PESQUISA

MILHO TRANSGNICO
Melhoria da qualidade nutricional do gro
Fotos cedidas pelos autores

milho, uma das maiores fontes de alimento, cultivado em todo o mundo. Movimenta um mercado de, aproximadamente, U$40 bilhes anuais, distribudos entre indstrias de produo de alimentos para consumo humano, raes e matria-prima para centenas de produtos industrializados. O Brasil produz mais de 30 milhes de toneladas de milho anualmente, em 13 milhes de hectares. Apesar de possuir teores proticos em torno de 10% da

Andra Almeida Carneiro Newton Portilho Carneiro

Ph.D Biologia Molecular andreac@cnpms.embrapa.br

Carlos Henrique S. Carvalho Maria J. V. Vasconcelos

Ph.D Biologia Molecular henrique@cnpms.embrapa.br

Ph.D Biologia Molecular newtonc@cnpms.embrapa.br

MS Agroqumica mariajose@cnpms.embrapa.br Ph.D Biologia Molecular edilson@cnpms.embrapa.br Embrapa Milho e Sorgo Sete Lagoas, MG.

Edilson Paiva

Figura 1: Estrutura do Gro de Milho. (A) Pericarpo; (B) Endosperma; (C) Embrio; (D) Pendculo
matria seca, a protena do gro do milho no considerada adequada para a nutrio de animais monogstricos incluindo o homem. Isso se deve ao

fato de que o endosperma, aproximadamente 80% do peso seco do gro, possuir uma baixa porcentagem de protenas ricas em aminocidos essenciais necessrios manuteno de uma dieta balanceada (Nelson, 1969). Na Amrica Latina, frica e sia, vrios milhes de pessoas dependem do milho como fonte diria de alimento. Para muitos, este cereal a principal fonte de protena da dieta. O grande estado de pobreza, em algumas regies do planeta, faz com que seja impossvel para seus habitantes comprar carne, ovos, leite, ou mesmo outros alimentos base de vegetais ricos em protenas para suplementar o milho. Muitas pessoas, entre elas recm-nascidos, crianas, mulheres grvidas e doentes, tm sua alimentao baseada em uma dieta quase que totalmente derivada do milho, o que no capaz de proporcionar crescimento e sade adequados (National Research Council, 1988). Dietas no balanceadas em carboidratos, protenas, lipdeos e micronutrientes so um problema mundial. Atualmente, mais de 800 milhes de pessoas, o equivalente a 15% da populao do mundo, obtm menos do que 2.000 calorias por dia e vivem em estado de fome permamente ou intermitente, sendo cronicamente subnutridos (Conway, 2000). Portanto, o melhoramento da composio nutricional de plantas usadas na alimentao, principalmente de culturas bsicas como o milho, uma necessidade ao redor do mundo. O Gro do Milho O milho uma planta cultivada de grande versatilidade, sendo utiliza-

