Captulo 17 Biodiversidade molecular e gentica da conservao

Prof. Dr Antonio M. Sol-Cava (sole@biologia.ufrj.br) Laboratrio de Biodiversidade Molecular Departamento de Gentica, Instituto de Biologia Universidade Federal do Rio de Janeiro Rio de Janeiro RJ

17.1 - INTRODUO
Apesar de ser muito popular hoje em dia, a expresso Diversidade Biolgica somente comeou a ser usada na literatura h pouco tempo (Norse e McManus, 1980). A expresso Biodiversidade mais recente ainda, tendo sido usada pela primeira vez em 1985, por W.G. Rosen, para uma reunio do Foro Nacional de Biodiversidade (norte-americano), em Washington. Desde sua origem, o termo Diversidade Biolgica j trazia a idia do conjunto de variabilidade ecolgica (nmero de espcies de uma comunidade e suas interaes) e gentica (diversidade de alelos nos vrios locos de uma espcie). O componente gentico da biodiversidade fundamental, pois a variao gentica que fornece o material bsico para a seleo natural e, portanto, para a evoluo de todas as espcies (Allcock et al., 1995). Com o aumento da populao humana e o desenvolvimento industrial, a biodiversidade do planeta sofreu modificaes profundas. A sociedade humana consome atualmente 40% de toda produo primria terrestre do planeta (Vitousek et al., 1986) Nunca uma nica espcie consumiu uma proporo to grande dos recursos naturais. Alm disso, as modificaes causadas por nossa espcie nas demais so, em geral, no sentido da reduo da biodiversidade. Essa reduo implica no somente o desaparecimento de espcies num ritmo sem precedentes na histria do planeta, mas tambm no florescimento de algumas outras, como aquelas que nos servem de alimento (como vacas, galinhas, trigo, etc.), aquelas que nos usam como alimento (como bactrias, mosquitos, vermes, etc.), e as que so comensais da sociedade humana (como baratas, ratos, pombos, etc.). O objetivo central da gentica da conservao o estudo da biodiversidade molecular nas populaes naturais das espcies sob impacto antropognico. A gentica da conservao foi criada h cerca de 20 anos, e os primeiros livros a rever o assunto foram feitos no incio dos anos 80 (Soul e Wilcox, 1980; Schonewald-Cox et al., 1983). Naquele momento, a gentica da conservao se resumia praticamente a estimativas de variabilidade gentica (heterozigosidade) e a sua extrapolao para a estimativa do tamanho efetivo de populaes ameaadas ou que haviam sofrido estrangulamentos populacionais (bottlenecks, em ingls, tambm chamados de gargalos populacionais) recentes (Soul, 1980). Por causa dessa limitao, a gentica da conservao foi criticada no final dos anos 80 como um desperdcio de dinheiro/esforos que poderiam ser melhor utilizados na manuteno de parques e reservas ambientais, pois as questes demogrficas como o nmero absoluto de indivduos e variaes estocsticas nesses nmeros seriam mais importantes do que as questes genticas, pelo menos da forma que eram apresentadas na poca (Lande, 1988). No entanto, com a maior compreenso pelos geneticistas dos problemas enfrentados pelos conservacionistas, que por sua vez compreenderam melhor o potencial que marcadores genticos tm para a abordagem de seus problemas, a gentica da conservao voltou a se Captulo 17

3 tornar uma cincia til e auxiliar para cientistas e pessoas em geral interessadas na conservao ambiental. Dessa forma, ao contrrio dos livros produzidos nos anos 80, uma grande diversidade de problemas foi abordada em publicaes recentes sobre gentica da conservao (boas revises recentes podem ser vistas em Avise e Hamrick, 1996 e Avise, 1998). A variabilidade gentica, tambm chamada de biodiversidade molecular, alm de importante para a evoluo, pode ser usada como instrumento de investigao por eclogos e sistematas em diversos ramos como, por exemplo, para verificar as afinidades e os limites entre as espcies, para detectar modos de reproduo e estrutura familiar, para estimar nveis de migrao e disperso nas populaes e at mesmo para ajudar na identificao de restos animais, como contedos estomacais e produtos industrializados (principalmente peles e carne) de espcies ameaadas de extino (Avise, 1994). Os dados bsicos para esses estudos so os chamados marcadores moleculares, que so locos gnicos que apresentam alguma variabilidade no escopo do problema a ser estudado (Avise, 1994; Silva e Russo, 1999). Lamentavelmente, os recursos disponveis para a preservao da biodiversidade so em geral muito reduzidos, por conta de decises polticas dos governos que raramente priorizam a conservao ambiental. Portanto, necessrio evitar que recursos to necessrios na manuteno e fiscalizao de parques e reservas nacionais sejam desviados, apenas por questes de modismo, para pesquisas genticas (que so geralmente bastante caras), a no ser nos casos em que os problemas esto claramente definidos e para os quais a abordagem gentica realmente pode fornecer dados originais impossveis de obter de outras maneiras. Naturalmente devemos lutar atravs da educao e da sensibilizao da opinio pblica (em ltima anlise a maior moeda corrente com valor na influncia de decises governamentais) para que a escolha no seja entre o estudo e a preservao da biodiversidade. Mas tambm devemos ser seletivos na aplicao de recursos na gentica da conservao, para evitar desperdcios. A maior parte dos problemas que podem ser abordados por eclogos ou sistematas pode tambm ser abordada molecularmente, com maior ou menor eficincia. No entanto, devemos concentrar o uso da gentica da conservao naqueles aspectos que sejam importantes mas ao mesmo tempo difceis ou impossveis de ser abordados por aquelas duas disciplinas. Dessa forma, a gentica da conservao se revela uma cincia til para o trabalho dos outros profissionais interessados na conservao da biodiversidade e a colaborao com eles passa a ter efeito multiplicativo nos resultados obtidos. O objetivo deste texto apresentar, brevemente, como os marcadores moleculares, interpretados sob a luz da gentica de populaes, podem ser usados para auxiliar no estudo e na conservao da biodiversidade.

