C.M.; TOBOUTI, N.R.; SINTO, I.S. Procedimentos básicos em
microbiologia clínica. 2 ed. São Paulo: Sarvier, 2004.

TEVA, A.; MORAES, A.M.L.; RIBEIRO, F.C.; et al. Bacteriologia. In: MOLINARO, E.M.;
CAPUTO, L.F.G.; AMENDOEIRA, M.R.R. (Orgs). Conceitos e Métodos para formação de
profissionais em laboratórios de saúde: v 4. Rio de Janeiro: EPSJV; IOC, 2009. cap.3,
p.221-398.

TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R. & CASE, C. L. Microbiologia. 12 ed. São Paulo: Artmed,
2017.

ROSSI, F. Cocos Gram-positivos: Staphylococcus aureus, Enterococcus spp. e Streptococcus

pneumoniae e os principais mecanismos de resistência. In: Rossi F. & Andreazzi D.B. (Orgs).
Interpretando o antibiograma. São Paulo: Atheneu, 2005. p. 27-63.

EXPLORE+
Para saber mais sobre os assuntos explorados neste tema:

Pesquise:

Como o Dr. Alvin Fox, Professor da University of South Carolina School of Medicine
aborda as características bacterianas no artigo A célula bacteriana.

Como Denise Spolidorio, Cristiane Duque e Helvécio Póvoa abordam as características

da morfologia e citologia bacteriana no capítulo 1 - Morfologia microbiana, do livro
Microbiologia e Imunologia Geral e Odontológica.

Como Ana Cristina Gales, Eliete Aguiar de Miranda Frigatto e Soraya Sgambatti de
Andrade abordam os Testes de Sensibilidade aos Antimicrobianos – módulo 5.

Visite o site do Brazilian Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (BrCast) que

tem como missão determinar e rever os pontos de corte para interpretação dos testes de
sensibilidades no Brasil. Além disso, ele disponibiliza os pontos de cortes dos
antimicrobianos e manuais de forma gratuita.

Assista:

Reino Monera - O crescimento bacteriano e a função exponencial, vídeo que aborda as

fases do crescimento microbiano.

Cultivando microrganismos, vídeo que aborda condições do crescimento bacteriano.

Exigências nutricionais – Microbiologia, vídeo que aborda os principais meios de cultura e

sua preparação em laboratório.

Coloração de Gram, animação que explica todo o passo a passo da coloração.

 Coloração de Ziehl Neelsen: Baciloscopia (Microbiologia) - Bio Aulas, vídeo que aborda
as principais características da coloração de BAAR.

Coloração de Ziehl-Neelsen, vídeo produzido pelo CONECTAMICRO da UFF que aborda

a fundamentação teórica e como realizar esta técnica de coloração utilizada para
visualização de bacilos álcool-ácido resistentes.

Leia:

A notícia Qual a finalidade dos meios de cultura em microbiologia? Publicado por KASVI
distribuidora.

O capítulo 3 do manual da Anvisa: Descrição dos meios de cultura empregados nos

exames microbiológicos.

O artigo científico escrito por Angelo Trento intitulado Colorações usadas em

Microbiologia.

CONTEUDISTA
Alice Maria de Magalhães Ornelas

 CURRÍCULO LATTES
DESCRIÇÃO
Principais bactérias de importância clínica e métodos de diagnóstico laboratorial para infecções
bacterianas do trato respiratório e trato urinário.

PROPÓSITO
Conhecer as espécies bacterianas que são importantes causadoras de infecções em humanos
e os métodos usados para seu diagnóstico a fim de que o profissional tenha domínio de suas
atividades exercidas no laboratório clínico, sendo capaz de realizá-la com segurança e
qualidade.

OBJETIVOS
MÓDULO 1

Reconhecer as principais espécies de bactérias causadoras de infecções em humanos e suas

características

MÓDULO 2

Descrever os métodos de diagnóstico laboratorial usados para infecções bacterianas do trato

respiratório

MÓDULO 3

Descrever os métodos de diagnóstico laboratorial usados para infecções bacterianas do trato

urinário

INTRODUÇÃO
As bactérias formam um grupo de microrganismos muito diverso. Dentro desse domínio,
encontramos espécies que estão adaptadas a diferentes ambientes, desde geleiras da
Antártida até o nosso próprio corpo. A grande maioria das bactérias que habitam o corpo
humano estão em equilíbrio e, muitas vezes, trazem benéficos para nossa saúde, fazendo
parte do que chamamos de microbiota normal. No entanto, existem também aquelas que
podem causar doenças (bactérias patogênicas) e, por isso, a presença dessas espécies deve
ser identificada.

Uma vez que a espécie responsável por uma doença é determinada, o tratamento pode ser
realizado de forma direcionada, e as chances de cura aumentam muito! Por isso, vamos
começar agora o nosso estudo sobre métodos laboratoriais de diagnóstico para bactérias de
importância clínica. Esses métodos têm como objetivo principal determinar a espécie
bacteriana encontrada em materiais obtidos de pacientes, como escarro, sangue e urina.
Agora falaremos um pouco sobre as características marcantes das espécies patogênicas aos
seres humanos e entraremos em detalhes sobre os métodos de diagnóstico de infecções
bacterianas do trato respiratório e urinário. Os métodos de diagnóstico laboratorial são
baseados nas particularidades de cada espécie e, por isso, é tão importante relacionar esses
temas.

MÓDULO 1
 Reconhecer as principais espécies de bactérias causadoras de infecções em
humanos e suas características

PRINCIPAIS BACTÉRIAS DE IMPORTÂNCIA

CLÍNICA
As espécies de bactérias possuem muitas diferenças entre si, mas destacaremos nesta
introdução aquelas que dizem respeito ao formato da célula, a cor que apresentam após a
coloração de Gram, a necessidade de oxigênio e o fato de formarem ou não esporos. Essas e
outras informações são muito valiosas, pois são como uma peça no quebra-cabeças, que, ao
final do processo, vão nos mostrar qual é a espécie responsável pela infecção.

As bactérias são seres unicelulares, e o formato de suas células é característico de cada

espécie. As instruções para a forma da célula estão guardadas no cromossomo bacteriano, e
assim bactérias “filhas” herdam essa informação da bactéria que lhe deu origem. Portanto,
saber a forma da célula de uma bactéria é uma grande dica para descobrir com qual espécie
estamos lidando. Existem alguns formatos possíveis, como cocos, bacilos e espirais.

A coloração de Gram nos permite definir uma cor e evidencia a forma para a maioria das
espécies de bactéria. A técnica diferencia esses microrganismos de acordo com a porção mais
externa da célula: uma camada espessa de peptideoglicano ou uma membrana de
fosfolipídeos.

As que têm o peptiodeoglicano na parte externa se coram de roxo pelo corante cristal violeta, e
mantém essa cor até o final do método. Por isso, são chamadas de Gram-positivas. Já as que
possuem uma membrana externa de fosfolipídeos, perdem a cor roxa em uma etapa do
método e depois são “recoradas” em vermelho, sendo chamadas Gram-negativas.

Fonte: Wikimedia
 Sequência de reagentes usados no método de coloração de Gram. A etapa 1
representa as células bacterinas antes de serem coradas e, ao final da etapa 5, observamos as
cores que as bactérias gram-positivas e gram-negativas adquirem após a técnica.

Além disso, quando as células são coradas, podemos identificar como elas se organizam, e, se
coloração de Gram for feita diretamente no material clínico, é possível a identificação de
leucócitos e outros tipos celulares úteis no diagnóstico.

Em relação à utilização do oxigênio, algumas espécies bacterianas usam essa molécula para
produzir energia, outras podem ou não utilizar, e ainda existem aquelas que nunca usam o
oxigênio. Baseado nisso, podemos chamar as bactérias de aeróbicas, facultativa ou
anaeróbicas, respectivamente.

Para algumas bactérias anaeróbicas o oxigênio é tóxico e, por isso, elas se transformam em
esporo quando entram em contato com ele. Também chamado de endósporo, essa estrutura é
uma forma de vida que a célula bacteriana assume permitindo sua sobrevivência em condições
inapropriadas para vida.

Depois de falar sobre as características bacterianas principais, precisamos pontuar o que é um

meio de cultura. Ele é um ambiente que proporciona condições ideais para o crescimento de
bactérias. Se o meio de cultura tiver consistência sólida, após um determinado período, nós
conseguimos visualizar colônias.
O ágar adicionado em meios de cultura sólidos é aquele mesmo da gelatina, que pode ser
comprado em lojas de alimentos. Cada colônia é um aglomerado visível de milhões de células
bacterianas.

Fonte: Pixnio
 Crescimento bacteriano em meio de cultura Ágar Sangue. Cada ponto no meio de
cultura é uma colônia que cresceu a partir da amostra clínica com bactéria que foi semeada
nesse ambiente.

Fonte: jkcDesign/Shutterstock
A temperatura para o crescimento em meio de cultura de bactérias que causam infeções em
seres humanos é quase sempre próxima de 36°C, já que essa é a nossa temperatura média
corporal. Por isso, quando queremos obter o crescimento de bactérias em laboratório,
costumamos deixar o meio de cultura dentro de estufas com temperaturas entre 35 e 37°C.

As bactérias de interesse clínico diferem sobre outras condições de crescimento, como

necessidade e utilização de nutrientes. Então, vamos falar de vários tipos de meio de cultura ao
longo da nossa conversa e algumas variações na condição de cultivo desses microrganismos.

Pronto! Agora, podemos entrar no mundo das principais bactérias agentes de doenças em
seres humanos.

Fonte: NatalieIme/Shutterstock

COCOS GRAM-POSITIVOS E GRAM-NEGATIVOS

Bactérias chamadas de cocos apresentam células redondas se observadas ao microscópio.

Os cocos costumam se organizar em arranjos característicos, e isso pode ser usado para sua
identificação laboratorial. Esses arranjos acontecem, pois, após a divisão, as células ainda
continuam bem próximas.

Quando a bactéria em forma de coco se divide para formar novas bactérias (“filhas”), o formato
redondo da célula possibilita que a divisão seja feita em diferentes direções, chamados de
planos de divisão.

Quando a divisão acontece em apenas um plano, os cocos podem ser organizar em fileira ou
em duplas e, quando ocorre em várias direções, a organização fica mais complexa, originando,
por exemplo, cachos de células bacterianas. Dois gêneros muito conhecidos de cocos são os
Staphylococcus e os Streptococcus, que possuem células organizadas em cachos e fileiras,
respectivamente.

Fonte: Wikimedia
 Fotografia da imagem observada ao microscópio óptico de uma espécie de
Staphylococcus. É possível observar aglomerados das células em formas de coco, que são
chamados de cachos. Perceba que essa espécie é gram-positiva, pois está corada em roxo.
Fonte: Wikimedia
 Fotografia da imagem observada ao microscópio óptico de uma espécie de
Streptococcus. É possível observar fileiras das células em formas de coco. Perceba que essa
espécie é gram-positiva pois está corada em roxo.

Staphylococcus é um gênero de bactérias gram-positivas. No laboratório, crescem bem em

diferentes tipos de meios de cultura, com concentração normal a baixa de oxigênio. Eles são
capazes de fermentar carboidratos e, consequentemente, liberar substâncias ácidas, o que
pode mudar o pH do meio de cultura onde essa bactéria foi semeada. Uma característica
importante das espécies desse gênero é que elas produzem a enzima catalase, que
decompõe o peróxido de hidrogênio, liberando água e gás oxigênio.

Provavelmente, você já limpou algum ferimento com água oxigenada e viu o surgimento de
bolhas, essa é uma reação típica produzida pela catalase.
Fonte: Kopytin Georgy/Shutterstock

Fonte: Yayah_Ai/Shutterstock
 Fotografia mostrando um teste da catalase positiva. Em uma lâmina, uma gota de
peróxido de hidrogênio (H2O2) é colocada em contato com a colônia suspeita. A presença de

bolhas (como na imagem) indica que a bactéria pertence ao gênero Staphylococcus.

Fonte:Shutterstock
 Fotografia mostrando o teste da coagulase positivo. Na foto, verificamos a presença de
um coágulo, que aponta que a bactéria produz a enzima coagulase, indicando a presença de
S. aureus.

A espécie Staphylococcus aureus é um patógeno humano muito comum, causando desde

pequenas infecções de pele até síndromes tóxicas mais perigosas. Observadas em cultura,
suas colônias têm cor amarela característica, daí o nome da espécie “aureus”, que remete ao
ouro. Elas podem crescer em ambientes com concentração de sal mais elevada e, por isso, se
desenvolvem bem na nossa pele, mesmo o suor sendo “salgado”. S. aureus também produz o
fator de agregação (chamado de fator clumping) e a enzima coagulase, que levam a
coagulação sanguínea. O teste da coagulase é muito útil na identificação de S. aureus.

 VOCÊ SABIA

Essa espécie pode produz importantes toxinas como a leucocidina de Panton-Valentine, toxina
esfoliativa e a toxina da síndrome do choque tóxico, que contribuem para os quadros mais
graves de infecção.

As espécies de Staphylococcus coagulase negativas são comuns na nossa microbiota

normal e, em algumas situações específicas, podem causar doenças, como infecções
associadas a cateteres em pessoas com sistema imunológico enfraquecido. Esse grupo inclui
diferentes espécies, mas é comum nos referimos a elas em conjunto, usando para isso a
característica que as diferencia do S. aureus (não produzir a enzima coagulase).

Streptococcus é um outro gênero de cocos gram-positivos que utilizam o oxigênio de forma

facultativa. São considerados fastidiosos, pois precisam de nutrientes adicionais no meio de
cultura, como a adição de sangue. Ao contrário dos Staphylococcus, não produzem a enzima
catalase. Muitas espécies desse grupo são capazes de produzir enzimas que destroem
hemácias (hemolisinas). A atividade dessas enzimas varia entre destruição parcial e
destruição completa das hemácias quando testadas em laboratório.

Fonte: Wikimedia
 α: Hemólise parcial (ao redor da colônia o ágar fica cinza-esverdeado). β: Hemólise total,
ao redor das colônias observamos um halo claro. γ: Sem hemólise.

É comum separar os Streptococcus em grupos para facilitar o estudo desse gênero. Essa
separação pode se basear, tanto no tipo de hemólise que é produzida, quanto pela presença
de determinados açúcares na parede celular de espécies do gênero. A classificação dos
Streptococcus usando como critério os açúcares da parede celular deu origem aos grupos de
Lancefield (usamos letras para nomear cada grupo).

De particular importância por causar doenças em humanos, podemos citar as espécies

Streptococcus pyogenes (associados a infecções invasivas como erisipela), Streptococcus
agalactiae (importantes agentes de infecções em recém-nascidos) e Streptococcus
pneumoniae (agentes de pneumonia bacteriana). Para diferenciar essas espécies no
laboratório, podemos usar meio de cultura suplementado com sangue.
O sangue torna o meio mais nutritivo e permite identificar quando a bactéria gera hemólise
(lise/ruptura das hemácias). Sobre S. pneumoniae vale destacar que os pneumococos (como
também são chamados) costumam se organizar em pares quando observados ao microscópio
e que podem possuir cápsula. Essa cápsula pode ser formada por diferentes tipos de
polissacarídeos, sendo essa constituição usada na classificação da espécie.

DIFERENCIAÇÃO LABORATORIAL DE
BACTÉRIAS DE IMPORTÂNCIA MÉDICA DO
GÊNERO STREPTOCOCCUS
Bactérias do gênero Enterococcus também são gram-positivas e não produzem a enzima
catalase, assim como os Streptococcus. Destacam-se por crescer em ampla variação de
temperatura (10 a 45°C) e tolerar concentrações de sal um pouco elevadas. Enterococcus
faecalis é o principal enterococo causador de infecções humanas, seguido de longe pela
espécie Enterococcus faecium. Essas espécies são mais comuns como causa de infecções
em pacientes internados em hospitais, causando o que chamamos de Infecções
Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS).

Fonte: Pikist

Dentre as bactérias gram-negativas em forma de cocos que causam importantes infecções em

humanos, devemos citar, principalmente, o gênero Neisseria. Esse gênero inclui as espécies
Neisseria gonorrhoeae (responsável pela gonorreia) e Neisseria meningitidis (agente de
meningite bacteriana). Usando o microscópio óptico, observamos que essas espécies,
geralmente, se organizam aos pares, e é comum usarmos os nomes gonococo e meningococo
para referimo-nos a elas.

No laboratório, N. gonorrhoeae e N. meningitidis exigem determinados tipos de nutrientes para

crescer, por isso, as cultivamos em meios de cultura enriquecidos (“ricos”) desses fatores de
crescimento. O tempo para visualizarmos as colônias é um pouco maior que o normal (48
horas) e, mesmo sendo aeróbicas, é necessário que o ambiente tenha 5% de CO2

(conseguimos isso colocando as placas de meio de culturas em garrafas apropriadas).

BACILOS GRAM-POSITIVOS E GRAM-
NEGATIVOS

Se observarmos ao microscópio uma lâmina contendo bactérias conhecidas como bacilos

veremos células na forma de bastão, também chamados de bastonetes. Após a divisão da
célula, que acontece apenas no plano vertical, elas se separam e, por isso, não é comum
encontrar organizações celulares típicas como falamos para os cocos (cachos, fileiras ou
pares). Os bacilos gram-negativos são mais comumente identificados em laboratório como
agentes de infecções humanas quando comparados aos bacilos gram-positivos, portanto,
vamos começar por eles.

Fonte: Wikimedia
 Fotografia da imagem observada ao microscópio óptico de células de um bacilo
gram-negativo. Perceba que essa espécie é gram-negativa pois está corada em vermelho.

Vamos separar os bacilos gram-negativos (BGN) patogênicos em grupos para facilitar a

nossa compreensão da diversidade e importância clínica desses microrganismos.

Primeiro, vamos conhecer o grupo das enterobactérias e o dos BGN não fermentadores:

As enterobactérias vivem no nosso intestino, e algumas podem causar infecções.

Costumamos diferenciar esse grupo dos BGN não fermentadores pelo fato de serem capazes
de fermentar carboidratos. Isso é importante no laboratório, pois a fermentação produz ácido,
esse ácido modifica o pH do meio de cultura, e podemos detectar essa mudança usando meios
com corantes indicadores de pH.

Fonte: Wikimedia
 Crescimento de duas espécies de bactérias gram-negativas em meio de cultura Ágar
MacConkey.

Na imagem, esse meio possui o açúcar lactose na sua composição, e permite diferenciar entre
espécies que fermentam esse açúcar (a cor do meio fica rosa), e aquelas que não fermentam a
lactose (a cor do meio fica amarelada ou bege).

De modo geral, os BGNs não exigem nutrientes específicos para seu crescimento, por isso,
podem ser cultivadas em diferentes meios de cultura.
As enterobactérias são BGN fermentadores, capazes de produzir energia através da
respiração aeróbica e da fermentação e, por isso, crescem em ambientes com ou sem
oxigênio, consideradas facultativas. Algumas enterobactérias convivem em harmonia no nosso
intestino e causam doenças só em situações específicas, como é o caso da espécie
Escherichia coli.

Já enterobactérias como as dos gêneros Salmonella e Shigella causam doença sempre que
presentes em número suficiente. Outras enterobactérias destacam-se por causar infecções em
pessoas internadas em hospitais, como a espécie Klebsiella pneumoniae. Dentre as
infecções causadas pelas enterobactérias, podemos citar gastroenterites, pneumonia,
meningite e infecções do trato urinário.
Os BGN não fermentadores só crescem em ambiente com oxigênio, pois realizam apenas a
respiração aeróbica. Ao contrário das enterobactérias, não são comuns na nossa microbiota
normal, mas são amplamente distribuídas no ambiente. Os principais patógenos humanos
desse grupo são as espécies Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii,
causando infecções em pacientes hospitalares. Uma característica marcante e bastante
conhecida de P. aeruginosa é que suas colônias costumam ter uma cor esverdeada devido a
produção de pigmentos próprios. Já os A. baumannii destacam-se pela aparência de
cocobacilos, ou seja, quando olhamos suas células no microscópio, observamos bacilos bem
curtos, “achatados”.

Fonte: Wikimedia
 Pseudomonas P. aeruginosa.
Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock
 Acinetobacter baumannii.

No grupo dos BGNs que não são enterobactérias, mas causam infecções gastrointestinais,
devemos lembrar do Vibrio cholerae. Sua célula possui formato de vírgula e, por esse motivo,
também é conhecida como vibrião colérico.

Essa bactéria é gram-negativa, e o lipopolissacarídeo “O” da sua membrana externa possui

muitas variações, sendo usado para nomear grupos específicos dentro dessa espécie. Apenas
alguns desses grupos são capazes de provocar a cólera.

Isso acontece por conta da produção de uma toxina, que provoca diarreia profusa, com grande
perda de água durante a evacuação. V. cholerae suporta concentrações elevadas de sal no
ambiente, e costuma crescer rapidamente em meios de cultura ricos em nutrientes.

Ainda dentro desse grupo, é importante citar a espécie Campylobacter jejuni, que também
possui célula curva ou em forma de vírgula. Essa bactéria é comum na microbiota do intestino
de animais, e causa infecções intestinais em seres humanos após ingestão de alimentos mal
cozidos e água contaminada. Para diagnosticar a presença dessa bactéria no nosso intestino,
basta cultivar fezes em meio de cultura apropriado, em um ambiente com 5 a 10% de oxigênio
e, portanto, são considerados microaerófilos.
Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock
 Campylobacter jejuni.

Por último, vamos falar de BGN com células bem pequenas. Dentre eles, a espécie Bordetella
pertussis é importante como agente da coqueluche, uma infecção respiratória conhecida
também como tosse comprida. O diagnóstico dessa doença é feito, principalmente, com base
nos sinais clínicos do paciente. O crescimento da B. pertussis é lento, então, a placa de meio
de cultura deve ser mantida por até sete dias. Em caso de resultados positivos, podemos
coletar uma parte da colônia e visualizar ao microscópio pequenos bastonetes gram-negativos.
Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock
 Bordetella pertussis.

Uma espécie bem parecida com a B. pertussis é o Haemophilus influenzae. Também se trata
de um pequeno bastonete gram-negativo que exige nutrientes específicos para o seu
crescimento, mas as colônias são vistas depois de um tempo padrão de 24 horas. Essa
bactéria faz parte da nossa microbiota normal do trato respiratório superior, mas pode causar
infecções respiratórias, como faringite e pneumonias e, nos piores casos, meningites. A
presença de uma cápsula de polissacarídeos (açúcares) envolvendo a célula dessa espécie é
usada para definir os “tipos” de H. influenzae, por exemplo, o H. influenzae tipo b, para qual já
existe vacina disponível.
Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock
 Haemophilus influenzae.

Bacilos gram-positivos que causam doenças em humanos podem ser separados entre os
que formam e o os que não formam esporos. Dentre os formadores de esporos, destacam-se
as espécies do gênero Clostridium, como Clostridium botulinum (agente do botulismo),
Clostridium tetani (responsável pelo tétano) e Clostridium perfringens (causa infecções
invasivas como a gangrena gasosa).

Essas espécies são caracterizadas por produzir toxinas potentes que causam sintomas sérios,
como a toxina botulínica que leva a incapacidade de contração da musculatura do pulmão.
Essa toxina é produzida pela espécie C. botulinum, que pode se desenvolver em alimentos
bem vedados, como as conservas vegetais artesanais.
Fonte:Shutterstock

Bactérias do gênero Clostridium são desenvolvidas em ambientes vedados, pois não usam
oxigênio na produção de energia, sendo chamadas de anaeróbicas. Para cultivar essas
bactérias, você precisa garantir que o meio de cultura seja mantido em recipientes que
impeçam a entrada de oxigênio. A cultura não costuma ser necessária para o diagnóstico das
doenças causadas por esses microrganismos, pois ele costuma se basear no quadro clínico e
no histórico do paciente (botulismo e tétano), ou ainda no exame direto da amostra ao
microscópio (C. perfringens).

Um importante patógeno humano deve ser citado entre os bacilos gram-positivos não
formadores de esporos: Corynebacterium diphtheriae. Essa bactéria é o agente da difteria,
grave doença respiratória provocada pela toxina produzida por esse microrganismo. O formato
celular dessa espécie chama atenção: depois de corada, observamos um inchaço em uma
das extremidades da célula, além de grânulos escuros que se distribuem ao longo do bacilo.
Esse inchaço pode estar presente nas duas extremidades e, às vezes, não ser visível, por isso,
C. diphtheriae é uma das poucas espécies bacterianas pleomórficas, com formato celular
variável.
Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock
 Corynebacterium diphtheriae.

 ATENÇÃO

O diagnóstico da difteria é feito baseado nos sinais clínicos característicos do paciente para
que logo se inicie o tratamento. Porém, cultivamos a amostra clínica em meio de cultura
seletivo e testamos se a bactéria produz toxina para que fique registrado e confirmado
ocorrência dessa doença. Esse registro é importante, pois já existe vacina contra a difteria, e
não é comum sua ocorrência.

ESPIROQUETÍDEOS

O próximo grupo de bactérias que vamos discutir apresenta uma aparência “diferenciada”.
Espiroquetas são bactérias com a célula longa e fina em formato espiral. Elas apresentam
estrutura celular incomum, que está super relacionada a sua intensa movimentação em
ambientes aquosos.
Na parte externa, existe uma bainha de glicosaminoglicana, seguida logo abaixo por camadas
de membranas semelhante ao que vemos em bactérias gram-negativas. Saindo das
extremidades da célula e fazendo um espiral em torno dela encontramos feixes de fibrila, que
recebem o nome de endoflagelos, estruturas que garantem a movimentação típica em torno do
próprio eixo, que lembra um saca-rolhas.

As principais espécies desse grupo que são agentes de doenças em humanos são Treponema
pallidum (responsável pela sífilis) e Leptospira interrogans (agente da leptospirose).

A célula do Treponema pallidum se assemelha a uma mola. O agente da sífilis, uma doença
sexualmente transmissível, é uma bactéria que não pode ser cultivada em meios de cultura.
Sendo assim, as técnicas de diagnóstico envolvem examinar diretamente o material clínico
usando um microscópio. A coloração usada é própria, que deixa os finos espirais mais
espessos ou marcados com fluorescência, para facilitar a observação.

Fonte: WIkimedia
 Diferentes técnicas usadas para visualização do Treponema pallidum. Na letra (A) a
bactéria é vista usando microscópio de campo escuro, na letra (B) na microscopia óptica após
coloração por impregnação pela prata.

 ATENÇÃO

A sífilis é uma doença com vários estágios, e os testes microscópicos são usados
principalmente na fase primária da doença. Depois dessa fase, o diagnóstico é feito através da
utilização de anticorpos fabricados em laboratório para detectar alvos específicos da bactéria
no sangue da pessoa doente.

Além da sífilis, outra patologia causada por bactérias do grupo das espiroquetas é a
leptospirose. Essa doença é considerada uma zoonose, ou seja, animais contaminados por
bactérias dessa espécie, como a Leptospira interrogans, podem transmiti-la para seres
humanos. A L. interrogans possui uma célula fina e “ondulada”, com as extremidades formando
uma espécie de gancho, lembrando um símbolo de interrogação (por isso interrogans).

Fonte: Wikipedia
 Leptospira interrogans por micrografia eletrônica.

O crescimento da bactéria pode ser verificado em meio de cultura com a consistência

semissólida em presença de oxigênio, mas pode demorar até oito semanas. O método mais
usado para diagnóstico é identificar a infecção através da detecção de anticorpos específicos
contra L. interrogans no soro da pessoa doente. Diferentes anticorpos podem ser observados,
dependo do tipo de lipopolissacarídeo (LPS) que a leptospira possui na sua bainha externa.

OUTRAS BACTÉRIAS

As bactérias que apresentam características distintas das espécies que já falamos até aqui
merecem um tópico a parte. Uma delas são bactérias com parede celular atípica e não
podem ser diferenciadas por Gram e, por isso, não se enquadram como gram-positivos ou
gram-negativos. Esse é o caso das micobactérias, conhecidas como agente etiológico de
doenças importantes, como a espécie Mycobacterium tuberculosis que é responsável pela
tuberculose.

Na parte externa de bactérias do gênero Mycobacterium, encontramos uma extensa camada

de ácido micólico, um tipo de lipídeo com pouquíssima afinidade pela água (hidrofóbico).

Fonte: Wikimedia
 Esquema da parede celular (8) das micobactérias. Os ácidos micólicos estão
representados pelo número 2, formando uma barreira hidrofóbica. As demais estruturas são
lipídios (1), polissacarídeos (3), peptidoglicano (4), membrana plasmática (5),
lipoarabinomanano (LAM) (6) e manosídeo de fosfatidilinositol (7).

 RECOMENDAÇÃO

Essa propriedade dificulta a penetração de muitos corantes aquosos na célula, incluindo

aqueles usados na coloração de Gram. Com isso, temos que usar um corante com adição de
fenol e ainda é necessário aquecer a lâmina para aumentar a sua penetração. Uma vez dentro
da célula, o corante não consegue ser retirado nem mesmo se a célula for exposta a uma
solução álcool-ácida.

Essa estratégia de coloração é chamada de técnica de Ziehl-Neelsen. Levando em conta as

características de coloração e o formato de bacilo, é comum nos referirmos às micobactérias,
como bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR).

O principal agente da tuberculose é a espécie Mycobacterium tuberculosis, também

conhecida como Bacilo de Koch (BK). Um grupo de diferentes espécies de bactéria forma o
complexo Mycobacterium tuberculosis. Além da M. tuberculosis, esse grupo inclui M. bovis, M.
africanum, M. canetti, M. microti, M. pinnipedi e M. caprae. Essas outras espécies devem ser
consideradas, principalmente, se estamos lidando com pacientes imunodeficientes.

Fonte: Artemida-psy/Shutterstock
 Mycobacterium tuberculosis.

A tuberculose é um importante problema de saúde pública no Brasil, e as técnicas de

diagnóstico vem evoluindo para contribuir com a melhora desse cenário, pela detecção de
indivíduos que são fontes de infecção e do tratamento adequado.

Outro grupo atípico inclui bactérias que são parasitas intracelulares obrigatórias, ou seja, só
sobrevivem dentro da célula do seu hospedeiro. A espécie Chlamydia trachomatis é uma
delas, responsável por causar doenças como tracoma, uretrite, cervicite e pneumonia infantil.
Dentro das células humanas infectadas, essa bactéria produz inclusões citoplasmáticas
compactas, que, após coloração de Giemsa, são observadas como bolinhas bem coradas no
citoplasma da célula.
Fonte: Shutterstock
 Chlamydia trachomatis.

Para o diagnóstico, podemos verificar essas inclusões pela análise do material clínico ao
microscópio, ou ainda, a detecção de anticorpos específicos contra a C. trachomatis, que são
desenvolvidos pelo sistema imune do doente.

VERIFICANDO O APRENDIZADO

1. DEPOIS DE CONHECER AS PRINCIPAIS ESPÉCIES BACTERIANAS DE

IMPORTÂNCIA CLÍNICA, JULGUE AS FRASES ABAIXO E SELECIONE A
ALTERATIVA INCORRETA.

A) A forma da célula bacteriana pode variar bastante entre as espécies de importância clínica
estudadas.

B) Bactérias podem causar diferentes tipos de infecções como pneumonias, gastroenterites,

doenças de pele e sexualmente transmissíveis.

C) Todas as espécies bacterianas de importância clínica se enquadram como gram-negativas

ou gram-positivas.
D) Cultivar bactérias em meio de cultura é uma abordagem útil para diagnosticar muitas
doenças infecciosas.

2. VIMOS QUE EXISTEM UMA VARIEDADE DE ESPÉCIES DE

BASTONETES GRAM-NEGATIVOS DE IMPORTÂNCIA CLÍNICA QUE
PODEM CAUSAR INFECÇÕES INTESTINAIS. ACERCA DESSE ASSUNTO,
INDIQUE A AFIRMATIVA INCORRETA.

A) Todas são enterobactérias.

B) Algumas fazem parte da microbiota normal, mas em determinadas situações podem

provocar doenças.

C) Algumas são naturalmente patogênicas.

D) Diferem-se em relação necessidade de oxigênio para produção de energia.

GABARITO

1. Depois de conhecer as principais espécies bacterianas de importância clínica, julgue

as frases abaixo e selecione a alterativa INCORRETA.

A alternativa "C " está correta.

As bactérias de importância médica coram como gram-positivos e gram-negativos, mas a

espécies do gênero Mycobacterium não se enquadram nessa classificação devido à presença
da camada de ácido micólico, que dificulta sua coloração pela técnica de Gram, essas
bactérias são chamadas de BAAR e coradas pela técnica de Ziehl-Neelsen.

2. Vimos que existem uma variedade de espécies de bastonetes gram-negativos de

importância clínica que podem causar infecções intestinais. Acerca desse assunto,
indique a afirmativa INCORRETA.

A alternativa "A " está correta.

A Vibrio cholerae, um bacilo gram-negativo, causa gastroenterite, mas não pertence ao grupo
das enterobactérias.
MÓDULO 2
 Descrever os métodos de diagnóstico laboratorial usados para infecções bacterianas
do trato respiratório

INTRODUÇÃO
O nosso trato respiratório está em constante contato com o meio externo e, por isso, é alvo de
infecções por diferentes microrganismos, principalmente, vírus e bactérias. A frequência
dessas infecções é reduzida por conta das nossas defesas naturais, como cílios, muco,
sistema imunológico e bactérias da microbiota normal. O muco retém partículas de poeira e
microrganismos, que depois são “empurrados” pelos cílios em direção à boca. O nosso sistema
imune nos defende pela ação de macrófagos teciduais e anticorpos de mucosa, entre outras
estratégias. Já a microbiota tem o papel principal de competir por espaço e alimento com
microrganismos que podem causar doenças, impedindo que os “vilões” se sobressaiam.

Os microrganismos da microbiota são comumente encontrados no nosso trato respiratório

superior, mas pouco frequentes na porção inferior desse sistema. O trato respiratório superior é
composto por nariz, faringe e estruturas associadas, como orelha média e tubas auditivas. A
parte inferior conta com a traqueia e o pulmão, esse último formado por brônquios, alvéolos e
tecido pulmonar envolvidos pela membrana pleural.
Fonte: solar22/Shutterstock
 A principal função do sistema respiratório é conduzir o ar inalado até os alvéolos, onde
ocorre a troca de CO2 do sangue pele O2 trazido pelo ar e, por fim, o CO2 é eliminado na

atmosfera.

 VOCÊ SABIA

As infecções do trato respiratório superior costumam ser mais brandas, mas as que acometem
o trato inferior são mais perigosas, pois afetam diretamente a função do sistema respiratório.

TRATO RESPIRATÓRIO SUPERIOR:

FARINGITE, TONSILITE, OTITE E SINUSITE
A faringite é uma inflamação das membranas mucosas da garganta. Dentre as bactérias, a
principal espécie responsável pela faringite é o Streptococcus pyogenes, um Streptococcus
do grupo A de Lancefield. Nesse caso, a faringite recebe o nome de faringite estreptocócica.
Uma consequência comum da faringite é o desenvolvimento de tonsilite, inflamação das
tonsilas. Em casos raros, quando o S. pyogenes adquiriu a capacidade de produzir a toxina
eritogênica, a infecção evolui para febre escarlate, provocando erupções cutâneas de
coloração avermelhada, febre alta e alterações na língua.

Fonte: Dimarion/Shutterstock
 Streptococcus pyogenes aumentada x1000 no microscópico.

Outra possível complicação é a glomerulonefrite, que pode se desenvolver entre uma até
quatro semanas após a faringite estreptocócica. Na glomerulonefrite, os anticorpos produzidos
pelo sistema imune do paciente se combinam com antígenos produzidos pela bactéria e depois
depositam na membrana dos glomérulos renais, levando a um processo inflamatório nesse
local.

Também por conta das complicações características da faringite provocada pelo S. pyogenes,
é importante identificar a bactéria a partir de um swab da garganta do paciente.

A forma mais rápida de liberar esse laudo é usando kits de testes rápidos para detecção de
antígenos específicos da bactéria. Esse antígeno é o açúcar da parede celular exclusivo do
grupo A de Lancefild. O antígeno é extraído do swab pela ação de uma enzima ou substância
química, e depois alguma técnica imunológica, como ensaio imunoenzimático ou aglutinação,
permite identificar o antígeno exclusivo de S. pyogenes.

Caso não seja possível a utilização dos kits ou, se o resultado desse teste for negativo, mas a
suspeita ainda persistir, podemos semear o swab em meio de cultura do tipo Ágar Sangue,
considerado o método diagnóstico de referência. A hemolisina produzida pelo S. pyogenes
destrói completamente as hemácias do sangue de carneiro presente nesse meio de cultura.
Onde ocorre o crescimento de colônias, a cor do Ágar Sangue passa de vermelha para
transparente, o que caracteriza β-hemólise, ou hemólise total.

Fonte: Wikimedia
 Meio de cultura Ágar Sangue com o crescimento da bactéria Streptococcus
pyogenes.

Na imagem, podemos notar que ao redor da colônia existe um halo translúcido (indicando que
o sangue do meio foi hemolisado), o que caracteriza a β-hemólise.

Depois de obter colônias, podemos fazer a coloração de Gram e confirmar que se trata de um
coco gram-positivo. Dois testes importantes caracterizam o S. pyogenes.

TESTE DO PYR (PYRROLIDONIL ARILAMIDASE)

Determina a atividade da enzima PYR, produzida por essa espécie bacteriana, que pode ser
detectada usando um reagente comercialmente disponível.


SENSIBILIDADE À BACITRACINA

É a sensibilidade ao antibiótico bacitracina, que inibe o crescimento dessa espécie.

 ATENÇÃO

A confirmação de faringite bacteriana é muito importante, pois, muitas vezes, os sinais clínicos
são parecidos com a faringite viral. Se o agente for uma bactéria, é necessário tratamento com
antimicrobianos.

A otite média é a infecção da orelha média, ou mais conhecida por dor de ouvido. Já a
sinusite é a infecção da membrana que recobre seios nasais, cavidades que se localizam ao
redor do nariz, maçãs do rosto e olhos. As principais bactérias capazes de causar essas duas
infecções são Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae.

Tanto para otite média quanto para sinusite, é difícil obter amostras clínicas válidas do
paciente. Nas sinusites e na otite média, o método de referência implica em um procedimento
invasivo, e muitas vezes nenhuma bactéria é detectada. Em ambos os casos, os sinais clínicos
e os sintomas do paciente são a base para o diagnóstico, e para sinusite os exames de
imagem são muito úteis.

Fonte: Maxx-Studio/Shutterstock
 Streptococcus pneumoniae.

Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock

 Haemophilus influenzae.

TRATO RESPIRATÓRIO INFERIOR:

INFECÇÕES AGUDAS (COQUELUCHE,
BRONQUITE, BRONQUIOLITE E
PNEUMONIA) E CRÔNICAS
(TUBERCULOSE)
A coqueluche é uma doença infecciosa, causada pela espécie Bordetella pertussis, que pode
chegar a ser fatal. Normalmente, essa doença atinge crianças que não tomam as três doses de
vacina DTP, ou adultos nos quais a vacina perdeu o efeito ao longo dos anos. Os sintomas da
coqueluche apresentam-se em diferentes fases. A primeira delas é fase catarral, assemelha-se
muito com um resfriado, por isso, a suspeita de coqueluche é bem rara nessa fase. Com o
tempo, a bactéria adere e destrói os cílios da traqueia, o que leva ao acúmulo do muco. Nessa
fase, conhecida como fase paroxística, começam as tosses secas e fortes, na tentativa de
eliminar o muco e permitir que o ar chegue até os pulmões. A tosse vai progredindo, podendo
comprometer a respiração.

O esforço para a entrada do ar produz um som uivante na tosse, daí o nome popular “tosse
comprida” dessa doença. Ainda que os casos sejam pouco frequentes, saber o diagnóstico da
coqueluche é muito importante devido à gravidade que a infecção pode assumir.

Caso você se depare com uma suspeita de coqueluche no laboratório, o diagnóstico

bacteriológico deve feito pela cultura do swab colhido da nasofaringe do doente. A semeadura
da amostra precisa ser feita em meio de cultura suplementado com nutrientes especiais e
antibiótico, já que é uma bactéria com exigências nutricionais e precisamos impedir o
crescimento da microbiota nasal. Podemos usar meios como Ágar Regan-Lowe ou Ágar Bordet
& Gengou.

Fonte: Wikimedia
 Bordetella pertussis crescendo em Ágar Regan-Lowe. Isolado a partir de swab nasal de
paciente com coqueluche mostrado crescimento de 7 dias em 10% de CO2.