Maurcio Antnio Lopes

Ph.D Biologia Molecular mauricio.lopes@embrapa.br Embrapa Sede - Braslia, DF

42

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

Figura 2: Melhoria da Qualidade Nutricional do Milho Hiptese em Estudo. A ORF do gene da -zena, representado pelo bloco vermelho, codifica para uma protena rica em metionina, um aminocido essencial. Entretanto, essa protena corresponde a apenas 5% das zenas presentes no endosperma do milho. No bloco azul est representado o gene da zenas, o qual codifica para uma protena abundante no endosperma, mas pobre em aminocidos essenciais. A abundncia de -zenas no gro devida principalmente alta atividade endosperma-especfico do promotor desse gene (PROM). Na tentativa de aumentar a produo da -zena no endosperma e, consequentemente, o teor de metionina do gro, um gene quimrico composto da regio promotora do gene das -zenas ligada regio codante do gene das -zena foi construdo (representado no esquema acima pelo bloco azul e vermelho). PROM: regio promotora dos genes; ORF: open reading frame ou regio codificadora das protenas
do diretamente como alimento, forragem ou matria-prima para vrios produtos industrializados. Somente conhecido em cultivo e, na sua forma atual, no apresenta indicativos de que pudesse sobreviver sem os cuidados do homem. Os programas de melhoramento gentico tm desenvolvido tipos to diferentes de milho, que seu cultivo possvel desde o Equador at o limite das terras temperadas e desde o nvel do mar at altitudes superiores a 3.600 m. O gro de milho uma cariopse que consiste de embrio, endosperma, pericarpo e pednculo (Figura 1). O pericarpo (camada externa) derivado da parede do ovrio e pode ser incolor, vermelho, marrom ou variegado. Os embries do milho no armazenam reservas durante o desenvolvimento da semente, a no ser uma pequena quantidade de lipdios no escutelo. Observase, entretanto, que as reservas de carboidratos so polimerizadas no endosperma na forma de amido e as reservas de protenas, acumuladas nos corpos proticos distribudos em todo o endosperma. O endosperma um tecido triplide, que se forma como resultado da fuso do ncleo do plen com dois ncleos femininos (Wolf et al., 1952). Esse tecido responsvel por 98% do amido, 80% da protena e 15% dos lipdios presentes no gro
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 43

Figura 3: Processo de Seleo e Regenerao de Plantas Transgnicas de Milho. (A) Embrio imaturo de milho com 2 mm; (B) Embries imaturos aps 2 semanas em meio de cultura N6 suplementado com Dicamba; (C) Calo embriognico cultivado em meio seletivo com glufosinato de amnio; (D) Processo de maturao de calos embriognicos; (E) Germinao de embries transgnicos; (F) Plantas transgnicas em casa de vegetao

(Glover and Mertz, 1987). As protenas do endosperma do milho podem ser divididas, de acordo com sua solubilidade, em quatro fraes: albuminas, globulinas, prolaminas e glutelinas. As albuminas so solveis em gua e as globulinas em solues salinas diludas. Albuminas e globulinas contribuem com 6% das protenas do endosperma; sendo que vrias delas so enzimas sintetizadas no incio do desenvolvimento do embrio. As glutelinas podem ser extradas com solues cidas ou alcalinas diludas e contribuem com 30 a 40% das protenas totais do gro. As prolaminas, 60% das protenas, so solveis em solues alcolicas e no possuem atividade enzimtica, sendo apenas fonte de aminocidos, nitrognio e esqueletos carbnicos para o desenvolvimento da plntula (Guimares, 1993). Prolaminas do milho so tambm conhecidas como zenas. As zenas so classificadas em quatro tipos distintos baseados na sua estrutura primria e solubilidade: 19 22 kD alfa zena (), 14 kD beta zena (), 16-27 kD gamma zena () e 10 kD delta zena () (Esen, 1986; Larkins et al., 1989). Alfa zenas so as protenas mais abundantes, perfazendo aproximadamente 60% das protenas de reserva, sendo seguidas pela -zena (25%), -zenas (5-10%) e -zenas (5%). As zenas possuem uma constituio aminoacdica bastante diversificada. As -zenas tm contedo elevado de glutamina (25%), leucina (20%) alanina (15%) e prolina (11%) e variam em tamanho de 210 a 245 aminocidos. A protena -zena constituda de 160 aminocidos e contm menos glutamina (16%), leucina (10%) e prolina (9%) que as -zenas, mas tem significativamente mais metionina (4%) e cistena (7%). A -zena possui 180 aminocidos e 7% de cistena e 25% de prolina. A -zena uma protena de 130 aminocidos e contedo muito alto do aminocido sulfurado metionina (23%) (Kirihara et al, 1988). Apesar das zenas constituirem a maior poro do gro de milho, seu valor protico para alimentao de animais monogstricos, incluindo o homem, baixo, devido baixa concentrao de aminocidos essencias, tais como lisina, metionina e triptofano. Os genes que codificam para essas protenas j foram isolados e caracte44 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