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17.2 MARCADORES MOLECULARES

A matria bruta dos estudos em biodiversidade molecular a mesma envolvida na evoluo das espcies: a variabilidade gnica. essa variabilidade que nos permite comparar indivduos, populaes ou espcies diferentes. Em outros captulos deste livro foram apresentadas as principais tcnicas de estimativa da variabilidade gnica (aloenzimas no Captulo 5, RFLP no captulo 14 , RAPDs, microssatlites, seqenciamento de DNA no captulo 15) e portanto no vamos nos estender aqui na sua descrio (outras revises sobre marcadores moleculares podem ser encontradas em Hoelzel, 1992; Avise, 1994; Ferreira e Grattapaglia, 1996; Parker et al., 1998 e Silva e Russo, 1999). O mais importante, do ponto de vista da gentica da conservao, o fato de que marcadores moleculares diferentes podem ter taxas de substituio/evoluo diferentes, de modo que, atravs de uma escolha judiciosa desses marcadores, podemos estudar desde problemas de identificao de indivduos identificao de espcies crpticas ou formulao de hipteses filogenticas em grupos supraespecficos. Os marcadores disponveis atualmente podem ser classificados de acordo com a existncia de dominncia: padres com dominncia, como os gerados com RAPD ou AFLP, so menos teis em anlises populacionais, pois exigem um pressuposto importante e freqentemente violado o equilbrio de Hardy-Weinberg para que possam ser estimadas as freqncias gnicas a partir dos dados brutos obtidos. Podem ainda ser classificados em relao possibilidade de vis sexual (DNA mitocondrial em geral transmitido apenas pelas fmeas), s taxas evolutivas (microssatlites e RAPDs evoluem muito rapidamente, aloenzimas evoluem mais lentamente), etc. (tabela 17.1). Tabela 17.1 uma comparao dos mtodos principais de estimativa da biodiversidade molecular. P&D custo de pesquisa e desenvolvimento para adequao da tcnica a cada projeto; Dados velocidade na produo de dados; Tcnica facilidade de interpretar geneticamente os dados. Abreviaes: AFLP "amplified fragment length polymorphism"; PCR/RFLP "Polymerase chain reaction/Restriction fragment length polymorphism"; RAPD "Random amplified polymorphic DNA"; SL/VNTR "Single locus/ Variable number of tandem repeats". Abordagem AFLP P&D baixo Custo mdio Dados rpido Herana dominante Tcnica mdia

Maior proble

Falta de homologia, domin

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5 Aloenzimas Microssatlites Minissatlites PCR/RFLP RAPD Seqenciamento baixo alto baixo baixo baixo baixo baixo mdio mdio baixo baixo alto muito rpido rpido rpido rpido muito rpido baixo codominante codominante codominante varivel dominante varivel difcil mdia difcil fcil difcil fcil Precisa material fresco

Busca dos primers para PC

Falta de homologia (exceto Escolha do gene

Falta de homologia, domin

Interpretao dos resultado

A escolha do mtodo a ser usado na abordagem de cada problema depende de vrios critrios cientficos e no cientficos. Entre os critrios cientficos est, em primeiro lugar, a adequao do grau de variabilidade do marcador molecular escolhido ao nvel de divergncia que se deseja estudar. Marcadores que evoluem rapidamente so teis para o estudo de indivduos, famlias e populaes, enquanto que marcadores que evoluem mais lentamente so melhor utilizados no estudo de espcies ou txons supra-especficos. Essa escolha crtica: se escolhermos um marcador que evolui de forma demasiadamente lenta para o nvel estudado, teremos pouca variabilidade e uma saturao de plesiomorfias nos dados (ou seja, todas as semelhanas observadas sero devidas ancestralidade dos alelos, e no haver eventos novos capazes de discriminar os grupos estudados). Se, por outro lado, escolhermos um marcador que evolui rpido demais para o nvel escolhido, teremos um excesso de variabilidade e uma saturao de homoplasias nos dados (ou seja, as semelhanas observadas sero freqentemente devidas convergncia acidental dos alelos devido ao carter finito do espao amostral e cometeremos erros na discriminao dos grupos). Um outro critrio importante na escolha o tipo de material disponvel para estudos. Em estudos com aloenzimas, por exemplo, necessitamos de quantidades maiores de material biolgico (pelo menos 200 mg para uma anlise completa de 30 locos enzimticos), que deve necessariamente estar fresco ou congelado (as enzimas se desnaturam ou so digeridas por proteases quando mantidas temperatura ambiente). Essa limitao pode ser importante se pretendemos estudar espcies raras (a coleta de tecido geralmente destrutiva) ou muito pequenas. Esse problema no existe para a maioria dos mtodos com DNA graas ao advento do PCR, pois este permite o uso de quantidades muito pequenas de tecido incluindo aquelas preservadas em lcool ou desidratadas. Por outro lado, em estudos populacionais em que um Captulo 17

6 nmero muito grande de indivduos deve ser analisado (nmeros tpicos em projetos dessa natureza envolvem a anlise de 1.000-2.000 indivduos), tcnicas como seqenciamento de DNA so onerosas demais. Entre os critrios no cientficos que costumam determinar a escolha do marcador est a tradio do laboratrio; freqentemente, os laboratrios se tornam proficientes para um nmero limitado de tcnicas e as aplicam ao maior nmero possvel de problemas (Sol-Cava e Thorpe, 1994). Esses autores lembram um velho ditado russo que diz que para quem tem um martelo novo, tudo parece prego. Outro critrio no cientfico refere-se moda: tcnicas mais modernas ou sofisticadas so freqentemente consideradas melhores e mais fceis de obter financiamentos do que tcnicas mais antigas, mesmo quando as duas oferecem os mesmos tipos de resultados (Allcock et al., 1995). Um aspecto no cientfico mas muito importante na escolha do mtodo a ser usado o custo: para qualquer problema biolgico podemos escolher um nmero grande de abordagens. Faz parte do bom senso sermos financeiramente parcimoniosos quando tivermos que escolher entre tcnicas igualmente informativas mas com custos muito diferentes. A escolha do marcador molecular a ser usado depende, portanto, de vrios fatores. O fundamental que o problema a ser estudado esteja bem definido, que exista uma adequao do grau de polimorfismo do marcador escolhido ao tipo de divergncia evolutiva a ser estudada, que os pressupostos da anlise dos dados sejam bem explicitados e, por fim, que o pesquisador evite o fetiche da tcnica, no perdendo de vista o problema original em seu estudo.

