1. Pendahuluan 2. Tinjauan Pustaka 3. Bahan dan Metode 3.1.

Bahan Bahan yang dipergunakan pada praktikum kali ini adalah temu ireng. Bahan kimia yang digunakan yaitu metanol 50 dan 80%, kloroform, etil asetat, akuades, asam asetat anhidrat, H2SO4 pekat, HCl, reagen Dragendroff, reagen Mayer, NH3 10%, NaCl 10%, garam gelatin, FeCl3, logam Mg, etanol, medium Nutrient Broth (NB), medium agar MH (Mueller Hinton), bakteri E. coli dan reagen pewarna iodomitrotetrazolium. Semua bahan diperoleh dari laboratorium kimia UKSW.

3.2. Piranti Piranti yang dipergunakan antara lain piranti kaca, corong pisah, chamber, plat KLT, rotary evaporator, kolf, shaker, spektrofotometer UV Mini 1240 Shimadzu, jarum ose, dan alat semprot.

3.3. Preparasi Sampel Temu Ireng

100 gram temu ireng dimaserasi selama 24 jam dengan pelarut metanol 80% lalu disaring. Residu dibilas 3 kali dengan pelarut metanol kemudian disaring dan filtrat digabung dengan filtrat awal. Filtrat dipekatkan dan dibagi dua. Satu bagian ekstrak dipartisi dengan 2 pelarut, etil asetat dan kloroform, masing-masing diulang 3 kali, sehingga pada akhirnya diperoleh 4 fraksi (eti asetat, kloroform, methanol, dan air)

3.4. Profil KLT Fraksi yang diperoleh di KLT dengan fase diam silica gel GF254 pada lempeng alumunium yang dielusikan dalam pelarut kloroform : Metanol = 9:1 dan 19 : 1.

Visualisasi dilakukan di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 dan 365 nm serta uap iod. 3.5. Pengukuran Kadar Air Sampel temu ireng dipotong kecil-kecil kemudian ditimbang sebanyak masing-masing 1 gram untuk pengukuran kadar air. Sampel yang telah ditimbang diletakkan dalam cawan petri sebanyak 3 buah lalu dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 1050C. Pada pengovenan pertama, sampel dioven selama 1 jam dan kemudian dimasukkan ke dalam desikator selama 15 menit dan ditimbang massanya. Setelah itu sampel dioven lagi dan ditimbang tiap 30 menit hingga massanya konstan dengan selisih massa 0,0002 gram, kemudian dihitung kadar air dari temu ireng. 3.6. Skrining Fotokimia ( Ciulei, 1978) 3.6.1 Identifikasi Sterol dan triterpen Ekstrak kasar diuapkan sampai kering. Residu yang dihasilkan dilarutkan dalam 0,5 ml asam asetat anhidridat. 0,5 ml kloroform ditambahkan pada residu. Campuran ini ditetesi dengan 1 2 ml H2SO4 pekat. Cincin merah kecoklatan atau violet menunjukan adanya sterol dan terpen. 3.6.2 Identifikasi alkaloid

Ekstrak diuapkan sampai kering. Ditambahkan 1,5 2% HCl lalu dibagi menjadi 3 tabung. Tabung 1 ditambah 0,5 ml larutan asam encer. Tabung 2 ditambahkan 2 3 tetes reagen Dragendorff. Tabung 3 ditambahkan 2 3 reagen Mayer. Jika tabung 1 jernih, tabung 2 terbentuk endapan jingga, tabung 3 terbentuk endapan kekuning kuningan hasil ini menunjukan adanya alkaloid.

3.6.3

Identifikasi Kumarin

Ekstrak diuapkan sampai kering kemudian dilarutkan dalam air panas dan dibagi dalam 2 tabung reaksi setelah dingin. Tabung 1 merupakan kontrol, tabung 2 ditambah 0,5 lm NH 10 %. Pijaran yang kuat dibawah UV menunjukan ada kumarin & turunannya. 3.6.4. Identifikasi Tannin dan fenolik Ekstrak kasar diuapkan sampai kering kemudian ditambah 10 ml air panas dan 5 tetes 10% NaCl. Larutan disaring dan dibagi menjadi 3 bagian, diambil 1 bagian sebagai kontrol. 3.6.4.1. Tes Gelatin Diambil 1 bagian lalu ditambahkan 2 tetes larutan garam gelatin. Pembentukan endapan mengidentifikasi keberadaan tannin. 3.6.4.2. Tes Ferriklorida Diambil 1 bagian yang tersisakemudian ditambahkan 3 tetes larutan FeCl3. Pembentukan warna biru kehitaman menunjukan hydrolysable tannin. pembentukan warna hijau kecoklatan menunjukan tannin terkondensasi.

3.7.

Uji flavon & aglikon

Ekstrak ditambah 1 2 ml metanol panas 50% ditambah logam Mg , kemudian ditambah 4 5 tetes HCl (p). Hasil positif jika warna larutan merah/orange.

3.8. Uji Saponin Ekstrak ditambah akuades (1 : 1) kemudian dikocok 5 menit. Jika terdapat gumpalan busa minimal 1 cm yang bertahan 15 menit, menandakan keberadaan saponin.