rizados (reviso Feix e Quayle, 1993). As -zenas so codificadas por uma famlia de genes mltiplos com 50 a 100 membros (Heidecker et al., 1991). Em contraste, , e zenas so codificadas por apenas um ou dois genes. Um dos maiores desafios no melhoramento do milho entender a regulao desses genes para que eles possam ser manipulados com o objetivo de melhorar a qualidade fsica e nutricional do gro. Melhoria da Qualidade Nutricional do Milho Utilizando Sequncias Endgenas: Uma Estratgia Desejvel do Ponto de Vista de Biossegurana Os melhoristas de plantas dependem da variabilidade gentica existente na natureza como matria-prima para desenvolverem cultivares superiores. A revoluo biotecnolgica ocorrida na ltima dcada possibilitou o desenvolvimento de tecnologias que permitem acesso a novas e variadas fontes de variabilidade gentica. Em especial, o aprimoramento das tecnologias de DNA recombinante tem gerado um crescente interesse na aplicao desses conhecimentos para gerao de nova variabilidade gentica, utilizvel em programas de melhoramento de plantas. O desenvolvimento de cultivares com uma melhor qualidade protica pode ser drasticamente acelerado com a utilizao de tcnicas de manipulao gnica e transformao. O Ncleo de Biologia Aplicada da EMBRAPA Milho e Sorgo Sete Lagoas / MG desenvolve uma ao multidisciplinar, que engloba a utilizao conjunta de tcnicas de melhoramento gentico e de biologia molecular, com o objetivo de desenvolver novas linhagens de milho tropical com qualidade nutricional melhorada. Para alcanar esse objetivo, genes endgenos que codificam protenas raras de alta qualidade nutricional tiveram sua regulao alterada por meio da engenharia gentica, com adio de promotores de protenas de reserva de alta atividade endosperma-especfica. Do ponto de vista de biossegurana, a estratgia de transformar milho com seqncias isoladas da prpria espcie desejvel, uma vez que se buscar apenas alterar a regulao de genes que j so naturalmente expressos na planta.

Na tentativa de aumentar a produo da -zena no endosperma utilizando-se tcnicas de biologia molecular, foi construdo um gene quimrico, onde a regio promotora do gene das -zenas foi ligada regio codante do gene das -zena. Como foi exposto anteriormente, a -zena uma protena que contm 23% do aminocido essencial metionina, mas essa protena corresponde a apenas 5% das prolaminas presentes no endosperma. Por outro lado, um dos promotores de maior atividade no endosperma do milho aquele dos genes que codificam a protena de reserva -zenas. Em milhos normais, 25% das protenas de reserva dos gros so representados pelas -zenas. As -zenas e as zenas so codificadas por genes presentes em uma ou duas cpias no genoma, o que torna seus sistemas regulatrios ferramentas potenciais para alterao da atividade gnica via engenharia gentica. Hipoteticamente, plantas transgnicas de milho, contendo a construo quimrica descrita acima, produziro uma maior quantidade de -zena no endosperma, uma vez que essa protena est sob o comando de um promotor de alta atividade endosperma-especfico promotor -zenas. Um esquema da estratgia utilizada para o melhoramento da qualidade nutricional do gro de milho mostrado na Figura 2. Um aumento da -zena no endosperma acarretar um conseqente aumento do aminocido essencial metionina no gro do milho, possibilitando o desenvolvimento de plantas de milho tropical transgnicas de alta qualidade nutricional sem a necessidade da utilizao de genes exgenos, uma vez que -zena e -zenas so normalmente expressas no endosperma de milhos no transgnicos. Transformao Gentica do Milho Via Biobalstica Atualmente, com o desenvolvimento da biologia molecular, houve um grande avano na compreenso dos mecanismos genticos e bioqumicos bsicos, o que permitiu o desenvolvimento de novas estratgias de melhoramento por meio da transformao gentica. Sendo uma das maiores comodites na agricultura internacional e uma fonte importante de nutrientes