17.3 APLICAES DE MARCADORES MOLECULARES NA CONSERVAO DAS ESPCIES

Como dito acima, marcadores moleculares podem ser usados como auxiliares para pesquisas em diferentes campos. Marcadores desse tipo foram usados, com sucesso, por exemplo, para: a) estimar os nveis de heterozigosidade e relacion-los com parmetros importantes na sobrevivncia das espcies, como eficincia reprodutiva e resistncia a doenas; b) analisar estruturas familiares, os efeitos da reproduo assexuada na populao e determinar o sexo de animais com pouco dimorfismo sexual externo; c) estimar o tipo de distribuio espacial e temporal das populaes em relao ao fluxo gnico, permitindo desenhar polticas adequadas de parques e reservas; d) verificar a biodiversidade nominal e os nveis de endemismo e cosmopolitismo das espcies, atravs de estudos de sistemtica molecular; e) identificar e acompanhar a disperso de espcies bioinvasoras; e f) identificar a origem de produtos industrializados para controlar a comercializao fraudulenta de espcies de venda proibida ou restrita. Captulo 17

7 Essas aplicaes sero brevemente comentadas a seguir.

17.3.1 - Heterozigosidade e fragilidade populacional

Populaes naturais tm normalmente nveis altos de variao gentica (Nevo, 1978; Sol-Cava e Thorpe, 1991). Essa variao introduzida continuamente nas populaes por mutao ou migrao de indivduos de outras populaes e perdida por deriva gentica, por endocruzamento e, no caso de genes no neutros, pela maior parte dos tipos de seleo natural (Nei, 1987). A variao gentica em uma populao pode ser medida pela heterozigosidade observada (ho), que a porcentagem de indivduos que so heterozigotos para um dado loco gnico. Uma outra medida a heterozigosidade em equilbrio (he ), que a proporo de indivduos que seriam heterozigotos se a populao estivesse em equilbrio de Hardy-Weinberg (he = 1 - fi2; onde fi a freqncia do alelo i na populao). Como o endocruzamento e a deriva gentica so inversamente proporcionais ao tamanho das populaes, comum observar nveis muito baixos de heterozigosidade em espcies que esto (ou que estiveram recentemente) ameaadas de extino. O tamanho das populaes, nesse caso, no igual ao nmero total de indivduos, como normalmente se considera em ecologia, mas sim como o nmero de indivduos participando na produo da prxima gerao, ou seja, excluindo os indivduos jovens ou velhos demais para a reproduo. Essa medida de tamanho populacional com relevncia gentica chamado de tamanho efetivo de populao (Ne ; Wright, 1931). O tamanho efetivo de populao leva em conta, tambm, a proporo sexual, de acordo com a frmula, Ne = 4N mNf / (Nm + N f), onde Nm e Nf so, respectivamente, os nmeros de machos e fmeas contribuindo para a reproduo da espcie. Essa relao tem implicaes importantes para o manejo de populaes ameaadas: por exemplo, se temos espao/recursos para manter 50 tigres em cativeiro em um programa de recolonizao, poderia ser demograficamente mais interessante ter um macho e 49 fmeas, pois em ltima anlise o nmero de fmeas que vai determinar o nmero de filhotes produzidos. No entanto, aplicando-se a frmula verificamos que, nesse caso, o tamanho efetivo de populao seria de apenas (4 X 1 X 49) / (1+49), ou seja, Ne seria apenas 3,92 indivduos! Se, por outro lado, tivssemos 25 machos e 25 fmeas, todos adultos e em idade reprodutiva, teramos um tamanho efetivo de 50, mas talvez nesse caso o nmero de filhotes produzidos fosse pequeno para fins de recolonizao. A deciso na administrao dessa populao vai depender, portanto, da obteno de uma proporo sexual que maximize o nmero de filhotes produzidos com um prejuzo menor na perda de variabilidade gnica. Captulo 17