O crescimento da B. pertussis é lento , por isso, a incubação precisa ser feita por até sete
dias, em ambiente aeróbico e úmido. A célula bacteriana se cora fracamente pelo Gram, e, por
isso, é recomendado deixar o último corante por dois minutos. Depois da coloração,
visualizamos, usando um microscópio, pequenos bacilos gram-negativos corados em
vermelho.
Por conta de demora para cultivar B. pertussis em laboratório, é recomendando aplicar técnicas
que acelerem o diagnóstico. Dentre elas, estão o teste sorológico e o diagnóstico molecular
pela PCR (Reação em Cadeia da Polimerase).

Fonte: Perelygin Maksim/Shutterstock

O teste sorológico detecta anticorpos no sangue do paciente que foram produzidos contra a
bactéria, mas eles demoram algumas semanas para aparecer desde o início da infecção.

Fonte: bogdanhoda/Shutterstock
O teste molecular identifica o DNA da bactéria, e é considerado o método mais eficiente de
diagnóstico para coqueluche. A escolha do método dependerá das condições oferecidas pelo
laboratório clínico e o quadro do paciente.

 RECOMENDAÇÃO

Bronquite e bronquiolite são infecções limitadas a traqueia e aos brônquios. As formas agudas,
de início rápido, quase sempre são causadas por vírus. O diagnóstico microbiológico, com
cultivo de bactérias por exemplo, não é indicado para essas infecções.

O tratamento é voltado para reverter os sintomas, como o uso de broncodiladores. Pelo menos
nesses casos, você não precisa se preocupar em desvendar dentro do laboratório clínico o
agente etológico!

A pneumonia é a infecção aguda de todo o pulmão, que pode ser causada por diferentes
espécies de bactérias, além de outros microrganismos. O agente bacteriano mais frequente é a
espécie Streptococcus pneumoniae e, nesse caso, a doença recebe o nome de pneumonia
pneumocócica.

Considerada a pneumonia clássica, os sintomas como febre alta, dificuldade de respirar e dor
lombar surgem logo. A ocorrência desse tipo de pneumonia pode diminuir ao longo dos
próximos anos pelo acesso a vacinas disponíveis contra alguns sorotipos de pneumococos,
que têm como alvo o açúcar da cápsula bacteriana.

As pneumonias adquiridas após um período maior ou igual a 48 horas de admissão no hospital

costumam ser causadas por Staphylococcus auereus ou bacilos gram-negativos, como as
espécies Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa, essa última muito associada a
situações em que o paciente está sob ventilação mecânica.

Pneumonias bacterianas atípicas são aquelas causadas por espécies como Mycoplasma
pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae e Legionella pneumophila. O diagnóstico laboratorial
que define o agente da pneumonia é muito importante, porque é a base para a escolha do
tratamento adequado, diminuindo do risco de óbito.

O material usado para o diagnóstico de pneumonias pode ser escarro, aspirado traqueal,
lavado broncoalveolar, material de biópsia e sangue. Swab das vias aéreas superiores
geralmente não são úteis pois acabam refletindo a microbiota normal. Em relação ao escarro,
deve ser coletado logo pela manhã e encaminhado diretamente ao laboratório. O aspirado está
sujeito a contaminações por microrganismos que colonizam pacientes entubados ou com
ventilação mecânica. Já o lavado broncoalveolar é mais seguro nesse aspecto.

 RECOMENDAÇÃO

As biópsias são mais indicadas para imunocomprometidos e crianças que não reagem bem ao
tratamento. A cultura de sangue é usada quando existe suspeita de que a bactéria tenha
atingido no sangue do paciente. Todas as amostras respiratórias podem ser armazenadas por
até 2 horas em temperatura ambiente, e até 24 horas em geladeira.

COMO DEVE SER FEITA UMA COLETA E

TRATAMENTO DE AMOSTRA DE ESCARRO
PARA DIAGNÓSTICOS DE INFECÇÕES
RESPIRATÓRIAS DO TRATO INFERIOR?
Se a pneumonia não é de origem hospitalar, primeiramente, devemos investigar a possibilidade
de pneumonia pneumocócica, por ser a mais prevalente. O material clínico deve ser
semeado em Ágar Sangue e incubado na presença de 5% de CO2. A hemólise parcial aponta

para o Streptococcus pneumoniae, já que essa espécie é α-hemolítica. A partir desse

crescimento, a coloração de Gram pode ser realizada, com a intenção de confirmar a presença
de cocos gram-positivos.

Outros dois testes confirmatórios são a solubilidade em bile e a sensibilidade a optoquina.

A célula do S. pneumoniae sofre lise pela ação dos sais biliares e é sensível ao antimicrobiano
optoquina, o que não acontece com outros cocos gram-positivos α-hemolíticos.

Fonte: Wikimedia
 Crescimento de Streptococcus pneumoniae em Ágar Sangue.

Na imagem, podemos observar a hemólise parcial onde a bactéria cresce, pois a cor do meio
fica esverdeada. Além disso, vemos um disco impregnado com optoquina (OP) que foi
colocado logo após a semeadura e, com isso, inibiu o crescimento bacteriano no seu entorno, o
que indica sensibilidade.

 RECOMENDAÇÃO

O teste mais atual para detecção de pneumococos é identificar um antígeno específico dessa
bactéria na urina do paciente, de forma muito rápida e prática. No entanto, o resultado negativo
precisa ser confirmado por cultura do material, como já foi mencionado anteriormente.

Se a causa da pneumonia não for a espécie S. pneumoniae, a próxima suspeita deve ser a
bactéria Haemophilus influenzae. A coloração de Gram direto do escarro é capaz de diferenciar
H. influenzae de S. pneumoniae, pois o primeiro é um cocobacilo gram-negativo, enquanto o
segundo é um coco gram-positivo. Para cultura e observação das colônias, usamos o meio de
cultura Ágar Chocolate, que tem na sua composição hemácias lisadas, uma rica fonte de
nutrientes para bactérias exigentes. Outro teste importante é verificar a necessidade da
bactéria pelo fator X (hemina ou hematina) e pelo fator V (NAD ou coenzima I). Se a espécie
isolada do material for realmente H. influenzae, ela irá crescer na presença desses fatores,
porque precisa deles.

Fonte: Wikimedia
 Teste dos fatores X e V para Haemophilus influenzae.
Na imagem, a bactéria foi semeada em meio de cultura simples, mas foram colocados discos
impregnados com os fatores X e/ou V. Perceba que o Haemophilus influenzae só cresce
quando o disco possui os dois fatores ao mesmo tempo.

 VOCÊ SABIA

As pneumonias causadas por H. influenzae de S. pneumoniae são geralmente adquiridas na

comunidade, durante o dia a dia, logo, são chamadas de pneumonias comunitárias.

Para diagnóstico de pneumonias hospitalares, são encaminhados para cultura diferentes

tipos do amostras, que já foram citadas aqui. O escarro pode ser corado pela coloração de
Gram e visto ao microscópio, um recurso simples e que pode direcionar as próximas ações. Se
forem amostras de aspirado traqueal e lavado broncoalveolar, semeamos em meios de cultura
como Ágar MacConkey e Ágar Sangue para checar o aparecimento de colônias. Se o agente
for o S. aureus, vamos observar hemólise total em Ágar Sangue, e nenhum crescimento em
Ágar MacConkey. Em casos de bacilos gram-negativos, teremos crescimento nos dois meios, e
o Ágar MacConkey ainda vai nos dar dicas sobre a fermentação.

Quando confirmada a presença de bastonetes gram-negativos, podemos suspeitar de

espécies como Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii.
Vários testes sobre as características bioquímicas dessas espécies são necessários para
chegar ao verdadeiro agente etiológico.
Fonte: Wikimedia
 Resultados de teste bioquímico de TSI (Triplo Açúcar e Ferro) para diferentes
espécies de bacilos gram-negativos. Da esquerda para direita: 1- Nenhuma bactéria foi
semeada. 2- Resultado para espécies como Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter
baumanni. 3- Resultado para espécies como Escherichia coli e Klebsiella pneumoniar. 4-
Resultado para a espécie Salmonella Typhimurium. 5- Resultado para a espécie Shigella
flexneri.

 ATENÇÃO

Fique atento e sempre verifique a sensibilidade dessas bactérias aos antimicrobianos

disponíveis para o tratamento, pois existe uma grande chance de elas serem resistentes a
ação da maioria deles! Além disso, tanto para casos de pneumonias comunitárias como
hospitalares, precisamos estar certos de que a bactéria cultivada a partir de amostras do
sistema respiratório seja realmente agente de infecção, e não só colonizadora desses órgãos.

Na colonização, o microrganismo não causa doença, enquanto nos casos de infecção, a

bactéria altera o estado de saúde do paciente, provocando sinais e sintomas. Se o material
clínico for escarro, é importante checar sua qualidade por microscopia. Quando se trata de
infecção, observaremos um número elevado de leucócitos, baixa contagem de células epiteliais
(provenientes da saliva) e um único tipo morfotintorial se destacará após coloração de Gram
(coco gram-positivo OU bacilos gram-negativos, por exemplo).
Para materiais que foram coletados de forma invasiva e estéril, como lavado broncoalveolar e
aspirado traqueal, devemos contar o número de colônias que apareceram no meio de cultura.
Para que a infecção seja confirmada, esse número deve ser superior ao limite mínimo
estipulado pelas normas da ANVISA. Chamamos essa técnica de cultura quantitativa, e será
abordada com mais detalhes no tópico Urinocultura.

Bactérias que causam pneumonias atípicas não podem ser detectadas por métodos de
diagnóstico microbiológicos convencionais, como a cultura. Dentre as limitações, podemos citar
o fato de não se corarem pelo método de Gram ou o difícil cultivo em meios de cultura
tradicionalmente usados no laboratório.

Em casos suspeitos, a confirmação pode ser feita através de técnicas imunológicas, que
detectam o anticorpo produzido pelo sistema imune do doente contra a bactéria ou algum
antígeno específico do microrganismo. Podemos contar também com o diagnóstico
molecular, como a PCR, que identifica o material genético da bactéria.

Fonte: Pikist
 Diagnóstico molecular.

A tuberculose é uma infecção crônica do trato respiratório inferior, diferente das outras
infecções discutidas até aqui. A doença se inicia quando a bactéria começa a invadir e se
multiplicar dentro dos macrófagos presentes nos alvéolos pulmonares. A doença avança
lentamente, à medida que mais macrófagos são destruídos, o que gera inflamação e lesão do
tecido pulmonar.
O papel do sistema imune é essencial e determina se a doença seguirá para fases mais
graves. A tuberculose passou a se tornar um problema ainda maior com a epidemia de HIV.
Por conta da baixa imunidade desses pacientes, a tuberculose pode evoluir de forma mais
rápida e perigosa. Nesses pacientes, existe mais chance da ocorrência de tuberculose
extrapulmonar, quando outros órgãos além do pulmão são atingidos, através da disseminação
da bactéria pelo sistema linfático e sanguíneo.

Diferentes materiais clínicos podem ser enviados ao laboratório para o diagnóstico de

tuberculose. Para tuberculose pulmonar, o principal é o escarro, mas também podem ser
enviados líquido pleural, biópsia, entre outros. Esteja atento aos cuidados com a manipulação
desse material. As medidas de proteção aumentam de acordo com o tipo de análise que será
realizada. As mais básicas envolvem o exame direto do material ao microscópio, quando é
necessário, por exemplo, tratar a amostra com hipoclorito de sódio a 5% antes de preparar a
lâmina, para inativar a bactéria. Além disso, existem outros detalhes que envolvem cultivo da
bactéria e a avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos, que exigem um ambiente
laboratorial adaptado.

A inviabilização com hipoclorito de sódio 5% é uma opção quando o laboratório não tem cabine
de segurança biológica.

Para tuberculose pulmonar, a primeira análise a ser feita é o exame microscópio do escarro
após coloração, conhecido como baciloscopia. O escarro pode ser distendido diretamente na
lâmina ou anteriormente podem sem usados agentes mucolíticos que o tornam mais fluido,
como NaOH. O método de coloração mais usado é Ziehl-Neelsen, onde os bacilos álcool-ácido
resistentes (BAAR), como as micobactérias, adquirem coloração rosa forte, e outras células
ficam coradas em azul, quando vistos ao microscópio óptico.
Fonte:Shutterstock
 Baciloscopia de escarro corado por Ziehl-Neelsen mostrando BAAR. A Mycobacterium
tuberculosis aparece em cor vermelha e as outras células do escarro se coram em azul.

Também é possível usar a coloração com auramina como triagem, onde os BAAR coram em
amarelo alaranjado e o restante da lâmina fica escura, mas, nesse caso, é necessário um
microscópio de fluorescência. O resultado da microscopia pode mostrar ausência de BAAR ou
presença. A presença é registrada de acordo com a quantidade de dessas células por campo
de visão, variado de raros (+) até numerosos (++++). A microscopia é simples, rápida e de
baixo custo, mas alguns casos podem não ser detectados por esse método. Por isso, a
confirmação de resultados negativos para casos suspeitos vem através da cultura do
microrganismo, considerado o padrão-ouro para tuberculose pulmonar. Também usamos a
cultura para o diagnóstico de tuberculose extrapulmonar.

A cultura de Mycobacterium é trabalhosa, porque essa bactéria possui um crescimento lento e

exige condições específicas. Além disso, algumas amostras, como escarro e lavado
broncoalveolar, precisam ser tratadas antes de serem semeadas no meio de cultura, para
eliminar microrganismos contaminantes.
Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock
 Mycobacterium.

Entre os meios de cultura usados, podemos destacar o Lowenstein-Jensen e Middlebrook.

Os meios devem ser incubados em estufa com 5 a 10% de CO2 por até 8 semanas, e

precisamos verificar se ocorreu o crescimento de colônias duas vezes nas duas primeiras
semanas, e depois, uma vez por semana. Se forem observadas colônias, seguimos com a
identificação da espécie de Mycobacterium. Essa discriminação baseia-se no tempo necessário
para o crescimento visível, na aparência das colônias, na produção de pigmento quando as
colônias são expostas à luz e na realização de certas análises bioquímicas.

Fonte: Shutterstock
 Meio de cultura Lowenstein-Jensen com crescimento de colônias características de
Mycobacterium tuberculosis. As colônias típicas dessa espécie são secas, amontoadas e
amareladas.

Uma outra opção de diagnóstico são os testes automatizados e métodos moleculares, que
são mais rápidos, porém mais caros. O BACTEC é um exemplo de teste automatizado que
identifica a espécie M. tuberculoses através da sua inibição pelo composto NAP (ρ-nitro-α-
acetylamino-β-hydroxypropiophenone), liberando o resultado em aproximadamente cinco dias.

Os testes moleculares incluem a utilização de sondas que se ligam ao RNAr da espécie alvo,
ou ainda a amplificação de determinadas regiões do DNA da bactéria pela técnica de PCR.
Tudo depende dos recursos disponíveis, mas devemos estar preparados e conhecer todas as
possibilidades.

Se o objetivo for rastrear possíveis doentes em uma população de risco para tuberculose,
podemos aplicar o teste imunológico da prova tuberculínica. Chamado de PPD (Purified
Protein Derivative), esse exame verifica se casos suspeitos apresentam reação imunológica
contra uma proteína purificada da M. tuberculosis, que é injetada nas camadas superficiais da
pele do indivíduo.

Fonte: Pixabay
 Teste de PPD.

Se ocorrer reação positiva, a área em torno da injeção ficará endurecida e vermelha após
aproximadamente 72 horas. Esse teste não significa que a doença está ativa, e sim um contato
anterior com a bactéria. Por isso, pessoas que já se vacinaram com a vacina BCG apresentam
PPD positivo. O PPD como indicativo de casos ativo de tuberculose é mais usado para
pacientes positivos para o vírus HIV e crianças bem novas, com imunidade baixa.

Testar a suscetibilidade de M. tuberculosis aos antimicrobianos usados para o tratamento é de

particular importância clínica. A tuberculose é uma infecção adquirida fora do ambiente
hospitalar, mas que, mesmo assim, apresenta altas taxas de falhas terapêuticas devido à
resistência bacteriana ao tratamento. O teste é feito para os antimicrobianos que são as
primeiras opções terapêuticas, como isoniazida e rifampicina. Esse teste pode ser feito através
de forma tradicional, verificando o crescimento bacteriano no meio de cultura Lowenstein-
Jensen com antimicrobiano, ou ainda utilizando métodos comerciais e técnicas moleculares.
Em todos os casos, o resultado indicará se a bactéria isolada do doente é resistente ou
sensível à ação de determinada droga. Se o resultado for resistente, a indicação de tratamento
passa a ser antimicrobianos de segunda linha, como aminoglicosídeos e etionamida.

VERIFICANDO O APRENDIZADO

1. APRENDEMOS QUE AS ESPÉCIES STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE E

STREPTOCOCCUS PYOGENES SÃO IMPORTANTES AGENTE DE
INFECÇÕES DO TRATO RESPIRATÓRIO. ESCOLHA A AFIRMATIVA QUE
DESCREVA UMA AFIRMAÇÃO VERDADEIRA SOBRE ESSAS BACTÉRIAS.

A) Streptococcus pneumoniae quando semeado em meio de cultura Ágar Sangue não realiza
hemólise das hemácias, deixando o meio com coloração esverdeada.

B) Streptococcus pneumoniae é mais importante por causar infecções respiratória do trato

inferior, como a faringite estreptocócica.

C) Streptococcus pyogenes é mais importante por causar infecções respiratória do trato

superior, como a pneumonia pneumocócica.

D) Streptococcus pyogenes quando semeado em meio de cultura Ágar Sangue realiza

hemólise total das hemácias, deixando halo transparente ao redor da colônia.
2. ESTUDAMOS QUE A TUBERCULOSE É UMA INFECÇÃO CRÔNICA DO
TRATO RESPIRATÓRIO INFERIOR. ELA É CAUSADA PELA ESPÉCIE
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS , QUE APRESENTA ALGUMAS
PARTICULARIDADES EM RELAÇÃO À MAIORIA DAS BACTÉRIAS.
ESCOLHA A OPÇÃO QUE RESUME ESSAS CARACTERÍSTICAS
CORRETAMENTE.

A) A Mycobacterium tuberculosis cresce em 24 horas, não é corada pelo método de Gram, e

tem grandes chances de ser resistente aos antimicrobianos de primeira linha usados no
tratamento da doença.

B) A Mycobacterium tuberculosis cresce em até uma semana, não é corada pelo método de
Gram, e raramente apresenta-se resistente aos antimicrobianos de primeira linha usados no
tratamento da doença.

C) A Mycobacterium tuberculosis cresce lentamente, não pode ser diferenciada pelo método de
Gram, e tem grandes chances de ser resistente aos antimicrobianos de primeira linha usados
no tratamento da doença.

D) A Mycobacterium tuberculosis cresce lentamente, é corada pelo método de Gram, e

raramente apresenta-se resistente aos antimicrobianos de primeira linha usados no tratamento
da doença.

GABARITO

1. Aprendemos que as espécies Streptococcus pneumoniae e Streptococcus pyogenes

são importantes agente de infecções do trato respiratório. Escolha a afirmativa que
descreva uma afirmação verdadeira sobre essas bactérias.

A alternativa "D " está correta.

Streptococcus pyogenes produz hemolisinas muito potentes, capazes de realizar β-hemólise.

Enquanto Streptococcus pneumoniae produz hemolisinas mais fracas, ocorrendo uma perda
parcial de hemoglobinas pelas hemácias, gerando uma zona esverdeada em torno da colônia.

2. Estudamos que a tuberculose é uma infecção crônica do trato respiratório inferior. Ela
é causada pela espécie Mycobacterium tuberculosis , que apresenta algumas
particularidades em relação à maioria das bactérias. Escolha a opção que resume essas
características corretamente.

A alternativa "C " está correta.

Essa bactéria pode levar até 24 para se dividir, não pode ser diferenciada pelo Gram devido às
extensas camadas externas de ácido micólico e uma preocupação com a resistência é
verdadeira.

MÓDULO 3
 Descrever os métodos de diagnóstico laboratorial usados para infecções bacterianas
do trato urinário

PATOGÊNESE DAS INFECÇÕES DO TRATO

URINÁRIO
Estudar a patogênese de uma doença é entender como ela agride o nosso corpo e como ele
reage a essa agressão. Aqui, iremos nos concentrar na patogênese das infecções bacterianas
no sistema urinário. Para isso, vamos falar sobre como as bactérias têm acesso a esses
órgãos, de que forma cada espécie pode alterar seu funcionamento, e as consequências das
ações desses pequenos seres vivos.

A função do sistema urinário é formar a urina, armazená-la e, posteriormente, eliminá-la. Tudo

começa nos rins, onde o sangue é filtrado, através de aglomerados de pequenas vasos
sanguíneos, para formar a urina. Os ureteres levam a urina formada para a bexiga, onde ela
fica armazena até o momento de sua eliminação. A liberação da urina ocorre pela uretra.
Fonte: La Gorda/Shutterstock
 Esquema do sistema urinário.

Na imagem, de cima para baixo, vemos dois rins, por onde chegam os vasos sanguíneos,
depois, os rins se conectam com a bexiga pelos ureteres e esses desembocam na bexiga. A
bexiga se comunica com o meio externo através da uretra.

Esse funcionamento é muito importante pois elimina substâncias tóxicas ao nosso organismo e
mantém uma quantidade de água suficiente para o nosso corpo. As patologias que afetam
esses órgãos podem, por exemplo, provocar o acúmulo de substâncias indesejáveis ou a
eliminação inadequada de componentes importantes, além de alterações da pressão
sanguínea. Dentre essas patologias, estão as infecções do trato urinário (ITU).

As ITUs são definidas como a presença e multiplicação de microrganismos nos órgãos

desse sistema. Devido a sua organização, o sistema urinário está em constante contato com o
meio externo, facilitando a entrada dos agentes infecciosos. Provavelmente, você conhece
alguém que já passou por uma infecção urinária baixa, que acomete a uretra e bexiga, muito
comuns, especialmente, em mulheres, durante a vida sexual ativa.

Algumas características do trato urinário dificultam o desenvolvimento de microrganismos

causadores de doença. A força com que eliminamos a urina é uma barreira mecânica, que
“empurra” para fora a bactéria patogênica. Os lactobacilos, bactérias da microbiota genital de
mulheres, produzem ácido lático através do seu metabolismo e mudam o pH da região. O pH
ácido, tanto da região genitália, quanto da urina, é impróprio para a reprodução de muitos
microrganismos, dificultado sua sobrevivência. Qualquer condição que altere as proteções
naturais do nosso organismo pode facilitar o desenvolvimento de infecção. Você já deve ter
ouvido falar que não é recomendado realizar higiene íntima muitas vezes ao dia ou com
sabonetes básicos. Essas ações podem alterar o pH ou eliminar os lactobacilos da microbiota.
O uso prolongado, desnecessário ou errado de antimicrobianos também altera a microbiota
genital.

A maioria das infecções do sistema urinário é causada por bactérias. No entanto, outros
microrganismos podem se desenvolver, como, por exemplo, fungos e protozoários. Um
exemplo importante é o fungo da espécie Candida albicans. Esse microrganismo faz parte da
microbiota normal de algumas mulheres, mas pode crescer de forma descontrolada, causando
a candidíase. Quando não tratada, essa infecção da genitália externa tem chances de evoluir
para uma infecção urinária.

Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock

 Candida albicans.

As bactérias podem provocar infecções nos diferentes órgãos do sistema urinário, dependo da
sua porta de entrada. Elas podem acessar os rins pelo sangue, por exemplo, a partir de uma
infecção que se originou em outra parte do corpo e se espalhou, chamada de infecção
sistêmica. Um exemplo é a leptospirose, causada pela bactéria Leptospira interrogans.

Essa bactéria pode ser liberada pela urina de animais e contaminar a água, penetrando no
nosso organismo através de pequenas lesões ou por membranas mucosas, como a cavidade
oral em caso de ingestão. Portanto, sempre lave bem produtos que serão colocados
diretamente na boca, como latas de bebidas.
Fonte: Shutterstock

Uma vez dentro do nosso organismo, a L. interrogans penetra dentro das nossas células. Ali
elas encontram “abrigo” para fugir do nosso sistema imune, além de conseguirem acessar
diferentes órgãos. Com isso, a bactéria ganha tempo para se multiplicar e, em algumas raras
vezes, os rins podem ser atingidos gravemente. Essa forma mais grave é conhecida como
Doença de Weil, que pode atingir também o fígado da pessoa doente.

 VOCÊ SABIA

A maior causa de mortes por leptospirose é a insuficiência renal aguda, quando os rins perdem
a sua função.

Além do acesso pelo sangue, é importante falarmos da maneira mais comum pela qual
bactérias atingem o sistema urinário: uma fonte externa que entra pelo ureter, chamada de via
ascendente. Devido à proximidade entre o ânus e o início do ureter, bactérias da microbiota
intestinal são famosas agentes de uretrites. Se o tratamento não for feito de forma correta, é
possível que a bactéria tenha acesso a partes mais altas do sistema urinário, podendo chegar
até aos rins. Isso justifica a recomendação de usar o papel higiênico no sentindo da vulva
(popular vagina) para o ânus, diminuindo a chance de contaminação.

O sufixo “ite” é usado para nomear os diferentes tipos de infecções do sistema urinário.
Portanto, usamos uretrite, cistite, ureterite e pielonefrite para nos referirmos a infeções na
uretra, bexiga, ureteres e rins, respectivamente. Em mulheres, a cistite é mais comum, pois o
comprimento da uretra é curto, além de se localizar muito próxima ao ânus, facilitando o
acesso das bactérias a esse órgão. Tanto em homens quanto em mulheres, a espécie mais
comum nesse tipo de infecção é a Escherichia coli, um microrganismo da microbiota
intestinal.

Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock

 Escherichia coli.

Um tipo especial de E. coli, chamada de uropatogênica, está muito relacionada às ITU por
possuir fatores que facilitam sua aderência à mucosa urinária. Com menos frequência ocorrem
casos de infecção por Staphylococcus coagulase negativo, como S. saprophyticus, que são
integrantes da microbiota da pele. Existem ainda outras espécies possíveis, como bactérias
envolvidas com infecções genitais e o gênero Proteus, uma enterobactéria assim como a E.
coli.
Fonte: OneMashi/Shutterstock
 S. saprophyticus.

Os casos mais graves de ITU são aqueles em que a bactéria atinge os rins. Uma vez nesse
órgão, o acesso desse microrganismo à corrente sanguínea é facilitado, o que pode provocar
bacteremia, ou, infecção da corrente sanguínea. Quando existe chance de bacteremia, é
preciso fazer a cultura do sangue do paciente para verificar a existência de qualquer
crescimento bacteriano. Pielonefrites crônicas são um risco para o funcionamento renal, pois
provoca pequenas lesões nos rins. Se você, ou alguma pessoa conhecida, desconfiar de
infecção urinária, procure atendimento médico para evitar a evolução da doença e os riscos
associados.

COLETA, TRANSPORTE E ARMAZENAMENTO

DE URINA

Agora que você já sabe como funciona o sistema urinário e como as bactérias podem atingi-lo,
vamos começar a discutir de que forma detectamos alterações das funções renais e a
presença de bactérias nesses órgãos. Além da avaliação dos sintomas e dos sinais clínicos do
paciente, a composição da urina pode ajudar muito na hora do diagnóstico. Já que o nosso
foco é a questão laboratorial, chegou a hora de avaliar o material clínico mais usado para trazer
informação sobre o sistema urinário: a urina!
Antes do exame propriamente dito (etapa analítica), precisamos nos atentar para condições
anteriores, que fazem parte da etapa pré-analítica. Se a primeira fase é realizada de forma
incorreta, todas as demais serão afetadas. No exame de urina, precisamos nos importar com a
forma correta de coletar, transportar e armazenar esse material clínico, pois ele é muito instável
e pode sofrer transformações de seus elementos a todo tempo.

A coleta ideal depende do tipo de exame que será realizado e das características do paciente.
Para suspeitas de ITU pode ser necessário apenas a verificação de componentes da urina
através de testes rápidos, mas a melhor forma de confirmar o diagnóstico é identificando o
crescimento bacteriano a partir da urina. Em relação ao paciente, condições associadas à
idade e ao estado de saúde podem impedir que um determinado tipo de coleta seja feito. Cada
uma dessas situações tem suas particularidades, e devemos estar atentos para recomendar a
forma mais adequada, para que isso não afete o resultado que será liberado. Os métodos de
coleta podem variar entre as seguintes opções:

Amostra de jato médio de urina colhida em frascos coletores.

Uso de bolsa coletora em pacientes que não controlam o momento de eliminar a urinar,
como crianças.

Cateteres vesicais, que são procedimentos feitos usando cateteres inseridos através da
uretra até a bexiga. São usados quando o paciente não consegue urinar
espontaneamente ou outras situações que dificultem a coleta tradicional usando frascos.

Punção suprapúbica, feita pela introdução de uma agulha no interior da bexiga pela
parede do abdômen.

 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal

De todas essas formas, provavelmente, você já realizou pelo menos uma vez na vida a coleta
de jato médio por frascos coletores, já que esse tipo de coleta faz parte de um check-up
médico de rotina. A primeira urina da manhã coletada em frascos é usada, por exemplo, para
checar “Elementos Anormais e Sedimentos”, exame conhecido como EAS. O EAS permite
analisar imediatamente vários componentes desse material clínico, como hemácias, leucócitos
e proteínas.

O exame de escolha para confirmação da ITU deve ser a urinocultura, ou cultura de urina.
Queremos com esse exame verificar o crescimento em meio de cultura da bactéria responsável
pela infecção, usando para isso a amostra de urina.

 ATENÇÃO

É muito importante que material clínico não seja contaminado com microrganismos externos ao
sistema urinário durante a coleta, porque isso irá confundir a interpretação do exame. Se
bactérias da microbiota da pele ou da região genitália crescem no meio de cultura, elas se
confundem com a verdadeira espécie responsável pela infecção.

Quando o objetivo é realizar uma urinocultura, a urina pode ser coletada por jato médio, pela
utilização de bolsas coletoras, através de cateter urinário ou punção suprapúbica. Em
todos os casos, deve-se diminuir ao máximo as chances de contaminação. A punção
suprapúbica, apesar de invasiva, é o método padrão-ouro para garantir maior esterilidade da
amostra. Dentre as opções não invasivas, a coleta de jato urinário médio usando frasco estéril
é o método mais usado.

É importante recomendarmos ao paciente ou profissionais responsáveis pela coleta os

seguintes cuidados específicos para cada método:

JATO MÉDIO ESTÉRIL

Realizar limpeza com água e sabão neutro da região genitália, tanto feminina, quanto
masculina.

Para homens, retrair o prepúcio e fazer higiene da glande.

Para mulheres, afastar os lábios vulvares durante a coleta.

Usar um frasco coletor estéril fornecido pelo laboratório ou adquirido em farmácia.

Descartar o primeiro jato de urina.

 Colher preferencialmente a primeira urina da manhã e, se não for possível, coletar a urina
após 2 horas da última micção.

Se possível, coletar a urina quando já estiver no laboratório.

Fonte: Doro Guzenda/Shutterstock

SACO COLETOR
Realizar a limpeza de toda região que terá contato com o saco coletor usando água e
sabão, e após secar adequadamente.

Trocar o saco com intervalos regulares (o tempo recomendado pode variar).

Se o resultado for positivo, deve-se fazer punção suprapúbica em crianças.

Fonte: g0d4ather/Shutterstock

CATETER VESICAL
Higienizar a entrada da vagina.

Desprezar o primeiro jato de urina cateterizada.

Fonte: meboonstudio/Shutterstock

PUNÇÃO SUPRAPÚBICA
Higienizar a pele com substâncias antissépticas antes da coleta.
 A bexiga deve estar cheia.

Para realizar a maioria dos exames de urina, é preciso que ela seja encaminhada rapidamente
ao laboratório quando a coleta for feita em casa. Nesses casos, é importante proteger a
amostra da luz solar direta, e evitar que durante o transporte ela seja exposta a temperaturas
maiores que 25°C. O primeiro motivo é que esse material é rico em nutrientes que possibilitam
o rápido crescimento bacteriano após a coleta. Além disso, os componentes da urina podem
sofrer alterações, como se precipitarem ou mudarem sua composição química. Por isso, a
urina deve ser preferencialmente coletada quando o paciente já estiver no laboratório.

 RECOMENDAÇÃO

O profissional responsável pelas análises no laboratório deve processar a amostra em até 2

horas após a coleta. Se não for possível, a urina deve ser armazenada em geladeira, entre 2 e
8°C. Mas atenção, NUNCA congele a urina, pois isso destrói elementos urinários, como
células. Na impossibilidade de usar refrigerador, são utilizados conservantes químicos, que
permitem que a urina fique em temperatura ambiente.

Existem diferentes tipos de conservantes, mas todos têm seus pontos fracos, portanto, devem
ser a última opção. Um exemplo é o ácido bórico, que pode matar algumas espécies de
microrganismos patogênicos, impossibilitando que eles sejam detectados pela cultura. O tempo
que a urina pode permanecer em geladeira ou sob a ação de conservantes pode variar entre o
tipo de exame que será realizado ou de acordo com a norma padronizada para cada
laboratório, mas, em geral, esse período não pode ser superior a 24 horas.

TESTES RÁPIDOS

O EAS ou urina do tipo I são sinônimos para um método indireto de diagnóstico ITU. Isso quer
dizer que alguns componentes avaliados indicam a presença de bactérias ou de uma resposta
inflamatória, mas não é possível confirmar a infecção bacteriana só com essa etapa.

Trata-se de um exame muito solicitado pelos médicos, porque permite a liberação rápida do
resultado, considerado que o método de coleta e os testes feitos são simples de serem
executados.
Dentre as características da urina que podem ser rapidamente avaliadas, estão as
propriedades físicas, presença de substâncias químicas e a visualização de componentes da
urina. Vamos falar um pouco de cada uma dessas análises voltadas para o diagnóstico de ITU,
mas é importante ter em mente que elas também auxiliam na confirmação de outras doenças,
como cálculos renais e diabetes.

As propriedades físicas da urina incluem sua cor, cheiro e aparência. Em relação a cor, nos
indivíduos sadios ela varia entre diferentes tons de amarelo dependendo da quantidade de
água ingerida. Não existe uma cor característica de ITU, mas em alguns casos pode estar
vermelha devido a presença de hemácias. O cheiro da urina de um paciente com ITU pode ter
aromas característicos, mas a origem do odor não é clara. Considerando a aparência, uma
pessoa saudável deve ter urina com aspecto transparente, porém, em casos de ITU ela pode
ser tornar turva por conta do excesso de alguns elementos.

Os componentes químicos mais sugestivos de ITU são esterase leucocitária e nitritos.

Enzimas do grupo das esterases são comuns no interior de leucócitos, que são as células de
defesa do nosso corpo. Detectar uma grande quantidade dessas enzimas aponta para uma
intensa atividade dos leucócitos, que é característica de um estado de infecção.

O nitrito é um composto produzido por algumas espécies de bactérias, como a E.coli e, por
isso, detectar a sua presença nos leva a acreditar que existem bactérias em intensa atividade
naquele sistema urinário.

 ATENÇÃO

Nem toda espécie de bactéria que pode causar ITU produz nitrito, como aquelas causadas por
cocos gram-positivos, portanto, o resultado negativo não descarta esse diagnóstico. Os testes
para a presença de esterase e nitrito são feitos usando fitas com marcadores que reagem à
presença desses componentes através da mudança de cor.

As fitas usadas nos testes de componentes químicos da urina são chamadas de fitas
reagentes. É importante armazenar esse material da forma sugerida pelo fabricante, por isso,
sempre leia antes os rótulos e instruções técnicas. Essas condições incluem temperatura, luz e
exposição ao ar. Nesses rótulos, você também encontra informações sobre quanto tempo a fita
deve ficar em contato com a urina, o que é determinante para muitos testes. Além disso, para
relacionar a alteração de cor com um determinado resultado, usamos uma espécie de escala
comparativa que vem na embalagem das fitas reagentes.
Fonte: Lothar Drechsel/Shutterstock
 Teste da fita reativa para EAS de urina.

Na imagem, cada quadradinho de papel filtro que está preso à fita possui um reagente químico
diferente, que irá alterar de cor de acordo com a concentração de uma determinada substância
na urina. Um desses quadradinhos detecta nitrito, e outro esterase leucocitária.

Outra característica importante que pode ser facilmente analisada é a composição da urina.
Para ITU, focamos na identificação de leucócitos e bactérias, que serão vistos usando um
microscópio óptico e, nesses casos, não centrifugamos a urina. Lembrando que, normalmente,
a sedimentoscopia é feita após centrifugação, mas, para ITU, essa não é uma técnica indicada.
Durante a pesquisa por leucócitos, podemos colocar uma pequena quantidade de urina sobre
uma lâmina de vidro e por cima uma lamínula. Usando a lente objetiva de 40x, se forem vistos
mais de cinco leucócitos por campo de visão, informamos a presença de leucocitúria ou piúria.
Para a identificação de bactérias, usamos 10 µl de urina medida por uma alça bacteriológica
calibrada.

Essa pequena quantidade será colorida através do método de Gram. Depois disso, a presença
de uma ou mais células de bactérias por campo usando a objetiva de 100x, será relatado
bacteriúria.
Fonte: Wikimedia
 Bacterúria e piúria observadas em um exame microscópico da urina. Os leucócitos
são as células grandes e arredondadas, enquanto as bactérias são os pequenos traços finos
(bastões).

A leucocitúria e a bacteriúria não são 100% confiáveis para o diagnóstico de ITU. A

leucocitúria positiva acontece na grande maioria nos casos de ITU, mas também pode estar
presente em casos de cálculos renais, lúpus eritematoso sistêmico, tumor de bexiga, dentre
outras patologias. Exercício físico exaustivo ou contaminação da urina com fluidos vaginais
também podem gerar leucocitúria.

Por outro lado, a bacteriúria é bastante específica para ITU, ainda que bactérias da microbiota
possam causar confusão em alguns casos. Um outro ponto negativo é a difícil observação da
bactéria e, por isso, casos confirmados de ITU podem ter bacteriúria negativa no exame
microscópico.

URINOCULTURA

Por conta das limitações dos testes rápidos, a urinocultura é o exame de referência para
confirmar infecções do trato urinário (ITU). Diferentes meios de cultura podem ser usados para
urinocultura, mas todos com consistência sólida, porque só assim é possível visualizar
colônias.
Os três principais meio de cultura são Ágar Sangue de Carneiro, Ágar MacConkey (ou Ágar
Eosina Azul de Metileno -EMB-, que tem as mesmas propriedades) e Ágar Cistina Lactose
Eletrólito Deficiente (CLED). Podemos destacar algumas diferenças importantes entre esses
meios de cultura:

Fonte: Pixnio

O Ágar Sangue tem como qualidade marcante a presença de hemácias inteiras, que são
fontes ricas em nutrientes e podem ser usados para o cultivo de diferentes espécies
bacterianas. Outra vantagem é a visualização de hemólise por ação de certas espécies de
bactérias, como alguns Streptococcus e o Staphylococcus aureus.
Fonte: AnaLysiSStudiO/Shutterstock

Sobre o Ágar MacConkey, é importante saber que se trata de um meio seletivo para bactérias
gram-negativas, portanto, gram-positivos não crescem nesse ambiente. Além disso, o Ágar
MacConkey possui corantes na sua composição que diferenciam, através da cor, bactérias que
realizam ou não a fermentação do açúcar lactose.

Fonte: Zaharia Bogdan Rares/Shutterstock

Já o Ágar CLED é muito usado porque, além de ser diferencial para a fermentação de lactose,
como o MacConkey, ele também impede que certas espécies de bactéria (como as do gênero
Proteus) cresçam se espalhando por toda placa, e assim, conseguimos observar colônias mais
definidas.

Apesar de mais caros, não podemos esquecer dos meios cromogênicos, que permitem a
identificação presuntiva de alguns agentes de ITU pela sua coloração característica após
crescimento, graças à ação de certos substratos do meio.

Uma abordagem possível é semear a amostra de urina em dois tipos de meio, um seletivo e
outro não seletivo, porque direciona a identificação da espécie bacteriana responsável pela
infecção. Por exemplo, se houver crescimento em MacConkey já sabemos que é um gram-
negativo e elimina a necessidade do Gram. Por outro lado, se não ocorre crescimento de
colônias no Ágar MacConkey mas elas aparecem em CLED ou Ágar Sangue, provavelmente, a
espécie bacteriana é um gram-positivo. Se o responsável pela ITU for um Staphylococcus
coagulase negativo, não veremos colônias no Ágar MacConkey, mas sim em Ágar Sangue e
em Ágar CLED. Se a bactéria isolada for uma Escherichia coli, veremos colônias em qualquer
um desses meios, além do que as colônias terão uma coloração rosa pink em MacConkey,
devido à fermentação da lactose.