para homens e animais, o milho tem sido alvo de muitos estudos de manipulao gnica (Barcelo e Lazzeri, 1995). Entretanto, a maioria dos estudos sobre produo de plantas transgnicas de milho foram realizados com a utilizao de gentipos adaptados ao clima temperado (Bohorova et al., 1999), portanto foi necessrio o desenvolvimento de tecnologias para a produo de linhagens de milho transgnicas adaptadas ao clima tropical e subtropical. Apesar dos cereais serem um dos grupos mais difceis de se transformarem, plantas transgnicas tm sido conseguidas utilizando estratgias tais como eletroporao, biobalstica e Agrobacterium tumefaciens (Hiei et

madas via A. tumefaciens. Esse mtodo tambm oferece vantagens sobre a transformao mediada por Agrobacterium tumefaciens, tais como independncia de gentipos especficos, simplicidade dos protocolos de transformao, uso de construes mais simplificadas e eliminao de falsopositivos devido persistncia de Agrobacterium no tecido infectado. A biobalstica baseada na transformao de clulas usando micropartculas de tungstnio ou de ouro revestidas com o DNA de interesse. Usandose equipamentos especiais denominados particle gun, as micropartculas so propulsionadas sob alta presso e penetram na parede celular e nas membranas sem matar as clulas (Klein

Figura 4: Comparao Entre as Zenas Presentes no Endosperma de Gros de Milho noTransgnicos e Transgnicos. A frao das zenas foi extrada de endospermas de gros de milho e separadas utilizando gel de poliacrilamida. Coluna 1: Marcador de peso molecular; Coluna 2: Milho no transgnico; Colunas de 3 a 10: Milho transformado com a construo gnica que contm o promotor da -zenas, e a regio codante da -zena

al., 1994; Ishida et al., 1996; Cheng et al., 1997). Bombardeamento de micropartculas cobertas com DNA de interesse, biobalstica, tem sido o mtodo de maior sucesso para produo de miho transgnico, uma vez que as gramneas no so facilmente transfor-

et al., 1987). Em geral, o tecido que bombardeado pode ser regenerado e plantas transgnicas so produzidas. Para a produo de milho tropical transgnico via biobalstica, foi desenvolvido um protocolo na EMBRAPA Milho e Sorgo, onde embries imaturos, de 1,5 a 2,0 mm, foram isolados em condies estreis e cultivados durante 2 a 6 dias, em meio bsico N6 (Chu et al., 1975) suplementado com 2,4-D ou Dicamba. Durante o bombardeamento, foram utilizadas micropartculas de tungstnio aceleradas por um aparelho movido a hlio. Um estoque de micropartculas de tungstnio foi preparado ressuspendendo 60 mg de tungstnio M10 (Sylvania, GTE Chemicals/ Towanda USA) em 1 ml de uma soluo com 50% de glicerol estril. DNA plasmidial, construo que contm o gene da -zena sobre o controle do promotor da -zenas, foi precipitado sobre 50 l da soluo estoque de tungstnio. As partculas