8 Uma outra caracterstica do tamanho efetivo de populao que ele incorpora tambm um fator histrico: uma populao com um nmero grande de indivduos, originados h poucas geraes de um nmero pequeno de ancestrais, ter um tamanho efetivo menor do que populaes que permaneceram demograficamente estveis h muito tempo. O tamanho efetivo de uma populao em um dado momento pode ser estimado pela mdia harmnica dos tamanhos efetivos das n geraes passadas, de acordo com a frmula Ne = n / [(1/Ni)], onde Ni o tamanho efetivo da populao na gerao i. Imaginemos, por exemplo, que no caso anterior dos tigres, o macho e as 49 fmeas da primeira gerao produzissem em sua vida um total de 200 filhotes (100 machos e 100 fmeas), e que esses filhotes, por sua vez, produzissem uma F2 de 800 filhotes (400 machos e 400 fmeas). Ao final dessas trs geraes o tamanho efetivo da populao dessa F2 seria de apenas Ne = 3/[(1/3,92)+(1/200)+(1/800)] = 11,48 indivduos. Isso indica que a recuperao do tamanho efetivo de populao muito lenta aps um estrangulamento populacional. A relao existente entre variao gentica e tamanho efetivo da populao pode ser expressa na seguinte frmula, com base no modelo de alelos infinitos (Wright, 1978) he = (4Ne ) / (4N e +1), onde a taxa de mutao para o gene estudado. A diminuio do tamanho efetivo da populao , portanto, um dos principais responsveis pela perda de variabilidade em populaes ameaadas de extino. Um problema adicional enfrentado por populaes pequenas (<1000 indivduos) a fixao aleatria de alelos deletrios preexistentes ou oriundos de novas mutaes, que podem levar a populao a um colapso (mutational meltdown, em ingls; Lynch et al., 1995). As populaes de tamanho normal costumam apresentar um grande nmero de alelos deletrios com freqncias reduzidas (a chamada carga gentica da populao). Esses alelos, geralmente recessivos, so mantidos em freqncias baixas pela ao leve mas constante da seleo natural sobre os homozigotos. No entanto, em populaes pequenas, a no ser em regimes seletivos muito fortes, pode acontecer a fixao aleatria desses alelos deletrios. Uma vez fixados, esses alelos no so mais sujeitos ao da seleo natural, pela ausncia de alternativa gentica que possa ser selecionada. Dessa forma, enquanto que para os alelos letais ou altamente deletrios o endocruzamento significa uma purificao, para alelos levemente deletrios ele pode significar a imposio de uma carga gentica crnica que pode levar a populao ao colapso (Lynch et al., 1995). Alguns autores estimam que um tamanho populacional efetivo mnimo para evitar depresso por endocruzamento seja de 50 indivduos (Franklin, 1998; Soul, 1980). Esse Captulo 17

9 nmero sobe para 500 indivduos se se deseja tambm evitar a perda de variabilidade devido deriva gnica (Franklin, 1998). Esses valores, embora tenham sido empregados como padro, originam-se de estudos realizados com moscas drosfilas na dcada de 1950 e dependem naturalmente da variabilidade gentica e da arquitetura gentica dessa variao que importante fenotipicamente. Por esse motivo devemos ser cautelosos na determinao de valores mnimos de tamanhos populacionais para fins de conservao. Por exemplo, uma vez perdida a variabilidade gnica, ela s recuperada muito lentamente (por mutao ou migrao), de modo que, mesmo tomando-se providncias para aumentar o tamanho populacional de uma espcie, ela pode continuar ameaada de extino (Avise, 1994). Um dos exemplos mais claros de como essa perda de variabilidade gnica recuperada lentamente o caso dos elefantes marinhos, Mirounga angustirostrus. Essa espcie foi caada de 1820 a 1880 devido ao alto valor de seu leo. A caa foi to intensa que, por volta de 1884, a espcie foi considerada extinta, at que se encontrou uma populao sobrevivente na Ilha de Guadalupe, na Baixa Califrnia. Alguns censos indicaram que menos de 20 indivduos haviam sobrevivido, quando ento os governos americano e mexicano tomaram medidas radicais aprovando leis rgidas para impedir a extino desses organismos. A partir da a populao comeou a se expandir e fundar novas colnias, aumentando o tamanho populacional, hoje estimado em 750.000 indivduos. No entanto, esse estrangulamento do tamanho populacional no foi sem conseqncias. Como o tamanho efetivo de populao influenciado fortemente pelos estrangulamentos passados, os nveis de heterozigosidade nessa espcie permaneceram extremamente baixos, a ponto de vrios estudos no conseguirem detectar variao gentica alguma em 55 locos de isoenzimas (Bonnell e Selander, 1974) e pouqussima variao em marcadores com alto grau de polimorfismo como a regio controle do DNA mitocondrial (Slade, 1998). Poderia ser argumentado que os elefantes marinhos, como muitos grandes mamferos, teriam normalmente variabilidade gentica baixa. No entanto, uma outra espcie do mesmo gnero (M. leonina), os lees marinhos, possuem variabilidade gnica cerca de cinco vezes maior (Slade, 1998), o que indica que a baixa variabilidade no uma caracterstica do gnero e, mais provavelmente, est realmente relacionada ao estrangulamento populacional recente desses elefantes marinhos. Outras espcies que esto ameaadas e conseqentemente tm baixos nveis de heterozigosidade so os lobos cinza (Canis lupus), que tm 50% da heterozigosidade de outros candeos e apenas 1 hapltipo mitocondrial das populaes naturais (Randi et al., 1993, 1995; Wayne, 1996). Os guepardos (Acinonyx jubatus jubatus) so outro exemplo clssico de baixa variao gnica em populaes impactadas, por terem variabilidade baixssima em aloenzimas (52 loci) e no complexo principal de histocompatibilidade (cuja sigla, em ingls, MHC, de Major Histocompatibility Complex, um grupo de protenas ligadas ao sistema imunolgico). Captulo 17