No entanto, o gasto com meios de cultura aumenta muito, e usar o meio seletivo associados ao
resultado da coloração de Gram é a opção mais comum e de menor custo.

Depois de conhecer os meios de cultura, precisamos falar das principais técnicas de cultivo de
bactérias usando amostras de urina: contagem de colônias por técnica de semeadura
superficial, contagem de colônias por técnica de semeadura em profundidade e o
lamino-cultivo.

As técnicas de contagem de colônia oferecem resultados quantitativos, definindo um

número de bactérias por mL de urina. Esse resultado é importante para o diagnóstico de ITU e
para o acompanhamento do sucesso da terapia antimicrobiana. Já o lamino-cultivo é útil para
definir a presença ou ausência de microrganismos, mas por não ser exato em relação ao
número de bactéria é considerado semiquantitativo.

Para contagem de colônias por técnica de semeadura superficial, utilizamos uma alça
calibrada, que já foi citada na parte de microscopia da urina.
Fonte: Douglas Olivares/Shutterstock
 Profissional manipulando uma alça bacteriológica. Na foto, a alça não é descartável.

Essa alça serve para pegarmos uma quantidade definida de urina, e assim, padronizamos o
nosso teste. O material da alça deve ser platina ou plástico descartável para evitar
interferentes. No caso de utilizar alça de platina, ela deve ser exclusiva para esse
procedimento, além de ter a calibração checada com frequência. A alça deve ser inserida no
frasco contendo urina homogeneizada, na posição vertical. Com a alça carregada de urina,
fazemos uma linha reta no centro da placa, e depois, devemos estriar o material de modo que
as estrias formem um ângulo de 90°C com a linha central.

 RECOMENDAÇÃO

O meio de cultura com o material semeado deve ser incubado em estufa de 35-37°C durante
24 horas. Esse tempo pode ser maior em situações específicas. Após o crescimento
bacteriano, passamos para a etapa de contagem que colônias.

O resultado do método é dado pelo número de colônias bacterianas que se desenvolveram no

meio cultura. Para alças calibradas com 1 µL, uma única colônia que cresceu no meio de
cultura representa 1.000 colônias por 1 mL de urina. Cada colônia contada é chamada de UFC
(Unidade Formadora de Colônia), pois assumimos que ela se originou a partir de apenas uma
célula bacteriana que se multiplicou a ponto de enxergamos seu crescimento. Para confirmar
um quadro de ITU, a contagem precisa corresponder a mais de 100.000 (105) UFC por mililitro
de urina. No caso da alça calibrada com 1 µL, precisamos contar mais de 100 colônias.
Devemos ter atenção com esse limite mínimo para o diagnóstico, porque existem situações
onde contagem menores indicam ITU, por exemplo, se a amostra for coletada por punção
suprapúbica. Para amostras com baixa chance de contaminação, costumamos diminuir o limite
mínimo para considerar uma infecção. Isso também acontece para pneumonias quando a
amostra é um lavado broncoalveolar.

A técnica de semeadura em profundidade baseia-se em diferentes diluições da amostra de

urina que depois são incorporadas ao meio de cultura. As diluições da urina são feitas em
solução salina de forma seriada, ou seja, as concentrações de urina nas diluições são
progressivamente menores. Essa mistura é depositada na placa de Petri com meio de cultura
ainda líquido (42°C), e depois a mistura se solidifica. A incubação é realizada a 35-37°C
durante 24 horas. O crescimento de colônias acontece em profundidade, não só na superfície
do meio de cultura. O resultado é dado pelo número de colônias que se desenvolveram,
multiplicado por quantas vezes a amostra de urina foi diluída. Por exemplo, se observamos

1.000 colônias para a urina diluída 100 vezes, o resultado será 105 UFC/mL. Percebe-se que
essa técnica é muito trabalhosa e, por isso, ela é pouco usada, apesar de ser confiável para
um resultado quantitativo.

Fonte: Wikimedia
 Técnicas de semeadura para contagem de colônias. Na primeira linha, é representado a
técnica de semeadura em profundidade (Pour Plate). Já na segunda, a semeadura em
superfície (spread plate), com auxílio da alça de Drigalski, alça que pode ser utilizada para o
espalhamento da amostra na placa.
Devemos nos atentar para a possível diversidade na aparência das colônias, porque isso pode
indicar contaminação. O crescimento de colônias com aspectos distintos significa que
diferentes microrganismos se desenvolveram a partir da amostra de urina. Para contagens

entre 104 e 105 UFC/mL, se dois ou mais tipos de colônias se sobressaem, é provável que

tenha ocorrido contaminação no momento da coleta. Para contagens superiores a 105

UFC/mL, se existem até duas colônias predominantes, seguimos com os próximos testes. Mas

se três ou mais colônias se destacam na contagem de 105 UFC/ml, assumimos que houve
contaminação grosseira da amostra. Em casos de contaminação, é preciso solicitar uma nova
amostra e refazer a urinocultura. Então, lembre-se de instruir muito bem o paciente ou
profissional que irá fazer a coleta, para evitar essa trabalheira toda!

O lamino-cultivo é uma técnica mais simples que a contagem de colônias em placa de Petri,
usado no diagnóstico de ITU. Para realizá-la, a urina deve ser coletada usando um frasco cuja
tampa está ligada a um suporte plástico em formato de lâmina. O suporte plástico possui duas
faces com meios de cultura diferentes, como Ágar MacConkey e Ágar CLED. Ao tampar o
frasco após a coleta, a lâmina entra em contato com a urina e depois é incubada na estufa de
35-37°C durante 24 horas.

Fonte: GoYong/Shutterstock
 Frasco para lamino-cultivo.

Essa técnica facilita o transporte e a semeadura da amostra. No entanto, a superfície para

contagem de colônias é pequena e, muitas vezes, não observamos colônias definidas. Por
isso, o lamino-cultivo não substitui a contagem de colônia como método quantitativo. A melhor
aplicação dessa técnica consiste em detectar o crescimento bacteriano e identificar os
principais gêneros responsáveis por ITU, como a E. coli.

COMO É FEITA A DILUIÇÃO E CONTAGEM

DE COLÔNIAS DE UMA AMOSTRA DE
URINA?

Após confirmar a ITU, os próximos passos incluem identificação bioquímica e sorológica do

microrganismo e o teste de suscetibilidade aos antimicrobianos. A identificação bioquímica e
sorológica definirá a espécie de bactéria responsável pela infecção. Se o número de colônias
contadas for pequeno, é indicado que forneçamos apenas a morfologia mínima da bactéria
encontrada, como, por exemplo, bacilos gram-negativos ou cocos gram-positivos.

Fonte: Frawash/Shutterstock
 Urinocultura semeada em agar cromogênio positivo com crescimento de apenas um tipo de
bactéria (Klebesiella pneumonaie).

Fonte: Reddress/Shutterstock
 Urinocultura semeada em agar MacConkey negativo com crescimento de vários tipos
bacterianos.
O teste de suscetibilidade aos antimicrobianos (TSA), também chamado de antibiograma,
apontará os medicamentos com maior chance de sucesso no tratamento de uma infecção
bacteriana. O método mais usado para os patógenos que costumam causar ITU é o método de
disco difusão. Nesse teste, discos impregnados com antimicrobianos são depositados sob o
meio de cultura, onde previamente já foi semeada a bactéria. Basicamente, verificaremos após
18 a 24 horas, se a bactéria consegue ou não crescer perto dos discos.

Fonte: Wikimedia
 Meio de cultura com resultado do teste de sensibilidade aos antimicrobianos pelo método
de disco-difusão.

Para realizar esse exame, é importante seguir toda a padronização recomendada pelos órgãos
oficiais, incluindo a utilização do meio de cultura apropriado, Ágar Mueller-Hinton. O resultado
desse teste nos mostrará se a bactéria resiste ou não a ação dos antimicrobianos testados, e
isso guiará a melhor terapia para o paciente, evitando os casos em que o antimicrobiano é
ineficiente e a infecção pode avançar para partes superiores do sistema urinário.

VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. ESTUDAMOS QUE A COLETA, ARMAZENAMENTO E TRANSPORTE DE
URINA PARA O DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES DO TRATO URINÁRIO É
UM PASSO MUITO IMPORTANTE DO PROCESSO. ANALISE AS
AFIRMATIVAS ABAIXO E INDIQUE AQUELA QUE ESTÁ DE ACORDO COM
O CUIDADO NECESSÁRIO COM ESSA AMOSTRA CLÍNICA.

A) No momento da coleta por jato médio, não se deve higienizar a região genital, pois isso
eliminaria a bactéria responsável pela infecção.

B) A urina pode ficar armazenada em ambiente por até 24 horas, pois isso facilita a
visualização de bactéria.

C) A coleta por punção suprapúbica é o padrão-ouro, pois garante que a amostra não será
contaminada com microrganismos externos ao trato urinário.

D) O ideal é armazenar a urina na temperatura de 36°C até o momento da análise, pois essa é
a temperatura na qual a bactéria vive no nosso corpo.

2. VIMOS QUE A INFECÇÕES URINÁRIAS REPRESENTAM O

CRESCIMENTO DE MICRORGANISMOS NO SISTEMA URINÁRIO. QUAL
MÉTODO É CONSIDERADO REFERÊNCIA (PADRÃO-OURO) PARA
CONFIRMAR O DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES DO TRATO URINÁRIO?

A) Testes rápidos com fitas reativas

B) Lamino-cultivo

C) Microscopia da urina

D) Urinocultura

GABARITO

1. Estudamos que a coleta, armazenamento e transporte de urina para o diagnóstico de

infecções do trato urinário é um passo muito importante do processo. Analise as
afirmativas abaixo e indique aquela que está de acordo com o cuidado necessário com
essa amostra clínica.

A alternativa "C " está correta.

Na coleta por punção suprapúbica, a urina não passa por nenhuma outra região do trato
urinário, e é coletada diretamente na seringa. Antes de realizar a coleta de jato médio, deve-se
fazer a higienização da região genital para evitar contaminação. O ideal é que a coleta seja
feita no laboratório, ela deve ser processada em até 2 horas após a coleta, caso não seja
possível, podem ser adicionados conservantes (ácido bório) ou ser mantida na temperatura de
2-8°C por no máximo 24 horas.

2. Vimos que a infecções urinárias representam o crescimento de microrganismos no

sistema urinário. Qual método é considerado referência (padrão-ouro) para confirmar o
diagnóstico de infecções do trato urinário?

A alternativa "D " está correta.

A urinocultura é o método mais preciso e com maior chance de detectar casos de infecção
urinária.

CONCLUSÃO

CONSIDERAÇÕES FINAIS
Acabamos de ter uma visão ampla da importância das bactérias como agentes de infecções
em humanos e mergulhamos no diagnóstico das infecções respiratórias e urinárias.
Percebemos que existem muitas variações entre as abordagens diagnósticas, principalmente,
porque as bactérias têm características particulares e diversas. Além disso, a ciência não para,
e a todo tempo novas opções estão aparecendo.

Agora, você está preparado para avançar ainda mais dentro da microbiologia, com a certeza de
que o conhecimento adquirido aqui é muito aplicável e útil na rotina de trabalho.
REFERÊNCIAS
ALBINI, C. A.; SOUZA, H. A. P. H. M.; SILVEIRA, A. C. O. Infecções Urinárias: uma
abordagem multidisciplinar. Curitiba: CRV Ltda, 2012.

BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Detecção e Identificação de Bactérias de

Importância Médica, Módulo 6. 2013. Consultado em meio eletrônico em: 2 set. 2020.

BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Detecção e Identificação de

Micobactérias de Importância Médica, Módulo 7. 2013. Consultado em meio eletrônico em:
2 set. 2020.

BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Principais Síndromes Infecciosas,

Módulo 3. 2013. Consultado em meio eletrônico em: 2 set. 2020.

BROOKS, G. F. et al. Microbiologia médica de Jawetz, Melnick e Adelberg. 26. ed. McGraw
Hill. 2013.

TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 12 ed. Porto Alegre: Artmed,
2017.

EXPLORE+
Para saber mais sobre os assuntos explorados neste tema:

Pesquise a matéria “A ameaça global das bactérias resistentes aos antibióticos”.

Disponível no site da Fiocruz. Autor Lucas Rocha (IOC/Fiocruz).
 Assista à entrevista “Teste único é capaz de diagnosticar tuberculose rapidamente e
liberar leitos de isolamento respiratório.” Disponível no site do jornal da USP. Matéria
realizada por Vitoria Pierri. No site disponível, há um podcast onde o infectologista Valdes
Roberto Bollela é entrevistado.

Leia o artigo “Presença de analitos químicos e microscópicos na urina e sua relação com
infecção urinária”, de autoria de Lenir Alves Bortolotto e colaboradores, publicado em
2016.

CONTEUDISTA
Melise Chaves Silveira

 CURRÍCULO LATTES
DESCRIÇÃO
Principais infecções bacterianas associadas a infecções sistêmicas (hemoculturas), infecções
gastrointestinais (coprocultura), infecções do sistema nervoso central (meningite) e as
infecções sexualmente transmissíveis (ISTs), bem como suas identificações e diagnóstico
laboratorial.

PROPÓSITO
Compreender a importância e correta identificação dos agentes etiológicos responsáveis pelas
principais infecções sistêmicas, do trato gastrointestinal, do sistema nervoso central e as
infecções sexualmente transmissíveis, a fim de fornecer um melhor prognóstico e tratamento
para o paciente.

OBJETIVOS

MÓDULO 1

Identificar as principais bactérias associadas a infecções sistêmicas (hemoculturas)

MÓDULO 2

Identificar as principais bactérias associadas a infecções do trato gastrointestinal (coprocultura)

MÓDULO 3

Reconhecer os principais procedimentos para o diagnóstico de meningite e das ISTs

INTRODUÇÃO
As bactérias podem causar infecções em diferentes sítios no hospedeiro, como infecções
sistêmicas, gastrointestinais, no trato respiratório superior e inferior, infecções urinárias,
sistema nervoso, na pele, dentre outros. Ao longo dessa jornada, vamos conhecer as infecções
sistêmicas, as gastrointestinais e as que afetam o sistema nervoso central. E qual a
importância dessas infecções?

As infecções sistêmicas são uma das complicações mais preocupantes durante uma infecção
bacteriana, a presença de bactéria no sangue aumenta significativamente as taxas de óbitos.
As infecções gastrointestinais (diarreia) causadas por bactérias, apesar de acometer todas as
idades, são um problema maior para crianças menores de 5 anos, onde é estimado uma
ocorrência de um bilhão de casos no mundo e cerca de 5 milhões de óbitos. No Sistema
Nervoso Central, as infecções, conhecidas como meningite, podem trazer danos irreversíveis
para o paciente se não for diagnosticada e tratada rapidamente. Por fim, vamos falar das ISTs
bacterianas mais importantes, que ainda acometem muitos pacientes.

Como sabemos, essas infecções podem ser causadas por uma variabilidade de bactérias. Para
conhecer a espécie bacteriana, é necessário um diagnóstico laboratorial que empregue um
conjunto de técnicas e procedimentos para a correta e rápida identificação do agente causador
da doença, bem como a melhor opção de tratamento e sua epidemiologia. O diagnóstico de
uma infecção se inicia na suspeita e coleta da amostra e continua no laboratório, com as
técnicas de culturas, provas bioquímicas e colorações.

Como é possível perceber, o seu papel no diagnóstico laboratorial é crucial, pois envolve a vida
dos pacientes. Esteja sempre atento aos procedimentos corretos, às normas de biossegurança
e consulte outro profissional sempre que tiver dúvidas. Agora, vamos nos aprofundar um pouco
mais sobre esse assunto.
MÓDULO 1

 Identificar as principais bactérias associadas a infecções sistêmicas (hemoculturas)

INTRODUÇÃO
As doenças infecciosas são quase tão diversas quanto os microrganismos capazes de causá-
las. Infecções sistêmicas são desencadeadas pela presença da bactéria na corrente sanguínea
(bacteremia) podendo ser de forma transitória, intermitente, contínua ou de escape de acordo
com o tempo que o microrganismo fica na corrente sanguínea. Os casos mais graves de
bacteremia envolvem uma resposta imunológica sistêmica grave chamada de sepse, podendo
causar a falência múltipla de órgão e consequente a morte do paciente, condição conhecida
como choque séptico.

Assim, o exame de hemocultura busca identificar e isolar a presença de microrganismos na

corrente sanguínea de paciente com suspeita de sepse e auxiliar na terapia antimicrobiana
mais eficaz.

Hoje, a probabilidade de óbito de pacientes positivos para hemocultura é cerca de 12 vezes

maior do que pacientes com resultado negativo, chamando atenção para o correto diagnóstico
deste tipo de infecção e um tratamento eficaz.

COLETA DE SANGUE
O primeiro passo para a solicitação de uma hemocultura é a identificação de quais pacientes
necessitam deste exame. O médico deve solicitar o exame toda vez que existir suspeita de
sepse, o que vai incluir um quadro caracterizado por febre alta (>38°C) e calafrios. No entanto,
em alguns casos, os pacientes podem apresentar temperatura baixa (<36°C), junto com um ou
mais dos seguintes sintomas: diminuição da pressão arterial, aumento da frequência cardíaca,
número muito alto ou muito baixo de glóbulos brancos no sangue.

Alguns fatores de risco devem ser considerados na escolha do exame: idade avançada, recém-
nascidos, sistema imunológico debilitado, tempo de hospitalização, procedimentos invasivos,
tais como uso de cateter, infusões, agulhas, entre outros, suspeita de endocardite (infecção do
tecido interno do coração), doenças crônicas como diabetes e cirrose, além de pacientes com
câncer ou AIDS.

COLETA DE SANGUE PARA HEMOCULTURA

A coleta de sangue pode ser realizada através de punção venosa, utilizando agulha e seringa,
ou pelos métodos a vácuos (os mais recomendados). No momento da coleta, devemos sempre
respeitar: os procedimentos de descontaminação do local da coleta para que não ocorra
contaminação do material; os procedimentos de biossegurança e o uso correto de EPI
(Equipamentos de proteção individual) para evitar possíveis problemas.

 RECOMENDAÇÃO

A antissepsia é fundamental para que não ocorra contaminação da amostra, e pode ser
realizada utilizando soluções de clorexidina alcoólica (0,5%), tintura de iodo (1-2%), PVPI
(10%), álcool isopropanol 92% ou álcool 70%. Deve-se preparar o material para coleta com a
devida identificação dos frascos (nome do paciente, data e hora da coleta, via de coleta, sítio
de coleta e tomar cuidado para não cobrir o código de barras do frasco de hemocultura),
realizar a assepsia da tampa do frasco e, lembre-se, não apalpar o local após a antissepsia.

É recomendado evitar coleta do cateter (alto risco de contaminação), punção venosa é a mais
recomendada. O cateter somente é coletado quando existe suspeita de infecção sanguínea
pelo uso dele. A coleta, sempre que possível, deve ser realizada antes da antibioticoterapia
(para não ocorrer morte bacteriana antes da sua detecção), antes do pico febril (pois, a febre é
uma resposta do sistema imunológico contra a infecção) e, se houver outro foco infeccioso,
fazer uma coleta deste também. Caso o paciente já esteja tomando antibióticos, a coleta deve
ser feita antes da administração da próxima dose.

 RECOMENDAÇÃO

Recomenda-se no mínimo 2 frascos e máximo de 4 frascos de sangue, mas vai depender de

cada paciente e da suspeita, por isso fique atento às recomendações do médico que solicitou o
exame. Deve-se coletar de sítios diferentes, por exemplo, braço esquerdo e braço direito, para
aumentar a probabilidade de detecção e diminuir a taxa de contaminação. O volume coletado
varia de 5 a 10 mL de sangue para adultos e 1 a 5 mL para crianças em cada frasco.

O primeiro frasco é utilizado para procura de bactérias anaeróbicas e outro para cultura de
bactérias aeróbicas, após a coleta deve-se homogeneizar o meio. Cada frasco possui meios de
cultura que vão favorecer o crescimento de cada tipo de bactéria. Quando existe suspeita de
infecção por dispositivos intravenosos, como o cateter, pode-se coletar a ponta do cateter e
mandar para análises microbiológicas também. Para isso, deve-se cortar o segmento que
estava inserido no paciente com tesoura estéril e colocar em frasco estéril, mandar para o
laboratório. Após a coleta, o material deve ser levado imediatamente para o laboratório em
temperatura ambiente.

 ATENÇÃO

Cateter são fontes notáveis de infecção da corrente sanguínea, principalmente, pela

capacidade de algumas bactérias em formar biofilme. É importante causa de infecção
sistêmica em pacientes imunodebilitados internados em UTI e a contaminação pode vir da
própria microbiota da pele do paciente, das mãos do profissional de saúde, contaminação do
fluido de infusão ou até mesmo pela colonização do dispositivo.

BIOFILME

Capacidade de se aderir a uma superfície, formando uma estrutura de açúcares (extra

polissacarídica) que protege e mantém as bactérias naquela superfície por longos períodos.

SEMEADURA EM MEIO DE CULTURA

No laboratório, diferentes meios de cultura ganham destaque, pois é neles que é possível
realizar o crescimento destes microrganismos e seu diagnóstico. Os meios de cultura são
combinações ricas em nutrientes que permitem o crescimento de microrganismos em
laboratório. Apesar disso, existem microrganismos ditos fastidiosos (demoram a crescer em
meios de culturas disponíveis atualmente) e o diagnóstico destes são mais demorados e
difíceis.

Os meios de culturas podem ser comerciais ou não, devendo sempre se respeitar as condições
de armazenamento, biossegurança e preparo para se garantir um resultado confiável.
Microrganismos apresentam exigências nutricionais diversas e, como não se sabe o agente
causador da infecção, é necessário utilizar meios ricos em nutrientes que permitirão o
crescimento da maioria dos microrganismos. Entre eles, temos os caldos (meios líquidos),
como o caldo BHI (Brain Heat Infusion), caldo TSB (Trypticase Soy Broth), Caldo Columbia,
todos meios ricos em nutrientes que permitem o crescimento da maioria dos microrganismos.
Geralmente, os frascos para coleta de sangue para aeróbicos conterão caldo BHI ou Caldo
TSB; e os frascos para anaeróbicos, o Caldo Columbia. Ambos terão um anticoagulante,
geralmente, o SPS.

Os meios sólidos pela presença de Ágar, incluem o Ágar Chocolate (com sangue hemolisado,
para microrganismos fastidiosos), Ágar Sangue (com sangue de cavalo ou carneiro), Ágar
MacConkey ou Ágar EMB (seletivo para bactérias gram-negativas e diferencial pela
fermentação da lactose). Existem diferentes meios de culturas para isolamento e identificação
bacteriana, sua escolha dependerá do meio padronizado pelo laboratório de microbiologia.

HEMOCULTURA
Após a coleta, os frascos são enviados ao laboratório de microbiologia e incubados a 35-37°C
em estufa. Existem diferentes formas de processamento das hemoculturas e a escolha
dependerá de cada laboratório, bem como a demanda de solicitação. Podemos ter
hemoculturas manuais, semiautomatizadas e automatizadas.

HEMOCULTURA MANUAL
Na hemocultura manual, os frascos coletados são incubados por 7 dias por 35-37°C com 3
subcultivos dos frascos. Sempre observar a aparência da hemocultura no frasco a fim de se
detectar turbidez, produção de gás, bolhas, grumos etc, pois são indicativos de crescimento
bacteriano no frasco. Após 24 horas de incubação, é realizada a primeira semeadura nos
meios Ágar chocolate, Ágar Sangue e Ágar McConkey ou Ágar EMB pela técnica de
esgotamento. Os frascos e os meios de cultura são incubados por 24 horas à 35-37°C, ou
seja, é realizado o subcultivo do frasco em meios de cultura sólidos. Se, após 24 horas, for
observado crescimento bacteriano nos meios, através da formação de colônias, segue-se para
a identificação (provas bioquímicas e coloração de Gram) e o antibiograma. Se for negativo,
um outro subcultivo deve ser realizado semeando a amostra no meio de cultura e incubando
por mais 24 horas a 35-37°C (aqui já temos 48 horas desde a coleta). Se no segundo
subcultivo tiver crescimento microbiano, seguimos para a identificação e antibiograma. Se der
negativo, ele segue para um terceiro subcultivo nos meios de cultura e incubação novamente
por mais tempo a 35-37°C.

SUBCULTIVOS

Os subcultivos consistem em semear a amostra dos frascos de coleta nos meios de cultura
para observar se há crescimento bacteriano.

TÉCNICA DE ESGOTAMENTO

Técnica de semeadura em meio de cultura sólido para se obter colônias isoladas. Com uma
alça estéril, passar na amostra e realizar estrias sobre o meio de cultura de modo que uma
estria não encoste na anterior.

COLÔNIAS

Aglomerado de bactérias visível em um meio de cultura sólido, obtido por uma única célula
bacteriana.
ANTIBIOGRAMA

Teste para saber qual melhor opção de tratamento para determinada bactéria.

 Diferentes meios de cultura mostrado o crescimento bacteriano (unidades formadoras de

colônia).

 ATENÇÃO

É importante ressaltar que o frasco de anaeróbicos deve-se incubar em tensão de anaerobiose

(sem oxigênio). Se após este período apresentar crescimento microbiano, seguimos para
identificação e antibiograma. Se der negativo, podemos descartar o frasco e liberar o resultado
como negativo. Esses três subcultivos são chamados de culturas cegas, pois não se sabe se
há crescimento no frasco. Microrganismos fastidiosos demoram mais tempo para crescer,
como por exemplo espécies do gênero Mycobacterium, quando tiver suspeita de infecção por
espécies fastidiosas o tempo de incubação é maior.
*Para suspeita de microrganismos fastidiosos ou fungos incubar por mais 10 dias.

 Fluxograma: Processamento de hemoculturas pelo método manual.

HEMOCULTURA AUTOMATIZADA

Nos sistemas automatizados, o frasco vai para o aparelho que é capaz de detectar o
crescimento mínimo de microrganismos no frasco. Quando o crescimento é detectado, o
aparelho emite um sinal e assim é realizada a semeadura nos meios de cultura Ágar
Chocolate, Ágar Sangue e Ágar McConckey ou Ágar EMB, seguindo para identificação e
antibiograma.

Os sistemas automatizados apresentam maior rapidez (tempo máximo de 5 dias dependendo

da suspeita do microrganismo), não há necessidade de muitas semeaduras e, com isso, menor
risco de contaminação. Como exemplo dos sistemas automatizados, podemos citar o
BacT/Alert da BioMérieux e BACTEC da BD.
 Aparelho de cultura automatizado.

Quando há suspeita de infecção por uso de cateter, a cultura é feita em paralelo à hemocultura,
onde, com auxílio de uma pinça estéril, o segmento do cateter é rolado sobre a superfície do
Ágar Sangue e incubado por 24 horas a 35-37°C, logo após é visualizado o crescimento
microbiano. Recomenda-se deixar o meio de cultura incubado por mais 48 ou 72 horas caso
não haja crescimento.
HEMOCULTURA AUTOMATIZADA

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

As infecções sistêmicas podem ter três origens: infecções primárias da corrente sanguínea
(sem foco de infecção primário identificável), infecções secundárias da corrente sanguínea
(com infecção primária identificada em outra localização) e as infecções da corrente
sanguínea associadas à utilização de cateter (o cateter é a fonte da contaminação).

Os principais focos de infecções secundárias são o trato geniturinário, trato respiratório, trato
intestinal, pele e abscessos. Na maioria das vezes, as bacteremias são causadas por uma
única bactéria, infecções ditas polimicrobianas (mais de uma bactéria) são raras.

 Foto representando colônias de Staphylococcus sp. em placas de ágar sangue.

As principais bactérias encontradas em hemoculturas com valor preditivo positivo alto (>90%),
ou seja, a probabilidade da hemocultura de fato ser uma bacteremia verdadeira ou septicemia
quando isolada do sangue, incluem: Staphylococcus aureus (gram-positivas), Escherichia coli e
demais enterobactérias (gram-negativas), Neisseria meningitidis (gram-negativas),
Pseudomonas aeruginosa (gram-negativas), Streptococcus pneumoniae (gram-positivas),
Brucella spp. (gram-negativas), Streptococcus pyogenes (gram-postivas), Straptococcus
agalactiae (gram-positivas), Listeria monocytogenes (gram-positivas), Haemophilus influenzae
(gram-negativo). Bactérias anaeróbicas são raras de acontecer, cerca de 1% das sepses são
causadas por elas e incluem espécies do gênero Bacterioides spp. (gram-negativas).

Microrganismos com valores preditivos positivos variáveis, ou seja, diferentes chances de ser
uma bacteremia verdadeira, incluem Streptptococcus viridans (38%), Enterococcus spp. (78%)
e Staphylococcus coagulase negativa (15%). Enquanto a presença de Corynebacterium spp.,
Micrococcus spp., Bacillus spp., e Propionibacterium acnes são constantemente associadas à
contaminação, com apenas 5% de chance de ser uma bacteremia verdadeira.

 EXEMPLO

Um paciente com infecção urinária confirmada para a bactéria E. coli realizou 2 coletas de
hemocultura em braços diferentes, utilizando 2 frascos, um para cada coleta. Após o
procedimento de incubação e cultura, é identificado em 1 frasco a bactéria Staphylococcus
coagulase negativa. Imediatamente, devemos pensar em contaminação no momento da coleta,
pois houve crescimento em apenas 1 frasco de uma bactéria comum da pele, no exemplo
Staphylococcus coagulase negativa, indicando que a assepsia foi realizada de maneira errada.
De forma diferente, quando ocorre uma bacteremia verdadeira ou uma endocardite, na maioria
dos frascos, após incubação e cultivo, apresentam positividade para a mesma bactéria.

VERIFICANDO O APRENDIZADO

MÓDULO 2
 Identificar as principais bactérias associadas a infecções do trato gastrointestinal
(coprocultura)

INTRODUÇÃO
Podemos definir a diarreia como um quadro de fezes aquosas com mais de duas evacuações
ou fora do que é habitual do indivíduo. As diarreias são comuns, principalmente, em países em
desenvolvimentos, podendo ser 2 a 3 vezes mais frequentes, estando ligada ao quadro
socioeconômico e de saneamento básico.

Podemos classificar as diarreias em: diarreia aguda (<14 dias), diarreia persistente (>14
dias) e diarreia crônica (>30 dias), sendo a aguda a mais comum. Apesar de todas as idades
serem cometidas por este quadro, existe uma prevalência em crianças menores de 5 anos e
gestantes. A maioria dos quadros de diarreia são autolimitantes, alguns podem evoluir para
casos mais graves e requerem atenção médica e exames adicionais para o seu diagnóstico e
tratamento.

As diarreias infecciosas possuem uma gama de agentes causadores, entre elas, vírus,
protozoários, helmintos e bactérias, as mais graves, geralmente, são causadas por bactérias. A
diarreia de origem bacteriana pode gerar um quadro grave de desidratação, problemas
neurológicos, insuficiência renal e até a morte se não for tratada.

Agora, vamos observar como essas infeções ocorrem e como proceder para o seu diagnóstico.

SÍNDROME DISENTERIFORME E
COLERIFORME
De acordo com os sintomas, podemos dividir a diarreia causada por bactérias em dois quadros
clínicos, chamados de síndrome disenteriforme e coleriforme. Essas síndromes ocorrerão de
acordo com o tipo de patógeno ou toxinas acometidas.
SÍNDROME DISENTERIFORME
É caracterizada por uma diarreia do tipo inflamatória, com visível sangue nas fezes, dor
abdominal, perda de peso, podendo gerar febre (com exceção da E. coli enterohemorragica). O
sangue nas fezes é proveniente de citotoxinas ou bactérias enteroinvasivas que destroem ou
invadem o trato gastrointestinal.

SÍNDROME COLERIFORME
Tem como característica uma diarreia aquosa aguda, com três ou mais fezes líquidas ou
semilíquidas por dia dentro de um intervalo de até 14 dias (a maioria dura menos de 7 dias),
não apresentam sangue visível, podendo apresentar vômito, náuseas, febre e falta de apetite.
Suas consequências são desidratação grave. São processos característicos de bactérias que
produzem enterotoxinas (toxinas que agem sobre o intestino).

PATOGENIA DA DIARREIA BACTERIANA

O sítio de infecção, o patógeno e o mecanismo de patogenicidade podem ser relacionados com
os casos clínicos. Podemos classificar os patógenos em:
PATÓGENOS QUE PRODUZEM ENTEROTOXINAS

Causam diarreia aquosa pela troca iônica e interação com as funções dos enterócitos (células
epiteliais do intestino grosso e delgado).


PATÓGENOS PRODUTORES DE CITOTOXINAS

Destroem os enterócitos, causando uma inflamação intestinal com todos os sintomas

inflamatórios, levando sangue nas fezes e febre.


PATÓGENOS QUE INVADEM A MUCOSA INTESTINAL E
SE ADEREM A ESTA:

Chamados de patógenos enteroaderentes, alteram a função normal dos enterócitos, levando a

um quadro inflamatório.

As principais formas de transmissão destes patógenos é pela via oral, de animais para
pessoas, de pessoa-pessoa ou pela ingestão de alimentos contaminados. Alguns indícios
(fatores de riscos) podem estar associados, como membros da família ou pessoas próximas
com diarreia, viagem recente, atendimento médico frequente, fontes de abastecimento de
água, dieta (contaminação de alimentos, bem comum) e uso anterior de antimicrobiano.

Os principais patógenos associados a quadros diarreicos podem ser relacionados às

síndromes disenteriforme e coleriforme de acordo com sua patogenia. Os patógenos que
produzem citotoxinas e/ou invadem e se aderem à mucosa intestinal levarão a um quadro
inflamatório característico da síndrome disenteriforme e incluem espécies Salmonella spp.,
Campylobacter spp., Shigella spp., E. coli enterohemorrágica (frequentemente associada ao
sorotipo 0157:H7) , E. coli enteroinvasiva, Yersinia spp., Clostridium difficile, Bacillus cereus.
Enquanto os mais comuns em gerar a síndrome coleriforme incluem E. coli enterotoxigênica, E.
coli enteropatogênica e enteroinvasiva, Vibrio cholerae.

PATOGENIA

Referente ao mecanismo de agressão ou ao desenvolvimento da doença.

COPROCULTURA
Na copropocultura, estamos falando de pesquisa de bactérias nas fezes, mas não é qualquer
bactéria, afinal, sabemos que as fezes contêm uma grande quantidade destes microrganismos
(incluindo a E. coli).

Então como saber a origem de uma infecção gastrointestinal bacteriana?

 RESPOSTA

Primeiro, a pesquisa é direcionada a determinados patógenos comumente associados a este

quadro infeccioso já mencionado, segundo a quantidade de determinadas bactérias nas fezes.

Sabemos que algumas bactérias não fazem parte da microbiota intestinal e sua detecção pode
sinalizar um quadro infeccioso, enquanto outros fazem parte da microbiota intestinal e podem
causar infecção quando ocorre um descontrole no seu crescimento, como, por exemplo, pelo
uso de antimicrobianos, que podem levar à morte de algumas bactérias da microbiota. O
descontrole da microbiota intestinal é chamado de disbiose e pode favorecer o crescimento de
algumas espécies, é o que acontece com infecções por C. difficile, em que a intensa
proliferação dessa bactéria acaba produzindo uma grande quantidade de toxinas que leva ao
quadro diarreico.
COLETA DE FEZES PARA A COPROCULTURA

A coleta é feita utilizando um coletor de fezes universal estéril, evitando contato da amostra
com urina ou água do vaso sanitário. A coleta deve ser feita, preferencialmente, antes do uso
de antibióticos, sem a necessidade de encher o pote de coleta, deve-se tomar cuidado para
não vazar material.

 Coletor universal de fezes.

 RECOMENDAÇÃO

O pote coletor deve ser encaminhado para o laboratório dentro de uma hora, se não for
possível, deixar refrigerado por até 6 horas. Existem alguns meios de cultura de transporte que
possuem conservantes, dando tempo de análise de 24 a 48 horas. Na análise, deve-se dar
prioridade a porções contendo muco, sangue ou pus, quando presentes, pois neles estão
grande quantidade do patógeno causador. Não deverá ser aceita amostras provenientes de
fraudas, com urina ou qualquer outro líquido e após 3 dias de quadro infeccioso.

A escolha dos meios de cultura utilizados para pesquisa de bactérias depende da suspeita
clínica e incluem Ágar McConkey e Ágar EMB para pesquisa de Enterobactérias Gram-
negativas, Ágar SS (Salmonella Shigella), Ágar HE (Entérico de Hektoen) e Ágar XLD
(Desoxicolato-Lisina-Xilose) para detecção de Salmonela spp. e Shigella spp., Ágar Campy
para detecção de Campylobacter spp., Ágar CIN (Novobiocina-Irgasan-Cefsulodina) para
detecção de Yersinia spp., Ágar RCBS (Tiossulfato, Citrato, Bílis e Sacarose) para detecção de
Vibrio spp. Além dos meios de cultura sólidos, a amostra também é semeada em um meio
enriquecido e seletivo para patógenos entéricos, como caldo Selenito, Caldo Tetrationato, caldo
Campy-tioglicolato (para Campylobacter spp.) e caldo GN (para Shigella e Salmonella).

Como é possível perceber, utilizamos meios de cultura que favorecem o crescimento dos
principais patógenos associados a essas infecções e que inibem ou diminuem o crescimento
de bactérias provenientes da microbiota.

Em caso de amostra líquida ou swab, deve ser semeado direto nos meios de cultura. Em caso
de fezes sólidas, deve-se diluir a amostra em solução salina 10% tamponada. Após semear as
amostras nos meios de cultura selecionados, elas são incubadas a 35-37°C por 18 a 24 horas.
Caso exista crescimento no meio de cultura, a amostra segue para a identificação e
antibiograma. Caso não haja crescimento, uma nova amostra é semeada do caldo de
enriquecimento e incubada novamente por 35-37°C por 18 a 24 horas. Após esse período, em
caso positivo (observado o crescimento), segue-se para a identificação e, em caso negativo, o
resultado é liberado como negativo.

DIAGNÓSTICO BIOQUÍMICO
Devido à grande diversidade de microrganismos encontrados na coprocultura, faz-se
necessária a realização de provas bioquímicas para confirmação se o crescimento microbiano
visualizado é, de fato, um enteropatógeno. Assim, as provas bioquímicas são grandes aliadas
para a identificação de patógenos nestas infecções e se baseiam na capacidade de as
bactérias utilizarem determinados substratos para seu crescimento, ou seja, através do seu
metabolismo é possível identificar gêneros ou espécies bacterianas e seu real papel na
patogênese das infecções gastrointestinais.
Entre as principais provas bioquímicas, podemos destacar:

TESTE DE OXIDASE

O teste da oxidase verifica se os isolados bacterianos apresentam a enzima citocromo oxidase,

estas enzimas estão associadas à cadeia transportadora de elétrons. O teste pode ser
realizado pingando uma gota de solução de Dimetil p-fenilenodiamina cloridrato sobre a colônia
ou impregnando uma tira de papel filtro com a solução e aplicando a amostra sobre.
Comercialmente, tiras de oxidases podem ser compradas. A cor azul/violeta indica positividade
no teste. E. coli e demais enterobactérias são negativas, enquanto Campylobacter spp. e Vibrio
spp. são positivos.
 Teste de oxidase.

FERMENTAÇÃO DE AÇÚCARES

Esse teste é utilizado para saber qual é o metabolismo bacteriano para obtenção de energia:
via oxidativa (aeróbica) ou via fermentativa (anaeróbica). Para isso, podem ser utilizadas
diferentes fontes de açúcares, como a glicose, a sacarose e a lactose. Bactérias que realizam a
fermentação obtêm menos energia e produzem um ácido como produto do seu metabolismo,
com possível formação de gás.

Bactérias não-fermentadoras crescerão no meio de cultura, mas não produzem ácido no final
e, portanto, não alteram o pH do meio. Bactérias fermentadoras crescerão no meio e
produzirão ácido, mudam o pH e alteram a coloração do meio. O meio mais utilizado é o Ágar
TSI. A cor original do meio é vermelha, se o meio possui crescimento sem alteração da cor
indica que a bactéria é não-fermentadora.

Quando temos a acidificação do meio, este fica amarelado, indicando uma alteração de pH
pela produção de ácido e que a bactéria apresenta um metabolismo fermentativo. Também é
possível ver a produção de gás e H2S neste meio. A E. coli fermentam a glicose, sacarose e

lactose. Salmonella e Shigella fermentam somente a glicose.