de tungstnio cobertas com DNA foram cuidadosamente lavadas e ressuspendidas em 60 l de etanol 100%. Seis microlitros foram depositados no centro dos macrocarreadores, discos (24 mm) de membranas Kapton (Du Pont). Essas membranas foram usadas no bombardeamento dos tecidos de interesse utilizando 1100 psi de presso de gs hlio, 1,6 g/tiro de DNA plasmidial e os explantes foram posicionadas a 6 cm da plataforma de lanamento das micropartculas. Foram mantidos constantes a distncia entre a cmara de gs de alta presso e a membrana carreadora contendo as micropartculas cobertas com DNA (8 mm), distncia entre a membrana carreadora e a tela de reteno (12 mm) e a presso de vcuo (27 mm Hg). A seleo de plantas transgnicas foi iniciada 14 dias aps o bombardeamento, quando os calos de milho foram transferidos para meio bsico N6 suplementados com glufosinato de amnia, o composto ativo do herbicida Finale. Os calos foram subcultivados a cada 2 semanas, em dosagens crescentes de glufosinato de amnia. Para regenerao, os calos embriognicos foram transferidos para meio MS suplementado com glufosinato de amnia e cultivados a 26oC em luz (16 horas). As plantas com aproximadamente 5 cm de altura foram transferidas para o solo, em casa de vegetao. A Figura 3 ilustra o processo de seleo e regenerao de plantas transgnicas a partir de embries imaturos de milho. O DNA genmico foi isolado das plantas transformadas, usando-se o protocolo de Dellaporta et al. (1983). 30 g de DNA enzimaticamente digerido com EcoRI foi transferido para uma membrana de nylon pela tcnica de Southern blot. O DNA transgnico foi detectado usando-se o mtodo quimioluminescente de digoxigenina. As fraes zenas, no-zenas e a protena total extradas foram quantificadas pelo teor de nitrognio determinado pelo mtodo micro-Kjeldhal. Resultados e Concluses O protocolo de regenerao e transformao de milho tropical desenvolvido nos laboratrios do Ncleo de Biologia Aplicada (NBA) da EMBRAPA Milho e Sorgo, atualmente atinBiotecnologia Cincia & Desenvolvimento 45

giu uma eficincia entre 0,66 e 3,0% para a produo de plantas transgnicas pelo uso do bombardeamento do tecido escutelar de embries imaturos de milho tropical. Essa eficincia de produo de plantas transgnicas de milho similar descrita por vrios laboratrios internacionais que trabalham com milho de zonas climticas temperadas. O domnio da tecnologia para transformao gentica de milho tropical nos insere em um seleto grupo de instituies capazes de executar todas as etapas tcnicas necessrias obteno de plantas transgnicas de milho. Ressaltando que esse conhecimento dever ser utilizado no apenas para obteno de plantas transgnicas, mas, tambm, em processos de avaliao e monitoramento de produtos transgnicos disponibilizados no mercado brasileiro. As plantas transgnicas obtidas nesse estudo, confirmadas atravs da tcnica de Southern blot, cresceram normalmente e produziram gros de milho duros e vtrios. Anlises iniciais da protena do endosperma dos gros transgnicos (Figura 4) mostraram que, conforme o previsto, em alguns eventos transgnicos, houve um aumento na produo da -zena, entretanto um aumento na produo da -zena, outra protena rica em aminocidos essenciais, tambm foi observado. Interessantemente, a -zena desapareceu na maioria dos gros transgnicos analisados. Alteraes no nvel da -zena parecem estar relacionadas com a dureza e a vitricidade dos gros de milho. Muitos dos gros transgnicos produzidos, apesar de serem vtrios, no possuem -zena no endosperma, portanto, novos questionamentos relacionados ao processo de modificao do endosperma farinceo para vtrio surgiram com esse trabalho. Os estudos do gro para avaliar as consequncias da mudana do teor protico na formao ultraestrutural dos corpos proticos e na deposio de amido, bem como estudos bioqumicos para analizar detalhadamente a nova composio aminoacdica dos gros transgnicos produzidos continuam em andamento. Os resultados obtidos nesse projeto serviro como base para a produo de linhagens de milho tropical
46 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

