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IMUNOCITOQUMICA

PROTOCOLO N 70 1) FIXAO DAS CLULAS Reagentes/solues: paraformaldedo (p) NaOH 10M NaH2PO4 (0,2M) Na2HPO4 (0,2M) d H2 O (18,2Mcm) 1.1. Material: seringa 50 ml, filtro, fitas para pH becker 100 ml, garrafas de 50 ml pipeta de vidro misturador, termmetro balana, cmara de fluxo laminar

PREPARAR SOLUO DE PARAFORMALDEDO 4% (W/V) EM BUFFER FOSFATADO (0,1M PH7,4)

pesar 4g de paraformaldedo (pesar na cmara de fluxo laminar) dissolver em menos de 50 ml de dH2O aquecer a 60oC, misturando continuamente adicionar 1-2 gotas de NaOH 10M (a soluo ficar mais clara) filtrar (utilizar seringa de 50 ml) assim que a soluo esfriar

preparar 50 ml de soluo de phosphate buffer 0,2M (pH7,4) misturando: 9,5 ml de NaH2PO4 (0,2M) + 40,5 ml de Na2HPO4 (0,2M)

misturar solues de paraformaldedo e tampo fosfatado checar pH (com fita: deve estar entre 7 e 8) completar com dH2O at volume de 100 ml (esta soluo pode ser mantida por at 1 semana a 4oC, protegida da luz)

1.2. FIXAO DAS CLULAS

Ao meio de cultura de clulas em pratos de 6 poos, adicionar igual volume de soluo de paraformaldedo (usualmente 2 ml) deixar na cmara de fluxo laminar por aproximadamente 30 minutos aspirar soluo/meio e lavar poos com 1 ml de phosphate buffer 0,1M (pH 7,4) (preparado como acima, mas acrescentando 50 ml de dH2O)

adicionar 3 ml de metanol gelado (-20oC); deixar culturas a -20oC overnight aspirar metanol e lavar duas vezes com TBS gelado (0oC); armazenar culturas em TBS por at 1 semana.

2) IMUNOCITOQUMICA Reagentes/solues: TBS Triton-X 100 0,2% (v/v) em TBS normal goat serum (NGS) Tris-HCl (pH 7,6) 50 mM (+ reagents) ou Dako liquid DAB substrate/chromogen system Glycergel mounting media aspirar contedos dos poos e adicionar (1 ml por poo): TBS-TritonX por 30 min. TBS-TritonX + 10% (v/v) NGS por 30 min. 1o anticorpo: (vide quadro) em TBS-TritonX-1%NGS por 4 horas (temp.amb.); lavar 3 vezes (10 min. cada vez) com TBS (1 ml por poo), no misturador suave 2o anticorpo: Anticorpo biotinilado goat anti-rabbit ou goat anti-mouse, em TBS-TritonX-1%NGS, por 30 min. (temp.amb.); lavar 3 vezes (10 min. cada vez) com TBS (1 ml por poo), no misturador Anticorpos: TP-70 (anti-rabbit) 1:2000 Tau-1 (anti-mouse) 1:200 B-19 (policlonal)

suave 3o anticorpo: streptavidin horseradish peroxidase 1:200 em TBS-TritonX1%NGS; 30 min. em temp.amb.; lavar 3 vezes (10 min. cada vez) com TBS (1 ml por poo), no misturador suave incubar por 10 minutos (5-30) em: Tris-HCl (pH 7,6) 50 mM contendo 0,25 mg/ml 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride + 0,015% (v/v) H2O2 ou (simplesmente): Dako liquid substrate/chromogen system: 20 l DAB chromogen per 1 ml buffered substrate; 200 l / poo lavar culturas com dH2O e colocar coverslips utilizando Glycergel mounting media (Dako). REAGENTES TritonX-100: t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (Sigma, T9284) Normal Goat Serum (Sigma Immunochemicals, G-023) Dako liquid DAB substrate-chromogen system (Dako, K3465) Dako Glycergel mounting medium (Dakopatts)