 Fermentação de açúcares no meio ágar TSI.

PRODUÇÃO DE GÁS SULFÍDRICO OU SULFETO

DE HIDROGÊNIO (H2S)

Esse teste detecta a capacidade da bactéria em liberar o enxofre, por ação enzimática, de
determinados aminoácidos. Ao realizar esta reação, ocorre a produção de gás sulfídrico ou
sulfeto de hidrogênio que reage com íons de ferro ou chumbo contidos no meio, formando um
precipitado negro e resultando em positividade para o isolado em questão. Podem ser
utilizados para o teste o Ágar TSI (Triplo Açúcar de Ferro), meio SIM (Sulfato de hidrogênio,
Indol e Motilidade), meio AIL (Instituto Adolfo Lutz). Grupo bacteriano mais importante em
infecções gastrointestinais positivo para este teste inclui a Salmonella spp. e C. difficile.
 Ágar TSI do lado esquerdo, negativo para o teste. Ágar TSI lado direito (negro), positivo
para o teste.

MOTILIDADE

Este teste não é uma prova bioquímica propriamente dita, mas, sim, fisiológica. Testa a
capacidade da bactéria em se mover em meio semissólido devido à presença de flagelos. Os
meios mais utilizados para isso incluem o meio SIM, meio MILI (Motilidade, Indol e Lisina).
Apresentam motilidade no meio: E. coli, Salmonella spp., Compylobacter spp., Vibrio spp.
 Mobilidade bacteriana em meio SIM.

PRODUÇÃO DE INDOL

Verifica a capacidade da degradação do aminoácido triptofano pela produção da enzima

triptofanase, resultando na produção de indol, ácido pirúvico e hidróxido de amônia. A
produção de indol é detectada, utilizando os reagentes de Kovac (solução de p-
dimetilaminobenzadeído) que reagem com indol, formando uma coloração rosa dentro de 5
minutos e dando positividade para o teste. Pode ser realizada no meio SIM ou no meio MILI. E.
coli e Vibrio cholerae são positivos.
 Produção de indol.

DEGRADAÇÃO DA UREIA

A degradação da ureia ocorre pela ação da enzima urease, bactérias que possuem esta
enzima têm a capacidade de degradar a ureia em amônia e CO2. Os meios utilizados para este

teste incluem ureia e um indicador de pH. Conforme a ureia é quebrada, o meio torna-se mais
alcalino e muda de cor para rosa, mostrando positividade do teste.
 Degradação da ureia.

PROVA VERMELHO DE METILA (VM)

Detecta o metabolismo bacteriano. A glicose é a principal fonte de energia celular, algumas

bactérias podem utilizar a glicose para obtenção de energia pela via oxidativa (aeróbica) ou
pela via fermentativa (anaeróbica). Na via fermentativa, o produto do metabolismo da glicose é
um ácido, o qual se acumula no meio, alterando o pH que é observado através de um indicador
de pH. Logo, se ocorre alteração de cor, a bactéria é dita fermentadora, caso não, dita oxidativa
ou não fermentadora.

 Prova VM.

PROVA DE VOGES-PROSKAUER (VP)

Também detecta a via bioquímica da utilização da glicose. As amostras positivas que

apresentam o teste positivo utilizam a via fermentativa para degradação da glicose do tipo
butilenoglicólica, em que os produtos desta reação são diacetil. A cor avermelhada indica que o
teste é positivo e que as bactérias que utilizam a via fermentativa butilenoglicólica. B. cereus
apresenta positividade neste teste.
 Prova Voges-Proskauer.

UTILIZAÇÃO DE CITRATO

A prova detecta a capacidade de algumas bactérias em utilizar o citrato como única fonte de
carbono. O meio comumente utilizado para este teste é o Citrato de Simmons, um meio sólido
contendo citrato que tem como indicador de pH, o azul de bromotimol. A entrada do citrato na
bactéria e sua degradação pela citratase resulta em oxaloacetato e acetato, alcalinizando o
meio. O meio é originalmente verde e, ao ser alcalinizado, muda de cor para o azul. B. cereus,
indicando ser positivo.
 Citrato de Simmons.

DESCARBOXILAÇÃO DE AMINOÁCIDOS

Algumas bactérias possuem enzimas específicas para descarboxilação de aminoácidos, ou

seja, removem CO2 dos aminoácidos, resultando em aminas alcalinas. Os aminoácidos mais

utilizados neste teste são a lisina, arginina e ornitina (LAO). São preparados um tubo para cada
aminoácido e um tubo controle, sem aminoácidos. Assim as diferentes bactérias podem ter
lisina-descarboxilase, arginina-descarboxilase e/ou ornitina-descarboxilase. A atividade de
cada uma dessas enzimas será detectada no meio pela alteração de pH e da coloração e
comparado com o grupo controle (sem aminoácidos). O meio mais utilizado é o de Moller, que
apresenta uma cor violeta quando positivo. E. coli são lisina positiva e variável para arginina e
ornitina.
 Descarboxilação da lisina. Tubo 1: Cor original do tubo com aminoácido. Tubo 2: Tubo
controle, sem aminoácido. Tubo 3: Tubo positivo para descarboxilação da lisina.

 ATENÇÃO

Meios adicionais ainda podem ser realizados dependendo da necessidade do laboratório.

Algumas características que podem ser observadas com esses meios adicionais são:
crescimento em altas concentrações de sal (NaCl), desaminação da fenilalanina, degradação
do malonato, entre outros. Além disso, a sorotipagem também é útil para identificação de
alguns sorogrupos de enteropatógenos.

SOROTIPAGEM

Detecção de anticorpos específicos contra determinados grupos bacterianos e sua detecção in

vitro.
IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA NA
COPROCULTURA

VERIFICANDO O APRENDIZADO

MÓDULO 3
 Reconhecer os principais procedimentos para o diagnóstico de meningite e das ISTs

INTRODUÇÃO
Apesar do surgimento dos antimicrobianos e de métodos de prevenção, as infecções do
Sistema Nervoso Central (SNC) e as Infecções Sexualmente Transmissíveis (ISTs) continuam
sendo um risco para muitas pessoas. A detecção dessas doenças tem aumentado de maneira
cada vez mais agressiva devido à reemergência da resistência ao tratamento. As infecções do
SNC podem apresentar consequências drásticas, pois deixam sequelas, afinal, os neurônios
são células que não se regeneram após uma lesão.

As ISTs são todas as infecções transmitidas por contato sexual (oral, vaginal ou anal), mas não
só, existem casos de transmissão da mãe para a criança por via transplacentária, durante o
parto ou amamentação, além de casos de infecções por contato com lesão ou feridas sobre a
pele ou mucosa. Uma ampla gama de patógenos podem estar associados a estas infecções.

Agora, vamos olhar algumas das principais e mais problemáticas bactérias que apresentam
uma elevada preocupação nestas infecções.

MEMBRANAS QUE REVESTEM O SNC

O SNC comanda todas as funções do nosso organismo, até mesmo o ato de pensar e
raciocinar, como o que estamos fazendo aqui. Com isso, é possível imaginar a sua importância.
Esse sistema é formado por encéfalo (cérebro, cerebelo, bulbo, ponte tálamo e hipotálamo) e
medula espinhal, que liga todo o corpo ao encéfalo permitindo os impulsos de movimentos.
Tamanha responsabilidade é aceitável que esse sistema esteja muito bem protegido, pois bem,
ele está! Temos o crânio e a coluna vertebral exercendo este papel, são estruturas ocas que
contêm o líquido cefalorraquidiano e as membranas que revestem esse sistema, conhecidas
como meninges.

LÍQUIDO CEFALORRAQUIDIANO
Também conhecido como líquor, é um fluido corporal estéril presente entre as membranas
aracnoide e pia-máter.

As meninges revestem todo esse sistema e são compostas por 3 membranas. Após o crânio
(tecido ósseo), temos a primeira membrana a dura-máter, no meio temos a aracnoide e em
contato com o encéfalo temos a pia-máter. Esse conjunto de membrana formam as meninges
que ajudam a proteger este sistema.

A dura-máter é a membrana mais superficial, resistente, vasculariza e inervada. A aracnoide é

a mediana, delicada e faz parte da absorção do líquor. A pia-máter é a interna, aderida ao
encéfalo e à medula, fina e dando sustentação ao órgão.

 Cérebro humano e bactérias meningocócicas.

MENINGITE ASSÉPTICA E BACTERIANA

Meningite é um processo inflamatório infeccioso que acomete as meninges, podendo ser
classificada de duas formas:

MENINGITES SÉPTICAS OU BACTERIANAS

São causadas pela presença da bactéria na meninge que estimula um processo inflamatório
com seus sinais e sintomas. Este tipo de meningite, geralmente, é mais grave.
MENINGITES ASSÉPTICAS
São as que não são causadas por bactérias, mais, sim, por vírus, fungos, protozoários, entre
outros fatores.

As bactérias podem acessar as meninges causando um processo inflamatório através da

corrente sanguínea (via hematogênica) após uma infecção primária por pneumonia, infecções
de face, garganta, ouvido, nariz ou olhos, ou por infecção sistêmica, como na bacteremia. Uma
bactéria pode acessar as meninges também através de traumatismos. Uma vez que esses
microrganismos atingem as meninges, inicia-se o processo inflamatório, levando a um infiltrado
de células e líquido, gerando uma hipertensão intracraniana. Essas alterações são facilmente
percebidas na composição do líquor, que se apresenta turvo nesses casos.

A coleta do líquor é realizada por punção lombar e segue para análises bioquímicas,
microbiológicas e citológicas no laboratório. Na análise microbiológica, o tubo é centrifugado e
o sedimento utilizado para as análises. Inicialmente, realiza-se uma coloração de Gram e Ziehl
e meios de cultura de enriquecimentos são utilizados para o crescimento, como Ágar Sangue e
Ágar chocolate. Para suspeita de micobactérias, devemos realizar o cultivo nos meios Ogawa-
Kudoh ou Lowentein Jesen. Para anaeróbicos, utilizar o caldo Tioglicolato, com as devidas
condições de anaerobiose.

 Coleta do líquor.

Os agentes etiológicos mais comuns nas causas da meningite bacteriana podem variar de
acordo com a idade do paciente:

Crianças com menos de 4 semanas de vida incluem as espécies de Streptococcus

grupo B (Cocos gram-positivos anaeróbicos facultativos) e algumas enterobactérias,
como a E. coli (Bacilo gram-negativo fermentador).

STREPTOCOCCUS GRUPO B

Classificação de Lancefield baseada na composição de antígeno de superfície, ou seja,

as proteínas de superfície deste gênero. Cada um recebe uma letra do alfabeto. De
acordo com esta classificação, há 20 grupos de Streptococcus, o grupo B inclui a
espécie Strpetococcus agalacitae, importante em infecções humanas.

Crianças entre 4 a 12 semanas, as causas mais comuns incluem Streptococcus grupo

B, Streptococcus pneumoniae (Cocos gram-positivos anaeróbicos facultativos),
Salmonella spp. (Bacilos gram-negativos fermentadores), L. monocytogenes (Bacilos
gram-positivos anaeróbicos facultativos) e Hemophikus influenzae (Cocobacilo gram-
negativo).

Acima de 3 anos as causas mais comuns são Streptococcus pneumoniae e Neisseria

meningitidis (Diplococos gram-negativos aeróbicos).

Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal

DIAGNÓSTICO DE MENINGITES
BACTERIANAS

ISTS E COLETA DE AMOSTRAS PARA

DIAGNÓSTICO
Você certamente já ouviu falar sobre Doenças Sexualmente Transmissíveis, as famosas DSTs.
O termo utilizado atualmente é Infecções Sexualmente Transmissíveis, as ISTs. Essa troca
ocorreu pelo fato de uma doença ocorrer quando se tem os sinais e sintomas visíveis.
O termo infecção significa a presença do agente etiológico no organismo, ou seja, uma pessoa
pode estar infectada, mas não apresentar os sinais e sintomas que caracterizam a doença.
Assim, o termo IST reflete melhor a realidade dessas infecções.

Existem mais de 30 agentes etiológicos de ISTs que incluem bactérias, vírus e parasitas.
Dentre as diversas ISTs, as mais comuns incluem as causadas por clamídias e a gonorreia,
ambas causadas por bactérias. Podendo ocorrer a coinfecção. Isso acontece, pois estas ISTs
possuem os mesmos fatores de risco, que incluem sexo com vários parceiros e o não uso de
preservativos, e a presença de uma doença parece favorecer uma segunda infecção pela
outra.

A Chlamydia trachomatis, popularmente conhecida como clamídia, é uma bactéria gram-

negativa, que não se cora pelo método de Gram, intracelular (vive dentro da célula do
hospedeiro). Apresenta amplo quadro clínico, que inclui inflamação da uretra (uretrite) nos
homens, podendo evoluir para prostatite (infecção na próstata), se migrar pela circulação
sanguínea pode chegar até as articulações, gerando a artrite infecciosa, conjuntivite e lesão de
pele e mucosas. Nas mulheres, pode causar inflamação da uretra, a uretrite, no epitélio
vaginal, a vaginite, e ao atingir o colo do útero, pode gerar uma cervite, e se disseminar, pode
gerar ainda a doença inflamatória pélvica, infertilidade e gravidez ectópica. Em gestantes,
podem causar problemas de parto precoce e morte neonatal. Em recém-nascidos, pode gerar
conjuntivite de inclusão que, se não tratada, pode evoluir para uma pneumonia. A infecção
neste caso é adquirida durante o parto através do canal vaginal. A infecção pode gerar dor ao
urinar, corrimento amarelo ou turvo devido à formação de pus durante o processo inflamatório,
sangramento espontâneo e dor durante a relação sexual.
 Chlamydia Trachomatis.

A gonorreia é causada pela bactéria Neisseria gonorrhoeae, gram-negativa na forma de

diplococos. Esta IST no homem, quando sintomática, pode apresentar dor ao urinar e secreção
amarelo-esverdeada no pênis devido ao processo inflamatório pela presença da bactéria,
chamado de uretrite. Se a bactéria chegar até a próstata, desenvolverá uma prostatite. Nas
mulheres, as manifestações clínicas são menores e incluem uma vaginite, com dor na área
genital, secreção na vagina, maior frequência de urina e dor ao urinar. Se a bactéria atingir o
colo do útero, pode gerar uma cervicite (infecção cérvice) e, no útero, gerar a doença
inflamatória pélvica. Pode ocorrer também infecções no ânus, levando à formação de pústulas
devido ao processo inflamatório desencadeado. O ponto mais grave da doença pode ocorrer
quando a N. gonorrhoeae se espalha pelo organismo gerando artrite infecciosa. Recém-
nascidos podem se contaminar durante o parto e desenvolver um quadro de conjuntivite que
pode evoluir para pneumonia e/ou meningite.
 Lâmina de Gram mostrando diplococos gram-negativos sugestivos de N.gnorrhoeae.

Como é possível perceber, os sinais e sintomas destas ISTs são similares, sendo necessário
um diagnóstico para sua correta identificação. A coleta para o diagnóstico de ambas as ISTs
ocorrem de modo similar. Pode se utilizar secreção uretral, secreção endocervical, esperma,
secreção ocular para conjuntivite em recém-nascido, secreção anal para infecção anal, a urina
pode ser utilizada quando a secreção uretral estiver escassa.

 RECOMENDAÇÃO

Deve-se coletar, preferencialmente, antes do uso de antimicrobianos. Na secreção de uretra,

deve-se colher durante a manhã e antes de urinar ou com intervalo de 4 horas após urinar.
Durante a coleta, não realizar o uso de antissépticos, não ter relações sexuais nas últimas 24
horas e, em caso de menstruação, aguardar 48 horas ou até o término. Além da secreção,
também pode ser colhido com swab endocervical ou uretral e a coleta de urina deve ser
referente ao primeiro jato do dia.

TESTE PARA DIAGNOSTICO DE

INFECÇÕES POR CHLAMYDIA E URETRITE
GONOCÓCICA
Existem várias metodologias para o diagnostico destas ISTs e incluem meios de cultura, testes
imunológicos (detecção de anticorpos ou antígenos) e testes moleculares (detecção do
material genético da bactéria). As vantagens de se realizar a cultura incluem a preservação da
bactéria para estudos adicionais, como o antibiograma e estudos de epidemiologia.

TESTES PARA O DIAGNÓSTICO DE C.

TRACHOMATIS

C. trachomatis é uma bactéria de difícil cultivo devido ao fato de viver dentro das células do
hospedeiro. Desse modo, para este patógeno, é recomendado o uso de testes imunológicos ou
testes moleculares, sendo os testes moleculares ainda mais capazes de detectar a bactéria do
que os imunológicos. Métodos de coloração direta não são possíveis devido ao pequeno
tamanho da bactéria e sua vida intracelular.

A cultura de Chlamydia em laboratório é algo dispendioso e requer muitos cuidados. Pelo fato
de ser uma bactéria intracelular, o cultivo de uma célula eucarionte é necessário para que elas
consigam crescer. Assim, é realizada a cultura de células das linhagens McCoy, HeLa 229 ou
BHK, em que a amostra coletada é inoculada sobre a superfície destas células. Após 3 dias de
incubação, é realizada a coloração por iodo ou Giemsa, buscando as alterações celulares
causadas pela presença da Chlamydia, como a presença de corpúsculos de inclusão
citoplasmáticos (vacúolos citoplasmáticos). Por esse motivo, os testes moleculares se tornam
úteis para o diagnóstico na maioria dos laboratórios, tendo boa sensibilidade e especificidade.

CÉLULAS MCCOY

Linhagem de células do tipo fibroblastos obtidas de camundongos.

CÉLULAS HELA 229

Linhagem de células humanas obtidas de um adenocarcinoma cervical.

CÉLULAS BHK

Linhagem de células obtidas de fibroblastos renais de hamster.

TESTES PARA O DIAGNÓSTICO DE NEISSERIA

GONORRHOEAE

No caso de suspeita de uretrite gonocócica, pode-se utilizar métodos de cultura, testes

imunológicos ou moleculares, porém nestas bactérias os testes de cultura respondem bem aos
achados. A coloração de Gram pode ser realizada para visualização dos diplococos gram-
negativos característicos desta espécie e a coleta é realizada utilizando o meio de Aimes, pois
preserva o diplococo de forma viável até as análises, o gonocócico é considerado uma bactéria
exigente e, sem os devidos cuidados, pode morrer facilmente atrapalhando no correto
diagnóstico.

SEMEADURA DE AMOSTRAS SUSPEITAS

DE N. GONORRHOEAE E OUTROS
AGENTES
No caso de suspeita de N. gonorrhoeae, o meio de cultura para semeadura mais utilizado é o
Thayer-Martin modificado (meio enriquecido e seletivo). Este meio possui antibióticos que
permitem o crescimento seletivo desta bactéria. A amostra pode ser semeada também em
Ágar Chocolate para detecção de outras espécies de Neisseria spp. que, por ventura, não
cresçam no meio Tayer-Martin. Após a semeadura pela técnica de esgotamento, os meios de
cultura serão incubados em temperatura de 35°C com umidade em torno de 90% e atmosfera
de 3-7% de CO2. Após o crescimento, é realizada a coloração de Gram (para confirmar a

morfologia), prova da catalase (resultado positivo pela formação de bolhas), prova da oxidase
(oxidase positiva) e fermentação de açúcares (fermenta a glicose). Sendo então confirmado o
diagnóstico para N. gonorrhoeae.

PROVA DA CATALASE

Detecta a presença da enzima catalase, responsável pela quebra de radicais de oxigênio,

como o peróxido de hidrogênio (água oxigenada), em água e oxigênio. Quando positivo,
observa-se a presença de bolhas proveniente do oxigênio. Esta prova é importante para
diferenciação de gêneros de bactérias Gram-positivas.

 ATENÇÃO

As uretrites podem ter diferentes causas, sendo a mais comum as ISTs causadas pela N.
gonorrheae. Aquelas que não são causadas por este agente etiológico são ditas não
gonocócicas. A uretrite não gonocócica mais comum é a causada pela C. trachomatis já
comentada aqui, enquanto outros microrganismos menos frequentes podem causar este
quadro infeccioso incluem Ureoplasma ureatylium, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma
homins, Staphylococcus aureus, Candida albicans (fungo), Gardnerella vaginalis. Para
exclusão de diagnóstico por estes agentes etiológicos, pode-se usar a semeadura em meios de
cultura como Ágar Sangue e Ágar MacConkey e coloração de Gram.

VERIFICANDO O APRENDIZADO

CONCLUSÃO

CONSIDERAÇÕES FINAIS
Observamos as principais bactérias associadas a infecções sistêmicas e suas possíveis
consequências, os principais patógenos associados a casos de diarreia no Brasil e no mundo,
a problemática das infecções do SNC e os sinais clínicos similares de algumas ISTs
prevalentes e sua importância no diagnóstico por cultura, tanto para epidemiologia, quanto para
determinação da melhor opção de tratamento pelo antibiograma. A cultura bacteriana continua
a ser usada por muitos laboratórios e com algumas particularidades, dependendo do local de
diagnóstico.

 PODCAST

REFERÊNCIAS
ANVISA. Detecção e Identificação de Bactérias de Importância Médica. Módulo V. 2004.

ANVISA. Procedimentos laboratoriais: da Requisição do Exame à Análise Microbiológica.

Módulo III. 2004.

ARAUJO. Hemocultura: recomendações de coleta, processamento e interpretação dos

resultados. In: The Journal of Infection Control. 2012; 1 (1): 08-19.

CAL, R. G. R.; CAMARGO, L. F. A.; KNOBEL, E. Infecção da Corrente Sanguínea

Relacionada a Cateter: Infectologia e Oxigenoterapia Hiperbárica. Rio de Janeiro: Atheneu,
2003.

MENEZES e SILVA. Coprocultura, parte 1 Salmonella e Shigella. 86. ed. NewsLab, 2008.

MENEZES e SILVA. Coprocultura, parte 2 outros enteropatógenos. 86. ed. NewsLab, 2008.

SEADI et al. Diagnóstico laboratorial da infecção pela Chlamydia trachomatis: vantagens

e desvantagens das técnicas. In: Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial. v. 38.
Rio de Janeiro, 2002.

EXPLORE+
Para saber mais sobre os assuntos explorados neste tema, pesquise:

A plataforma chamada TELELAB, do Ministério da Saúde, que disponibiliza capacitação a

distância e on-line, com diversos cursos da área da saúde, incluindo diagnóstico de ISTs.
Vale a pena conferir!

O manual disponibilizado pela ANVISA para identificação das principais bactérias em

infecções: Detecção e Identificação de Bactérias de Importância Médica e Principais
Síndromes Infecciosas. Leia e esclareça possíveis dúvidas.

CONTEUDISTA
Ivson Cassiano de Oliveira Santos

 CURRÍCULO LATTES
DESCRIÇÃO
Princípios da imunologia e sua aplicação na identificação de grupos sanguíneos e doenças
relacionadas.

PROPÓSITO
Compreender os principais sistemas eritrocitários e como o nosso sistema imunológico atua na defesa
do organismo. Esse conhecimento facilitará o entendimento dos testes imuno-hematológicos e das
doenças correlacionadas.

OBJETIVOS

MÓDULO 1
Descrever os componentes e as funções das respostas imunes inata e adquirida e a interação
antígeno-anticorpo

MÓDULO 2

Identificar os principais sistemas eritrocitários humanos e as doenças associadas

MÓDULO 3

Reconhecer métodos imuno-hematológicos para classificação sanguínea e diagnóstico de doenças

relacionadas

INTRODUÇÃO
Ao longo desta jornada, vamos estudar a organização estrutural do sistema imunológico e entender
como seus componentes celulares e moleculares interagem entre si para garantir a geração de
respostas imunológicas eficazes, bem como as características da interação entre antígenos e
anticorpos.

Além disso, vamos desvendar os principais sistemas de classificação eritrocitários e relacionar os

grupos ABO e Rh às doenças geradas por incompatibilidade sanguínea, identificando os princípios dos
testes imuno-hematológicos e sua importância diagnóstica. Você sabe qual tipo sanguíneo um paciente
AB positivo pode receber? E um paciente O negativo? Vamos descobrir?

MÓDULO 1

 Descrever os componentes e as funções das respostas imunes inata e adquirida e a interação

antígeno-anticorpo

SISTEMA IMUNOLÓGICO
Nosso sistema imunológico é um conjunto de tecidos, células e moléculas que atuam de forma
coordenada para nos defender de microrganismos que podem nos causar infecções ou doenças.

Além disso, o sistema imunológico é capaz de reconhecer e eliminar do nosso organismo células
tumorais ou que sofreram algum dano que prejudique sua função normal. Em casos de transplante de
órgãos, de tecidos e nas transfusões sanguíneas, o sistema imunológico também pode reconhecer
esses elementos como não próprios e desencadear a resposta imune.

Fonte: Azat Valeev / Shutterstock

Os mecanismos de defesa do hospedeiro seguem uma sequência coordenada de etapas, sendo que,
em cada uma delas, as propriedades específicas dos componentes do sistema imune desempenham
papel fundamental. Dessa forma, é essencial entender a organização do sistema imunológico para
a geração de respostas eficazes.

Assim, temos o rápido direcionamento das células efetoras da imunidade inata para os locais de
infecção, permitindo que linfócitos reconheçam e respondam de forma específica a determinado
antígeno, independentemente do local em que ele é introduzido no organismo.

ÓRGÃOS LINFOIDES E CÉLULAS DO SISTEMA

IMUNE

O sistema imunológico é composto por diferentes órgãos, que são classificados como órgãos
geradores ou primários e órgãos periféricos ou secundários. A medula óssea é um órgão gerador, no
qual há produção de todos os elementos figurados do sangue a partir da célula hematopoiética
pluripotente, observados na figura a seguir.
Fonte: extender_01 / Shutterstock
 Hematopoiese

IMPORTANTE
No timo, outro órgão gerador, ocorre a maturação de linfócitos T.

Nos órgãos linfoides periféricos, ocorre a apresentação de antígenos aos linfócitos,

possibilitando o início da resposta imune adquirida. Nos linfonodos, os linfócitos B e T encontram
os antígenos coletados pela linfa dos tecidos periféricos e, no baço, os antígenos capturados no
sangue encontram os linfócitos.

Além de formarem aglomerados que dão origem a órgãos linfoides, as células das imunidades
inata e adquirida encontram-se como células circulantes no sangue e na linfa. As células do
sistema imunológico que circulam no sangue pertencem à série leucocitária e compreendem os
linfócitos, granulócitos e monócitos.

Os leucócitos permanecem temporariamente no sangue e migram para o tecido conjuntivo através

das paredes dos capilares e vênulas, processo conhecido como diapedese ou transmigração.
Uma vez nos tecidos, essas células desempenharão funções específicas.

Os leucócitos são agrupados em granulócitos e agranulócitos de acordo com suas características

morfológicas. Os granulócitos são os neutrófilos, eosinófilos e basófilos, e os agranulócitos são
os monócitos e linfócitos. Vamos, agora, conhecer um pouco mais sobre a série granulocítica?

SÉRIE GRANULOCÍTICA
Os basófilos contêm grânulos com enzimas hidrolíticas, fatores quimiotáticos, heparina e histamina em
seu citoplasma e receptores de imunoglobulina em sua superfície, desempenhando papel importante,
principalmente nas reações alérgicas (hipersensibilidade do tipo I) e anafiláticas.

BASOFILIA
Número de células anormalmente aumentado no sangue.

Colite ulcerativa, asma, sinusite e rinite, artrite, insuficiência renal crônica, anemia hemolítica, leucemia
mieloide crônica, quimioterapia, remoção do baço.

BASOPENIA
Número de células anormalmente diminuído no sangue.

Urticária, hipertireoidismo, síndrome de Cushing, uso de corticosteroides, ovulação ou gestação,

estresse.

Os eosinófilos apresentam grânulos que contêm enzimas hidrolíticas (peroxidase, histaminase,

arilsulfatase) e outras proteínas. Essas células migram do sangue para os tecidos periféricos, sendo
encontradas especialmente no revestimento de mucosas dos tratos respiratório, gastrointestinal e
genitourinário, podendo aumentar em número sob condições inflamatórias.

Além disso, os eosinófilos estão envolvidos no combate a infecções parasitárias causadas por
helmintos e na produção de citocinas que modulam respostas inflamatórias nas reações alérgicas.

EOSINOFILIA
Doenças parasitárias, alergias (asma e eczemas).

EOSINOPENIA
Síndrome de Cushing, uso de corticosteroides, estresse.

Os neutrófilos constituem a população mais numerosa de leucócitos no sangue e compõem a primeira

linha de defesa do hospedeiro, destacando-se sua grande capacidade fagocítica. O acúmulo de
neutrófilos mortos e bactérias degradadas no sítio de infecção forma o pus.
Fonte: Kateryna Kon / Shutterstock

NEUTROFILIA
Infecções bacterianas, apendicite, gestação, estresse.

NEUTROPENIA
Câncer, esplenomegalia, doenças autoimunes, quimioterapia, radioterapia, deficiência de vitamina B12
ou folato.

SÉRIE AGRANULOCÍTICA

Os monócitos são as maiores células observadas em esfregaços sanguíneos. Esses tipos celulares
podem ser recrutados rapidamente da corrente sanguínea para os sítios de inflamação, e, ao entrar nos
tecidos, os monócitos diferenciam-se em macrófagos. Desempenham funções tanto na imunidade
inata, como a fagocitose e morte de microrganismos por meio da produção de espécies reativas de
oxigênio e digestão proteolítica, como na adquirida, pois apresentam antígenos aos linfócitos.

Os linfócitos são células geralmente pequenas, classificadas em diversos tipos, os quais diferem nas
funções e em seus produtos proteicos. As principais populações são:
Fonte: Autor

Este vídeo apresenta um aprofundamento sobre diapedese, suas causas, seu processo e seus efeitos.

RESPOSTA IMUNE INATA E ADQUIRIDA

As respostas imunes compõem um sistema integrado de defesa do hospedeiro, no qual diversas células
e moléculas atuam em cooperação. Nossa primeira linha de defesa é constituída pela imunidade inata
ou natural, composta por barreiras naturais (pele, mucosas, enzimas), células fagocíticas, em
especial neutrófilos e macrófagos, e proteínas de fase aguda, como a proteína C reativa (PCR) e os
componentes do sistema complemento.

As proteínas de fase aguda podem ser úteis como biomarcadores de condições patológicas.
Sintetizada pelos hepatócitos em resposta a citocinas inflamatórias como a IL-6, a PCR tem sido
utilizada como marcador de resposta de fase aguda, uma vez que seus níveis séricos aumentam
rapidamente após lesão e/ou necrose tecidual, infecção ou outros processos inflamatórios.

BIOMARCADORES

Biomarcadores ou marcadores biológicos são utilizados na prática clínica para diagnóstico ou

identificação de riscos de ocorrência de determinada doença.

A PCR tem especial utilidade na investigação e no acompanhamento de isquemia ou infarto agudo do

miocárdio, queimaduras, doenças renais, hematológicas e reumatológicas.

Fonte: Image Point Fr / Shutterstock

 A proteína C reativa, encontrada no soro, é um importante marcador precoce do infarto agudo do
miocárdio
A imunidade adquirida ou adaptativa desenvolve-se posteriormente à ação da imunidade inata, e seus
componentes celulares são capazes de reconhecer antígenos de forma específica.


Com o antígeno reconhecido, uma resposta pode ser desencadeada por meio da produção de
anticorpos, por exemplo.


Esse tipo de resposta confere memória protetora contra o mesmo antígeno, isto é, durante uma segunda
exposição, frequentemente a resposta é mais rápida do que na infecção primária.

A IMUNIDADE ADQUIRIDA CELULAR OU MEDIADA

POR CÉLULAS TEM COMO SEUS PRINCIPAIS
COMPONENTES OS DIVERSOS SUBTIPOS DE
LINFÓCITOS T, CLASSIFICADOS DE ACORDO COM
SEU MODO DE AÇÃO. POR SUA VEZ, A IMUNIDADE
ADQUIRIDA HUMORAL É MEDIADA POR
ANTICORPOS PRODUZIDOS PELOS PLASMÓCITOS.

ANTÍGENOS E ANTICORPOS
Antígenos são definidos como moléculas ou partículas que, uma vez reconhecidas por células do nosso
sistema imunológico, podem desencadear ou não uma resposta imunológica. Um antígeno capaz de
ativar uma resposta imunológica é chamado de imunógeno. Cada antígeno possui sítios de
reconhecimento aos quais os anticorpos ou receptores de linfócitos B se ligam. Os antígenos podem ser
moléculas simples ou complexas, como:

Metabólitos intermediários de carboidratos, lipídeos e hormônios.

Macromoléculas, como carboidratos complexos, fosfolipídeos, ácidos nucleicos e proteínas.

Fonte: ustas7777777 / Shutterstock

As imunoglobulinas, popularmente conhecidas como anticorpos, caracterizam-se por serem moléculas

proteicas que atuam como receptores de membrana dos linfócitos B (BCR) ou podem se apresentar em
sua forma solúvel, sendo sintetizadas por plasmócitos (linfócitos B diferenciados).

Os anticorpos são produzidos em resposta a determinado antígeno, sendo capazes de se ligar a ele de
forma altamente específica, formando os chamados imunocomplexos. Os anticorpos podem atuar em
diferentes processos, tais como:

Neutralização de microrganismos ou toxinas.

Opsonização de patógenos, possibilitando o aumento da fagocitose e da toxicidade mediada por

células dependentes de anticorpos.

Ativação do sistema complemento.

Ativação de mastócitos nas infecções por helmintos.

OPSONIZAÇÃO

A opsonização consiste na fixação de moléculas como anticorpos à superfície de patógenos.

Dessa forma, os fagócitos têm a sua ação otimizada.
NO NOSSO ORGANISMO, TEMOS CINCO TIPOS DE
IMUNOGLOBULINAS. VOCÊ SABE COMO ELAS SÃO
CLASSIFICADAS?

RESPOSTA

As imunoglobulinas podem ser classificadas em cinco diferentes isotipos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.

Cada uma dessas classes está envolvida em um tipo específico de proteção. Clique nas setas e
conheça cada classificação.

Fonte: Martin Brändli / Wikipedia

Monômero

IgD: receptor de membrana de linfócitos B.

 IgE: defesa contra helmintos e hipersensibilidades.

IgG: opsonização, ativação do sistema complemento, único isotipo que atravessa a placenta.

Fonte: Martin Brändli / Wikipedia

Dímero

IgA: imunidade de mucosas.

Fonte: Martin Brändli / Wikipedia

Pentâmero

IgM: receptor de membrana de linfócitos B, ativação do sistema complemento.

As classes e a quantidade de anticorpos podem variar de acordo com o tipo de resposta imunológica. A
IgM é denominada “anticorpo frio”, pois sua fixação ao antígeno é máxima em baixas temperaturas e
praticamente nula a 37 °C; é sintetizada de forma mais rápida e em maior quantidade na resposta
primária. Por sua vez, a IgG é denominada “anticorpo quente”, pois sua fixação é ótima a 37 °C, sendo
produzida de forma tardia e em menor quantidade.

Na interpretação de exames imunológicos, a detecção de IgM indica infecção aguda ou recente,

enquanto a detecção de IgG indica que houve contato com o antígeno há algum tempo. De forma geral,
os anticorpos da classe IgM podem permanecer de três a seis meses no organismo, e os anticorpos IgG
resistem por tempo mais prolongado ou permanecem durante toda a vida.

No plasma sanguíneo, encontramos muitos anticorpos diferentes, sendo cada um deles derivado de um
clone de linfócito B. Quando temos ativação de diversos clones de linfócitos B e estes, diferenciados em
plasmócitos, produzem anticorpos, denominamos anticorpos policlonais, uma vez que são produtos
de clones diferentes e cada um desses clones produz anticorpos de especificidade única.

Fonte: oksana2010 / Shutterstock

Os anticorpos monoclonais ou mAbs são produzidos a partir de um único clone de linfócito B, que
passa a produzir sempre os mesmos anticorpos em resposta a um antígeno. Saiba mais sobre eles
clicando a seguir:

ANTICORPOS MONOCLONAIS
Podem ser produzidos em grande quantidade em laboratório a partir de linfócitos B gerados por
camundongos cujo sistema imunológico tenha sido estimulado por antígenos de interesse.

As novas gerações de mAbs quiméricos e humanizados usam camundongos geneticamente

modificados para produzir uma molécula híbrida, o que diminui a probabilidade de reação do sistema
imunológico humano contra proteínas do camundongo.
 QUIMÉRICOS

Um anticorpo quimérico é constituído por uma combinação de uma região do anticorpo de

camundongo e outra região do anticorpo humano.

Fonte: Adaptado de Nanocomposix

 Esquema mostrando a diferença no reconhecimento dos antígenos entre os anticorpos monoclonais
e policlonais.

Os mAbs são utilizados como ferramentas diagnósticas e terapêuticas. Como exemplos, temos:
infliximab ou entanercept para o controle da inflamação na artrite reumatoide e doença de Crohn;
trastuzumab para tratamento de câncer de mama; muromonab-CD3 para diminuição da rejeição de
transplante renal, entre outros.

INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO
A ligação do anticorpo ao antígeno ocorre em um sítio específico, denominado epítopo ou determinante
antigênico. Uma macromolécula que apresenta muitos epítopos iguais é chamada de antígeno
polivalente. Os epítopos podem ser classificados de acordo com sua estrutura em:

Determinantes lineares: formados com aproximadamente seis aminoácidos em sequência linear.

 Determinantes conformacionais: formados por aminoácidos que não estão em sequência, sendo
encontrados na forma de proteína dobrada.

Fonte: Soleil Nordic / Shutterstock

 Ilustração mostrando a interação do antígeno com a IgG.

A interação antígeno-anticorpo (Ag-Ac) é semelhante à interação de enzimas com seus substratos

(modelo chave e fechadura) ou de hormônios com seus receptores, mas com algumas diferenças. Você
imagina quais?

O anticorpo não provoca alteração química irreversível na molécula do antígeno; assim, o produto
formado (Ag-Ac) pode se dissociar em dois componentes, ficando cada um deles livre em solução. Além
disso, os antígenos apresentam estruturas químicas que favorecem a complementaridade com o
anticorpo por meio de ligações não covalentes reversíveis.

NÃO COVALENTES REVERSÍVEIS

Essas ligações podem ser rompidas após o contato com altas concentrações de sal, pH extremo,
detergentes e também por competição com elevadas concentrações do próprio epítopo puro.

A associação antígeno e anticorpo apresenta diferentes peculiaridades; um anticorpo pode apresentar

distintas afinidades, avidez e especificidade a uma gama de moléculas.

Porém, o que são afinidade, avidez e especificidade? Clique nas abas para conhecer cada uma delas.
AFINIDADE
É determinada pela força de ligação resultante entre um anticorpo e um único epítopo do antígeno e
depende da complementariedade entre as duas moléculas. Anticorpos com alta afinidade apresentam
grande similaridade ao antígeno, interagindo por meio de ligações fortes e duradouras; anticorpos com
baixa afinidade dissociam-se rapidamente, pois estabelecem ligações mais fracas.

AVIDEZ
É determinada pela força resultante de interações múltiplas entre uma molécula de anticorpo e os
epítopos de um antígeno complexo. Assim, quanto maior a avidez, melhor o efeito biológico final do
anticorpo, porém a afinidade será menor. A baixa afinidade de um anticorpo pode ser compensada por
uma avidez elevada, como acontece em uma molécula de IgM, que, por ser pentamérica, apresenta
diferentes sítios de ligação.

Fonte: Adaptado de Pediaa

Afinidade se refere à força da interação antígeno-anticorpo único. Na figura vemos a interação entre IgG
e o antígeno. Cada sítio de ligação do anticorpo IgG normalmente tem alta afinidade para seu sítio de
ligação.
Fonte: Adaptado de Pediaa

Avidez refere-se à força de todas as interações combinadas. Na figura vemos a interação de IgM com
um antígeno, que tem locais de ligação ao antígeno de baixa afinidade, mas, como é uma estrutura
pentamérica, há dez sítios de ligação, assim a avidez é alta.

ESPECIFICIDADE
Consiste na habilidade do anticorpo de distinguir seu imunógeno de outros antígenos.

A relação Ag-Ac é influenciada por diversos fatores. Assim, reações entre antígenos e anticorpos
polivalentes são mais estáveis, sendo detectadas mais facilmente. Caso o antígeno seja particulado,
geralmente é observada a aglutinação do antígeno pelo anticorpo. No entanto, se o antígeno estiver na
forma solúvel, geralmente é observada a precipitação de um antígeno após a produção de grandes
complexos Ag-Ac insolúveis. A formação dos complexos Ag-Ac é influenciada pela temperatura e pelo
tempo de reação. Já o tamanho desses complexos está relacionado à concentração do antígeno e do
anticorpo.

