Citometria de fluxo

Imunologia Oral
(1) Citometria de fluxo
(2) Separação de células
Citometria de fluxo
Técnica que permite analisar e separar células

Utiliza propriedades físicas

(dimensões, granularidade)

Utiliza propriedades ópticas

(luz reflectida, fluorescência)

- técnica quantitativa
- técnica qualitativa
Fluorocromos
Exemplo: GFP
(green fluorescente protein)

Proteína extraída da alga

Aequorea victoria

Emite fluorescência na zona visível

Semelhante a FITC
Fluorocromos
Espectro de absorção / emissão da GFP
Citometria de fluxo
Técnica desenvolvida por Wallace Coulter (1950)

Primeiros citómetros de fluxo surgem em 1970

Equipamentos analisam, contam e separam

células
com base nas suas propriedades ópticas
(dispersão da luz e fluorescência)

Atualmente os equipamentos têm capacidade de

analisar até 13 parâmetros diferentes
(dispersão, reflexão, 11 cores fluorescentes)
Citometria de fluxo
Tipo de amostras biológicas analisadas

- sangue
- aspirados de medula óssea
- suspensões / homogenizados ganglionares

Virtualmente qualquer suspensão celular

Citometria de fluxo
O sistema é constituído por 3 componentes principais:

(1) O sistema de fluxo (microfluidica)

Células em suspensão são encaminhadas em fluxo laminar

(2) O sistema de óptica (sensor luminoso)

Sistema de laser que emite luz (de fluorescência) que é filtrada e recolhida

(3) O sistema de electrónica (processamento de sinal)

Luz emitida é convertida em valores digitais que são analisados
Focagem hidrodinâmica
As células são direcionadas para o centro do fluxo, de acordo com os princípios
físicos da focagem hidrodinâmica (microfluídica)

Apenas uma única célula (ou partícula) pode passar pelo feixe laser
Sistema de óptica
Aquisição de dados
Parâmetros ópticos
Parâmetros ópticos indicam propriedades físicas (tamanho, granularidade)
- tamanho celular: medido a partir do Forward Scatter
- granularidade: medido a partir do Side Scatter
Parâmetros ópticos
Forward Scatter (FSC) vs. Side Scatter (SSC)
Parâmetros ópticos
Forward Scatter (FSC) vs. Side Scatter (SSC)
Parâmetros ópticos
Forward Scatter (FSC) vs. Side Scatter (SSC)
Parâmetros ópticos
Forward Scatter (FSC) vs. Side Scatter (SSC)
Parâmetros ópticos
Fluorescência
Obtida a partir de anticorpos que marcam proteínas nas células a analisar
Análise electrónica
Parâmetros físicos e ópticos são combinados numa análise electrónica
- pulsos são gerados de acordo com a voltagem (depende de intensidade
luminosa)
Análise electrónica
Exemplo
Marcação dupla (anticorpo A vs. anticorpo B)
Exemplo
Marcação de linfócitos (CD4 vs. CD8)
Representação gráfica
Níveis de expressão antigénica
Sinal elétrico pode traduzir nível de expressão antigénica na superfície celular

- Se o antigénio é muito expresso: bright

- Se o antigénio é pouco expresso: dim

Permite avaliar diferentes populações

celulares: permite acompanhar células
durante processo de maturação e/ou
desenvolvimento
 Citometria de fluxo
Propriedades

(1) Análise combinada multiparamétrica

(2) Análise rápida de uma grande quantidade de células

(3) Análise a nível de uma única célula

(4) Deteção de populações celulares pouco abundantes

(5) Permite o isolamento físico de células

Aplicações
Análise de subpopulações linfocitárias

- Linfócitos totais: T, B, NK

Linfócitos T (CD3+)
T helper – auxiliares CD3+ CD4+
T killer – citotóxicos CD3+ CD8+

Linfócitos NK (CD56+ CD16+ CD3-)

Linfócitos B (CD19+ CD3-)

Aplicações
Tubo 1 CD3 / CD4 / CD8 / CD45
Aplicações
Tubo 2

CD3
CD16 / CD56
CD19
CD45
 Aplicações clínicas
Subpopulações linfocitárias

(1) Estudo e caracterização de imunodeficiências

(2) HIV / SIDA

Valor absoluto de linfócitos T CD4

(3) Estudo e caracterização de doenças auto-imunes

(4) Despiste de leucemias / linfomas
 Ensaios funcionais
Funções de resposta imunitária inata

(1) Fagocitose

(2) Metabolismo oxidativo

(3) Activação de TLR

(4) Citotoxicidade NK

(5) Desgranulação de basófilos

Fagocitose
Neutrófilos e Monócitos / Macrófagos

- Essenciais na defesa do organismo

contra infecções bacterianas e fúngicas

- Avaliação por microscopia electrónica

e/ou citometria de fluxo
Fagocitose
Fagocitose
Fagocitose
Gate em neutrófilos

Doente 1 – avaliação da capacidade fagocítica

Capacidade fagocítica: NORMAL

Fagocitose
Gate em neutrófilos

Doente 2 – avaliação da capacidade fagocítica

Capacidade fagocítica: DIMINUÍDA

 Ensaios funcionais
Funções de resposta imunitária adaptativa

(1) Proliferação celular em resposta a estímulos

(2) Produção de citocinas

(3) Citotoxicidade T
Avaliação da função dos linfócitos
Resposta Avaliação geral Avaliação celular

Timidina titriada [3H-TdR]

Reconhecimento de Ag Tetrâmeros
Libertação de 51Cr

Citocinas RIA, ELISA, mRNA, CBA, Luminex Marcação intracelular

Corantes de viabilidade
Citólise / citotoxicidade Libertação de 51Cr Marcadores de membrana viável
CD107

Proliferação / expansão clonal TTL, contagem… Diluição de marcadores (CFSE…)

Avaliação da função dos linfócitos
Isolamento de PBMCs por gradiente de densidade
Permite separar células mononucleares (monócitos, linfócitos)

Ficoll – polissacárido hidrofílico

Densidade 1.077 g/mL
Avaliação da proliferação celular
Marcação e estimulação com nucleótidos marcados

- Método sensível

- Utiliza timidina marcada

- Utiliza radioatividade
Avaliação da proliferação celular
Células não estimuladas Células estimuladas

3
3
H 3
H
3
H H
3
H 3
3 H
3
H 3
H
H
3
3 H
1456 cpm 3
H
H

3
3
H H
Stimulation index = cpm Stim / cpm Unstim

154348 cpm
Avaliação da proliferação celular
Marcação e estimulação com corantes nucleares (CFSE)
Avaliação da sinapse imunológica
Avaliação da sinapse imunológica

Ferro et al., 2020

Avaliação da produção de citocinas
Produção intracelular
de IFN

Ferro et al., 2020

Avaliação da produção de citocinas
Produção intracelular
de IFN

Double Single cells

ts

Ferro et al., 2020

Bom estudo!