10 Guepardos so geneticamente to homogneos que seus indivduos aceitam enxertos de peles um dos outros sem nenhuma rejeio (O'Brien et al., 1983, O'Brien, 1994; Menotti-Raymond e O'Brien, 1993). O mesmo ocorre com o leo asitico (Panthera leo persica), cuja populao muito reduzida (cerca de 250 animais, depois de um estrangulamento populacional em 20 indivduos, no incio do sculo), e conseqentemente no tem nenhuma variao aloenzimtica (50 loci testados; Wildt et al., 1987) ou no sistema MHC (avaliada com RFLP; O'Brien, 1994). Por outro lado, a perda de variabilidade gnica pode estar associada a problemas importantes na reproduo e biologia das espcies. No guepardo, por exemplo, observamos uma contagem de esperma 10 vezes menor do que em outros felinos, so observadas 79% de malformaes em embries e assimetria bilateral do esqueleto todos fenmenos comuns em espcies endocruzadas (O'Brien, 1994; O'Brien et al., 1996). Da mesma forma, o leo asitico possui contagem de esperma 10 vezes menor do que o leo da Tanznia (Panthera leo), que tem tamanhos populacionais muito mais elevados. Anomalias nos espermatozides, que ocorrem em 25% dos espermatozides dos lees da Tanznia, atingem 65% dos espermatozides dos lees asiticos. Finalmente, os nveis de testosterona circulante nos lees asiticos so 10 vezes menores (0,1 ng/ml) do que nos lees da Tanznia (1,3 ng/ml; Wildt et al., 1987). O endocruzamento de populaes pode reduzir, portanto, a fecundidade das populaes envolvidas. Baseado nesses e outros resultados, foi sugerido que 10% na reduo do tamanho da populao acarretaria, devido depresso de endocruzamento, uma reduo de 10 a 25% no seu desempenho reprodutivo (Franklin e Soul, 1981; Franklin, 1998). Isto, por sua vez, pode causar uma nova reduo no tamanho efetivo da populao e, portanto, reduzir a habilidade de persistncia da populao ao longo do tempo (Gilpin e Soul, 1986). Espcies presas nesse crculo vicioso eventualmente se extinguem, principalmente se levarmos em conta que, alm dos problemas genticos, existem outros comportamentais (algumas espcies precisam de uma densidade populacional mnima para se reproduzirem) e demogrficos que podem precipitar a extino dessas espcies (Andrewartha e Birch, 1954). Parece claro, ento, que um dos objetivos a serem buscados na conservao de espcies ameaadas a manuteno da heterozigosidade e a diminuio do endocruzamento, principalmente com espcies mantidas em cativeiro para recolonizao (Borlase et al., 1993; Avise e Hamrick, 1996). No entanto, existem alguns dados que poderiam indicar que a perda da heterozigosidade talvez no fosse to problemtica! Por exemplo, os elefantes marinhos apresentados acima, apesar da baixa heterozigosidade, parecem estar vivendo muito bem, com tamanhos populacionais elevados e ainda em crescimento. O mesmo foi observado em castores da Escandinvia, que quase se extinguiram devido caa no sculo passado e agora apresentam, previsivelmente, uma baixssima heterozigosidade e no entanto tm populaes estveis de mais Captulo 17

11 de 100.000 animais (Ellegren et al., 1993). Outro exemplo o tordo (black robin, Petroica traversi), uma ave cuja populao permaneceu abaixo de 200 indivduos pelos ltimos 100 anos, tendo atingido um mnimo de 5 indivduos em 1980, dos quais um casal conseguiu se reproduzir e a populao, sob intensa proteo, voltou a aumentar novamente at 200 indivduos nos anos 90. Esses indivduos tm baixssima heterozigosidade, mas so saudveis e se reproduzem normalmente, indicando que essa baixa variao gnica no parece estar prejudicando suas chances de sobrevivncia, pelo menos nas condies atuais (Ardern et al., 1997). Uma possvel explicao para esse sucesso reprodutivo, apesar da baixa variabilidade, que os exemplos dados so de animais que passaram suas crises de endocruzamento h muito tempo e sobreviveram, saindo, no processo, purificados das mutaes deletrias. Como falado anteriormente, um dos problemas do endocruzamento a ocorrncia de homozigose de alelos deletrios recessivos, existentes normalmente nas populaes naturais. Portanto, poderia ser argumentado que inmeras espcies que no sculo passado sofreram redues populacionais j se extinguiram por colapso de endocruzamento, e que os elefantes marinhos, os castores dinamarqueses e os tordos so alguns dos poucos exemplos de espcies que escaparam desse cataclismo gentico por terem populaes iniciais muito grandes, poucos alelos levemente deletrios (o que diminuiria a chance de fixao desses alelos sub-timos por deriva), ou apenas por acaso. Outras espcies, como o guepardo, os lobos cinzas, etc. estariam ainda lutando em seu purgatrio evolutivo, seu futuro dependendo, em ltima anlise, da proporo de genes deletrios fixados ou dos acidentes demogrficos que suas populaes possam sofrer. De qualquer forma, nosso papel no deve ser de observadores passivos dessa roleta russa do endocruzamento, deixando que o acaso decida sobre a sobrevivncia das espcies. A crise do endocruzamento pode ser evitada, atravs da manuteno dos tamanhos populacionais acima de um nvel crtico, com o monitoramento regular dos nveis de heterozigosidade e com cruzamentos que maximizem a variabilidade gnica e minimizem o endocruzamento (Borlase, 1993). Como as taxas de mutao para caracteres morfolgicos de herana quantitativa so at trs ordens de grandeza maiores do que os observados para a maioria dos caracteres moleculares (com exceo dos microssatlites; Slatkin, 1995; Lynch, 1996), possvel que os elefantes marinhos j tenham inclusive recuperado parte do seu potencial evolutivo nesses caracteres apesar da baixa variabilidade molecular. Entretanto, existem caracteres moleculares com grande importncia adaptativa e para os quais o grau de polimorfismo fundamental. Para esses, a purificao do endocruzamento , na verdade, muito prejudicial, por reduzir a variabilidade gnica e comprometer, assim, as chances de sobrevivncia da espcie a curto e mdio prazos. Um sistema gnico tpico desse Captulo 17