PARTICULADO

Antígenos particulados constituem a estrutura de bactérias, fungos, vírus e alguns tipos celulares,
como hemácias. Geralmente, são mais imunogênicos que antígenos solúveis.
REATIVIDADE CRUZADA

Alguns anticorpos podem ter habilidade de interagir com mais de um epítopo com propriedades
químicas similares. Assim, é possível que ocorram ligações mais fracas com regiões semelhantes, mas
não idênticas, do antígeno que o induziu. Esse tipo de ligação é chamado de reação cruzada. Observe
a seguir:

Fonte: Anônimo

Fonte: Anônimo

EPÍTOPO SIMILAR
Fonte: Anônimo

EPÍTOPO COMPARTILHADO

Muitos vírus e diversas bactérias podem apresentar epítopos idênticos ou similares a componentes
normais da célula hospedeira. Os antígenos microbianos estimulam anticorpos que reagem de maneira
cruzada com os componentes da célula hospedeira e resultam em uma reação autoimune que lesiona o
tecido.

 EXEMPLO

Um exemplo é a bactéria Streptococcus pyogenes, que expressa proteínas na parede celular (antígenos
M). Os anticorpos produzidos contra antígenos M reagem de forma cruzada com várias proteínas do
miocárdio e do músculo esquelético, causando lesões cardíacas e renais que levam ao desenvolvimento
da febre reumática.

Além disso, sabe-se que algumas bactérias intestinais têm substâncias quimicamente semelhantes que
apresentam reatividade antigênica cruzada com antígenos A e/ou B expressos na superfície dos
eritrócitos.

VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. APRENDEMOS QUE AS CLASSES E QUANTIDADES DAS IMUNOGLOBULINAS
PODEM VARIAR COM O TIPO DE UMA RESPOSTA IMUNOLÓGICA. UMA MULHER
DE 29 ANOS, GESTANTE DE 16 SEMANAS, REALIZOU SOROLOGIA PARA
TOXOPLASMOSE, E O RESULTADO DO EXAME REVELOU IGM NEGATIVO E IGG
POSITIVO. ASSINALE A ALTERNATIVA QUE APRESENTA A INTERPRETAÇÃO
DIAGNÓSTICA CORRETA DO TESTE LABORATORIAL:

A) Infecção prévia.

B) Possível infecção aguda.

C) Transmissão ativa da doença.

D) Nunca entrou em contato com T. gondii.

2. (EBSERH – 2015) PACIENTE CHEGOU AO PRONTO-ATENDIMENTO DO

HOSPITAL MUNICIPAL COM QUADRO INFLAMATÓRIO AGUDO.
CONSIDERANDO-SE A RESPOSTA MEDULAR À INFECÇÃO, NA CHAMADA FASE
INICIAL, PÔDE SER OBSERVADA NO HEMOGRAMA PRESENÇA,
PRINCIPALMENTE, DE QUAL TIPO DE LEUCÓCITOS?

A) Monócitos.

B) Eosinófilos.

C) Neutrófilos.

D) Eritrócitos.

GABARITO

1. Aprendemos que as classes e quantidades das imunoglobulinas podem variar com o tipo de
uma resposta imunológica. Uma mulher de 29 anos, gestante de 16 semanas, realizou sorologia
para toxoplasmose, e o resultado do exame revelou IgM negativo e IgG positivo. Assinale a
alternativa que apresenta a interpretação diagnóstica correta do teste laboratorial:

A alternativa "A " está correta.

De forma geral, a presença de IgG indica que o indivíduo já esteve em contato com o antígeno.

2. (EBSERH – 2015) Paciente chegou ao pronto-atendimento do hospital municipal com quadro

inflamatório agudo. Considerando-se a resposta medular à infecção, na chamada fase inicial,
pôde ser observada no hemograma presença, principalmente, de qual tipo de leucócitos?

A alternativa "C " está correta.

Os neutrófilos são o primeiro tipo celular a responder às infecções, principalmente aquelas causadas por
bactérias extracelulares. Sua principal função é a fagocitose.

MÓDULO 2

 Identificar os principais sistemas eritrocitários humanos e as doenças associadas

ANTÍGENOS ERITROCITÁRIOS
Nossas hemácias têm diferentes antígenos de superfície em suas membranas. Dentre os antígenos
presentes, temos o sistema ABO e Rh, que possibilitam a determinação do tipo sanguíneo de cada
indivíduo. Você sabe qual é seu grupo sanguíneo? Sabe qual tipo sanguíneo você pode receber em uma
transfusão? Faz ideia de como são realizados os exames pré-transfusionais?

Os grupos sanguíneos têm grande importância no contexto da transfusão de sangue, pois, se indivíduos
que não apresentam determinado antígeno eritrocitário (exemplo o antígeno Rh) entrarem em contato
com esse antígeno (Rh positivo) durante uma transfusão sanguínea, produzirão anticorpos contra esse
antígeno (anticorpo anti-Rh), o que pode causar uma reação transfusional, com hemólise, podendo até
levar o paciente ao óbito.

Assim, a determinação do tipo sanguíneo de um indivíduo é uma das etapas essenciais para possibilitar
uma transfusão sanguínea segura. Apesar de serem descritos centenas de tipos de antígenos
eritrocitários, os mais importantes e complexos pertencem aos grupos ABO e Rh. Esses são os dois
sistemas com maior relevância no contexto de compatibilidade sanguínea.
Fonte: Schira / Shutterstock

SISTEMA ABO

O sistema ABO foi o primeiro sistema de classificação sanguínea a ser descrito em 1900. Na ocasião, o
cientista austríaco Karl Landsteiner observou aglutinação após misturar diferentes amostras de sangue.

Posteriormente, Landsteiner descobriu que a aglutinação era causada por uma reação imunológica que
ocorre quando anticorpos são produzidos contra células do sangue de um doador. Essa resposta imune
é induzida porque existe grande variação dos antígenos localizados na superfície dos eritrócitos entre as
pessoas.

Esses antígenos estão presentes nas hemácias e na maioria das células epiteliais e endoteliais,
linfócitos e plaquetas. Além disso, apresentam-se na forma solúvel em secreções como saliva, lágrima,
leite, urina e líquido amniótico. Por esse motivo, o sistema ABO é considerado um sistema de
histocompatibilidade.

Os antígenos do sistema ABO são definidos por uma proteína codificada por um gene único, para o qual
há três alelos: A, B e O. Observa-se uma relação de dominância dos alelos A e B sobre o alelo O e uma
codominância entre os alelos A e B, o que nos dá a possibilidade de quatro tipos sanguíneos: A, B, AB
ou O.

 EXEMPLO
Dessa forma, se um indivíduo com tipo sanguíneo A, por exemplo, recebe sangue de um indivíduo de
um tipo sanguíneo diferente (como tipo B), o sistema imunológico desse receptor não reconhecerá os
antígenos B nas células do sangue do doador e, portanto, considerará que eles são estranhos à sua
composição.

Fonte: VectorMine / Shutterstock

Se os eritrócitos apresentam o antígeno A, seu tipo sanguíneo é A. Seu plasma tem anticorpos que
destroem hemácias de um indivíduo do tipo B.

Se os eritrócitos apresentam o antígeno B, seu tipo sanguíneo é B. Seu plasma tem anticorpos que
destroem hemácias de um indivíduo do tipo A.

Se os eritrócitos não apresentam o antígeno A nem o antígeno B, seu tipo sanguíneo é O. Seu plasma
tem anticorpos que destroem hemácias de indivíduos dos tipos A e B.

Se os eritrócitos apresentam o antígeno A e o antígeno B, seu tipo sanguíneo é AB. Seu plasma
sanguíneo não tem anticorpos que atacam o sangue do tipo A nem o tipo B.

DURANTE NOSSA VIDA, JÁ ESCUTAMOS MUITO OS

TERMOS DOADOR E RECEPTOR UNIVERSAL.
VAMOS ENTENDER O QUE É ISSO?

A identificação dos antígenos eritrocitários do sistema ABO e dos anticorpos produzidos possibilita
entender a compatibilidade entre os grupos sanguíneos (Figura 9). A ausência de antígenos nas
hemácias do grupo O possibilita que os grupo A, B e AB recebam sangue do tipo O, por isso esse tipo
sanguíneo é definido como doador universal. O grupo AB é considerado o receptor universal, uma
vez que não produz anticorpos anti-A e anti-B, podendo, assim, receber sangue de qualquer grupo
sanguíneo.

Fonte: Jrexjaaaa / Shutterstock

 Compatibilidade de tipos sanguíneos

A expressão dos genes ABO depende da ação do gene H, que se apresenta em 99% da população sob
a forma homozigota HH ou heterozigota Hh. A forma hh é rara e caracteriza o fenótipo Bombaim, que
compreende indivíduos que não apresentam antígenos ABO e H nem nos eritrócitos nem em
substâncias solúveis: são os chamados “falsos O”.

Os anticorpos contra antígenos A e/ou B são encontrados no plasma de indivíduos com eritrócitos que
não apresentam o antígeno correspondente. Portanto, diferem dos demais por terem ocorrência natural,
mesmo em indivíduos que não receberam transfusão ou tiveram gestação prévia.

Os anticorpos mais importantes são anti-A e anti-B. Em geral, são anticorpos da classe IgM, e a reação
com os antígenos correspondentes é ótima em temperaturas baixas (4 °C), sendo chamados de
anticorpos frios, apesar de também serem reativos à temperatura corporal, em torno de 37 °C.

Aglutinógenos e Aglutininas contidos no sangue - Sistema ABO

Tipos Aglutinógenos Aglutininas

O Bombay* Não contém Anti-A1, Anti-A2, Anti-B e Anti-H

 O H Anti-A1, Anti-A2 e Anti-B

A1 A1 Anti-B (Anti-A2*)

A2 A2 Anti-B (Anti-A1*)

B B Anti-A1, Anti-A2

A1B A1, B, H (Anti-A2*)

A2B A2, B, H (Anti-A1*)

Onde se encontram Hemácias Plasma

 * Podem ou não estar presentes

Aglutinógeno: Aglutinógeno ou aglutinogênio é a substância antigênica que estimula a formação de

uma aglutinina específica.

Aglutinina: Substância que pode provocar a aglutinação de células quando identificadas como
antígeno.

 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal

 SAIBA MAIS

Os anticorpos naturais ABO estão ausentes no nascimento; entre 3 e 6 meses de vida, começam a
aparecer e atingem títulos máximo entre 5 e 10 anos, permanecendo elevados até a fase adulta. Esses
anticorpos apresentam grande relevância do ponto de vista transfusional, estando relacionados à reação
transfusional grave e em casos de DHRN de forma clínica moderada, causando icterícia leve.

SISTEMA RH

Com mais de 50 diferentes antígenos caracterizados, o sistema Rh é o maior de todos os sistemas

sanguíneos.
O antígeno RhD foi descoberto em 1939 pelos cientistas Philip Levine e Rufus Stetson, quando
estudaram o caso de uma mãe que necessitou de transfusão após o nascimento de seu bebê natimorto.
Apesar de ambos serem do tipo O, a mulher apresentou reação hemolítica transfusional ao receber
sangue do marido.


Os cientistas levantaram a hipótese de que o pai do bebê (o doador das hemácias que a mãe recebeu)
tinha um "fator" (antígeno) que faltava à mãe e que o bebê havia herdado do pai. Em gestações
anteriores, a mãe havia sido imunizada por exposição às hemácias de seus outros bebês, que também
tinham esse fator.


O fator ou anticorpo que causou a morte do bebê foi atribuído ao sistema Rh (remetendo ao modelo
experimental utilizado – macaco do gênero Rhesus) e nomeado de anti-D.

Os antígenos do sistema RH são encontrados apenas nas hemácias. Esse antígeno é codificado por um
par de genes homólogos RHD e RHCE, que codifica a produção do antígeno RhD, e de dois pares de
antígenos antitéticos (Antígenos antitéticos são antagônicos, opostos.) : C, c, E, e, respectivamente.
Quando falamos em pacientes RH positivo ou negativo, isso corresponde à presença ou à ausência na
hemácia do antígeno D, mas ambos apresentam os antígenos Cc e Ee .

Fonte: LeoRed2KD / Shutterstock

 Esquema ilustrando hemácias com Rh (antígeno D) positiva e negativa.
DIFERENTEMENTE DOS ANTICORPOS ABO, OS
ANTICORPOS RH RARAMENTE OCORREM DE
FORMA NATURAL, SENDO CONSIDERADOS
ANTICORPOS IMUNES. ISSO SIGNIFICA DIZER QUE
ANTICORPOS RH RESULTAM DE SENSIBILIZAÇÃO
QUE OCORRE POR TRANSFUSÃO SANGUÍNEA
PRÉVIA OU GESTAÇÃO ANTERIOR. O ANTICORPO
ANTI-D É RESPONSÁVEL PELA MAIOR PARTE DAS
IMPLICAÇÕES CLÍNICAS ASSOCIADAS AO SISTEMA
RH.

A classificação simples dos indivíduos em Rh D+ e Rh D –, usando soro anti-D, geralmente se mostra

suficiente para fins clínicos. Anti-C, anti-c, anti-E e anti-e são vistos ocasionalmente e podem causar
tanto reações transfusionais como doença hemolítica do recém-nascido (DHRN).

SISTEMAS LEWIS, KELL, DUFFY E OUTROS

SISTEMAS ERITROCITÁRIOS

Além dos sistemas ABO e Rh, outras classificações de antígenos eritrocitários são propostas, entre elas
os sistemas Lewis, MNS, P, I, Kell e Duffy. Embora a ocorrência natural de anticorpos dos sistemas
Lewis, P e MNS não seja incomum, eles geralmente reagem apenas a baixas temperaturas e, por isso,
não acarretam consequências clínicas.

A frequência de detecção de anticorpos imunes contra antígenos desses sistemas é pequena. Muitos
antígenos apresentam baixa antigenicidade, e outros, embora imunogênicos, apresentam frequência
relativamente baixa.

SISTEMA LEWIS
O sistema Lewis fundamenta-se na classificação do sangue humano com base na expressão de
glicoproteínas chamadas antígenos de Lewis (Le), na superfície dos eritrócitos ou nos fluidos corporais,
ou em ambos. Esse sistema está bioquimicamente associado ao sistema de grupo sanguíneo ABO,
embora os loci genéticos não estejam ligados entre si.
O sistema consiste em dois alelos, chamados de Le (dominante) e le (recessivo). A presença de Le

especifica a formação do antígeno Lea, um antígeno solúvel em água identificado em 1946. Um segundo

antígeno, Leb, identificado em 1948, ocorre apenas quando os alelos Le e H (do sistema de grupo
sanguíneo ABO) interagem e é encontrado em indivíduos secretores que expressam fenótipo
eritrocitário Le (a-b+).

SISTEMA KELL
O sistema Kell foi descrito em 1946 e é composto por mais de 20 antígenos, sendo alguns deles mais
importantes que outros.

Esses antígenos são produtos do gene KEL e expressos na glicoproteína transmembrana N-glicosilada
Kell e começam a ser expressos logo no início da vida; a partir da décima semana, podem ser
detectados nas células do feto. Ao nascimento, estão bem desenvolvidos e são encontrados
principalmente na linhagem eritroide, nos testículos e, em menor nível, no cérebro, nos tecidos linfoides
e no tecido muscular, estando ausentes em plaquetas, linfócitos, granulócitos ou monócitos.

Geralmente, os anticorpos anti-Kell pertencem à classe IgG e apresentam maior imunogenicidade do

que os dos sistemas ABO e Rh. Sendo assim, podem causar reações transfusionais e estão implicados
na DHRN.

SISTEMA DUFFY
O sistema Duffy é composto por seis antígenos, sendo Fya e Fyb os mais importantes. Esses dois
antígenos são produtos de alelos codominantes expressos na glicoproteína gpD, que é um receptor de
citocinas na superfície das hemácias. Os antígenos do sistema Duffy são expressos nas hemácias e em
tecidos como rim, coração, cérebro, pulmão, pâncreas, placenta, tireoide, entre outros. Eles não são
expressos em linfócitos, monócitos e plaquetas.

Os quatro fenótipos no sistema Duffy são:

Fy (a+b+)

Fy (a+b-)

Fy (a-b+)

Fy (a-b-)

O fenótipo Fy (a-b-), raro em caucasianos e mais comum na população africana, é resultante de uma
mutação que leva à ausência da expressão proteica nas hemácias. Esse fenótipo tem relevância clínica,
pois confere resistência à malária.
Sabe-se que anticorpos anti-Fy são moderadamente imunogênicos. Assim, anti-Fya podem causar

DHRN moderada e reações transfusionais. Por sua vez, anticorpos anti-Fyb são incomuns.

SISTEMA MNSS
O sistema MN foi o segundo sistema de grupos sanguíneos a ser descrito, em 1927, por Landsteiner e
Levine, quando encontraram anticorpos anti-M e anti-N no soro dos coelhos imunizados.
Posteriormente, o antígeno S foi relatado por Walsh e Montgomery e, em 1951, foi descrito o alelo s.

Assim, o sistema MN transformou-se em MNSs e, atualmente, sabe-se que esse sistema é formado por
43 antígenos associados a sialoglicoproteínas de membrana e restritos à linhagem eritroide. São
antígenos bem desenvolvidos ao nascimento.

A produção de anticorpos anti-M ou anti-N ocorre somente após sensibilização; assim, não haverá
reação de incompatibilidade se um indivíduo que não tenha o antígeno M (M-) receber um sangue de um
doador com antígeno M (M+), a não ser que ele esteja sensibilizado por transfusões anteriores e
apresente o anticorpo anti-M.

O anticorpo anti-N é mais raro que o anti-M, estando raramente associado a DHRN e reações
transfusionais. O anticorpo anti-S é mais comum do que o anti-s, mas ambos podem desencadear
reações transfusionais hemolíticas moderadas a graves, assim como DHRN.

Além dos sistemas que já estudamos, existem ainda outros antígenos eritrocitários, como o sistema P,
cuja expressão dos antígenos é influenciada por genes do sistema ABO, e o sistema I, presente em
quase todos os adultos e o único expresso no sangue do cordão umbilical.

Esses antígenos não estão comumente envolvidos em reações transfusionais, mas podem causar
hemólise se pacientes sensibilizados (que têm anticorpo contra o sistema P ou I) forem transfundidos
com hemácias que apresentem esse antígeno.

 SAIBA MAIS

Nem todos os bancos de sangues têm os materiais necessários para conhecer os antígenos
eritrocitários. Assim, no momento da seleção de bolsas de sangue para a transfusão, é feita a
classificação sanguínea (sistema ABO e Rh) e Kell dos doadores e receptores para os pacientes
imunodeprimidos (como os pacientes que recebem tratamento para câncer). Nos pacientes
imunocompetentes (como pacientes com anemia falciforme), também é verificado o sistema Duffy, para
garantir que os receptores tenham antígenos eritrocitários compatíveis.
DOENÇA HEMOLÍTICA DO RN (DHRN/DHPN) POR RH
OU ABO

A doença hemolítica perinatal (DHPN), ou doença hemolítica do recém-nascido (DHRN), compreende

patologias que resultam da destruição ou diminuição da sobrevida dos eritrócitos do feto e/ou
recém-nascido. Essa condição pode ser classificada em três categorias: DHRN por incompatibilidade
sanguínea materno-fetal aos antígenos do sistema Rh, do sistema ABO e contra antígenos de outros
sistemas eritrocitários.

A DHRN por anticorpo anti-D é grave na maioria dos casos, caracterizando-se por destruição acentuada
das hemácias do feto. Essa condição é evidenciada por hiperbilirrubinemia, anemia profunda e
hidropsia fetal, que muitas vezes evolui para o óbito.

HIPERBILIRRUBINEMIA

A hiperbilirrubinemia do recém-nascido é uma condição causada pelo acúmulo de bilirrubina no

sangue, deixando a pele do bebê amarelada.

Fonte: Strela Studio / Shutterstock

 ATENÇÃO

É importante ressaltar que a incidência de DHRN por anticorpo anti-D tem diminuído graças ao
acompanhamento pré-natal e à utilização da imunoglobulina humana anti-D nas mães não
sensibilizadas.

Quando a gestante é Rh negativa e o feto é Rh positivo, eritrócitos fetais entram na circulação materna
geralmente durante o parto e podem sensibilizar a mãe, que passa a produzir anticorpos anti-D. A mãe
também pode ser sensibilizada anteriormente por transfusão de sangue, aborto prévio ou amniocentese,
produzindo anticorpos anti-D. Uma vez sensibilizada, em uma nova gestação de filho Rh positivo, seus
anticorpos anti-D poderão destruir as hemácias do bebê.

COMO PREVENIR
A principal forma de manejo é prevenir a formação de anticorpo anti-D em mulheres Rh negativas por
meio da administração de anticorpos anti-D, que levam à remoção rápida dos eritrócitos fetais Rh
positivos da circulação, antes que eles possam sensibilizar o sistema imunológico da mãe e ela comece
a produzir anti-D. Quando realizada até 72 horas após o nascimento, a imunoprofilaxia com IgRh
promove proteção de 98% a 99% contra a formação de anticorpos anti-D.

A classificação da DHRN como grave está relacionada à morte intrauterina por hidropsia fetal. Já na
doença moderada, o bebê nasce com anemia e icterícia, podendo apresentar palidez, edema e
hepatoesplenomegalia. Se o nível de bilirrubina não conjugada não for controlado, a deposição de
pigmento biliar nos gânglios da base cerebral pode causar dano ao sistema nervoso central, com
possibilidade de levar à deficiência intelectual, surdez e epilepsia. Na DHRN leve, o bebê apresenta
anemia leve com ou sem icterícia.

A investigação laboratorial pode mostrar:

Anemia variável com alta contagem de reticulócitos.

A classificação sanguínea revela que o bebê é Rh positivo e a mãe negativa, o teste direto de
antiglobulina (chamado de Coombs direto) é positivo e a bilirrubina está elevada.

Em casos moderados e graves, são vistos eritoblastos abundantes no hemograma.

COOMBS

Teste que detecta a presença de anticorpos ligados a antígenos eritrocitários.

Embora o anticorpo anti-D seja responsável pela maioria dos casos graves de DHRN, anticorpos anti-c,
anti-E e anti-K também podem estar envolvidos. Além disso, sabe-se que anticorpos relacionados ao
sistema ABO são a causa mais frequente de DHRN, mas a doença costuma ser leve.

A doença hemolítica por incompatibilidade do sistema ABO pode ocorrer em qualquer gestação
(incluindo a primeira), podendo não afetar as gestações subsequentes, e se restringe aos recém-
nascidos com tipo sanguíneo A ou B de mães do tipo O. Geralmente, a doença se apresenta com
intensidade mais branda, com anemia leve e de fácil manejo.

Fonte: Blue Planet Studio / Shutterstock

O diagnóstico laboratorial da DHRN por incompatibilidade do sistema ABO compreende anemia,

reticulócitos e hiperbirrubinemia indireta precoce. O diagnóstico sorológico pode ser confirmado por meio
do teste de Coombs direto positivo nos eritrócitos do recém-nascido e incompatibilidade sanguínea
materno-fetal.

A baixa gravidade da DHRN do sistema ABO pode ser explicada pela falta de desenvolvimento total dos
antígenos A e B ao nascimento e pela neutralização parcial dos anticorpos IgG maternos pelos
antígenos A e B em outras células, no plasma e nos fluidos dos tecidos.

 RECOMENDAÇÃO

Cabe ressaltar que todas as gestantes devem fazer tipagem dos sistemas ABO e Rh. A pesquisa de
anticorpos irregulares deve ser feita ao menos duas vezes durante todas as gestações por meio do teste
de Coombs.
Este vídeo apresenta as características dos sistemas Kidd e Diego, respectivos tipos de antígenos e
anticorpos.

VERIFICANDO O APRENDIZADO

1. (IBFC – 2019 ADAPTADA) ESTUDAMOS QUE O SISTEMA RH É O MAIS

COMPLEXO DOS SISTEMAS ERITROCITÁRIOS, SENDO O SEGUNDO MAIS
IMPORTANTE, DEPOIS DO SISTEMA ABO, NA MEDICINA TRANSFUSIONAL. EM
RELAÇÃO À SUA CLASSIFICAÇÃO, É CORRETO AFIRMAR QUE:

A) Anticorpos Rh são naturalmente encontrados no organismo humano.

B) O antígeno Rh D é o único envolvido em reações transfusionais.

C) Os anticorpos do sistema Rh são gerados após sensibilização prévia.

D) Os antígenos do sistema Rh são encontrados em hemácias e fluidos corporais.

2. (PUC-RP – 2016 ADAPTADA) VIMOS A IMPORTÂNCIA DO SISTEMA ABO E RH

COMO UM DOS PILARES PARA A SEGURANÇA TRANSFUSIONAL. IMAGINE
QUE DETERMINADO BANCO DE SANGUE VEICULE A SEGUINTE SOLICITAÇÃO:
“O BANCO DE SANGUE NECESSITA, COM A MÁXIMA URGÊNCIA, DE SANGUE
TIPO A”. CONSIDERANDO SEUS CONHECIMENTOS SOBRE O GRUPO
SANGUÍNEO ABO, PACIENTES QUE PODEM RECEBER TRANSFUSÃO DESSE
SANGUE POSSUEM TIPO SANGUÍNEO:

A) A ou O.

B) A ou AB.

C) B ou O.

D) B ou AB.

GABARITO

1. (IBFC – 2019 adaptada) Estudamos que o sistema Rh é o mais complexo dos sistemas
eritrocitários, sendo o segundo mais importante, depois do sistema ABO, na medicina
transfusional. Em relação à sua classificação, é correto afirmar que:

A alternativa "C " está correta.

Naturalmente, não temos anticorpos anti-Rh em nosso organismo. Assim, quando há sensibilização por
uma gestação ou transfusão sanguínea anterior, os anticorpos são produzidos.

2. (PUC-RP – 2016 adaptada) Vimos a importância do sistema ABO e RH como um dos pilares
para a segurança transfusional. Imagine que determinado banco de sangue veicule a seguinte
solicitação: “O banco de sangue necessita, com a máxima urgência, de sangue tipo A”.
Considerando seus conhecimentos sobre o grupo sanguíneo ABO, pacientes que podem receber
transfusão desse sangue possuem tipo sanguíneo:

A alternativa "B " está correta.

Indivíduos do grupo A podem doar sangue somente para indivíduos do grupo A e AB.
MÓDULO 3

 Reconhecer métodos imuno-hematológicos para classificação sanguínea e diagnóstico de

doenças relacionadas

TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS
Diversas técnicas imunológicas são utilizadas no diagnóstico clínico de doenças infectocontagiosas e no
monitoramento de tratamento por quimioterapia e radioterapia. São úteis, ainda, para a determinação do
grupo sanguíneo de um indivíduo.

Essas técnicas possibilitam a detecção ou quantificação de anticorpos, antígenos e outras moléculas

provenientes da interação Ag-Ac em amostras biológicas. Os testes utilizados para a detecção de
anticorpos ou antígenos podem ser primários ou secundários.

Fonte: Roman Zaiets / Shutterstock

Vamos conhecer um pouco mais sobre cada teste.

PRIMÁRIOS
Verificam a interação direta entre Ag-Ac.

Exemplos: radioimunoensaio, imunofluorescência, ELISA.

SECUNDÁRIOS
Detectam as consequências da interação entre Ag-Ac ou mudanças no estado físico do antígeno.

Exemplos: imunodifusão, aglutinação, precipitação, fixação de complemento.

Além de possuir diversas aplicações, de forma geral, o imunodiagnóstico apresenta vantagens como:

Rapidez

Possibilidade de automação

Kits comerciais padronizados

Custo operacional relativamente baixo

A imuno-hematologia é uma das áreas que utiliza técnicas de imunodiagnóstico para estudar e
classificar os grupos sanguíneos por meio de reações imunológicas entre aglutinógenos e anticorpos.

Os testes imuno-hematológicos pré-transfusionais realizados no sangue do doador e receptor são

fundamentais e críticos para a realização de uma transfusão segura. Além disso, os testes imuno-
hematológicos são rotineiramente empregados para verificar a compatibilidade sanguínea entre mãe e
filho.

As metodologias mais utilizadas na imuno-hematologia são as técnicas em tubo, microplacas e gel

teste.

Fonte: Jenjira pimtep / Shutterstock

TÉCNICA EM TUBO

Na técnica em tubo, são utilizados tubos de vidro ou plástico, onde são colocados os reagentes e as
amostras e, após centrifugação, é verificada a presença de aglutinação.

Fonte: cawee / Shutterstock

MICROPLACAS

As técnicas que utilizam as microplacas apresentam o mesmo fundamento que a técnica em tubo, mas
as reações são realizadas em microplacas de acrílico com fundo em “U” ou fundo em “V”.
Fonte: Sunisa Butphet / Shutterstock

GEL TESTE

No gel teste, a reação é feita em um cartão contendo microtubos com gel (Sephadex 6100 ou
poliacrilamida), que possibilitam que os complexos formados após a interação Ag-AC fiquem retidos na
coluna do gel quando submetidos à centrifugação. A presença de aglutinação (botão de hemácias)
retida no gel indica que o teste é positivo. O gel teste apresenta uma vantagem em relação aos outros
dois, pois a reação é estável e permite que o cartão fique guardado por até 48 horas, possibilitando
revisão do resultado.

A condução dos testes imuno-hematológicos no laboratório deve ser criteriosa e seguir as normas de
biossegurança, o procedimento operacional padrão e todas as indicações das bulas dos fabricantes dos
reagentes. Diversos fatores podem influenciar a qualidade dos ensaios imuno-hematológicos.

 SAIBA MAIS

O sangue deve ser coletado de forma adequada em tubo apropriado.

Devem ser utilizadas vidrarias limpas e sem resíduos de detergente, pois a presença de
interferentes pode favorecer a formação de aglutinatos (Agregados formados por aglutinação.) ,
levando a resultados falso-positivos.
 Deve ser utilizada a técnica adequada para separação do soro.

As suspensões de hemácias com Salina (NaCl 0,9%) devem ser preparadas corretamente, uma
vez que concentrações muito abaixo ou acima da ideal podem levar a resultados falsos negativos.

É essencial verificar a qualidade dos reagentes e equipamentos empregados.

Devem ser utilizados ensaios técnicos padronizados.

PRÁTICAS IMUNO-HEMATOLÓGICAS:
CLASSIFICAÇÃO DO SISTEMA ABO

Para conhecermos a classificação sanguínea em relação ao sistema ABO, é obrigatória a realização de

duas provas, chamadas de prova direta e reversa. Para conhecê-las, clique a seguir.

PROVA DIRETA
Na prova direta, ou teste de Beth-Vincent, faz-se a pesquisa de antígenos fixados nas hemácias do
indivíduo. Para isso, são utilizados soros (anticorpos anti-A, anti-B e anti-A, B) que apresentam a
capacidade de reconhecer e ligar-se aos antígenos eritrocitários, permitindo a definição dos grupos
sanguíneos: A, B, AB, O.

PROVA REVERSA
Na prova reversa, ou teste de Simonin, faz-se a pesquisa do anticorpo presente no soro (ou plasma)
do indivíduo. Esse teste deve ser feito com hemácias com o tipo sanguíneo A e B conhecido. Essa prova
é uma contraprova essencial para a conclusão da tipagem sanguínea, devendo ser sempre realizada,
exceto em bebês com idade inferior a quatro meses de idade, isto porque os anticorpos do sistema ABO
estão ausentes ao nascimento, sendo detectados após os primeiros meses de vida.

Soro Anti- Soro Anti- Soro Anti- Hemácia Hemácia

A B A+B A B

Grupo A     
 Grupo B     

Grupo
    
AB

Grupo O     

 Ausência de aglutinação  Presença de aglutinação

 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal

 Classificação sanguínea pela prova direta e reversa. Fonte: Ministério da Saúde (2014).

É importante ressaltar que o anticorpo B geralmente apresenta título mais fraco que os demais
anticorpos. As provas direta e reversa são complementares entre si. É possível ocorrerem discrepâncias
por alterações nos antígenos, no soro/plasma ou devido a erros laboratoriais. Antes de o laudo
laboratorial ser liberado, os resultados discrepantes devem ser esclarecidos.

 SAIBA MAIS

Em bebês com menos de quatro meses de idade, podemos observar a presença de anticorpos maternos
durante a classificação sanguínea. Em pacientes imunodeprimidos, durante a prova reversa, podemos
não observar os anticorpos devido à sua baixa produção nesses pacientes.

 ATENÇÃO

Além dos quatro tipos sanguíneos conhecidos (A, B, AB, O), existem alguns subgrupos dos grupos A, B
e AB. Os subgrupos do antígeno A e B apresentam algumas mutações no gene que codifica essas
moléculas, o que leva a uma menor expressão e presença desses antígenos na membrana dos
eritrócitos. Durante a classificação direta em pacientes com esses subgrupos, a baixa expressão desses
antígenos gera uma reação fraca nos testes imunológicos, gerando discrepâncias entre a prova direta e
a reversa.

Em bancos de sangue, a distinção entre os subgrupos A e B não apresenta relevância, pois

normalmente a transfusão desses sorogrupos não leva a uma reação transfusional.
PRÁTICAS IMUNO-HEMATOLÓGICAS:
CLASSIFICAÇÃO DO SISTEMA RHD E PESQUISA DE
D FRACO

Diferentemente da tipagem do sistema ABO, a classificação do RhD refere‑se somente à presença ou

ausência do antígeno RhD, não existindo prova reversa, pois os indivíduos não apresentam anticorpos
naturais contra o antígeno Rh.

A classificação do Rh é feita pela tipagem direta, com a utilização de soros comerciais contendo
anticorpos anti-D monoclonais ou policlonais, que identificam a presença de antígenos na superfície dos
eritrócitos, classificando os indivíduos como RhD positivo (aglutinação direta) e RhD negativo
(ausência de aglutinação).

Fonte: Maky_orel / Pixabay

Fonte: Ministério da Saúde (2014).

 Tipagem direta para a pesquisa de RH. Tubo D (pesquisa antígenos D e tubo CTR é o tubo controle)
Como o reagente anti-D apresenta natureza proteica, faz-se necessária a utilização de um controle
negativo, que consiste na mesma base proteica do reagente anti-D, mas não contém o anticorpo. Se o
controle for positivo, a reação não pode ser considerada válida, uma vez que houve aglutinação sem a
presença do anticorpo. A tipagem Rh pode ser realizada pelo método em tubo, lâmina, microplaca ou
em gel.

O antígeno RhD exibe um extenso polimorfismo, podendo se apresentar como D normal, com fraca
expressão (D fraco) devido a substituições de aminoácidos na proteína D ou como um antígeno
modificado (D parcial) pela ausência de um ou mais epítopos. Em testes sorológicos de rotina para
tipagem Rh, é difícil distinguir entre o D fraco e o D parcial, sendo necessários estudos moleculares.

A pesquisa de D fraco deve ser feita sempre que a classificação do RhD for negativa, isto é, quando não
houver aglutinação. A classificação correta do sistema RhD e de suas variantes tem grande relevância,
uma vez que esse antígeno é o mais imunogênico quando comparado aos demais antígenos
eritrocitários conhecidos até o momento.

Fonte: Shirley Lopes de Castilho / Ministério da Saúde (2004).

 Fluxograma de interpretação de RhD fraco.
Assista ao vídeo a seguir, em que o especialista apresenta os testes Beth-Vincent (prova direta) e
Simonin (prova reversa), demonstrando como se complementam.

PRÁTICAS IMUNO-HEMATOLÓGICAS: TESTE DE

COOMBS

O teste da antiglobulina humana ou teste de Coombs foi descoberto em 1945 e destina-se à pesquisa de
anticorpos e proteínas do sistema complemento. O sistema imunológico pode produzir anticorpos contra
eritrócitos nos seguintes casos:

Anemia hemolítica

Leucemia linfocítica crônica

DHRN
 Mononucleose infecciosa

Sífilis

Lúpus eritematoso sistêmico

Reação transfusional

Vamos conhecer um pouco mais sobre os testes.

TESTE DE COOMBS DIRETO OU TESTE DA

ANTIGLOBULINA DIRETO (TAD)
O teste de Coombs direto ou teste da antiglobulina direto (TAD) é um teste que detecta anticorpos
(gamaglobulinas) do tipo IgG ou fração do sistema complemento que estão ligados às hemácias. Esses
anticorpos podem ser produzidos pelo próprio organismo ou recebidos durante uma transfusão de
sangue.

O TAD é realizado com suspensão a 5% de eritrócitos do paciente em soro fisiológico e adição do soro
de Coombs (anticorpo anti-Ig humano, que reconhece uma região do IgG). Posteriormente, a mistura é
centrifugada para a verificação da aglutinação. A presença de aglutinação (TAD positivo) indica
sensibilização (anticorpos ligados a hemácias).

Fonte: Maria de Lourdes Rios Barjas de Castro / Ministério da Saúde (2004)

 Hemácias sensibilizadas aglutinadas pelo soro antiglobulina humana.

Uma das maiores aplicações do teste de Coombs direto é na pesquisa da DHRN. Nas mães com o fator
Rh negativo com o recém-nascido com fator Rh positivo, a realização do TAD permite verificar se a mãe
produziu anticorpos anti-Rh e se estes atingiram o bebê, podendo levar ao desenvolvimento da doença.

Além de casos de DHRN, a realização do TAD é indicada em casos de anemia hemolítica autoimune,
anemia induzida por medicamentos e na reação transfusional. O TAD positivo não significa que o
paciente necessariamente apresenta anemia hemolítica autoimune e o teste negativo não exclui
hemólise imune. Assim, todo paciente com TAD positivo deve ser submetido a uma avaliação clínica
criteriosa e a testes adicionais.

TESTE DE COOMBS INDIRETO OU TESTE DA

ANTIGLOBULINA INDIRETO (TAI)
O teste de Coombs indireto ou teste da antiglobulina indireto (TAI) é frequentemente utilizado na
identificação e detecção de anticorpos presentes no soro. Esses anticorpos podem atacar os eritrócitos,
mas não estão ligados a eles, sendo chamados de anticorpos irregulares, incompletos ou não
aglutinantes.

Normalmente, realiza-se este teste para detectar a presença de anticorpos no sangue de um receptor ou
doador antes de uma transfusão. Além disso, tem utilidade no acompanhamento pré-natal, sendo
possível proteger os bebês no início da gestação, caso a mãe tenha sangue Rh negativo.

O teste é realizado incubando-se o soro ou plasma do paciente com hemácias reagentes de

triagem (Hemácias em que os antígenos eritrocitários são conhecidos.) e, após incubação a 37 °C com
potencializadores, como albumina, o soro de Coombs é adicionado, misturado e centrifugado para a
verificação da aglutinação.

Esse teste é utilizado como uma triagem para pesquisa de anticorpos irregulares; caso o TAI apresente
resultado negativo, isso indica que a amostra testada não tem anticorpos livres (irregulares), que
reagiriam, assim, com eritrócitos. De forma diferente, TAI positivo indica a presença desses anticorpos,
sendo necessários testes adicionais para identificar qual anticorpo foi formado, pesquisando-se, assim,
os diferentes tipos de antígenos eritrocitários (sistemas Rh, Duffy, Lewis, Kell, MNS, dentre outros).

Na gestante ou na mulher Rh negativa que esteja planejando engravidar, o teste de triagem positivo
pode ser indicativo da presença de um anticorpo anti-Rh, ou seja, sugere que a mãe foi sensibilizada, e
deve ser realizada a testagem sanguínea no feto e o acompanhamento médico para evitar riscos ao
bebê. Caso o teste seja negativo, isso indica que a mãe não foi sensibilizada. Durante o pré-natal, esse
teste é sempre solicitado.

AGORA, COMO FAZEMOS A COMPATIBILIDADE

ENTRE DOADORES E RECEPTORES DE SANGUE?

Durante os exames transfusionais para transfusões de concentrados de hemácias (CH), devemos fazer
a classificação sanguínea (ABO e Rh) e a pesquisa de anticorpos irregulares (TAI) no receptor e no
doador.

Além disso, deve-se fazer a prova cruzada, que consiste em verificar se o receptor tem anticorpos contra
algum antígeno eritrocitário do doador, o que pode levar a uma reação transfusional.
Fonte: cawee / Shutterstock

Para isso, é realizada a testagem do soro ou plasma do paciente (receptor) com as hemácias do
possível doador e é verificada a presença de aglutinação. Caso haja aglutinação, o receptor não pode
receber aquela bolsa de CH e o sangue de outros doadores deve ser compatibilizados.