transgnicos que podero ser incorporadas a programas de melhoramento tradicional, diminuindo o tempo e o custo na produo de novos gentipos de melhor qualidade nutricional. Agradecimentos Os autores agradecem o suporte tcnico dado pelas seguintes pessoas: Antnio G. P. Filho, Clio V. Moreira, Douglas Barduche, Luana M. Costa, Luciano Paiva, Luciano P. Nogueira, Marcelo A. Fontes, Mariana C. A. Gonalves, Maurcio S. Antunes, Raymundo D. Filho, Rosimere C. S. Saraiva, Solange M. Barbosa, Ubiraci G. P. Lana. AAC bolsista recm-doutor pelo CNPq. Orgos financiadores: SEP EMBRAPA, PROMOAGRO, CNPq, FAPEMIG, IAEA, PADCT, PRONEX. Referncias Bibliogrficas 1. Cheng, M; Fry, J E; Paang, S; Zhou, H; Hironaka, C M; Duncan, D R; Conner, T W; Wan, Y. 1997. Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Physiol. 115: 971 980. 2. Chu, C C; Wang, C C; Sun, C S; Hsu, C; Yin, K C; Chu, C Y; Bi, F Y. 1975. Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparaative experiments on the nitrogen sources. Sci Sinica 18; 659 668. 3. Conway G. 2000. President Rockefeller Foundation, New York. Speech delivered March 28 in Edinburgh, Scotland at: GM Food Safety: Facts, Uncertains, And Assessment; The Organization For Economic CoOperation And Development (OECD) Edinburgh Conference on the Scientific and Health Aspects of Genetically Modified Foods. 4. Dellaporta, S L; Wood, J; Hicks, J B. 1983. A plaant DNA minipreparation: version II. Plant Mol. Biol. Rep. 1: 19 21. 5. Esen, A. 11986. Separation of Alcohol soluble proteins (zeins) from maize into three fractions by differential solubility. Plant Physiol. 80: 623 627. 6. Feix, G and Quayle, T. 1993. Structure and expression of zeins

genes. Cr. Rev. Plant. Sci 12, 111 - 127. 7. Glover, D V and Mertz, E T. 1987. In: Nutritional Quality of Cereal Grains: Genetic and Agronomic Improvement. Agronomy Monograph, Olson R A and Frey K J eds. (Madison, Wisconsin: American Society of Agronomy), pp. 183 - 336. 8. Guimares, C T. 1993. Caracterizao de populaes indgenas de milho (Zea mays L.) que apresentam gros opacos. Tese M.S. Universidade Federal de Viosa, Viosa, Minas Gerais. 9. Heidecker, G; Chaudhuri, S and Messing, J W. 1991. Highly clustered zein gene sequences reveal evolutionary history of the multigene family. Genomics 10: 719 726. 10. Hiei, Y; Ohta, S; Komari, T; Kumasho, T. 1994. Efficient transformation of rice mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of T-DNA. Plant J 6: 271 282. 11. Ishida, V; Saito, H; Ohta, S; Hiei, Y; Komari, T; Kumashiro, T. 1996. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nature Biotech. 14 : 745 - 750 12. Kirihara, J A; Hunsperger, J P; Mahony, W C and Messing, J W. 1988. Differential expression of a gene for a methionine rich storage protein in maize. Mol. Gen. Genet. 211, 477484. 13. Klein, T M; Wolf, E d; Wu, R; Sandford, J C. 1987. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature 6117: 70 73. 14. Larkins, B A; Lending, C R; Wallace, J C; Galili, G; Kawata, E E, Geetha, K B, Kris, A L Martin, D N and Bracker, C E. 1989. In: The Molecular Basis of Plant Development, R. B. Goldberg, ed (New York: Alan R. Liss, In.), pp. 109-120. 15. National Research Council. 1988. Quality-Protein Maize. National Academy Press, Washington, D.C. 16. Nelson, O E. 1969. Genetic modification of protein quality in plants. Advanced Agronomy, 21:171194. 17. Wolf, M J; Buzan, C L; Mac Masters, MM; Risr, CE. 1952. Structure of the mature corn kernel. I. Grass anatomy and structure relationship. Cereal Chemistry, 29: 321-333.