12 caso o de protenas do sistema MHC. Essas protenas so responsveis pelo reconhecimento de peptdeos virais ou de outros patgenos e pela transmisso dessa mensagem aos linfcitos T, no processo de resposta imune s infeces (Klein et al., 1993). Existe uma co-evoluo constante entre os organismos patognicos e o sistema de reconhecimento. Nesse processo, cada mutao que altera os peptdeos virais diminuindo sua chance de reconhecimento pelo sistema imunolgico favorecida e, conseqentemente, aumenta em freqncia na populao viral. Uma vez tal peptdio mutante passa a ser comum nesses vrus, cada mutao no sistema de reconhecimento que permita a deteco do novo peptdeo tambm favorecida (Hughes e Nei, 1992a, 1992b). Essa processo de ao e reao constante tambm conhecido como a hiptese evolutiva da Rainha de copas ("Red Queen", em ingls), por referncia frase dita por tal rainha em Alice no Pas das Maravilhas: -voc tem de estar sempre correndo para poder continuar no mesmo lugar (veja, por exemplo, Dybdahl e Lively, 1996). Organismos com um nmero maior de locos heterozigotos no sistema MHC so favorecidos nessa co-evoluo (seleo dependente de freqncia), e conseqentemente o grau de polimorfismo desses sistemas em populaes naturais est entre os mais elevados para genes no neutros (Hughes e Nei, 1988, 1990). Graus anormalmente baixos de polimorfismo no sistema MHC so freqentemente encontrados em espcies que sofreram muito estrangulamento populacional, como os castores escandinavos (Ellegren et al., 1993) em que o MHC monomrfico; nas populaes remanescentes do Biso europeu (Bison bonasus; Udina e Shaikhaev, 1998), em uma espcie ameaada de peixe de gua doce dos EUA (Poeciliopis o. occidentalis; Hedrick e Parker, 1998); nos lees asiticos (Packer et al., 1991) e no guepardo (Yuhki e O'Brien, 1990). Com essa baixa variabilidade no sistema MHC, essas espcies esto potencialmente mais vulnerveis a doenas virais. De fato, uma epidemia do vrus da peritonite felina, que em gatos domsticos (que tm variabilidade normal no sistema MHC), costuma matar no mximo 5% dos gatos afetados, praticamente dizimou uma populao experimental de guepardos nos EUA nos anos 80, matando mais de 60% de toda a populao e severamente debilitando os sobreviventes (O'Brien et al., 1985). As outras espcies com baixa variabilidade do sistema MHC devido ao endocruzamento podem estar, portanto, vivendo uma situao de bomba-relgio, em que o aparecimento de uma cepa viral que consiga driblar o sistema imunolgico de um indivduo rapidamente se espalhar por toda a populao. Elas tero vencido a batalha contra os prprios genes deletrios durante a crise do endocruzamento, se tornando, no processo, mais puras e homogneas, para serem em seguida derrotadas por um agente externo justamente por sua homogeneidade e conseqente falta de potencial evolutivo.

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13 A variabilidade gentica, portanto, importante para a persistncia evolutiva das espcies, e programas de tentativa de recuperao de populaes reduzidas devem se preocupar com a manuteno da pouca variabilidade restante. Em casos extremos, em que a espcie est claramente debilitada e em vias de extino, pode ser at considerada a hibridizao com subespcies prximas para tentar diminuir a depresso de endocruzamento. Esse procedimento normalmente no recomendado, pois a hibridizao freqentemente vista como uma outra maneira, mais sutil, de extinguir uma espcie, atravs da sua diluio em genomas de outra linhagem evolutiva (Rhymer e Simberloff, 1996). No entanto, se o destino mais provvel de alguns poucos indivduos restantes de uma espcie a extino devida a problemas reprodutivos e outros decorrentes do endocruzamento, essa medida pode ser considerada. No caso dos lees asiticos, por exemplo, observou-se que os cruzamentos em cativeiro eram raramente bem-sucedidos (muitos machos tinham dificuldades de cruzar e, daqueles que cruzavam, apenas 15% das gestaes chegavam a termo nos zoolgicos; O'Brien, 1994). No entanto, em um parque nos EUA, observou-se, inesperadamente, um grande sucesso reprodutivo nesses lees em uma colnia comeada com apenas cinco indivduos. Um estudo posterior, feito com aloenzimas mostrou, no entanto, que desses cinco indivduos, dois eram, na verdade, lees africanos, que pertencem a uma outra subespcie. O sucesso da reproduo em cativeiro tinha sido, portanto, provavelmente devido ao vigor hbrido (Wildt et al., 1987). Introgresses contnuas e controladas desses lees revigorados com lees asiticos puros podem servir para injetar alguma variabilidade gnica nessa subespcie sem que sejam perdidos em demasia seus genes originais. Alguns autores, no entanto, alertam contra o uso disseminado de tentativas de recuperao de variabilidade gentica pelo intercruzamento de indivduos que provenham de reas geogrficas distintas, conforme justificado mais adiante. Os estudos apresentados acima so, na sua maioria, com espcies ditas carismticas, que atraem a ateno do pblico e dos rgos financiadores. No entanto, processos semelhantes devem estar acontecendo com todas as espcies ameaadas de extino, de modo que devemos procurar sempre a preservao dos seus tamanhos populacionais acima de um nvel crtico, para evitar tanto os acidentes demogrficos como a depresso por endocruzamento.

17.3.2 - Indivduos e estruturas familiares

Marcadores moleculares com altas taxas de mutao, como mini e microssatlites e, de maneira mais limitada, aloenzimas, RAPD ou AFLP, podem ser usados com vantagem no estudo das estruturas clonais e das composies familiares nas espcies (Avise, 1994; Hughes, 1998). Atravs de marcadores de RAPD, por exemplo, se pode estabelecer que a ltima Captulo 17