 ATENÇÃO

Caso a pesquisa de anticorpos irregulares (TAI) no paciente (receptor) seja positiva, mostrando a
presença de anticorpos irregulares, e a prova cruzada, negativa, o paciente pode receber o sangue,
pois, como não ocorreu aglutinação na prova cruzada, o doador não apresenta antígenos eritrocitários
que interajam com o anticorpo irregular produzido pelo paciente. No entanto, devemos realizar testes
adicionais para descobrir qual anticorpo irregular o paciente desenvolveu.

VERIFICANDO O APRENDIZADO

1. (EBSERH-2017 ADAPTADA) A TÃO FAMOSA DOENÇA HEMOLÍTICA DO

RECÉM-NASCIDO (DHRN), APESAR DE FÁCIL DETECÇÃO E TRATAMENTO,
AINDA MANTÉM OS ALTOS ÍNDICES DE INTERNAÇÃO PÓS-PARTO NOS
HOSPITAIS PÚBLICOS. ASSINALE A ALTERNATIVA CORRETA:
A) O teste de Coombs indireto detecta antígenos ou componentes do sistema complemento fixados às
hemácias maternas, portanto o sangue materno é coletado.

B) Se uma mulher Rh negativo gera um bebê Rh positivo, ela pode vir a produzir anticorpos contra as
células do sangue do segundo filho Rh positivo.

C) O teste de Coombs direto é realizado quando o recém-nascido é Rh positivo, independentemente do

fator Rh da mãe.

D) A DHRN é investigada apenas quando a gestantes são Rh positivo e o primeiro filho tem Rh negativo,
independentemente da tipagem ABO.

2. (ENADE – 2007 ADAPTADA) O SISTEMA DE GRUPO SANGUÍNEO RH É UM

DOS MAIS IMPORTANTES, SENDO DETERMINADO PELA PRESENÇA (RH
POSITIVO) OU AUSÊNCIA (RH NEGATIVO) DO ANTÍGENO D. ENTRETANTO,
FORAM DESCRITOS ERITRÓCITOS QUE EXPRESSAM POUCOS ANTÍGENOS D E
SÃO DESIGNADOS COMO D FRACO. UM INDIVÍDUO PORTADOR DO D FRACO
PODE APARECER COMO RH NEGATIVO EM TESTES QUANDO AS AMOSTRAS
SÃO TIPADAS APENAS COM ANTISSOROS CONTRA O ANTÍGENO D. É
CORRETO AFIRMAR QUE:

A) O D fraco é expresso em outras células do sistema sanguíneo, como linfócitos e macrófagos.

B) Um indivíduo D fraco somente poderá doar sangue para outro indivíduo D fraco.

C) Um indivíduo D fraco, por expressar menos sítios antigênicos, poderá doar sangue para indivíduos
Rh negativo.

D) O D fraco pode ser detectado com o teste da antiglobulina indireta, indicando tratar-se de um
indivíduo Rh positivo.

GABARITO

1. (EBSERH-2017 adaptada) A tão famosa doença hemolítica do recém-nascido (DHRN), apesar

de fácil detecção e tratamento, ainda mantém os altos índices de internação pós-parto nos
hospitais públicos. Assinale a alternativa correta:

A alternativa "B " está correta.

A condição necessária para que ocorra a DHRN é a mãe apresentar tipo sanguíneo Rh negativo e ter
um primeiro filho Rh positivo, que a sensibilizará. Sendo a segunda gestação de um feto Rh positivo, os
anticorpos da mãe previamente sensibilizada destruirão as hemácias desse segundo filho. O teste de
Coombs indireto é realizado para verificar a presença de anticorpos do tipo irregular, e o teste de
Coombs direto é um teste que detecta anticorpos (gamaglobulinas) do tipo IgG ou fração do sistema
complemento que estão ligados às hemácias.

2. (ENADE – 2007 adaptada) O sistema de grupo sanguíneo Rh é um dos mais importantes, sendo
determinado pela presença (Rh positivo) ou ausência (Rh negativo) do antígeno D. Entretanto,
foram descritos eritrócitos que expressam poucos antígenos D e são designados como D fraco.
Um indivíduo portador do D fraco pode aparecer como Rh negativo em testes quando as
amostras são tipadas apenas com antissoros contra o antígeno D. É correto afirmar que:

A alternativa "D " está correta.

A pesquisa do antígeno D fraco é realizada em amostras de sangue que apresentam reações fracas ou
nulas em testes de aglutinação direta com soro anti-D. O teste de Coombs indireto ou teste da
antiglobulina indireta (TAI) pode esclarecer esses casos, pois o teste positivo indica indivíduo Rh
positivo.

CONCLUSÃO

CONSIDERAÇÕES FINAIS
Ao longo desta jornada, apreendemos como o sistema imunológico está ordenado para defender o
organismo contra patógenos invasores por meio da imunidade inata e adquirida. Entendemos a
importância dos anticorpos e como se dá a interação específica com os diversos antígenos a que
estamos expostos diariamente.

Visitamos os antígenos eritrocitários e vimos como podem ser classificados esses antígenos em
diferentes sistemas, sendo que os sistemas ABO e Rh apresentam maior relevância clínica, uma vez
que estão envolvidos em reações transfusionais e na doença hemolítica do recém-nascido. Entretanto, o
sistema Rh é capaz de causar as formas mais graves dessa doença.

Além disso, entendemos os princípios dos métodos imuno-hematológicos utilizados na rotina laboratorial
para a determinação dos tipos sanguíneos e detecção de anticorpos produzidos contra eritrócitos,
identificando sua importância na prática clínica.
REFERÊNCIAS
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S. Imunologia celular e molecular. 8. ed. Rio de Janeiro:
Elsevier HS – Education, 2015.

BRASIL. Ministério da Saúde. Imuno-hematologia laboratorial. Brasília, 2014. Consultado em meio

eletrônico em: 8 set. 2020.

HOFFBRAND, A. V.; MOSS, P. A. H. Fundamentos em hematologia de Hoffbrand. 7. ed. Porto

Alegre: Artmed, 2018.

MURPHY, K. Imunobiologia de Janeway. Porto Alegre: Artmed, 2014.

ROITT, I. M.; DELVES, P. J.; BURTON, D. R. Fundamentos de imunologia. 13. ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2018.

SILVA, P. H. et al. Hematologia laboratorial: teoria e procedimentos. Porto Alegre: Artmed, 2016.

EXPLORE+

Descubra como o funcionamento do sistema imunológico pode sofrer influência hormonal lendo o
artigo Pós-menopausa e o sistema imune, de Marco Antonio Faria et al.

Aprenda mais sobre o teste de Coombs assistindo ao vídeo intitulado Coombs direto/avaliando
hemólise em recém-nascido.

Aprenda mais sobre as técnicas imuno-hematológicas visitando o guia do Ministério da Saúde

Imuno-hematologia laboratorial.
CONTEUDISTA
Angelica Martins Batista

 CURRÍCULO LATTES
DESCRIÇÃO
A construção do conhecimento sobre o diagnóstico sorológico e controle de qualidade na
imunologia clínica.

PROPÓSITO
Compreender a importância dos testes sorológicos realizados com padrões definidos de
qualidade auxilia na investigação diagnóstica, no acompanhamento do prognóstico de uma
doença e na verificação da eficácia terapêutica garantindo assim resultados confiáveis.

OBJETIVOS
MÓDULO 1

Identificar a importância do diagnóstico sorológico

MÓDULO 2

Descrever os métodos de controle de qualidade

INTRODUÇÃO
Neste tema, exploraremos a importância do diagnóstico sorológico. Inicialmente, vamos
entender por que os métodos de diagnóstico sorológicos são classificados em qualitativos e
quantitativos. Você sabe a diferença entre esses dois tipos de análises? Vamos juntos observar
a importância da sorologia para definir um diagnóstico, a fase clínica e o prognóstico da
doença, a eficiência terapêutica, a seleção de doadores e receptores de sangue e órgãos e
entender mais sobre o conceito de soroconversão. Também será possível entendermos sobre o
diagnóstico coletivo. Você já ouviu falar sobre soroepidemiologia e soroprevalência?

Para que um método diagnóstico sorológico atenda a todos esses aspectos, é necessário
verificar parâmetros diretamente relacionados à eficiência e qualidade dos testes de fornecer
resultados fidedignos. Todos esses parâmetros fazem parte do controle da qualidade em
imunologia.

Você já ouviu falar em sensibilidade, acurácia e especificidade, valor de predileção negativo e

positivo? Sabe o que é um teste com alta sensibilidade e especificidade e sua importância? Já
recebeu um resultado positivo sem estar doente, os famosos “falso positivos”? Sabe o que
significa isso e por que acontece?

Vamos juntos nos próximos módulos conhecer mais acerca desses assuntos!

MÓDULO 1
 Identificar a importância do diagnóstico sorológico

DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO
Os métodos sorológicos são desenvolvidos a partir do reconhecimento antígeno-anticorpo. Os
antígenos são qualquer molécula estranha ao organismo, como fungos, bactérias, vírus e
protozoários, que estimulam a produção de imunoglobulinas.

A ligação do anticorpo ao antígeno é altamente específica e ocorre em um sítio denominado

epítopo. Assim, os testes sorológicos utilizados para detectar a presença de um anticorpo
(anti-X) são desenvolvidos apresentando em sua composição o epítopo do antígeno específico
(X), isso garante que a reação ocorra apenas quando o soro testado apresentar o anticorpo
(anti-X) em investigação. Além de verificar a presença ou a ausência de um determinado
anticorpo, esses testes foram adaptados para detectar um antígeno, a presença de enzimas e
os hormônios.

Os testes sorológicos são uma ferramenta auxiliar para:

IMUNOGLOBULINAS

Popularmente conhecidas como anticorpos, moléculas do sistema imunológico capazes

de eliminar esses antígenos.

Diagnosticar infecções

Avaliar a compatibilidade entre doadores de sangue e de órgãos

Verificar a evolução de uma doença e a soroconversão durante uma imunização ativa

(vacina) ou infecção

Detectar antígenos tumorais

Além disso, contribuem para o diagnóstico de infecções causadas por patógenos difíceis de
visualizar a partir de fluidos biológicos ou alojados em uma estrutura tecidual do hospedeiro.
Assim, não há necessidade de realizar exames mais invasivos, como biopsias, ou utilizar
métodos que necessitem de uma estrutura e profissionais especializados, como os métodos
moleculares. Esses testes são altamente empregados, pois são de fácil execução, apresentam
baixo custo, em alguns casos, há possibilidade de automação e conferem resultados e
diagnóstico rápidos, possibilitando um tratamento imediato.

 SAIBA MAIS

Para a aplicação correta e a interpretação eficiente dos resultados, é necessário que a técnica
seja executada por um profissional bem treinado, a fim de evitar equívocos e intercorrências
nos resultados.

Pode haver uma demora no diagnóstico de algumas doenças, pois é necessário aguardar que
a produção dos anticorpos seja detectável. Em alguns casos, há reações cruzadas, gerando
resultados falso positivos.

REAÇÃO CRUZADA

Alguns anticorpos podem ter habilidade de interagir com mais de um antígeno que
apresentem propriedades químicas similares.

CLASSIFICAÇÃO DOS TESTES

SOROLÓGICOS
Durante a realização dos exames laboratoriais de rotina, é comum encontrar resultados de
sorologia, como a avaliação da presença de anticorpos contra um antígeno apenas como
positivo ou negativo, e outros que, além de classificá-los, vêm com um valor atribuído.

MAS POR QUE ESSA DIFERENÇA?

QUALITATIVO

QUANTITATIVO

VAMOS ENTENDER UM POUCO MAIS ESSAS DIFERENÇAS:

O método qualitativo indica a presença ou ausência de uma resposta, ou seja, apenas
classifica aquela análise como positiva ou negativa, reagente ou não reagente.

Um paciente vai a um consultório médico com suspeita de dengue.

O médico solicita a sorologia e, após a realização do exame, em alguns minutos, o paciente

recebe o seguinte:

Resultado: Teste rápido para a detecção de anticorpos da dengue do tipo IgM: Positivo.



O médico, então, informa ao paciente que ele está com dengue, pois seu resultado detectou,
de modo qualitativo, a presença de anticorpos contra o vírus causador dessa doença. Os
anticorpos da classe IgM são os primeiros a serem produzidos durante uma infecção, e indicam
que o paciente está com a infecção ativa, ou seja, com a doença.

Alguns tipos de testes sorológicos qualitativos são muito utilizados no ambiente laboratorial,
como os testes rápidos para HIV, coronavírus, sífilis, zika, H. pylori, rotavírus, dentre outros.
Esses testes apresentam um resultado rápido e contribuem com um diagnóstico em poucos
minutos (Figura 1).
Fonte: Shutterstock.
 Teste rápido para detecção de anticorpos contra o coronavírus.

 ATENÇÃO

É importante destacar que, nessa metodologia, conseguimos verificar se houve ou não a

positividade do teste, mas não podemos identificar valores mensuráveis.

Quando desejamos que um resultado seja medido, ou seja, tenha um valor quantificado,
devemos utilizar o método quantitativo. Nesse tipo de método, a quantidade de antígenos, ou
anticorpos, pode ser expressa das seguintes maneiras:

• No formato de cruzes (positivo +/++++; ++/++++; +++/++++; ++++/++++, onde 4 “+” indicam o
máximo de positividade do método)

• Titulações (1:2, 1:4, 1:8; 1:16, dentre outros)

• Densidades ópticas de reações colorimétricas

• Unidades de medidas (UI/mL, % e mg/ mL) que apresentem o valor absoluto do analito
 ANALITO

Substância em uma amostra que está sendo investigada.

Voltando ao exemplo anterior:

Se o mesmo paciente fosse realizar o exame para a dengue, mas agora com um teste
quantitativo para detecção de anticorpos, ele receberia o seguinte resultado:

Teste de sorologia para detecção de anticorpos da dengue do tipo IgM igual a 63 UI/mL,
reagente. Valores de referência: IgM > 30: reagente, IgM > 30: Não reagente.



Agora, além de saber que o exame foi positivo (reagente), o médico tem a concentração de
anticorpo (63 UI/mL).

As metodologias quantitativas para o diagnóstico sorológico também possibilitam a

identificação da quantidade de antígenos (Carga viral) presentes ou o título de anticorpos.
Para a determinação da titulação de anticorpos, podemos citar o teste sorológico
VDRL (Veneral Desease Laboratory) , amplamente utilizado nas rotinas laboratoriais para a
detecção da sífilis, doença causada pela bactéria Treponema pallidum.

 ATENÇÃO

Alguns autores classificam a detecção de títulos dos anticorpos pela diluição da amostra como
uma metodologia semiquantitativa. Também é classificado como semiquantitativo o resultado
em cruzes. Nesses métodos, não é possível obter os valores absolutos (reais) de anticorpos.

Nesse teste sorológico VDRL, é detectada a presença de anticorpos não treponêmicos, ou

seja, que não são específicos da bactéria, mas estão presentes durante a doença. O teste de
VDRL nas rotinas laboratoriais é realizado de maneira qualitativa (detecta a presença ou
ausência da doença, como uma triagem) ou quantitativa, que determina o título do anticorpo,
uma ferramenta essencial para acompanhar a eficiência do tratamento. No VDRL quantitativo,
a presença de floculação a partir da diluição 1:4 indica que a doença está ativa.
 SAIBA MAIS

A titulação é mensurada através de diluição seriada, ou seja, o soro do paciente em análise é

diluído diversas vezes (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64....) e é verificado até que na diluição
ocorre a reação. O título do anticorpo é dado pela última diluição que apresentou reação, no
caso específico do VDRL onde teve a floculação. Quanto maior for a diluição em que
observamos reação (soros mais diluídos), maior a quantidade de anticorpos, ou seja, o título.

Como exemplo de testes diagnósticos quantitativos, destaca-se o VDRL quantitativo, os

ensaios imunocromatográficos, a imunofluorescência e o ELISA (Ensaio de imunoabsorção
enzimática) para detecção de anticorpos IgM e IgG de diferentes tipos de vírus e detecção de
antígenos (Figura 2).

A determinação do tipo de método qualitativo ou quantitativo deve estar alinhado com a clínica
do paciente, pois, dependendo do interesse médico, é necessário apenas descobrir a presença
de um anticorpo para o diagnóstico e tratamento rápido. Nesses casos, é utilizada uma
metodologia qualitativa.

Em outras situações, é importante acompanhar o título (quantidade) de anticorpos ou a carga

viral para verificar se o tratamento está sendo eficaz, para isso, é utilizada uma metodologia
quantitativa. Por essa razão, é fundamental conhecer os diferentes tipos de métodos para
definir o melhor teste a ser utilizado em cada caso.

Fonte: Shutterstock.
 Figura 2: ELISA.

IMPORTÂNCIA DO DIAGNÓSTICO
INDIVIDUAL
Como mencionado anteriormente, os métodos sorológicos na pesquisa de anticorpos, ou
antígenos, são amplamente empregados para tentar conhecer o agente causador de uma
infecção, auxiliando no diagnóstico de uma suspeita clínica principal. Assim, durante uma
avaliação, a sintomatologia apresentada pelo paciente indica algumas suspeitas diagnósticas,
a partir desse resultado, o médico pode chegar a uma conclusão e iniciar o tratamento. É
importante ressaltar que os indivíduos podem ter respostas diferentes frente ao mesmo invasor,
variando a sintomatologia, o perfil e a quantidade de anticorpos produzidos. Um exemplo dessa
situação é a infecção pelo novo coronavírus, que apresenta pacientes sintomáticos (Com
sintomas) leves, graves, com perfis e quantidade de produção de anticorpos diferentes. Além
disso, esses exames ajudam a entender os processos patológicos com sinais e sintomas
clínicos confundíveis.

Fonte: Shutterstock.
 EXEMPLO

A partir de um exame sorológico de um paciente com quadro de arbovirose, podemos

identificar se ele tem dengue, Zika ou Chikungunya. A identificação dessa doença não muda o
tipo de tratamento, no entanto, sua notificação compulsória ajuda a traçar o perfil
epidemiológico e contribui para ações de controle do vetor, buscando diminuir o número de
casos.

ARBOVIROSE

Doenças causadas pelos arbovírus que são transmitidos por artrópodes (mosquitos) que
causam febre, dor de cabeça, mal estar, dor nas articulações, manchas vermelhas e
erupção na pele, náuseas e vômitos.

Esses exames também contribuem:

• Na diferenciação da fase de uma doença

• Na avaliação de prognóstico e eficácia terapêutica

• Na definição e seleção de doadores de órgãos e sangue

• Na investigação da imunidade contra um antígeno específico após o contato ou uma

campanha de vacinação

Assim, conseguimos perceber como um exame sorológico é capaz de auxiliar coletivamente,

gerando dados epidemiológicos e, individualmente, contribuindo no diagnóstico e tratamento de
um paciente. Vamos agora detalhar alguns pontos importantes dos testes sorológicos quando
estudamos o indivíduo e o coletivo.

PROCESSO DE SOROCONVERSÃO

A soroconversão é o termo dado para indicar que um organismo produziu anticorpos após o
contato com um antígeno. Durante uma resposta imunológica, o contato com um antígeno
geralmente induz a produção de anticorpos, mas a detecção destes pelos métodos sorológicos
disponíveis pode demorar semanas ou até meses. O período entre a produção e a detecção
dos anticorpos pelos métodos é chamado de janela imunológica, janela sorológica ou
janela de soroconversão. Nesse intervalo, mesmo que um paciente esteja infectado, a
pesquisa de anticorpos será negativa.

Vamos a um exemplo?

Na infecção pelo novo coronavírus, causado pelo vírus SARS-COV2, a produção de anticorpos
do tipo IgM, pelos testes sorológicos de ELISA ou testes rápidos, normalmente, é detectada a
partir de 7 dias do início dos sintomas. Um paciente com sintomas ao realizar o exame
sorológico antes desse período terá um resultado negativo, ou seja, falso negativo.

Durante a investigação diagnóstica, um paciente sintomático ou assintomático para

determinada doença, pode apresentar níveis de anticorpos detectáveis (Soropositividade) , ou
não detectáveis (Soronegatividade) . Dizemos que houve um processo de soroconversão
quando o resultado de um primeiro teste sorológico para a detecção de anticorpos contra um
antígeno hipotético X for negativo e o de um segundo exame, feito algum tempo depois, for
positivo.

A soroconversão nos pacientes com HIV é um exemplo clássico. Durante muito tempo, a
enorme janela imunológica e o tempo para o aparecimento dos sintomas contribuíram
diretamente para o aumento da disseminação do vírus no mundo, contaminando pessoas que
recebiam transplantes e transfusões sanguíneas. Havia ainda um atraso no início do
tratamento dos contaminados, os quais não sabiam que estavam doentes. Nessa época, a
janela imunológica era de 6 meses.

Vamos agora entender por que isso acontece:


Após a infecção pelo HIV, ocorre intensa replicação viral. Nas primeiras 3 semanas, fase em
que ocorre a disseminação do vírus pelo corpo com contaminação dos órgãos linfoides, podem
aparecer sintomas relacionados a uma síndrome retroviral aguda, como: febre, adenopatia,
faringite, mialgia, exantema, náuseas, vômitos, sudorese, dentre outros, sintomas caraterísticos
de uma gripe.

Em seguida, ocorre a fase de latência, que pode durar semanas, meses ou anos. Nessa fase, o
exame clínico e laboratorial passa a ser normal e a pessoa não tem mais sintomas.


Com o passar dos anos, à medida que a infecção progride e os sintomas passam a ser mais
frequentes, começam a surgir as infecções oportunistas. É apenas nessa fase que o paciente
percebe que está infectado.

Entenda melhor esse processo no gráfico:

Fonte: Wikipedia.

O organismo começa a produzir anticorpos anti-HIV entre 30-60 dias após a infecção. Os
primeiros testes sorológicos desenvolvidos para confirmação sorológica do HIV (primeira
geração) apenas conseguiam detectar a presença dos anticorpos anti-HIV após 6 meses da
infecção. Nos dias atuais, a confirmação sorológica depende do tipo de imunoensaio utilizado.
Os ensaios de ELISA (de quarta geração) mais modernos são capazes de detectar a
presença de antígenos e anticorpos ao mesmo tempo, a janela imunológica é de
aproximadamente 15 dias. Na figura a seguir, podemos perceber a evolução na concentração
plasmática dos marcadores da infecção pelo HIV. O anticorpo IgM apresenta um pico após 4
semanas da infecção (30 dias), diferente do RNA viral, que é visto nas primeiras semanas e
pode ser detectado através de técnicas moleculares.

QUARTA GERAÇÃO

Ensaios que detectam anticorpos contra o antígeno p24 e antígenos (proteínas) do HIV-1
(como as proteínas gp160, gp120 e gp41), antígenos do grupo O e antígenos de HIV-2.
Fonte: CONICTEC, 2017.
 Figura 4: Marcadores sanguíneos da infecção do HIV.

FASE CLÍNICA E PROGNÓSTICO DA DOENÇA

A doença pode apresentar diferentes fases e graus de acometimento, desde manifestações

leves ou até mesmo graves, e pode evoluir para cura ou cronicidade (Figura 5).

Fonte: O autor.
 Figura 5: Fases da doença.

VOCÊ IMAGINA COMO O DIAGNÓSTICO

SOROLÓGICO É IMPORTANTE PARA A
COMPREENSÃO DA FASE CLÍNICA DA
DOENÇA?

Como já apreendemos, a detecção de um anticorpo durante uma análise imunológica indica

que o indivíduo está ou esteve exposto anteriormente a um antígeno. Em nosso organismo,
ocorre a produção de diferentes tipos de imunoglobulinas (IgG, IgE, IgA, IgM e IgD), ou
“anticorpos”, e cada uma delas está envolvida em um tipo de resposta imunológica (Figura 6).

Fonte: Shutterstock.
 Figura 6: Tipos de imunoglobulinas produzidas pelo organismo.

Na maioria das infecções, a imunoglobulina IgM é a primeira a ser produzida após um estímulo
imunogênico, aumentando significativamente seus níveis plasmáticos durante a fase aguda da
doença. Normalmente, a detecção de IgM na corrente sanguínea é um indicativo de infecção
recente, mas essa imunoglobulina pode permanecer de 3-6 meses no organismo. Ao longo da
infecção e do prognóstico da doença (sua evolução), temos a diminuição da concentração
plasmática de IgM e o aumento da produção e detecção da imunoglobulina do tipo IgG. A IgG
é, normalmente, encontrada no final de um processo agudo, permanecendo com níveis
plasmáticos elevados durante longos períodos na fase denominada crônica e após a cura da
doença. Essa imunoglobulina é associada à memória imunológica e pode permanecer elevada
durante a vida toda (Figura 7).

Fonte: O autor.
 Figura 7: Esquema do aparecimento das imunoglobulinas e do tipo de infecção.
A dosagem dessas imunoglobulinas (IgM e IgG) é de suma importância para identificar a fase
da doença. Se um paciente apresenta um IgM positivo para o coronavírus com IgG negativo,
então, encontra-se na fase aguda da doença, ou seja, a fase altamente transmissível,
necessitando ficar em isolamento social.

Um termo amplamente utilizado no diagnóstico laboratorial é marcador sorológico. Nos exames

sorológicos, os anticorpos ou antígenos detectados que possibilitam o diagnóstico de uma
patologia ou infecção são chamados de marcadores sorológicos. Na sorologia para dengue,
são utilizados alguns marcadores sorológicos: os anticorpos IgM e IgG e a identificação
precoce de um antígeno NS1, que corresponde a uma proteína não estrutural do vírus e está
presente nos 4 sorotipos diferentes do vírus (Figura 8).

Fonte: Shutterstock.
 Figura 8: Teste rápido negativo para a detecção de IgM e IgG e da proteína não estrutural
NS1 da dengue. Não vemos a reação (aparecimento de linhas vermelhas) na região G, M
(cassete da direita) e T (cassete da esquerda).

NOS PEDIDOS DE EXAMES LABORATORIAIS, É

COMUM ENCONTRARMOS A PESQUISA DE
ANTICORPOS DO TIPO IGM E IGG. PORÉM, EM
ALGUNS CASOS, ELES PODEM NÃO SER
DETECTADOS, SENDO NECESSÁRIA A PESQUISA DE
OUTRAS IMUNOGLOBULINAS (IG) COMO É O CASO
DE IGA E IGE. ESSAS IMUNOGLOBULINAS POSSUEM
VIDA MÉDIA NA CIRCULAÇÃO MENOR DO QUE O IGM
E MELHOR DETECÇÃO EM INFECÇÕES POR
PROTOZOÁRIOS E HELMINTOS. NO DIAGNÓSTICO DE
TOXOPLASMA GONDII (UM PROTOZOÁRIO), QUE É
REALIZADO POR MÉTODOS SOROLÓGICOS , UM
RESULTADO DE IGM POSITIVO OU NEGATIVO NÃO
AFASTA A POSSIBILIDADE DE A DOENÇA ESTAR NA
FASE AGUDA. NESSA INFECÇÃO, A DOSAGEM DO
IGA É UM MELHOR MARCADOR DE FASE AGUDA DO
QUE O IGM, POIS ESSA IMUNOGLOBULINA PERSISTE
ELEVADA NA CORRENTE SANGUÍNEA POR NO
MÍNIMO 26 DIAS. A IGA ESTÁ PRESENTE NO SANGUE,
NAS SECREÇÕES DO TRATO GASTROINTESTINAL E
RESPIRATÓRIO, NA SALIVA E NAS LÁGRIMAS.

O estudo do prognóstico de uma doença e avaliação dos marcadores sorológicos permite

conhecer algumas variáveis que são fundamentais para entender a ação de um agente
infeccioso sobre uma população. Vamos conhecê-las? (Quadro 1):

Sobrevida Quantidade de pacientes que sobrevivem à doença

Letalidade Quantidade de pacientes que vêm a óbito em uma população

Mortalidade/doença É a análise dos marcadores sorológicos de uma doença e o

específica percentual de óbitos causados por ela
 Remissão Fase da doença em que não são encontrados sintomas
clínicos, porém não é possível afirmar a cura do paciente, pois
ainda são detectados marcadores sorológicos

Doença que, a princípio, estava curada, mas depois de um

Recorrência tempo, os sinais e sintomas clínicos e os marcadores
sorológicos reaparecem

Atenção! Para visualizaçãocompleta da tabela utilize a rolagem horizontal

 Quadro 1: Prognóstico da doença e avaliação de marcadores. Fonte: O autor.

A análise do prognóstico de cada doença também possibilita realizar estudos populacionais

para verificar o desenvolvimento e o tempo de aparecimento dos sintomas de uma determinada
doença. Para isso, os pacientes são analisados por um mesmo período, iniciado a partir de um
ponto chamado de tempo zero.

EFICÁCIA TERAPÊUTICA

Os marcadores sorológicos possibilitam avaliar a eficácia terapêutica. Do ponto de vista

imunológico, a eficácia terapêutica é a eficiência na produção de anticorpos protetores após
uma infecção ou vacinação (imunização ativa, quando é oferecido ao organismo um vírus
morto, ou atenuado, para estimular a produção de anticorpos do tipo IgG de memória) (Figura
9).
Fonte: OMS.
 Figura 9: Gráfico demonstrando a eficiência da vacinação com a diminuindo os casos de
tétano entre 1980-2020.

Podemos analisar se um paciente está curado pela ausência dos sintomas e pela presença de
níveis séricos de IgG e níveis não detectáveis de IgM.

Também podemos avaliar se o tratamento empregado no combate da infecção é eficaz, como é

realizado no exame quantitativo de VDRL, no qual a queda do título de anticorpos produzidos
em contato com a bactéria indica que o tratamento está funcionando.

Além disso, podemos verificar se uma vacina foi eficaz pela dosagem de anticorpos IgG depois
de pelo menos 1 mês da vacinação ou após anos, avaliando a necessidade de uma segunda
dose.

Os estudos clínicos para a liberação da vacina, normalmente, refazem a sorologia dos

participantes de pesquisa após 10 anos do primeiro esquema de vacinação para verificar se os
indivíduos permanecem protegidos ao longo desses anos e se é necessária uma nova dose.

 ATENÇÃO

Durante o pré-natal, as mulheres são submetidas a diferentes exames sorológicos, realizando

a dosagem de IgM e IgG para a rubéola, toxoplasmose, hepatite B, sífilis e tétano. A partir
desses exames, é possível avaliar se a gestante está protegida, pois apresenta a memória
imunológica (detecta IgG), ou se contraiu alguma doença durante a gestação, pela detecção do
IgM.
É importante lembrar que doenças como rubéola, toxoplasmose e sífilis podem ainda causar
doenças congênitas e problemas graves aos recém-natos, além de levarem a malformações e
ao óbito da criança, principalmente, quando contraídas no primeiro trimestre da gestação.

DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO NA SELEÇÃO DE

DOADORES E RECEPTORES DE SANGUE E
ÓRGÃOS

Os diagnósticos sorológicos são bastante utilizados para estabelecer a seleção entre doadores
e receptores de sangue e órgãos. O transplante é a substituição de um órgão ou tecido com
alterações irreversíveis que são comprometedoras para a vida. A transfusão de sangue
consiste na administração de componentes sanguíneos de um doador (hemácia, plasma,
plaquetas, crioprecipitados) em um paciente. Para saber se uma pessoa pode ser
transplantada ou transfundida, são realizados exames sorológicos para detecção de doenças
infectocontagiosas e a prova de compatibilidade, que pesquisa da presença de antígenos do
doador que interagem com anticorpos do receptor. Os doadores e receptores de órgãos
precisam apresentar características biológicas similares, buscando a diminuição ou
neutralização da rejeição do órgão/tecido transplantado. Os antígenos responsáveis pela
rejeição dos transplantes são denominados aloantígenos, que são conhecidos como antígenos
de histocompatibilidade e se dividem em:
Fonte: Shutterstock.

DOENÇAS INFECTOCONTAGIOSAS

São preconizadas pelo Ministério da Saúde as triagens clínica, epidemiológica e

sorológica, que incluem doenças como: Chagas, sífilis, hepatites virais, AIDS, HTLV, e
malária em regiões endêmicas. São incluídas também avaliação laboratorial para sepse
bacteriana ou fúngica.

Fonte: O autor.
 Figura 10: Complexo de Histocompatibilidade principal (MHC), responsável pela
apresentação de antígenos as células T. Os genes do sistema de antígenos leucocitários
humanos (HLA, human leukocyte antigen) codificam as principais moléculas encarregadas da
apresentação do antígeno na superfície celular que se encontra em uma região genômica
chamada de MHC. Embora esses genes sejam conhecidos como HLA, muitos autores usam
MHC para designar as moléculas resultantes da expressão desses genes. Fonte: O autor.

Vamos conhecer os principais tipos de rejeição a enxertos?

REJEIÇÃO HIPERAGUDA
REJEIÇÃO AGUDA
REJEIÇÃO CRÔNICA

REJEIÇÃO HIPERAGUDA

Ocorre minutos ou dias após o transplante, é causada pela ação de anticorpos IgM contra
antígenos do sistema ABO, HLA ou antígenos expressos no endotélio vascular.

REJEIÇÃO AGUDA

Ocorre poucos dias ou semanas após o transplante, é mediada pelas células T e pelos
anticorpos que respondem especialmente ao MHC.

REJEIÇÃO CRÔNICA

Ocorre seis meses a um ano após o transplante através da imunidade celular e humoral
adquirida, que cria respostas contra o enxerto.

Agora vamos conhecer a aplicabilidade dos testes imunológicos realizados na seleção de

doadores e receptores de sangue e órgãos (Quadro 2)?

Tipagem
sanguínea Teste utilizado para identificar tipo sanguíneo e fator Rh
(ABO)
 Reatividade Método utilizado para avaliar status imunológico do paciente,
contra painel detecção de moléculas HLA reconhecida pelo paciente
(PRA)

Teste que verifica se o sangue do doador apresenta

Prova cruzada
incompatibilidade com o receptor

Tipagem de
Detecta compatibilidade entre o HLA do doador e do receptor
tecidos

Atenção! Para visualizaçãocompleta da tabela utilize a rolagem horizontal

 Quadro 2: Aplicabilidade dos testes imunológicos na seleção de doadores e receptores de

sangue e órgãos. Fonte: O autor.

DIAGNÓSTICO COLETIVO

Os exames sorológicos, quando aplicados ao coletivo, permitem analisar a situação

imunológica em uma população e geram dados epidemiológicos importantes, pois avaliam a
população em meio a infecções endêmicas, como dengue, zika, HIV, sífilis, dentre outros. A
avaliação coletiva é importante em grandes surtos, pois possibilita uma fotografia do panorama
da infecção na população e auxilia no acompanhamento, desenvolvimento de medidas de
saúde pública, políticas e socioeconômica de combate ao surto.

Em 11 de março de 2020, a organização mundial da saúde (OMS) declarou a infecção pelo

novo coronavírus como uma pandemia após milhares de pessoas serem infectadas por esse
vírus no mundo. A partir de então, alguns países realizaram testagem sorológica em massa,
conseguindo triar os pacientes sintomáticos e assintomáticos, isolando os casos positivos para
evitar novas contaminações. Nesses países, verificou-se uma diminuição no número de óbitos
por covid-19.
Fonte: Shutterstock.

Existem dois importantes termos relacionados ao diagnóstico coletivo: soroprevalência e

soroepidemiologia. Vamos conhecer mais sobre eles?

SOROPREVALÊNCIA
Refere-se ao número de pessoas que apresentam anticorpos detectáveis contra um agente
infeccioso, ou seja, a reação de soropositividade desenvolvida a partir da soroconversão.

SOROEPIDEMIOLOGIA
Acompanha os pacientes, através dos exames de diagnóstico, que apresentaram marcadores
sorológicos (anticorpos) contra algum microrganismo, associando esses dados aos fatores
sociais, ambientais e econômicos; assim, é possível estudar as melhores estratégias para a
saúde pública da população.
IMPORTÂNCIA DO DIAGNÓSTICO DE IGM E
IGG NA INFECÇÃO POR COVID-19

VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. ESTUDAMOS QUE UMA DAS APLICABILIDADES DO DIAGNÓSTICO
SOROLÓGICO É DETECTAR A PRESENÇA DE ANTÍGENO OU
ANTICORPOS DURANTE UM PROCESSO INFECCIOSO DE MANEIRA
QUALITATIVA E QUANTITATIVA. COM RELAÇÃO A ESSAS ANÁLISES,
ASSINALE A ALTERNATIVA CORRETA:

A) A análise qualitativa é utilizada para verificar a concentração de um antígeno.

B) A análise quantitativa detecta apenas presença ou ausência de antígenos.

C) A análise quantitativa é capaz de verificar a concentração de um antígeno.

D) As análises quantitativas e qualitativas de antígenos são a mesma coisa, visto que ambas
definem um teste sorológico.

2. APREENDEMOS A IMPORTÂNCIA DO DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO

COLETIVO NA AVALIAÇÃO DO PANORAMA DE UMA POPULAÇÃO
DURANTE O SURTO DE UM VÍRUS. COM RELAÇÃO AO DIAGNÓSTICO
COLETIVO, ASSINALE A ALTERNATIVA CORRETA:

A) A soroprevalência indica a incidência de pessoas que apresentam antígenos detectáveis

contra um antígeno infeccioso.

B) A soroprevalência indica a prevalência de pessoas que apresentam antígenos detectáveis

contra um agente infeccioso.

C) A soroepidemiologia indica a indica a prevalência de pessoas que apresentam um marcador

sorológico naquela população.

D) A soroconversão indica a prevalência de pessoas que apresentam um marcador sorológico

naquela população.

GABARITO

1. Estudamos que uma das aplicabilidades do diagnóstico sorológico é detectar a

presença de antígeno ou anticorpos durante um processo infeccioso de maneira
qualitativa e quantitativa. Com relação a essas análises, assinale a alternativa correta:

A alternativa "C " está correta.

Somente a análise quantitativa é capaz de mensurar valores, podendo ser obtidos resultados
em percentuais e concentrações plasmáticas. Na análise qualitativa, teremos os resultados
classificados como positivo e negativo, ou seja, presente ou ausente.

2. Apreendemos a importância do diagnóstico sorológico coletivo na avaliação do

panorama de uma população durante o surto de um vírus. Com relação ao diagnóstico
coletivo, assinale a alternativa correta:

A alternativa "B " está correta.

Soroprevalência - refere-se ao número de pessoas que apresentam anticorpos detectáveis

contra um agente infeccioso, ou seja, a reação de soropositividade desenvolvida a partir da
soroconversão. Soroepidemiologia - acompanha os pacientes, através dos exames de
diagnóstico, que apresentaram marcadores sorológicos (anticorpos) contra algum
microrganismo, associando esses dados aos fatores sociais, ambientais e econômicos; assim,
é possível estudar as melhores estratégias para a saúde pública da população.

MÓDULO 2

 Descrever os métodos de controle de qualidade

Como aprendemos, os métodos imunológicos são essenciais para auxiliar no diagnóstico de

doenças infecciosas, acompanhar sua evolução e a eficiência terapêutica. Durante a rotina
laboratorial, é essencial que os soros dos pacientes sejam armazenados, para garantir que, em
casos de resultados duvidosos, seja realizada uma nova testagem. Além disso, para realização
desses testes, faz-se necessário avaliar uma série de parâmetros e controles para garantir que
o resultado encontrado seja verdadeiro, seja de qualidade e expresse a realidade do indivíduo,
diminuindo as chances de resultados e diagnósticos falhos. Para isso, durante a padronização
de um teste sorológico, são analisados diferentes parâmetros (reprodutibilidade, acurácia,
sensibilidade, especificidade, eficiência, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e razão
de verossimilhança) que controlam a qualidade do resultado que é fornecido pelo teste. Agora,
conheceremos os principais aspectos em laboratório de imunologia que garantam um controle
da qualidade das análises e uma padronização dos métodos. Vamos lá?
Fonte: Shutterstock.

BANCO DE SOROS

Fonte: Shutterstock.
Nos laboratórios de imunologia, recebemos diversas amostras de soros de pacientes para
testagem sorológica. Buscando melhores maneiras de organizar e armazenar esses soros, seja
para uma possível retestagem, seja devido ao seu potencial terapêutico (medicamento), eles
são guardados em um banco, uma espécie de biblioteca, também conhecida como sorotecas.
Essa organização também facilita o rápido levantamento dos soros testados em uma rotina
laboratorial. Esses bancos são importantes porque garantem a rastreabilidade dos resultados
encontrados, ou seja, possibilitam que uma análise seja repetida para a confirmação do
resultado encontrado.