3.9. Uji Minyak atsiri Ekstrak ditambah etanol lalu diuapkan. Hasil positif Jika berbau mengengat.

3.10.
3.10.1.

Uji antibakteri Pembuatan Inokulum pada Media Nutrient Broth (NB)

Media NB dibuat dengan konsentrasi 8 g/l sebanyak 50 ml kemudian disetrilkan dengan autoklaf. 1 ose bakteri E. coli diinokulasikan pada media NB steril. Media kemudian digoyang dengan menggunakan shaker selama 24 jam. 3.10.2. Pembuatan Media Uji Media uji yang digunakan adalah medium agar MH (Mueller Hinton) dengan konsentrasi 21 g/l. 9 ml media agar MH ditambahkan 1 ml inokulum yang memiliki OD 0,4 0,5 pada panjang gelombang 550 nm kemudian dipadatkan. 3.10.3. Metode Difusi Cakram Pengujian aktivitas antibakteri temu ireng mrnggunakan kertas cakram 6 mm Schleicher dan Schuel. Cakram kertas yang sudah ditetesi ekstrak temu ireng dengan konsentrasi 250, 1000, dan 5000 ppm sebanyak 20l, dimasukan ke dalam medium agar MH (Mueller Hinton) yang sudah memadat dengan jarak yang relative sama antara satu dengan yang lain. Cawan diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam. sebagai control negative dan positif masing masing digunakan etanol dan antibiotik tetrasiklin. Pengukuran dilakukan terhadap diameter daerah hambatan (DDH) yang muncul.

3.10.4. Metode Bioautografi Uji antibakteri dilakukan dengan Metode Bioautogfrafi Langsung menurut Humburger et al, (1987). Metode bioautografi langsung menggunakan fase diam silica gel GF254 pada lempeng alumunium (Kromatografi Lapis Tipis/KLT) yang dielusikan dalam pelarut kloroform : Metanol = 19 : 1 menggunakan fraksi yang memiliki daya hambat terkuat berdasarkan hasi uji dengan metode difusi cakram. Lempeng KLT disemprot dengan suspensi bakteri dalam nutrient broth (NB) cair dan diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam dalam bejana kaca. Visualisasi digunakan reagen pewarna iodomitrotetrazolium 5 mg/ml. 4. Hasil dan Pembahasan Kadar air dari Temu Ireng adalah sebesar 63%. Tabel 1. Pengukuran Kadar Air Temu Ireng Massa Cawan Petri Massa Cawan Petri + sampel 1 gram Waktu (menit) 0 60 90 120 Kromatografi Lapis Tipis Untuk menentukan kombinasi pelarut yang cocok untuk kromatografi pada saat penentuan metode Bioautografi. Hasil pelarut yang cocok adalah dengan kombinasi Kloroform : Metanol = 19 : 1 I 38,1003 39,1003 38,1003 38,4453 38,4452 38,4461 II 36,7523 37,7523 37,7523 37,1260 37,1258 37,1274 III 48,7819 49,7819 49,7819 49,1488 49,1487 49,1499

Rf Plat KLT Visualisasi 1 0,943 0,514 9:1 2 0,914 0,8 0,743 0,686 0,6 0,914 0,743 0,657 0,543 3 0,914 0,657 0,514 4* 1 0,886 0,314 19:1 2 0,857 0,828 0,6 0,543 0,486 0,343 0,857 0,828 0,771 0,6 0,543 0,486 0,429 0,343 0,857 0,828 0,771 0,6 0,543 0,486 0,429 0,343 3 0,886 0,317
4*

UV 256 nm

0,514 0,371 0,7 UV 365 nm

0,914 0,828 0,686

0,886 0,314

0,886 0,771 0,457 0,371 0,2

0,514 0,371 0,7 Iod

0,914 0,743 0,657 0,543

0,914 0,828 0,686 0,543

0,886 0,314

0,886 0,771 0,514 0,457 0,371 0,2 0,114

Keterangan: 1 = Metanol 2 = Kloroform 3 = Etil Asetat 4 = Air * = Hasil tailing

Skreening Fitokimia Skreening dilakukan untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa yang terkandung di dalamnya. Tabel Skreening Fitokimia Triterpen Alkaloid Kumarin Tannin dan Fenolik Flavon dan Aglikon Saponin Minyak Atsiri Metanol + + + + Kloroform + + + Etil Asetat + + + Air + + + + -

Pada ekstrak temu ireng teridentifikasi bahwa mengandung triterpen, alkaloid, tannin, fenolik, dan saponin. Kandungan ekstrak temu ireng pada literatur adalah

Tabel Pengamatan DDH Hari ke - 1 Hari ke - 2 Keterangan C 250 1000 5000 C 250 1000 5000 Metanol Kloroform 1 cm Radikal Etil Asetat Air * 1 cm 0,88 cm 0,945 cm 0,965 cm Iradikal Keterangan: * = untuk fraksi air, kontrol (C) merupaka kontol positif (tetracyicilin 30 Fraksi g)

Gambar Bioautografi Air Kloroform

EA

Metanol