14 populao remanescente de uma espcie de eucalipto australiana (Eucalyptus phylacis) provavelmente constituda de um nico clone, ou seja, geneticamente apenas um indivduo desse eucalipto sobreviveu expanso da agricultura naquele pas (Rossetto et al., 1999). Atravs de marcadores moleculares foi possvel, tambm, verificar que a suposta monogamia de muitas espcies de aves estava errada, ao se verificar que, para marcadores nucleares polimrficos, muitas ninhadas apresentavam mais de quatro alelos, o que seria impossvel se todos fossem filhos de um nico casal (Haig e Avise, 1996; Petrie, 1998; Alderson et al., 1999). Uma outra aplicao importante da gentica da conservao na determinao no invasiva do sexo em espcies sem dimorfismo sexual, como muitas aves, onde cerca de 50% das espcies no apresentam dimorfismo sexual visvel (Griffiths et al., 1998). Freqentemente, pessoas lidando com conservao e criao em cativeiro de espcies de aves ameaadas de extino se deparam com o problema de no saber quais aves devem ser pareadas para formar casais reprodutores. Himantopus novaezeleiae, por exemplo, uma das aves mais ameaadas de extino do mundo, com apenas 24 adultos existentes. Muitas tentativas de reproduo dessas aves em cativeiro foram mal sucedidas por envolverem pares do mesmo sexo, j que a formao dos pares nas condies de criao era aleatria. Com o uso de marcadores moleculares ligados aos cromossomos sexuais (nas aves o sexo heterogamtico o feminino, que apresenta no seu caritipo os cromossomos sexuais W e Z, enquanto que os machos so ZZ), esses pssaros puderam ser agrupados na forma de casais, o que aumentou o sucesso na reproduo da espcie em programas de reintroduo na natureza (Millar et al., 1997). Marcadores de sexo em aves, portanto, so muito importantes, e vrias estratgias tm sido seguidas, como a busca emprica de bandas sexo-especficas em padres de RAPD (Lessells, 1998) ou de minissatlites (Wink et al., 1998; Miyaki et al., 1997). Esse ltimo trabalho particularmente interessante por ser desenvolvido por cientistas brasileiros, que usam minissatlites humanos no estudo de populaes de vrias espcies de papagaios (Psittacidae). Estudos posteriores, por esse mesmo grupo, serviram para identificar, por PCR, o sexo de vrias espcies de papagaios e tucanos (Miyaki et al., 1998). Uma abordagem que parece ser muito promissora, semelhante usada por Miyaki et al (1998), o uso de genes de uma enzima ligada replicao do DNA os genes da helicase de ligao cromossmica- (CHD chromo-helicase-DNA binding, em ingls), que so evolutivamente muito conservados e que esto localizados nos cromossomas sexuais. O gene CHD-W existe apenas nas fmeas, enquanto que o CHD-Z existe nos dois sexos. Os dois genes tm introns de tamanhos diferentes, mas tm homologia e similaridade em regies conservadas, para as quais podem ser desenhados iniciadores para PCR. Assim, uma nica reao de PCR produz para cada gene um fragmento de DNA de tamanho diferente. Esses Captulo 17

15 produtos de PCR podem ser facilmente visualizados por eletroforese, de forma que o macho apresenta apenas uma banda e a fmea, duas bandas. Esses genes so evolutivamente muito conservados e aparentemente ocorrem em todas as aves, exceto nos avestruzes e outros Struthioniformes, onde esses genes esto em cromossomos autossmicos (Griffiths et al., 1998). Desta forma, eles podero ser usados facilmente como marcadores moleculares na determinao do sexo da maioria das aves onde no exista dimorfismo sexual externo, facilitando enormemente todos os estudos com reproduo em cativeiro e reintroduo na natureza de espcies ameaadas. Em populaes naturais, grupos geneticamente mais relacionados (famlias) freqentemente se encontram distribudos, espacialmente, de maneira agregada. As conseqncias desse comportamento so vrias, inclusive o aumento de endocruzamento e, algumas vezes, a necessidade da manuteno de tais estruturas familiares para a reproduo da espcie (Avise, 1994). Marcadores moleculares foram usados com sucesso na identificao deste tipo de estrutura familiar em um nmero grande e diverso de organismos. Em ascdias do gnero Botryllus, por exemplo, observou-se, atravs de um estudo com aloenzimas, que apesar das larvas terem um potencial de disperso elevado, elas normalmente se fixam muito prximo de suas mes (Grosberg e Quinn, 1986). Da mesma forma, marcadores moleculares permitiram verificar que vrias espcies de baleias (Amos et al., 1993; Baker e Palumbi, 1996), tartarugas (Bowen e Avise, 1996), e inmeras aves (Avise, 1996a; Haig e Avise, 1996) tm comportamentos migratrios com fidelidade regio natal (filopatria), e freqentemente se mantm agregadas em estruturas familiares muito fechadas, com pouco intercmbio entre grupos (Avise, 1994).

17.3.3 - Estruturao gentica e estratgias de conservao

O estudo das estruturas populacionais atravs de tcnicas moleculares talvez a parte mais importante da gentica da conservao e tem sido til tanto no estudo de populaes exploradas comercialmente (ou seja, abundantes mas com riscos populacionais devido superexplorao) como nas espcies j ameaadas de extino. Espcies abundantes mas ameaadas - Peixes e outros organismos marinhos so os nicos animais selvagens consumidos por nossa espcie em grande escala, atravs da explorao direta de populaes naturais. Assim, os problemas (e as solues) encontrados na sua explorao so completamente diferentes daqueles oriundos da explorao das plantas e animais domsticos. O risco de extino, por exemplo, no um problema para a explorao de animais terrestres como vacas e ovelhas, mas se torna um problema constante na explorao de populaes marinhas. Por exemplo, as baleias que eram abundantes at o sculo passado, Captulo 17