 ATENÇÃO

As bibliotecas (coleção catalogada de soros) também são utilizadas para armazenar amostras
representativas de uma população e assim preservar as características imunológicas. Quando
os soros são armazenados com essa finalidade, é necessário a permissão do comitê de ética.

Normalmente, esses soros são separados pelo tipo de análise, ou seja, pelo tipo de agente
infeccioso que se deseja investigar. Os tubos armazenados apresentam a identificação do
paciente (nome completo ou iniciais e/ou o número do exame laboratorial), data da coleta da
amostra e tipo de microrganismos investigados. Essas amostras então são acondicionadas em
tubos por um período de 5 a 10 anos e mantidas em congelamento (-20 °C) até serem
utilizadas e/ou descartadas futuramente.

No caso de um laboratório de pesquisa, esses soros ficam separados de acordo com suas
similaridades e podem ser importantes para estudos futuros, devendo ficar armazenados a
uma temperatura de -80 °C.

Segundo a Resolução da diretoria colegiada (RDC N°34/ 2014), os bancos de sangue devem
armazenar a plasmateca, ou soroteca, dos doadores por pelo menos 6 meses na temperatura
de -20 °C. No entanto, em alguns banco de sangues, esse armazenamento é feito por mais de
5 anos. Esse armazenamento é muito importante, pois, caso um paciente receba um
componente sanguíneo negativo para todas as doenças infectocontagiosas e, depois de alguns
meses da transfusão, apresente exame sorológico positivo para HIV, por exemplo, o doador
deverá ser encontrado e novos exames deverão ser realizados com o soro armazenado na
plasmateca e com a amostra atual, a fim de verificar se a contaminação foi através da
transfusão. Além disso, durante o processamento do sangue após a doação, caso haja
qualquer dúvida nos resultados sorológicos, podem ser utilizadas amostras de soro
armazenadas para novas testagens.
Fonte: Shutterstock.

AVALIAÇÃO DOS MÉTODOS

SOROLÓGICOS
A avaliação do desempenho dos testes sorológicos depende da ausência de desvios na
análise (validade ou acurácia do método) e da precisão dos resultados. Desse modo, os
métodos de diagnósticos têm que ser avaliados quanto à reprodutibilidade e à acurácia.

REPRODUTIBILIDADE
A reprodutibilidade representa a capacidade dos métodos de produzir resultados iguais,
mesmo em condições distintas de análises, sendo precisos e confiáveis. Um teste sorológico é
de alta reprodutibilidade quando, após análises repetidas em uma mesma amostra ou
amostras provenientes de um mesmo paciente, são encontrados resultados similares.

De modo diferente, durante a avaliação de um método, se este não apresentar

reprodutibilidade de resultados, que pode ser devido a um erro aleatório (ao acaso), seu
valor e sua utilidade para implementação como teste de diagnóstico são mínimos. Os
erros aleatórios são inerentes ao observador e às variações entre os sujeitos. Vamos
agora conhecer melhor os erros aleatórios (ao acaso):
• Variação entre os sujeitos individualmente: A verificação de uma determinada análise
em um mesmo indivíduo pode variar ao longo dia, dependendo da condição em que é
medida, resultando em resultados distintos. Exemplo: Depois de uma atividade física, a
pressão arterial será diferente da medida quando o paciente está em repouso.

• Variação na interpretação de um mesmo exame realizado em momentos diferentes.

Exemplo: Ao realizar a leitura de uma lâmina em dois momentos diferentes, podemos
encontrar resultados diversos.

• Variação na interpretação entre dois técnicos, ou seja, dois observadores podem

interpretar um resultado de modo diferente.

ACURÁCIA
A acurácia (Validade ou exatidão) de um método é a sua capacidade de fornecer resultados
verdadeiros, ou seja, quanto aquele método é útil para predizer ou diagnosticar um evento que
se propôs de maneira qualitativa ou quantitativa. Para determinar a acurácia de um método,
devemos comparar o resultado do teste com os resultados de um padrão, que pode ser a
clínica do paciente, exames disponíveis ou um ensaio que possa servir como referência
(considerado padrão-ouro).

NÃO PODEMOS CONFUNDIR ACURÁCIA (EXATIDÃO)

DE UM TESTE COM
REPRODUTIBILIDADE (PRECISÃO) . A PRECISÃO
INDICA A REPRODUTIBILIDADE DE UM MÉTODO; JÁ A
EXATIDÃO APONTA O QUANTO ESSE MÉTODO
APRESENTA RESULTADOS VERDADEIROS (FIGURA
12).
Fonte: http://calibraend.blogspot.com/2013/02/voce-conhece-diferenca-entre-precisao-e.html
 Figura 12: Resultados de um método esperado relacionado à exatidão e à precisão.

Durante a validação de um teste rápido novo para a detecção de anticorpos para a dengue do
tipo IgM e IgG, devemos, além de realizar o teste sorológico, compará-lo com o padrão-ouro
preconizado, que seria a detecção de antígenos virais (NS1) observados logo no início da
infecção, ou então compará-lo com o resultado de um exame sorológico já validado, verificando
a acurácia e a reprodutibilidade do teste novo com o padrão. No caso da dengue, um teste
rápido para identificar o antígeno NS1 pode ser comparado com a detecção molecular da
partícula viral.

Você sabe como funciona um teste rápido? Vamos entender?

O teste rápido é um ensaio imunocromático qualitativo que detecta anticorpos.

Uma amostra é depositada em uma área pré-determinada, que está impregnada com um
anticorpo (A) complexado ao ouro coloidal. A presença do antígeno na amostra possibilita a
ligação com o anticorpo complexado ao ouro (A) e posterior migração por capilaridade pela fita
teste de nitrocelulose.


Ao migrar, o anticorpo A vai se complexar, tanto com o anticorpo B (reconhece o antígeno),
quanto com o anticorpo C (reconhece o anticorpo A), gerando uma cor e formando assim 2
bandas coloridas (teste positivo).


Caso não haja o antígeno na amostra, não teremos a ligação de nenhum antígeno com os
anticorpos A e B, mas teremos a ligação do anticorpo A com o anticorpo C, resultando em
apenas 1 banda (resultado negativo).

Fonte: Wikimedia.
 Figura 13: Desenho esquematizando um teste rápido para a detecção de anticorpos do tipo
IgG.

AGORA, COMO VAMOS ESCOLHER O TESTE

SOROLÓGICO CONSIDERADO IDEAL PARA UMA
ANÁLISE?

O teste sorológico ideal deve fornecer a resposta correta, ser rápido, seguro, simples, inócuo,
confiável e de baixo custo. Os resultados possíveis encontrados durante uma validação de um
novo teste são:

RESULTADOS VERDADEIRAMENTE POSITIVO

RESULTADOS FALSO POSITIVO
RESULTADOS VERDADEIRAMENTE NEGATIVO
RESULTADOS FALSO NEGATIVO
Quando não há dúvida da positividade do teste

Quando o teste é positivo, mas o paciente não apresenta a infecção

Quando não há dúvida da negatividade do teste

Quando, apesar de o teste ser negativo, o paciente apresenta infecção

Assim, durante a validação de um novo teste sorológico, podemos relacioná-lo ao teste

considerado padrão-ouro (Quadro 3).

Fonte: UFG.
 Quadro 3: Resultados esperados durante a validação de testes sorológicos novos em
comparação a um teste de referência (padrão-ouro).

A partir dos resultados encontrados para a determinação da acurácia, podemos calcular alguns
parâmetros para avaliar o desempenho do método. Vamos conhecê-los?

EFICIÊNCIA DO TESTE
Capacidade do teste detectar os pacientes que apresentam ou não a doença, ou seja, quantos
indivíduos são verdadeiramente positivos e negativos dentro de uma população total. Mede
quanto o teste apresenta resultados fidedignos.

SENSIBILIDADE
Indica quanto um teste consegue determinar em um grupo de indivíduos aqueles que
realmente se encontram verdadeiramente positivos.
OS CASOS COM RESULTADO FALSO NEGATIVO SÃO
INTERPRETADOS COMO UMA FALHA NA
SENSIBILIDADE DO ENSAIO. UM TESTE ALTAMENTE
SENSÍVEL, DIFICILMENTE, DEIXA DE ENCONTRAR
PESSOAS DOENTES E, POR ISSO, É USADO PARA A
TRIAGEM DE UMA DOENÇA NAS ROTINAS
LABORATORIAIS.

ESPECIFICIDADE
Indica quanto o teste consegue determinar em um grupo de indivíduos aqueles que não estão
doentes, os verdadeiramente negativos.

QUANTO MAIOR A ESPECIFICIDADE, MENOR A TAXA

DE FALSO POSITIVO, E MENOS PESSOAS ESTARÃO
EXPOSTAS A TRATAMENTOS INDEVIDOS. UM TESTE
ALTAMENTE ESPECÍFICO, DIFICILMENTE,
CLASSIFICARÁ INDIVÍDUOS SADIOS COMO DOENTES,
POR ISSO, É USADO NOS TESTES CONFIRMATÓRIOS
DE UMA DOENÇA.

Vamos entender melhor com um exemplo:

 EXEMPLO
Na rotina de um laboratório, a triagem sorológica para HIV é realizada a partir de exames com
alta sensibilidade (ELISA) . Todos os exames positivos são confirmados com testes altamente
específicos, como o Western blot.

WESTERN BLOT

Técnica que detecta proteínas em amostras após a eletroforese, transferência para uma
membrana de nitrocelulose, e o reconhecimento do antígeno e do anticorpo.

Outro exemplo que podemos citar:

Um exame sorológico para verificar a presença de anticorpos IgM contra o COVID-19 foi
realizado em 1000 indivíduos, onde foram detectados 100 testes positivos e 900 negativos.

POSSIBILIDADE 1
Digamos que um teste apresente sensibilidade de 80% e foram encontradas 100 pessoas
positivas. Concluímos dos 100 pacientes positivos, 80 são de fato positivos e 20 são falso
negativos, ou seja, estão doentes e não são detectados no exame.


POSSIBILIDADE 2
Digamos que um teste apresente 80% de especificidade e encontre 900 pacientes não
infectados. Concluímos que, dos 900 pacientes, 720 são negativos e 180 são falso positivos,
ou seja, são positivos no teste, mas não estão infectados.

Um teste de diagnóstico ideal deve ter alta sensibilidade (evitar falso negativo) e alta
especificidade (evitar resultados falso positivo). Os problemas encontrados durante a avaliação
da sensibilidade ou especificidade de um teste estão relacionados a erros sistemáticos
inerentes aos métodos. Os erros sistemáticos podem ser:

PRÉ-ANALÍTICOS
Correspondem a toda fase anterior à análise e à chegada ao laboratório. Exemplos: problemas
na coleta, no transporte, no armazenamento, na conservação e nas características da amostra
(hemólise, lipídico, contaminado).

ANALÍTICOS
Correspondem à análise em si, a erros de pipetagem, nos equipamentos (manutenção e
calibração), nos reagentes disponíveis (validade, contaminação, diluição).

PÓS-ANALÍTICOS
Correspondem a erros na interpretação dos resultados. Exemplo: erros de cálculos,
interpretação e transcrição.

Agora que já conhecemos a sensibilidade e a especificidade de um teste e vimos que esses

parâmetros estão relacionados apenas com o teste, vamos pensar em uma outra situação:

Após receber um exame com um diagnóstico que mostre um determinado marcador sorológico
positivo ou negativo, como saber se o paciente está doente ou sadio? Esse parâmetro é
avaliado pelos valores de predição (VP), que indicam a probabilidade de um determinado
paciente que apresentar diagnóstico positivo ou negativo esteja verdadeiramente doente ou
sadio. O VP é dividido em valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN) .

Fonte: Shutterstock.

Valor preditivo positivo (VPP)

É a probabilidade de um paciente com uma testagem positiva ter efetivamente a doença. Esse
parâmetro é baseado na prevalência (número de casos totais existentes em uma população
por um determinado espaço de tempo) da doença na amostra estudada e na especificidade do
teste. Quantificará a proporção de positivos que efetivamente tem a doença.

Exemplo: um método que apresenta VPP de 80% indica que, a cada 10 testes positivos, 8 são
de pacientes infectados.

Fonte: Shutterstock.

Valor preditivo negativo (VPN)

Quantifica a probabilidade de um resultado “verdadeiro negativo”. Esse parâmetro é baseado

na prevalência da doença na amostra estudada, verificando a quantidade de sadios com um
teste negativo.

Exemplo: um método com VPN de 80% indica que, a cada 10 testes negativos, 8 são de
pacientes sadios.

Vamos agora a um exemplo prático para a determinação

do valor preditivo negativo e positivo:

Um teste foi realizado em 500 pessoas. O resultado foi negativo para 225 indivíduos, dentre os
quais, 200 estavam de fato saudáveis e 25 doentes.
O resultado foi positivo para 275 pessoas, dentre elas, 210 estavam realmente doentes e
outras 55 estavam saudáveis. Qual o valor preditivo positivo (VPP) e negativo (VPN) desse
teste?

VPP
Indica a probabilidade de um doente ter efetivamente a doença. Das 275 pessoas positivas,
210 estavam realmente doentes, assim, temos que: VPP = 210/275 = 0,76

VPN
Indica a probabilidade de uma pessoa sadia não ter a doença, das 225 pessoas com resultado
negativo, apenas 200 estavam sem a doença: então 200/225 =0,89

QUANTO MAIOR O VALOR DO PREDITIVO POSITIVO,

MAIOR É A PREVALÊNCIA DA DOENÇA EM UMA
DETERMINADA POPULAÇÃO.

Para verificar o desempenho de um teste, podemos calcular a razão de verossimilhança.

Esse parâmetro indica quantas vezes é possível a detecção de um teste positivo ou negativo e
é muito utilizado nas análises de pré-testes, quando queremos estabelecer um novo método de
diagnóstico. Essa medida pode ser positiva ou negativa. Quando os dados são avaliados em
sensibilidade (e especificidade) , essa medida pode ser calculada a partir desses dois
parâmetros.

RAZÃO DE VEROSSIMILHANÇA

Divisão entre a probabilidade do resultado positivo em pacientes doentes e a

probabilidade do mesmo resultado em pessoas sadias.

RAZÃO DE VEROSSIMILHANÇA POSITIVA (RV +)

Verifica quantas vezes é mais provável encontrar um resultado positivo em pessoas doentes
quando comparadas com não doentes. Quanto maior a RV +, melhor é o teste. Calculado
como:


RAZÃO DE VEROSSIMILHANÇA NEGATIVA (RV -)
Verifica quantas vezes é mais provável encontrar um resultado negativo em pessoas doentes,
quando comparadas com não doentes.

Assista ao vídeo para entender mais sobre esses cálculos.

COMO CALCULAR OS VALORES
PREDITIVO, SENSIBILIDADE E
ESPECIFICIDADE EM TESTES
SOROLÓGICOS

VERIFICANDO O APRENDIZADO

1. APREENDEMOS QUE A SENSIBILIDADE É UMA MEDIDA QUE PODE

SER OBTIDA DURANTE A AVALIAÇÃO DA VALIDADE DE UM TESTE. COM
RELAÇÃO À SENSIBILIDADE DOS TESTES, ASSINALE A ALTERNATIVA
CORRETA:

A) Indica quanto um teste consegue determinar, em um grupo de indivíduos, aqueles que

realmente se encontram doentes.

B) Mede a capacidade do teste de obter resultados reprodutíveis, ou seja, em dosagens

repetidas da mesma amostra temos a obtenção do mesmo resultado.

C) É a habilidade de o teste obter resultados similares ao teste padrão (padrão-ouro).

D) Verifica quantas vezes é mais provável encontrar um resultado negativo em pessoas

doentes quando comparadas com não doentes.
2. VERIFICAMOS QUE, DURANTE A REALIZAÇÃO DE EXAMES DE
SOROLOGIA, FAZ-SE NECESSÁRIO O ARMAZENAMENTO DOS SOROS
EM BANCOS DE SOROS. SOBRE ESSE ARMAZENAMENTO, ANALISE AS
AFIRMATIVAS A SEGUIR:

I. OS BANCOS DE SOROS PERMITEM A RASTREABILIDADE DOS

RESULTADOS SOROLÓGICOS, PODENDO REPETIR O TESTE NO CASO
DE RESULTADOS DUVIDOSOS.
II. DURANTE ROTINA LABORATORIAL DE DOADORES DE SANGUE, É
PRECONIZADO PELA ANVISA O ARMAZENAMENTO DO SORO POR 3
MESES.
III. OS TUBOS QUE SERÃO ARMAZENADOS DEVEM SER ORGANIZADOS
DE ACORDO COM O TIPO DE MICRORGANISMOS QUE SÃO
INVESTIGADOS.

ASSINALE A SEGUIR A ALTERNATIVA QUE APRESENTA A(S)

AFIRMATIVA(S) CORRETA(S):

A) I e III

B) I e II

C) II e III

D) Apenas a III

GABARITO

1. Apreendemos que a sensibilidade é uma medida que pode ser obtida durante a
avaliação da validade de um teste. Com relação à sensibilidade dos testes, assinale a
alternativa correta:

A alternativa "A " está correta.

A sensibilidade é o parâmetro que indica quanto um teste consegue determinar, em um grupo

de indivíduos, aqueles que realmente estão doentes. A reprodutibilidade indica a precisão
(obtenção de resultados reprodutíveis) dessa medida, a acurácia é a habilidade de o teste
obter resultados similares ao teste padrão (padrão-ouro). A razão de verossimilhança positiva
verifica quantas vezes é mais provável encontrar um resultado negativo em pessoas doentes,
quando comparadas com não doentes.

2. Verificamos que, durante a realização de exames de sorologia, faz-se necessário o

armazenamento dos soros em bancos de soros. Sobre esse armazenamento, analise as
afirmativas a seguir:

I. Os bancos de soros permitem a rastreabilidade dos resultados sorológicos, podendo

repetir o teste no caso de resultados duvidosos.
II. Durante rotina laboratorial de doadores de sangue, é preconizado pela ANVISA o
armazenamento do soro por 3 meses.
III. Os tubos que serão armazenados devem ser organizados de acordo com o tipo de
microrganismos que são investigados.

Assinale a seguir a alternativa que apresenta a(s) afirmativa(s) correta(s):

A alternativa "B " está correta.

Os bancos de soros permitem o armazenamento, a organização e a rastreabilidade nos

laboratórios de imunologia. Nos bancos de sangue, de acordo com a RDC Nª 34/2014, as
amostras de soros de doadores devem ser armazenadas por, no mínimo, 6 meses a -20 °C.

CONCLUSÃO

CONSIDERAÇÕES FINAIS
O diagnóstico sorológico é de suma importância, pois auxilia na identificação de agentes
etiológicos e pode determinar as fases de uma doença, garantindo ao paciente um diagnóstico
confiável e um tratamento seguro. Além disso, a evolução desses métodos ao longo dos anos
tornou a doação de sangue e órgãos mais segura, diminuindo a contaminação por doenças
infectocontagiosas e mimetizando o número de reações de incompatibilidades. Vimos que
esses métodos podem ser qualitativos (conferem resultados que definem uma qualidade) ou
quantitativos (quando os resultados apresentam um valor mensurável).

Visitamos ainda os principais conceitos ligados ao controle de qualidade dos testes sorológicos
para que se tenha um resultado reprodutível e exato. Além disso, conseguimos compreender, a
partir da análise da acurácia de um teste, como podemos medir a sensibilidade, a eficiência, a
especificidade, os valores de predição e a razão de verossimilhança de um teste, e
entendemos o que cada um deles representa.

REFERÊNCIAS
ABBAS, A. K., LICTMAN, A. H. Imunologia Celular e Molecular, 5 ed. Rio de Janeiro:
Elsevier, 2005.

ANVISA. RDC N°24de 11 de junho de 2014. In: Hemocentro. Consultado em meio eletrônico
em: 9 set. 2020.

BRASIL. Protocolo clínico e diretrizes terapêuticas para manejo da infecção pelo HIV em
adultos. In: Conitec. Consultado em meio eletrônico em: 7 set. 2020.

BRASIL. Diagnóstico da infecção pelo HIV - aula 2. In: Telab. Consultado em meio eletrônico
em: 7 set. 2020.

FERREIRA, J. C.; PARTINO, C. M. Entendendo os testes de diagnóstico - parte 3. In: Jornal

Brasileiro de patologia. v. 44 (1), 2018.

MOLINARO, E. M.; CAPUTO, L. F. G.; AMENDOREIRA, M. R. R. Conceitos e métodos para

a formação de profissionais em laboratórios de saúde. Rio de Janeiro: EPSJV/ IOC, 2013.
SIQUEIRA, C. O.; RIBEIRO, F. C.; VIZZONI, A. G. Conceitos básicos e aplicados em imuno-
hematologia. Organização de Maria Beatriz. Rio de Janeiro: EPSJV, 2013.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIAS (s/d). Avaliação dos testes de diagnóstico. In: UFGV.
Consultado em meio eletrônico em: 7 set. 2020.

EXPLORE+
Para aprofundar os seus conhecimentos a respeito do assunto deste tema, leia:

CARMINATI, R. et al. Determinação da sensibilidade e especificidade de um teste de

ELISA indireto para o diagnóstico da linfadenite caseosa em caprinos. Indicamos este
artigo para que você conheça como um teste sorológico é desenvolvido e padronizado,
avaliando sua sensibilidade. Conforme aprendemos, exames com alta sensibilidade são
amplamente utilizados durante uma triagem sorológica e o exame de especificidade para
confirmação diagnóstica.

TEIXIERA, R. I. A.; VEXENAT, A. C. Real significado de exames sorológicos no

diagnóstico das doenças endêmicas. Leia este artigo para aprender mais sobre a
importância do diagnóstico sorológico coletivo no diagnóstico dos surtos.

Acurácia dos testes de diagnósticos registrados na ANVISA para o COVID-19. Este

documento, encontrado no site do Ministério da Saúde, avalia os resultados da acurácia
dos testes diagnósticos disponíveis no Brasil.

Para aprofundar os seus conhecimentos a respeito do assunto deste tema, leia:

GOLDBERG, A. C.; RIZZO, L. V.Estrutura do MHC e função – apresentação de

antígenos. Parte 1.

CONTEUDISTA
Gabrielly Sbano Teixeira
 CURRÍCULO LATTES
DESCRIÇÃO
Abordagem dos principais métodos laboratoriais empregados na imunologia clínica.

PROPÓSITO
Compreender os principais métodos laboratoriais empregados na imunologia clínica, bem como
sua importância e aplicabilidades na rotina laboratorial para auxiliar na escolha da melhor
metodologia para um diagnóstico confiável, rápido, de baixo custo e que possibilite um
tratamento eficaz e cuidadoso ao paciente.

OBJETIVOS
MÓDULO 1

Descrever os principais métodos laboratoriais imunológicos com reagentes não marcados

MÓDULO 2

Explicar os métodos laboratoriais imunológicos com reagentes marcados

INTRODUÇÃO
Neste tema, vamos explorar um pouco mais sobre a metodologia dos principais testes
imunológicos empregados em um laboratório de análises clínicas.

Você sabe o que é um teste imunológico?

Os testes imunológicos são metodologias amplamente empregadas para detectar anticorpos

contra os microrganismos (Parasitas, fungos, vírus e bactérias) . Isto é, antígenos que podem
ser o próprio patógeno que causou a enfermidade ou qualquer substância que se comporte
como um antígeno em uma interação com o anticorpo, como:

Hormônios

Drogas

Ácidos nucléicos

Receptores das células.

A partir desses testes, podemos fornecer uma confirmação diagnóstica, o diagnóstico precoce,
a fim de acompanhar a evolução e o tratamento de uma doença, além de confirmar a presença
de uma substância no organismo.

Atualmente, existe uma enorme variabilidade de testes imunológicos, como, por exemplo, as
reações de precipitação, reações de aglutinação, reações de fixação de complemento, ensaios
imunocromáticos, imunoenzimáticos, dentre outros. Todas essas técnicas são baseadas no
reconhecimento antígeno-anticorpo e podem ser feitas a partir de reagentes marcados com
algum corante fluorescente ou quimioluminescentes, radioisótopos, enzimas que geram uma
coloração ao final da reação ou reagentes não marcados, gerando uma interação que é
visível a olho nu.

 DICA

Imunosorologia é a detecção quantitativa e qualitativa da interação antígeno e anticorpo que

visa o diagnóstico.

Você certamente já ouviu falar em ELISA, ensaios de precipitação e teste rápido. Sabe qual a
diferença entre eles? Ao longo desta jornada, vamos entender como esses testes são
realizados e como cada técnica pode ser empregada, compreendendo a diferença entre eles e
as principais vantagens e desvantagens. Para melhor entendimento, vamos dividir esses testes
em dois grandes grupos:

Métodos que usam reagentes não marcados

Métodos que usam reagentes marcados.

MÓDULO 1
 Descrever os principais métodos laboratoriais imunológicos com reagentes não
marcados

MÉTODOS LABORATORIAIS
IMUNOLÓGICOS COM REAGENTES NÃO
MARCADOS
Como mencionamos, os métodos laboratoriais imunológicos que utilizam imunorreagentes
livres de marcação são técnicas que possibilitam uma interação antígeno e anticorpo que
podemos visualizar. Nesse tipo de reação, ocorre o reconhecimento de anticorpos com
antígenos solúveis e a formação de precipitados insolúveis.

Quando o antígeno pesquisado é um microrganismo, como uma bactéria, um protozoário, uma

hemácia, ou seja, um antígeno particulado, os anticorpos, ao reconhecerem o antígeno, irão se
aglutinar (Figura 1). De modo diferente, quando o antígeno está ligado à superfície celular, o
resultado da interação com o anticorpo pode ser a lise celular (Citólise) .

PRECIPITADOS

São produtos que não são capazes de se dissolver.

Fonte: Soleil Nordic/Shutterstock

 Figura 1: Interação entre antígeno e anticorpo, resultando em aglutinação.

Dentre as técnicas imunológicas com reagentes não marcados, destacam-se:

REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO

AGLUTINAÇÃO
FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO

REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO
São técnicas que consistem no reconhecimento de antígenos solúveis com seus anticorpos
complementares que também estão em solução, originando um agregado (Imunocomplexo)
que não se solubiliza (Precipitado) e é visível (Figuras 2 e 3).

Fonte: O autor
 Figura 2: Imunocomplexos.

Fonte: Wikimedia
 Figura 3: Formação dos imunocomplexos.

É importante ressaltar que, para que a reação de precipitação seja visível, um fator
determinante é a concentração de antígeno (Ag) e anticorpo presentes (Ac) . Quando as
concentrações dessas duas moléculas são equivalentes, ocorre uma precipitação máxima e,
assim, é possível visualizar a precipitação. Chamamos esse fenômeno de zona de
equivalência. De forma diferente, quando existe excesso de antígeno ou anticorpo, a interação
diminui e a formação de precipitado também, gerando resultados falso-negativos. Quando
temos excesso de anticorpos, ocorrem reações que não são visíveis a olho nu (Precipitação
subótima) , esse fenômeno é chamado de prozona (Figura 4).

PROZONA

Esse efeito pode ser observado em outros testes sorológicos, como aglutinação. Durante
os exames, a partir dessa técnica, são realizadas diferentes diluições para evitar
resultados falhos.

Fonte: Soleil Nordic/Shutterstock

 Figura 4: Curva que mostra a reação de precipitação entre antígeno e anticorpo.

Entenda melhor a figura:

A
Na figura, temos em (A) excesso de anticorpos, o que resulta em precipitados pequenos que
não são visíveis a olho nu, efeito prozona.

B
Representa a zona de equivalência, com concentrações de antígeno e anticorpo equivalentes e
precipitação máxima e visível.

C
Em (C), o excesso de antígeno também gera precipitados pequenos, não visíveis a olho nu,
efeito pós-zona.

Nas reações de precipitação, para verificar a interação antígeno e anticorpo, são utilizados
diferentes meios reacionais, como, por exemplo, o meio líquido ou semissólido. Quando
realizadas em meio semissólido, essas reações são dividias em imunodifusão e
imunoeletroforese. As principais vantagens dessa técnica são rapidez, fácil execução, baixo
custo, podem ser testadas diferentes amostras e boa especificidade. No entanto, elas
apresentam uma baixa sensibilidade.

Agora vamos conhecer as peculiaridades de cada técnica de precipitação:

REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO EM MEIO LÍQUIDO,

TÉCNICA DE PRECIPITINA E/OU DO ANEL

A precipitação ocorre em tubos de ensaio ou em capilares e visa pesquisar a presença de

antígenos. Para isso, os tubos apresentam uma solução de anticorpos já conhecida, também
chamada de soro hiperimune e nele, cuidadosamente, é adicionado uma amostra, para
formar duas fases: uma inferior, com o soro hiperimune, e outra superior, com a amostra. Se o
antígeno pesquisado estiver presente na amostra, este migrará em direção ao soro, formando
um gradiente de concentração. Quando ocorrer a interação antígeno e anticorpo e esta estiver
na zona de equivalência, é possível verificar a formação de um precipitado visível (Um anel de
turvação) (Figura 5). Tal técnica é mais utilizada em laboratórios de pesquisa.
Fonte: O autor
 Figura 5: Esquema de reações de precipitação em meio líquido.

Antes de estudarmos as técnicas de precipitação em meio semissólido, devemos conhecer

mais um pouco sobre imunodifusão.

IMUNODIFUSÃO

Consiste na migração de antígenos solúveis em uma matriz gelatinosa (ágar ou um gel de

agarose) que contém um anticorpo em sua composição. É importante ressaltar que algumas
técnicas podem pesquisar anticorpos solúveis em uma matriz que apresente o antígeno
correspondente. Quando as moléculas estão livres, a difusão permanece constante, mas,
quando ocorre a interação de antígenos solúveis com os anticorpos, o
precipitado (Imunopreciptado) formado fica preso no gel de acordo com o peso molecular
desse complexo e assim, podem ser visualizados.

As técnicas de imunodifusão dependem de alguns parâmetros, são eles: concentração, pureza

e tamanho dos poros do gel, concentração dos antígenos e anticorpos, tempo de difusão,
temperatura, especificidade e avidez da interação antígeno e anticorpo.

Dependendo do tipo de migração do antígeno e do anticorpo sobre a matriz, a imunodifusão

pode ser dividida em simples, dupla ou radial.

ESPECIFICIDADE
 Capacidade de um anticorpo apenas reconhecer o seu antígeno específico.

AVIDEZ

Força de interação total do antígeno com o anticorpo.

IMUNODIFUSÃO SIMPLES OU IMUNODIFUSÃO

UNIDIRECIONAL EM MEIO SEMISSÓLIDO
Quando um dos componentes (Ag ou Ac) fica fixado ao gel, enquanto o outro vai migrando até
que se forme os imunocomplexos.

O antígeno é colocado sobreposto a uma coluna de ágar, contendo o soro hiperimune. As

moléculas do antígeno irão penetrar no ágar e se difundirem com uma velocidade diferente
para cada substância, dependendo do peso molecular. Após o tempo de incubação de
normalmente uma semana, será possível observar o que chamamos de disco (banda) ou
zona de precipitação (Figura 06).

Fonte: Biosciencenotes
 Figura 6: Imunodifusão simples.

IMUNODIFUSÃO DUPLA OU IMUNODIFUSÃO DE

OUCHTERLONY
Quando o antígeno e o anticorpo migram ao mesmo tempo, um em direção ao outro para a
formação do imunocomplexos. Esse teste é realizado em uma lâmina de vidro ou placa de
Petri, que é coberta por uma camada fina de gel, com dois orifícios, onde em um é colocado o
antígeno e no outro o anticorpo, caso haja formação de imunocomplexos, há o aparecimento
de bandas ou linhas de precipitação (Figura 7). Essa é uma técnica semiqualitativa, que pode
ser utilizada para o diagnóstico de doenças infectocontagiosas, como candidíase,
histoplasmose e aspergilose.

Após a imunodifusão, podemos utilizar um corante para marcar as proteínas, a fim de visualizar
melhor as linhas de precipitação. A utilização desses corantes é preconizada quando temos
uma baixa concentração de antígenos e anticorpos, o que torna as bandas não visíveis.

Fonte: Biosciencenotes
 Figura 7: Imunodifusão dupla.

IMUNODIFUSÃO RADIAL SIMPLES (IMUNODIFUSÃO

DE MANCINI)
Quando o movimento do antígeno ocorre em todas as direções em um meio semissólido. Para
isso, uma lâmina de vidro ou uma placa de Petri é coberta com um gel impregnado de
anticorpo distribuído uniformemente, em seguida, as amostras em investigação são colocadas
em pequenos orifícios. Os antígenos presentes na amostra irão se difundir de forma radial e, à
medida que vão encontrando os anticorpos, há formação de imunocomplexos e de um halo de
precipitação ao redor do orifício (na forma de anel). Quanto maior a concentração do antígeno,
maior é o tamanho do halo (Figura 8).

Fonte: Microbenotes
 Figura 8: Imunodifusão radial.

Além das amostras testes, nessa técnica, são utilizadas soluções padrões com concentrações
conhecidas de antígenos. A partir do tamanho dos halos de precipitação obtidos com os
antígenos controles (padrão), podemos originar uma curva padrão e descobrir a concentração
de antígenos presentes em amostras de soros de pacientes, possibilitando uma análise
quantitativa. Essa técnica pode ser utilizada para quantificação de proteínas, como:

Imunoglobulinas

Proteínas séricas

Fatores do complemento

Proteínas de fase aguda (PCR)

IMUNOELETROFORESE (MÉTODO DE GRABAR

E WILLIAMS)
A imunoeletroforese é uma técnica de imunopreciptação em meio semissólido (gel) que
associa as técnicas de imunodifusão e a eletroforese. Como vimos, a imunodifusão verificará
a difusão do antígeno (ou anticorpo) sobre uma superfície gelatinosa composta de anticorpos
(ou antígeno) e a formação de zona de precipitação, indicando o reconhecimento antígeno-
anticorpo.

Mas e a eletroforese, você conhece?

Fonte: Shutterstock

A eletroforese é uma técnica que consiste na migração e separação de moléculas de acordo

com a carga após a geração de um campo elétrico. Ela utiliza diferentes meios de suporte,
como fitas ou membranas de poliacetato de celulose e géis de agarose.

No nosso organismo, diversas moléculas, como proteínas, aminoácidos, polipeptídios,

nucleotídeos e ácido nucleico, apresentam grupos funcionais ionizáveis que adquirem cargas
(positiva ou negativa) em um determinado pH. Assim, quando um campo elétrico é gerado, as
moléculas migrarão para o polo positivo (Ânodo) ou negativo (Cátodo) de acordo com a sua
carga líquida. Para verificação de proteínas, normalmente, é utilizado um tampão com pH entre
8,2 e 8,6 e, nessa solução, as moléculas são carregadas negativamente e migram em direção
ao ânodo (+) . As imunoglobulinas, em média, têm pouca carga neste pH e, portanto, migram
pouco desde o ponto de aplicação da amostra (origem). Além disso, a migração também
depende do tamanho e conformação das moléculas, proteínas de alto peso molecular migram
menos que as de baixo peso molecular.

Essa técnica é amplamente utilizada para:

 Verificação analítica, como na avaliação de proteína sérica

Análises preparatórias, ou seja, na purificação de proteína que depois será estudada

Para a detecção específica de enzimas e suas isoformas (por meio de sua atividade
particular)

Detecção de antígenos (em combinação com uma variedade de técnicas imunológicas)

 SAIBA MAIS

As proteínas separadas por eletroforese podem ser fixadas e coradas com vários tipos de
corantes, como o preto de amido 10 B (azul escuro); Ponceau-S (vermelho); Coomassie G-250
(azul claro) ou Coomassie R-250 (violeta azul).

Agora que conhecemos mais sobre a eletroforese, vamos entender a técnica de

imunoeletroforese.

A imunoeletroforese é realizada em duas etapas:

Fonte: Adaptado de The Biotech Notes

A primeira separa as proteínas através da eletroforese. Para isso, um gel é preparado,

colocado em uma cuba de eletroforese, e o tampão é escolhido para que as partículas a serem
analisadas fiquem com as cargas negativas e migrem para o polo positivo. As amostras a
serem testadas (misturas de anticorpos ou antígenos) são aplicadas no gel (Figura 9A).
 Figura 9A: Esquema representando uma imunoeletroforese.

Fonte: Adaptado de The Biotech Notes

Nesse aparato, é aplicada uma diferença de potencial, que será responsável pela migração e
separação das moléculas de acordo com a carga, tamanho e conformação (Figura 9B).

 Figura 9B: Esquema representando uma imunoeletroforese.

Fonte: Adaptado de The Biotech Notes

Após a corrida eletroforética, é feita a imunodifusão de cada componente que foi separado no
gel. Para isso, é cortada uma canaleta entre os poços onde é colocado o antígeno ou anticorpo
correspondente (figura 9C).

 Figura 9C: Esquema representando uma imunoeletroforese.

Fonte: Adaptado de The Biotech Notes

À medida que ocorre uma interação antígeno-anticorpo, vamos ter uma linha de precipitação
em forma de arco na região de equivalência. Cada banda formada representa a formação de
um complexo imune específico (Figura 9D).

 Figura 9D: Esquema representando uma imunoeletroforese.

Essa é uma técnica qualitativa e semiquantitativa que possibilita distinguir substâncias de

acordo com suas cargas elétricas, seus pesos moleculares, tamanhos, sua conformação
espacial, concentração e suas propriedades antigênicas. Ela é muito empregada no
diagnóstico de gamopatias monoclonais, como o mieloma múltiplo e macroglobulinemia.

 SAIBA MAIS

O mieloma múltiplo é uma neoplasia da medula óssea que leva à proliferação das células B e
ao aumento descontrolado da produção de anticorpos monoclonais (normalmente, do tipo IgG
ou IgA) e fragmentos deles, chamados de proteína M. Nessa doença, as proteínas
monoclonais de IgM, IgA, IgD e IgE podem estar presentes em quantidades relativamente
pequenas quando comparadas à IgG. Um resultado de imunoeletroforese que não detecta a
porção da cadeia leve das imunoglobulinas não-IgG, mostra uma alteração no padrão de
produção desses anticorpos, o que é indicativo de gamopatias como o mieloma.

A partir da técnica de Grabar e Williams, outras metodologias foram desenvolvidas, são elas:

REAÇÃO DE IMUNOELETROFORESE
UNIDIMENSIONAL SIMPLES (ELETROFORESE DE
FOGUETE OU TÉCNICA DE LAURELL)
É uma adaptação da técnica de Graber e Williams, onde a eletroforese e a imunodifusão
ocorrem ao mesmo tempo com o deslocamento apenas da substância que se deseja analisar.
Para isso, uma pequena camada de gel incorporada com o anticorpo ou antígeno é preparada
sobre uma lâmina de vidro. As amostras são aplicadas em poços pré-formados, o tampão é
escolhido para que as partículas a serem analisadas fiquem com as cargas negativas e migrem
para o polo positivo e esse conjunto é submetido à eletroforese. Durante a eletroforese, à
medida que a substância vai migrando a partir do orifício de aplicação, ocorre a separação das
moléculas e o reconhecimento do antígeno-anticorpo , com a formação das linhas de
precipitação em formato de cone ou foguete. Isto porque, no início, há uma grande
concentração da substância de interesse, que ao longo da corrida eletroforética vai
diminuindo até que se esgote. É importante ressaltar que, durante a técnica, não ocorre a
migração da substância que está incorporada ao gel.

REAÇÃO DE IMUNOELETROFORESE DUPLA

BIDIMENSIONAL (CONTRAIMUNOELETROFORESE)
Nesta técnica, antígenos e anticorpos migram ao mesmo tempo por eletroforese, no mesmo
eixo, mas em direções opostas, resultando na precipitação no local onde ocorre o
reconhecimento antígeno e anticorpo. A reação de contraimunoeletroforese só é possível
quando antígenos e anticorpos migram em sentidos opostos durante a eletroforese, ou seja,
os anticorpos migram para o polo negativo (cátodo), enquanto os antígenos migram para o polo
positivo (ânodo). Nesse método, podemos realizar várias análises em somente uma lâmina, é
uma metodologia rápida e mais sensível que a imunodifusão, além de poder ser realizado em
membranas de acetato de celulose.

ANTÍGENOS MIGRAM PARA O POLO

POSITIVO

Esse fenômeno pode ser estimulado com o uso de tampões alcalinos.

Fonte: O autor.
 Reação de imunoeletroforese dupla bidirecional.

REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
As reações de aglutinação consistem na formação de um agregado visível após a interação de
anticorpos específicos com partículas insolúveis que contêm diferentes determinantes
antigênicos (local de ligação do anticorpo, ou epítopo) ligados à superfície dessas
partículas. Diferente da precipitação, onde os anticorpos e antígenos são solúveis, nessa
técnica, pelo menos uma substância deve ser insolúvel.

Mas o que são essas partículas insolúveis?

As partículas insolúveis podem ser um antígeno insolúvel, antígenos expressos na superfície

das membras plasmáticas, como os antígenos presente na membrana dos eritrocitários, ou
então partículas cobertas com os antígenos (exemplo: látex).

Essa técnica apresenta alta especificidade e reprodutibilidade, é de fácil execução, simples e

barata, mas apresenta baixa sensibilidade. É amplamente utilizada para tipagem sanguínea,
provas de compatibilidade transfusional, detecção de hormônios, detectar patógenos (Vírus,
bactérias, protozoários e fungos) e no diagnóstico das doenças autoimunes. Essas reações
são divididas em: reações de aglutinação direta, indireta, reações de inibição da aglutinação.
AGLUTINAÇÃO DIRETA

Como o nome diz, é a interação direta entre antígenos presentes na superfície de uma
célula com o anticorpo correspondente. Os antígenos podem estar na sua forma integra ou
fragmentada. No entanto, para ocorrer uma aglutinação visível, é necessário que o anticorpo
reconheça pelo menos dois sítios antigênicos (bivalente), o que permite a ligação simultânea
com mais de um antígeno formando interações cruzadas e um agrupado de partículas visíveis
(rever a Figura 1).

FIGURA 1

Fonte: Shutterstock

 EXEMPLO

Classificação sanguínea, prova de compatibilidade, teste de Coombs direto e indireto e

sorotipagem bacteriana são exemplos dessa técnica.

Quando desejamos encontrar um anticorpo específico, devemos fazer diluições seriadas das
amostras frente a uma concentração fixa e conhecida do antígeno correspondente. Após o
tempo de incubação, o resultado é expresso como título do anticorpo, ou seja, a última diluição
em que é possível verificar a aglutinação.

AGLUTINAÇÃO PASSIVA OU INDIRETA

Essa reação consiste no reconhecimento de anticorpos presentes no soro com antígenos

presentes artificialmente em partículas inertes (látex ou gelatina) ou então hemácias, que são
sensibilizadas por adsorção passiva e desempenham uma função de suporte. Quando uma
amostra de soro ou plasma apresenta um anticorpo que reconheça os antígenos
correspondentes nas hemácias ou nas partículas inertes que formem pontes entre as partículas
vizinhas, irá ocorrer a aglutinação (Figura 10). Esse teste apresenta diversas aplicabilidades.

LÁTEX

Partículas de látex são esferas de poliestireno que desempenham um papel de suporte, e

é possível adsorver antígenos.

ADSORÇÃO PASSIVA

Adesão de moléculas fluidas a uma superfície sólida.

Fonte: Wikimedia
 Figura 10: Teste de aglutinação indireta. O teste de Coombs indireto é um exemplo desse
teste quando é utilizado hemácias como suporte.

O teste de Coombs indireto é um exemplo desse teste quando se utiliza hemácias como
suporte.

 VOCÊ SABIA

A reação de aglutinação indireta com o látex como partícula inerte é amplamente utilizada para
a detecção do fator reumatoide. A artrite reumatoide é uma doença autoimune que leva à
inflamação crônica nas articulações, à ativação desregulada de células B e T e à produção de
autoanticorpos, moléculas que reconhecem a região Fc das imunoglobulinas produzidas no
nosso organismo, chamado de fator reumatoide que normalmente é uma variante de IgM. Na
pesquisa do fator reumatoide, o látex é sensibilizado com anticorpo do tipo IgM, IgG, IgM e IgA,
e essa partícula é reagida com o soro do paciente. Se o soro apresentar o fator reumatoide,
teremos a aglutinação.

REAÇÕES DE INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO

Nessas reações, ocorre uma competição entre os antígenos presentes na superfície de

hemácias ou de partículas inertes e antígenos solúveis pelo sítio de ligação com o
anticorpo, diminuindo assim a capacidade de interação e aglutinação. Dessa forma, a reação
é positiva quando não temos aglutinação. A competição acontece entre dois antígenos
semelhantes, pelo local de ligação com o anticorpo, ou entre dois anticorpos diferentes pela
ligação ao mesmo antígeno. A interação acontecerá entre o antígeno e o anticorpo que
apresente uma reação mais estável.

INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO DIRETA DE HEMÁCIAS

POR ANTÍGENOS VIRAIS
Durante uma infecção viral, alguns vírus apresentam a capacidade de se ligar a receptores
localizados na superfície de hemácias danificadas. Assim, essa propriedade é utilizada para a
dosagem de anticorpos contra os vírus durante a evolução de uma doença.

Um paciente com uma suspeita de infecção viral faz um exame de sangue para confirmar a
presença de anticorpos contra esse vírus. O soro desse paciente é então diluído e colocado em
contato com quantidades fixas de antígenos virais e hemácias. Teremos uma competição da
ligação dos anticorpos aos antígenos livres e os que estão ligados a hemácias. À medida
que ocorre a ligação antígeno livre e anticorpo, a aglutinação diminui. Em seguida,
verificamos qual foi a diluição que não houve mais a aglutinação das hemácias, ou seja, a
inibição da propriedade aglutinante, e esse representa o título do anticorpo .

REAÇÃO DE INIBIÇÃO PASSIVA DE PARTÍCULAS

INERTES (LÁTEX)
Ocorre pela inibição da ligação entre antígenos ancorados na sua superfície do látex e seus
anticorpos correspondentes, quando existem anticorpos solúveis que competem inibindo a
aglutinação.
Fonte: Shutterstock

Uma paciente está com suspeita de gravidez e realiza a coleta da urina para o teste.
Normalmente, o teste de gravidez detecta o hormônio da gonodotrofina coriônica (hHCG) em
uma reação de inibição de aglutinação.

Vamos entender melhor:

Fonte: O autor
REAÇÃO DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO
Podemos identificar e quantificar a presença de antígenos e anticorpos em uma amostra
através da formação de imunocomplexos e a avaliação da capacidade desses complexos em
fixar e consumir as moléculas do sistema complemento in vitro.

Essa técnica é barata, simples e utilizada para o diagnóstico de alguns agentes infecciosos
como a histoplasmose e a coccidioidomicose. No entanto, esses testes estão sendo
substituídos pelos ensaios enzimáticos, que são mais sensíveis, e são empregados apenas
como testes confirmatórios.

O teste é realizado em duas etapas.

ETAPA 1
Na primeira etapa, ocorre a formação dos imunocomplexos (interação antígeno e anticorpo) e a
ligação (fixação) com as moléculas do sistema complemento.

ETAPA 2
Na segunda etapa, as hemácias ligadas aos anticorpos antieritrócitos (hemolisinas) são
adicionadas e, após um período, observamos se ocorreu ou não a hemólise.

A presença de hemólise indica que, na primeira etapa, não houve a formação do

imunocomplexo e a fixação do complemento, ficando as moléculas do sistema complemento
livres e capazes de interagir com o complexo hemácias-hemolisinas. De forma diferente, a
ausência de hemólise informa que houve a formação do imunocomplexo e a fixação das
moléculas do sistema complemento, ou seja, uma reação positiva. É importante ressaltar que,
nessa reação, os antígenos e anticorpos isolados não podem ativar o sistema complemento,
pois geraria resultados falhos.
Fonte: O autor.
 Esquema mostrando a reação de fixação do complemento.

O sistema hemácia-hemolisina funciona como um sistema revelador.

IMUNOFIXAÇÃO, NEFELOMETRIA E
FLOCULAÇÃO

VERIFICANDO O APRENDIZADO

1. APRENDEMOS QUE OS TESTES IMUNOLÓGICOS SÃO BASEADOS NO

RECONHECIMENTO ANTÍGENO-ANTICORPO E PODEM SER FEITOS A
PARTIR DE REAGENTES MARCADOS OU NÃO MARCADOS, GERANDO
UMA INTERAÇÃO QUE É VISÍVEL A OLHO NU, COMO A AGLUTINAÇÃO.
SOBRE A AGLUTINAÇÃO, ANALISE AS ASSERTIVAS A SEGUIR:

I. SÃO REAÇÕES QUE OCORREM ENTRE ANTÍGENOS NATURAIS

INSOLÚVEIS OU ADSORVIDOS À SUPERFÍCIE DE PARTÍCULAS INERTES
COM OS ANTICORPOS CORRESPONDENTES.
II. A ALTA SENSIBILIDADE E BAIXA ESPECIFICIDADE SÃO VANTAGENS
DAS REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO.
III. PODE SER UTILIZADA PARA TIPAGEM SANGUÍNEA, PROVAS DE
COMPATIBILIDADE TRANSFUSIONAL, DETECÇÃO DE HORMÔNIOS,
DETECTAR PATÓGENOS (VÍRUS, BACTÉRIAS, PROTOZOÁRIOS E
FUNGOS) E NO DIAGNÓSTICO DAS DOENÇAS AUTOIMUNES.

ESTÃO CORRETAS AS ASSERTIVAS:

A) I e II

B) II e III

C) I e III

D) III

2. ESTUDAMOS QUE A DETECÇÃO DE UM ANTÍGENO OU ANTICORPO

PODE SER REALIZADA A PARTIR DA CAPACIDADE DOS
IMUNOCOMPLEXOS DE FIXAR E CONSUMIR O SISTEMA
COMPLEMENTO, NO TESTE CHAMADO DE REAÇÃO DE FIXAÇÃO DO
COMPLEMENTO. SOBRE ESSE MÉTODO, ASSINALE A ALTERNATIVA
INCORRETA.

A) O teste de fixação do complemento é um teste utilizado para o diagnóstico de alguns

agentes infecciosos como a histoplasmose e coccidioidomicose.

B) O teste de fixação de complemento é feito em duas etapas, na primeira etapa, ocorre a

fixação do complemento e, na segunda, a revelação da reação que é verificada pela ausência
ou presença de lise nas hemácias.

C) A interação do antígeno e anticorpo possibilita a fixação do sistema complemento e, nesse

caso, ele é consumindo não ficando disponível para uma segunda reação.

D) Se o complemento foi fixado na primeira etapa da reação, na segunda etapa após a

revelação, veremos a hemólise, ou seja, um resultado positivo.

GABARITO

1. Aprendemos que os testes imunológicos são baseados no reconhecimento antígeno-

anticorpo e podem ser feitos a partir de reagentes marcados ou não marcados, gerando
uma interação que é visível a olho nu, como a aglutinação. Sobre a aglutinação, analise
as assertivas a seguir:

I. São reações que ocorrem entre antígenos naturais insolúveis ou adsorvidos à

superfície de partículas inertes com os anticorpos correspondentes.
II. A alta sensibilidade e baixa especificidade são vantagens das reações de aglutinação.
III. Pode ser utilizada para tipagem sanguínea, provas de compatibilidade transfusional,
detecção de hormônios, detectar patógenos (vírus, bactérias, protozoários e fungos) e
no diagnóstico das doenças autoimunes.

Estão corretas as assertivas:

A alternativa "C " está correta.

A aglutinação é uma técnica que apresenta alta especificidade e baixa sensibilidade, pois, se
os anticorpos e antígenos não estiverem nas concentrações equivalentes, pode ocorrer
resultados falso negativos (o paciente tem a doença, mas o teste não detecta).

2. Estudamos que a detecção de um antígeno ou anticorpo pode ser realizada a partir da

capacidade dos imunocomplexos de fixar e consumir o sistema complemento, no teste
chamado de reação de fixação do complemento. Sobre esse método, assinale a
alternativa INCORRETA.

A alternativa "D " está correta.

Na reação de fixação do complemento, quando temos a ligação do antígeno-anticorpo, o

complexo formado é capaz de se ligar, fixar e consumir o sistema complemento, não ficando
assim disponível para hemolisar as hemácias ligadas à hemolisina (anticorpo antieritrocitário)
quando for adicionado o sistema revelador. Nesse caso, uma reação é positiva quando não
vemos hemólise.

MÓDULO 2
 Explicar os métodos laboratoriais imunológicos com reagentes marcados

MÉTODOS LABORATORIAIS
IMUNOLÓGICOS COM REAGENTES
MARCADOS
Estudamos que as técnicas de precipitação, aglutinação e de fixação do complemento são os
principais ensaios imunológicos que utilizam reagentes não marcados. Agora, vamos conhecer
alguns métodos onde a verificação da presença de um antígeno e o anticorpo é realizado com
algum dos elementos (antígeno ou anticorpo) marcados com um corante fluorescente ou
quimioluminescentes, radioisótopos, enzimas, entre outros marcadores.

Vamos juntos estudar um pouco sobre o ELISA, testes de fluorescência, testes

imunocromatográficos, radioimunoensaios e algumas técnicas de imuno-histoquímica. Além
disso, vamos entender a importância dos testes de hipersensibilidade celular cutânea tardia na
avaliação geral da imunidade celular.

IMUNOFLUORESCÊNCIA
Em 1941, uma equipe de pesquisadores liderados por Albert H. Coons, desejando analisar as
técnicas imunológicas com auxílio de corantes, utilizou radicais fluorescentes, pois a coloração
com os reagentes comuns conferia uma fraca intensidade. Nessa época, já era conhecida a
capacidade dos anticorpos de ligar-se aos radicais químicos sem alterar sua conformação e
capacidade de interagir com os antígenos. Foi desenvolvido assim o teste de
imunofluorescência.

O desenvolvimento desse teste só foi possível pela capacidade de algumas substâncias em

armazenar energia luminosa e liberá-la depois, fenômeno esse conhecido como
luminescência.

FOSFORESCÊNCIA
Quando a substância consegue armazenar energia luminosa por longos períodos até a sua
emissão.

FLUORESCÊNCIA
Quando a substância armazena energia luminosa por curto período até sua emissão.

Os corantes fluorescentes mais utilizados são a rodamina e a fluoresceína.

Após a coloração, essas amostras podem ser analisadas:
Fonte: Wikipedia

NO MICROSCÓPIO ÓPTICO DE FLUORESCÊNCIA

Fonte: Wikipedia
NO CITÔMETRO DE FLUXO
A imunofluorescência representa um grande avanço na imunologia clínica, pois permitiu a
detecção de substâncias de forma direta, mesmo que em pequenas concentrações, e
utilizando pequenas quantidades de corantes fluorescentes, uma vez que esses corantes
emitem grande quantidade de energia. Antes, a detecção de um antígeno ou anticorpo era
realizado através de Reações secundárias (aglutinação ou precipitação) , ou seja, após a
formação de um imunocomplexo, sendo necessária grandes quantidades de antígenos e
anticorpos para sua visualização.

A partir dessa técnica, diferentes métodos foram descritos, como a imunoflorescência direta e
indireta.

IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
Esta técnica é utilizada para detectar antígenos em biopsias de tecidos, como também a
presença de células, bactérias, vírus, fungos e protozoários. Ela consiste no reconhecimento
de antígenos por anticorpo correspondente que está conjugado com uma substância
fluorescente. A presença de fluorescência indica que a amostra tem a substância pesquisada.
A análise por esse método costuma ser qualitativa (Figura 11).

Fonte: Vshivkova/Shutterstock
 Figura 11: Células leucêmicas marcadas com corante fluorescente, em que o núcleo está
corado em verde e o citoplasma em vermelho.

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
Nesta técnica, utiliza-se um anticorpo secundário conjugado com o radical fluorescente, ou
seja, um anticorpo anti-imunoglobulina que é capaz de reconhecer diferentes imunoglobulinas
ligadas a um antígeno específico. A principal vantagem desse método é a diminuição dos
custos, uma vez que o anticorpo secundário pode ser empregado para o reconhecimento de
qualquer anticorpo humano e utilizado para diferentes análises. Além disso, é um método mais
sensível e específico quando comparado à imunofluorescência direta. É utilizado para o
diagnóstico e o acompanhamento de diferentes doenças (Figura 12).

Fonte: Wikimedia
 Figura 12: Teste de imunofluorescência. Em (A) e (B) fotos de células marcadas pela
imunofluorescência. (C) esquema mostrando a diferença entre a imunofluorescência direta e
indireta.

ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA-

ENZYME LINKED IMMUNOSORBET ASSAY)
Em 1971, foi introduzido pelos pesquisadores Van Weermen e Schurs e Engvall e Perlmann o
método imunoenzimático para detecção e quantificação de antígenos e anticorpos específicos.
Esses pesquisadores verificaram que a interação antígeno e anticorpo poderia ser detectada e
quantificada utilizando como substância reveladora um conjunto enzima-substrato, que, na
presença de uma espécie doadora de elétrons (cromógeno), forma produtos coloridos. Além
disso, observaram que as proteínas poderiam ser imobilizadas em superfícies sólidas como a
de poliestireno. Essa foi a base para o desenvolvimento dessa técnica.

O método de ELISA é capaz de detectar antígenos ou anticorpos. Ele é realizado em placas

plásticas de 96 poços (placas de microdiluições) formadas de poliestireno e que seguem uma
sequência de procedimentos.

Fonte: Wikipedia
 Uma microplaca de 96 poços usada para ELISA.

ETAPA 1
Inicialmente, a placa é previamente sensibilizada com a substância (antígeno e anticorpo)
específica que é complementar à molécula que desejamos identificar.

SENSIBILIZADA

Processo de revestimento da placa com o reagente adequado. Normalmente, utiliza-se

um pH alcalino, mantendo os reagentes com carga negativa e garantindo que ocorra a
adsorção na placa, pois essa apresenta carga positiva, devido ao poliestireno.
ETAPA 2
Após a sensibilização, nem todos os espaços da placa são cobertos, restando alguns espaços
vazios que podem ser ocupados por qualquer outra molécula gerando ligações inespecíficas e
resultados falso positivos. Assim, é feito um bloqueio com soro albumina bovina (BSA), a
ovalbumina, a caseína ou um complexo proteico, como o soro de cobaia dos espaços vazios
da placa.

ETAPA 3
Durante a execução do método, são realizadas várias lavagens (manual, por meio automático
ou por um sistema a vácuo) importantes para a retirada dos excessos de reagentes que não
estão ligados a nenhuma molécula, impedindo assim qualquer tipo de ligação cruzada e
interferências.

ETAPA 4
Dependendo do que queremos analisar, podemos utilizar antígenos conjugados com
enzimas (Ac-E) e anticorpos ou anti-anticorpos conjugados com enzimas (Ag-E) . As
enzimas mais empregadas são a fosfatase alcalina e peroxidase. Para revelar e verificar se
ocorreu interação antígeno-anticorpo conjugado com a enzima ou anticorpo-antígenos
conjugados com a enzima, é oferecido o substrato dessa enzima e um componente doador de
elétrons (cromógeno).

Quando a enzima está presente no meio reacional, ou seja, quando houve interação e
reconhecimento antígeno-anticorpo conjugado, a enzima quebra o substrato e o produto
formado atua no cromógeno, gerando uma cor. Agora, quando a alteração de cor não é
verificada, indica que a interação não ocorreu, não tendo assim no meio reacional a enzima
para agir no substrato

ETAPA 5
A leitura pode ser qualitativa, apenas verificando a alteração de cor, ou então pode ser
realizada a leitura em espectrofotômetro, o que converte as diferentes intensidades de cor em
valores numéricos (valores de densidade óptica). Quanto maior a cor obtida, maior é a
concentração da enzima conjugada e assim, maior a concentração da substância na amostra
investigada.

O método de ELISA, quando realizado em condições excelentes (enzimas ativas, antígenos

puros e anticorpo conjugado), é capaz de apresentar uma sensibilidade muito similar à do
radioimunoensaio, porém com vantagem de não se utilizar elementos radioativos. Ele
consegue detectar quantidades muito pequenas de antígenos ou anticorpos. No entanto,
alguns reagentes utilizados são teratogênicos e podem ter interferentes de enzimas endógenas
quando utilizadas como antígenos células inteiras e íntegras.

Fonte: Jarun Ontakrai/Shutterstock

 ELISA com reação colorimétrica.

O método de ELISA pode ser classificado em direto, indireto ou competitivo, são eles:

ELISA direto

Método utilizado para pesquisar a presença de antígenos. É amplamente empregado em

testes imuno-histoquímicos, que buscam em amostra de tecidos obtidas por biopsias detectar
proteínas, enzimas, receptores, alterações celulares etc. Para isso, o tecido ou amostra (com
os antígenos pesquisados) é fixado a uma superfície e, em seguida, é adicionado um anticorpo
conjugado com uma enzima (anticorpos primários) correspondente ao antígeno que
investigamos. Quando temos a presença do antígeno, há o reconhecimento com o anticorpo-
conjugado e, ao adicionar o substrato da enzima, teremos uma coloração (Figura 13).
Fonte: Adaptado de Soleil Nordic e Fluke Cha /Shutterstock
 Método de ELISA direto. (A) Esquema mostrando a técnica. (B) Esquema mostrando a
interação antígeno-anticorpo marcado, uma reação positiva e uma reação negativa.

ELISA INDIRETO

Método utilizado para pesquisar a concentração de anticorpos presentes em uma amostra de

soro ou plasma. Para isso, os antígenos são imobilizados na fase sólida (Placa de ELISA) . A
interação antígeno-anticorpo será evidenciada pela utilização de um segundo
anticorpo (Anticorpo secundário) que está conjugado com a enzima e reconhece o anticorpo
ligado ao antígeno (Figura 14). A reação será visualizada após a adição do substrato da
enzima. É empregado no diagnóstico de doenças infectocontagiosas como AIDS e doença de
chagas.

Essa técnica pode ser adaptada para a pesquisa de antígenos em uma amostra biológica e é
chamada de ELISA Sanduíche. Para isso:

A placa é sensibilizada com o anticorpo (anticorpos de captura).


Depois, o anticorpo de captura reconhece o antígeno presente na amostra biológica.

Em seguida, a reação é revelada com um anticorpo-conjugado que reconhece o antígeno
ligado ao anticorpo de captura (Figura 14).

 SAIBA MAIS

É empregado no teste de gravidez para detecção do hormônio gonodotrofina coriônica no soro.

Fonte: Adaptado de Soleil Nordic/Shutterstock

 Figura 14: Método de ELISA Indireto e ELISA Sanduíche.

ELISA COMPETITIVO

Nessa técnica, pesquisamos antígenos nas amostras através da competição com antígenos
conjugados com a enzima. Para isso:

ETAPA 1
ETAPA 2
ETAPA 3

ETAPA 1

A placa é sensibilizada com o anticorpo de captura.

ETAPA 2

São adicionados ao mesmo tempo a amostra em investigação e quantidades fixas de

antígenos conjugados em que ambos competirão pela ligação ao anticorpo, que se liga àquela
molécula que estiver em maior concentração.

ETAPA 3

Após a adição do substrato da enzima, a interação anticorpo de captura e antígeno marcado

gera uma cor, quanto maior a intensidade de coloração, mais antígenos conjugados estão
ligados e menor é a concentração de antígenos na amostra. Agora, quanto menor a
intensidade de cor, maior é a concentração de antígenos na amostra em investigação e
menor a ligação dos antígenos conjugados ao anticorpo de captura.

O ELISA Competitivo pode ser:

DIRETO
Pesquisa antígenos

INDIRETO
Pesquisa anticorpos

Ocorre através de uma competição simultânea, quando a substância marcada e a investigada

são adicionadas ao mesmo tempo, ou uma saturação sequencial, quando a substância em
investigação é adicionada primeiro e depois é adicionado o antígeno ou o anticorpo conjugado
(Figura 15).

Fonte: Adaptado de Research Gate

 Figura 15: Método de ELISA Competitivo.

RADIOIMUNOENSAIO
Em 1956, foi desenvolvida a técnica radioimunoensaio (RIE) para a detecção da insulina.
Essa representa a primeira metodologia padronizada que utiliza reagentes marcados para a
detecção de moléculas na ordem de nano e picogramas. O RIE é semelhante ao ELISA
competitivo, no entanto, utiliza substâncias marcadas com o radioisótopo. O radioisótopo mais
empregado é o iodo-125.

 SAIBA MAIS

O termo Radioimunoensaio (RIE) é usado apenas quando a substância marcada é o antígeno,

e ensaio imunorradiométrico (IRMA) quando o anticorpo que está marcado.

A detecção de antígenos ou anticorpos ocorre pela competição pelo sítio de ligação entre a
substância marcada com radioisótopo e a substância que se deseja analisar. Os antígenos ou
anticorpos são adicionados à fase sólida e acrescentados às moléculas marcadas com
radioisótopo junto com a amostra do paciente. A quantificação é realizada em aparelho
específico para a detecção da radioatividade.
Quanto maior for a leitura da radioatividade, maior a formação de imunocomplexos com a
substância marcada e menor é a concentração do antígeno ou anticorpo investigado
(Figura 16).

VANTAGENS DESSE TESTE

Alta especificidade e sensibilidade.

É rápido, barato.

Requer pouco volume de amostra para testagem.

Permite dosagem de substâncias em pequenas concentrações.


DESVANTAGEM DESSE TESTE

Apresenta um alto risco ao operador.

É necessário um grande investimento em biossegurança e descarte de material

radioativo.

Grande instabilidade dos radioisótopos.

E amplamente empregado para dosar polipeptídeos, catecolaminas, esteroides, hormônios,

drogas, vitaminas, verificar a presença de vírus como o da hepatite B e a presença de alguns
marcadores tumorais.
Fonte: O autor
 Figura 16: Esquema ilustrando um ensaio imunorradiométrico (IRMA).

TESTES IMUNOCROMATOGRÁFICOS
Os testes imunocromatográficos realizam a detecção da interação antígeno-anticorpo pela
difusão cromatográfica, onde o complexo formado gera uma cor, e a partir deles, podemos
detectar antígenos ou anticorpos. Os testes rápidos são um exemplo clássico de
imunocromatografia e são muito utilizados para a detecção de várias doenças, como: HIV,
Hepatite, COVID. Essa metodologia é de fácil execução, baixo custo, que conferem resultados
rápidos, versáteis, dispensa equipamentos e que podem ser realizados em diferentes
amostras, como o soro, plasma, sangue total, saliva, swab de nasofaringe e orofaringe, urina e
fezes. Entretanto, apresentam baixa sensibilidade.
Fonte:Shutterstock
 Teste Imunocromatográfico para HIV.

Você já realizou um teste rápido?

Sabe por que aparecem duas bandas, uma chamada de “T” e a outra de “C”, vamos entender?

O teste rápido é realizado em um cassete constituído por uma membrana porosa de celulose
modificada e membranas absorventes de fibra de vidro. Envolvendo a membrana, temos um
dispositivo plástico que contém os locais de aplicação das amostras e verificação dos
resultados. Ele é constituído por uma fase sólida (Membrana porosa) , onde ocorre a interação
antígeno-anticorpo e é o local onde estão presentes os elementos de captura (Antígeno ou
anticorpos específicos) fixados na membrana e uma fase móvel com o deslocamento das
substâncias por capilaridade.

Inicialmente, para a detecção de antígenos, a amostra é colocada em uma região pré-

determinada da membrana. Nessa área, estão presentes anticorpos conjugados normalmente
com ouro coloidal (coloração rosa) ou prata coloidal (azul marinho), que serão responsáveis
pela revelação da interação antígeno-anticorpo.


Após aplicação, a amostra migra em direção as regiões testes (T) e controle (C).

Caso haja reconhecimento entre o antígeno-anticorpo conjugado, esse complexo será retido
pela ligação com os anticorpos presentes na região T, que reconhecem os epítopos do
antígeno em investigação e gera uma linha colorida. Caso não haja interação, essa linha
colorida não aparecerá.

É importante ressaltar que, após a região teste, temos uma região controle, com anticorpos
anti-IgG que são capazes de se ligar a todos os anticorpos livres presentes na amostra. O
aparecimento da linha controle é essencial, pois indica que houve migração da amostra e deve
estar presente nos resultados positivos e negativos. O não aparecimento da linha controle
invalidada o teste (Figura 17).

Fonte: Adaptado de Biomedicina Padrão

 Figura 17: Esquema ilustrando um teste rápido para detecção do antígeno NS1, que indica
infecção pelo vírus da dengue.

IMUNO-HISTOQUÍMICA
O teste de imuno-histoquímica (IHQ) é uma técnica que combina a imunologia, histologia e
química e tem como finalidade o reconhecimento de proteínas de alta afinidade durante os
exames histopatológicos. Esse teste é empregado em cortes de tecidos obtidos após a biópsia
para a detecção de doenças degenerativas ou parasitárias, identificação de substâncias e
análises de estruturas dos tecidos normais e alteradas durante a evolução da doença.
Atualmente, existe uma série de anticorpos capazes de reconhecer com alta especificidade
proteínas do tecido e que garantem um diagnóstico mais fidedigno.

Existem dois tipos de técnicas que podem ser aplicadas para a imuno-histoquímica:

TÉCNICA DIRETA
Técnica que reconhece os antígenos presentes em um corte de tecido a partir de anticorpos
ligados a um marcador (anticorpos primários). Os cortes de tecidos são colocados em contato
com os anticorpos primários e, após um tempo de incubação, é realizada a leitura em
microscópios adequados. Os antígenos pesquisados no tecido serão observados pelo
aparecimento de uma cor, indicando que houve reconhecimento pelo anticorpo. Os anticorpos
não ligados são removidos por lavagens realizadas durante a técnica.

TÉCNICA INDIRETA
Técnica que reconhece proteínas pela ligação com um anticorpo (primário não marcado)
específico ao antígeno em investigação e depois essa interação é revelada pela utilização de
um anticorpo anti-IgG marcado (anticorpo secundário) e a amostra é observada em um
microscópio adequado.

Normalmente, em sistemas reveladores na IHQ, são utilizadas reações enzimáticas, com

destaque para o sistema avidina-biotina-enzima-cromógeno. Vamos entender como isso
acontece?

Nessas reações, o anticorpo secundário é complexado à biotina, e é adicionado ao meio

reacional à estreptavidina ligada a uma peroxidase. A estreptavidina tem afinidade à biotina e
liga-se a ela e, consequentemente, ao anticorpo secundário. Em seguida, é adicionado ao meio
reacional a 3,3-diaminobenzina (DAB) , que reage com a peroxidase, reduzindo o DAB que se
precipita no local de reação e gera uma cor marrom- ferruginosa. A coloração marrom indica
que houve interação antígeno-anticorpo (Figura 18).
Fonte: Vetpathologist/Shutterstock
 Figura 18: Corte histológico mostrando as enzimas pepsinogênicas (coloração marrom) no
estômago. Imuno-histoquímica por complexo avidina-biotina-enzima-cromógeno.

TESTE DE HIPERSENSIBILIDADE CELULAR

CUTÂNEA TARDIA
Todas as técnicas que verificamos até aqui estudam a imunidade humoral, com a interação
antígeno e anticorpo. Mas e a imunidade celular? Quais são as técnicas que avaliam in vitro ou
in vivo esse tipo de imunidade?

A análise da imunidade celular in vitro é feita pela linfoproliferação e citometria de fluxo e in

vivo a partir do teste de hipersensibilidade celular cutânea tardia. O teste de hipersensibilidade
tardia é um método simples e pode ser empregado para confirmar exposição prévia a alguns
agentes infecciosos, como Mycobacterium tuberculosis, Hanseníase, Leishmania, Candida
albicans, Paracoccidioides brasiliensis, dentre outros. Para isso:

ETAPA 1
ETAPA 2
ETAPA 3
ETAPA 1

São aplicados no antebraço do paciente 0,1 mL de antígeno específico com agulhas e seringas
estéreis, por via intradérmica.

A via subcutânea não é recomendada, pois diluiu os antígenos inoculados, levando a

resultados falso negativos.

ETAPA 2

No outro antebraço, é aplicado a mesma quantidade de Soro fisiológico 0,9% estéril (salina)
como controle.

ETAPA 3

Após 48-72 horas, é realizada a leitura, onde é medido o diâmetro do endurecimento (Parte
dura) . Normalmente, caroços superiores a 5 mm são indicativos de uma reação imune
celular (Tipo th1) no local e da exposição ao antígeno pesquisado, mas o tamanho depende
do tipo de antígeno (Figura 19).
Fonte: Adaptado de Shutterstock
 Figura 19: Ilustração mostrando o teste de PPD.

Um teste positivo não indica que o paciente esteja doente ou que obrigatoriamente tenha tido
uma infecção. O aparecimento do eritema e do endurecimento indica a presença de células de
memória do tipo Th1, por uma doença que já foi curada ou uma infecção assintomática, onde o
participante não apresentou sintomas. O teste negativo indica a ausência de contato com
aquele agente infeccioso.

Alguns exemplos do emprego do teste hipersensibilidade celular cutânea tardia, ou teste de

PPD (derivado proteico purificado):

Pesquisa a exposição ao Mycobacterium tuberculosis, com o antígeno tuberculina,

conhecido como teste de Mantoux.

Pesquisa a exposição à hanseníase com o antígeno lepromina, ou antígeno de Mitsuda.

Pesquisa a exposição a Candida albicans com os antígenos candidina ou oidiomicina.

Pesquisa a exposição a Paracoccidioides brasiliensis com o antígeno paracoccidioidina.

Pesquisa de Leishmaniose tegumentar com o extrato de protozoário como antígeno, o

famoso teste de Montenegro.
Além disso, essa metodologia é indicada para avaliar a diminuição da imunidade celular do tipo
th1 (anergia) em indivíduos que não respondem mais a microrganismos não patogênicos,
situação que é observada em pacientes imunossuprimidos pelo uso de drogas e doenças,
como neoplasias, AIDS, doenças autoimunes. Alguns produtos químicos quando aplicados ao
antebraço provocam uma sensibilização e uma reação imune no local. Essa propriedade tem
sido utilizada para analisar casos de anergia e a droga mais empregada é o DNCB. Esse é um
teste que não é de rotina e deve ser feito apenas com pacientes com suspeita de ausência de
resposta imune celular.

Fonte: Pixel-Shot/Shutterstock
CITOMETRIA DE FLUXO E
QUIMIOLUMINESCÊNCIA

VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. VIMOS QUE A TÉCNICA DE ELISA É AMPLAMENTE UTILIZADA NO
DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO DE DIFERENTES DOENÇAS
INFECCIOSAS, COMO HIV, DOENÇA DE CHAGAS, COMO TAMBÉM É
CAPAZ DE DETECTAR HORMÔNIOS COMO A GONADOTROFINA
CORIÔNICA HUMANA. ESSA TÉCNICA APRESENTA ALGUMAS
VARIAÇÕES E, DE ACORDO COM A METODOLOGIA, PODE SER
CLASSIFICADA EM ELISA DIRETO, COMPETITIVO E INDIRETO. SOBRE
ESSE ASSUNTO, MARQUE A ALTERNATIVA CORRETA.

A) O teste de ELISA indireto é utilizado para verificar apenas a presença de antígenos em

cortes de tecidos.

B) O teste de ELISA direto é utilizado para verificar a presença de antígenos em cortes de

tecido.

C) No teste de ELISA competitivo, a intensidade de cor e a concentração de antígenos na

amostra em investigação é diretamente proporcional.

D) O teste de ELISA competitivo é utilizado para verificar apenas a presença de antígenos em

cortes de tecidos.

2. APRENDEMOS QUE OS TESTES RÁPIDOS SÃO MUITO UTILIZADOS

QUANDO PRECISAMOS DE UM DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO IMEDIATO,
PARA A DETECÇÃO DE DOENÇAS INFECTOCONTAGIOSAS COMO
COVID, DENGUE, HIV E SÍFILIS E É UMA TÉCNICA DE FÁCIL EXECUÇÃO,
VERSÁTIL E QUE DISPENSA EQUIPAMENTOS. OS TESTES RÁPIDOS
DETECTAM A INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPOS POR QUAL
REAÇÃO?

A) Imunoenzimática

B) Imunocromatografia

C) Imuno-histoquímica

D) Teste de sensibilidade cutânea

GABARITO
1. Vimos que a técnica de ELISA é amplamente utilizada no diagnóstico imunológico de
diferentes doenças infecciosas, como HIV, doença de chagas, como também é capaz de
detectar hormônios como a gonadotrofina coriônica humana. Essa técnica apresenta
algumas variações e, de acordo com a metodologia, pode ser classificada em ELISA
direto, competitivo e indireto. Sobre esse assunto, marque a alternativa correta.

A alternativa "B " está correta.

O teste de ELISA direto é um teste para verificar a presença de antígenos em cortes de

tecidos. O ELISA indireto e competitivo pode analisar tanto antígenos como anticorpos. No
teste de ELISA competitivo, a intensidade de cor e a concentração da amostra é inversamente
proporcional, quanto maior a intensidade de cor, maior é a concentração de antígenos na
amostra em investigação, pois menor é a ligação dos antígenos conjugados ao anticorpo de
captura.

2. Aprendemos que os testes rápidos são muito utilizados quando precisamos de um

diagnóstico imunológico imediato, para a detecção de doenças infectocontagiosas como
COVID, dengue, HIV e sífilis e é uma técnica de fácil execução, versátil e que dispensa
equipamentos. Os testes rápidos detectam a interação antígeno-anticorpos por qual
reação?

A alternativa "B " está correta.

Os testes imunocromatográficos realizam a detecção da interação antígeno-anticorpo pela

difusão cromatográfica, onde o complexo formado gera uma cor, e a partir dele podemos
detectar antígenos ou anticorpos. Um exemplo clássico de teste imuncromatográfico são os
testes rápidos comerciais para detecção de várias doenças, como: HIV, Hepatite, COVID.

CONCLUSÃO

CONSIDERAÇÕES FINAIS
Ao longo desta jornada, conhecemos os diferentes testes imunológicos empregados para a
confirmação diagnóstica, o diagnóstico precoce, acompanhar a evolução e o tratamento de
uma doença, além de confirmar a presença de uma substância no organismo. Vimos que a
maioria dos testes utilizados consistem na interação antígeno-anticorpo. Essa interação pode
ser visível a olho nu (teste de precipitação, aglutinação ou fixação de complemento) ou então
um dos componentes da interação deve estar marcado com corante fluorescente ou
quimioluminescentes, radioisótopos, enzimas, entre outros marcadores, para que essa
interação seja visível (ELISA, radioimunoensaio, teste de fluorescências).

Ao final, foi verificado que o teste de hipersensibilidade cutânea tardia é uma forma de
verificação in vivo da imunidade celular, sendo essencial para confirmar a exposição prévia a
alguns agentes infecciosos e estudar casos de diminuição da imunidade celular do tipo th1
(anergia).

Juntos podemos entender a metodologia de cada teste, aplicabilidade, sua vantagem e

desvantagem, ampliando ainda mais o conhecimento sobre imunologia clínica.

REFERÊNCIAS
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H. Imunologia Celular e Molecular. 5. ed. Rio de Janeiro:
Elsevier, 2005.

MACHADO, S. L; MACHADO, R. D. Imunologia básica e aplicada às análises clínicas.

Consultado em meio eletrônico em: 18 ago. 2020.

MOLINARO, E. M.; CAPUTO, L. F. G; AMENDOEIRA, M. R. R. Conceitos e métodos para a

formação de profissionais em laboratórios de saúde. 3. ed. Rio de Janeiro: EPSJV: IOC,
2013.
WASTOWSKI, I.; DONADI, E. Imunologia básico para o clínico. Consultado em meio
eletrônico em: 18 ago. 2020.

EXPLORE+
Aprendemos que o efeito prozona acontece quando a concentração de anticorpos está maior
do que de antígenos e que isso pode levar a resultados falso negativos, pois a visualização
desses precipitados fica prejudica. Esse efeito é muito comum nos testes para detecção de
sífilis pelo teste de VDRL. Para conhecer mais sobre isso, busque o artigo Efeito prozona no
diagnóstico de sífilis pelo método VDRL: experiência de um serviço de referência no sul do
Brasil.

Conhecemos um pouco sobre o diagnóstico por ELISA e de que forma pode ser realizado.
Para saber mais, não deixe de pesquisar artigo Teste de ELISA indireto para o diagnóstico
sorológico de pitiose.

Para conhecer um pouco mais da aplicabilidade do teste rápido para HIV e como são utilizados
na clínica, leia o artigo Teste Rápido para Detecção da Infecção pelo HIV-1 em Gestantes.

Para compreender um pouco mais sobre o teste de sensibilidade cutânea Montenegro, leia o
artigo Avaliação do poder sensibilizante da reação de Montenegro.

Apreendemos que a citometria de fluxo é uma forma de avaliação da imunidade celular in vitro,
para conhecer mais sobre essa técnica leia Citometria de Fluxo no estudo das doenças infecto-
parasitárias.

CONTEUDISTA
Gabrielly Sbano Teixeira

 CURRÍCULO LATTES