16 constituindo recurso alimentar e industrial notvel, quase se extinguiram em meados de nosso sculo (Baker e Palumbi, 1996). O colapso da pesca de vrias espcies de vertebrados e invertebrados um exemplo da fragilidade que populaes que anteriormente pareciam ser (e, freqentemente, eram) enormes quando exploradas intensivamente (Grant e Bowen, 1998). A gentica das espcies exploradas comercialmente, tambm conhecida como gentica pesqueira, um campo de pesquisas enorme e interessante. O leitor poder encontrar mais informaes sobre esse assunto em vrias revises (Ryman e Utter, 1987; Carvalho e Pitcher, 1995; Ward, 1999; Thorpe et al., 1999). Espcies raras Antes de falar especificamente sobre a questo das implicaes da estruturao gentica sobre as abordagens de conservao em populaes ameaadas, necessrio que se explique brevemente o que estruturao gnica e de que modo podemos estimar os nveis de fluxo gnico (disperso e migrao) entre populaes naturais. Populaes naturais freqentemente no mantm panmixia, ou seja, a probabilidade de reproduo entre dois indivduos quaisquer da populao no sempre a mesma, dependendo de fatores biolgicos e geogrficos. Os motivos para essa limitao em relao panmixia so muitos e, freqentemente, complexos (revises desses conceitos e processos podem ser encontradas em Wright, 1978; Lewontin, 1974; Lewontin, 1985). Alguns fatores que limitam a panmixia so: - Pouco deslocamento dos adultos ou das larvas/sementes (para uma panmixia real o deslocamento potencial de uma espcies deveria ser igual sua faixa de distribuio); - Em organismos fixos, como plantas e vrios organismos marinhos, pouca viabilidade gamtica (o que leva a uma probabilidade maior de cruzamentos entre vizinhos); - Seleo de hbitat com fidelidade natal (filopatria); - Cruzamentos com escolha de parceiro (assortive mating, em ingls); - Recrutamento catico (alta disperso, mas dispersantes endocruzados migrando em conjunto e de maneira catica, com ciclos dispersivos muito longos e de seleo ps-fixao). Esta ausncia de panmixia vai provocar uma estruturao (subdiviso) das populaes em subpopulaes pois: 1) novidades evolutivas (mutaes) surgidas em algumas partes vo levar muito tempo para se espalharem para toda a populao; 2) endocruzamento local diminuir a variabilidade gentica de cada subpopulao; 3) deriva e seleo podero levar a uma divergncia entre os vrios pontos. Dessa forma, populaes estruturadas vo apresentar um equilbrio dinmico entre fatores de diferenciao (mutao, deriva e seleo natural direcional ou disruptiva diferente em cada rea) e fatores de homogeneizao (migrao, seleo natural purificadora e seleo natural balanceada ou direcional igual em cada rea). A importncia relativa de cada um dos fatores vai variar de acordo com o tamanho populacional e as diferenas ambientais ao longo da faixa de distribuio da espcie. Captulo 17

17 De acordo com a biologia da espcie em particular o tipo de disperso podemos observar trs tipos principais de estruturao de populaes (Wright, 1978): a) Isolamento por distncia, em que o fator principal para a diferenciao a limitao da disperso em funo da distncia geogrfica, dentro de uma populao sem subdivises aparentes. Nesse modelo no existe panmixia, mas tambm no existe uma diferenciao abrupta ou descontinuidade que permita a delimitao de subpopulaes; b) Modelo de Ilhas, em que a diferenciao entre as populaes no depende da distncia entre elas, sendo os recrutas oriundos de uma nica populao de tamanho infinito (modelo infinito; Wright, 1978) ou de outras ilhas, sem relao com sua posio espacial (modelo finito; Slatkin, 1985); c) Modelo passo-a-passo (stepping stones; Wright, 1978), em que cada subpopulao somente pode trocar migrantes com as populaes vizinhas. Uma maneira grfica de visualizar os diferentes modos de estruturao gnica em populaes naturais considerar que em uma dada regio geogrfica foram amostradas trs localidades ao longo de uma linha (por exemplo, trs praias diferentes ao longo de uma costa). Se denominarmos os gametas produzidos pelos indivduos dos trs pontos, respectivamente, de A, B e C, teremos panmixia se a probabilidade de cruzamentos entre gametas de uma mesma localidade (PA-A , PB-B e PC-C) for igual probabilidade dos cruzamentos entre gametas de localidades diferentes (PA-B, PB-C e PA-C). Por outro lado, teremos uma populao estruturada quando as probabilidades de cruzamentos dentro de cada localidade (PA-A , PB-B e PC-C) forem maiores do que as probabilidades de cruzamentos entre gametas de localidade diferentes (PA-B, etc.). Usando essa notao, podemos dizer que, tomando como referncia a populao A: a) Panmixia: PA-A = P B-B = P C-C = P A-B = P A-C b) c) d) Isolamento por distncia: Ilhas: Passo-a-passo: PA-A = P B-B = P C-C > P A-B > P A-C PA-A = P B-B = P C-C >> P A-B = P A-C PA-A = P B-B = P C-C >> P A-B >> P A-C 0

De uma maneira geral, esperado que espcies com alta capacidade de disperso mas exibindo algum tipo de filopatria, como vrias espcies de aves e peixes, se apresentem estruturadas conforme o modelo de ilhas. Por outro lado, espcies em que os dispersores tm vida curta, ou por algum outro motivo no podem cobrir toda a distncia da distribuio da espcie, se apresentaro estruturadas conforme o modelo de isolamento por distncia ou passoa-passo (Avise, 1994). Naturalmente, esses modelos, como todos os modelos, so simplificaes da realidade, e portanto podemos observar na natureza casos de transies entre os modelos (Neigel, 1997).

Captulo 17

18 A verificao da existncia de estruturao gnica nas populaes naturais e a estimativa do fluxo gnico entre essas subpopulaes pode ser feita a partir da varincia das freqncias gnicas entre localidades diferentes (FST, Wright, 1978) ou pela perda de heterozigosidade das subpopulaes em relao heterozigosidade total (GST, Nei, 1973), de acordo, respectivamente, com as frmulas:
FST = 2 p p(1 p )

ou seja, a varincia das freqncias dos alelos de um loco em relao mxima varincia que aqueles alelos poderiam ter na populao (pq ou p(1-p) pela distribuio binomial), e
GST = H tot H sub , H tot

ou seja, a diferena em heterozigosidades entre a populao total (Htot) e a mdia das heterozigosidades das subpopulaes (Hsub), padronizada pela heterozigosidade total. De uma maneira geral, os dois mtodos produzem valores virtualmente idnticos (Nei, 1987) e tm sido usados igualmente em estudos populacionais (Neigel, 1997). A significncia de FST (ou GST) pode ser medida (contra a hiptese nula de panmixia, em cujo caso FST=0), atravs do teste de qui-quadrado abaixo (Waples, 1987): 2 = 2N FST (k-1), onde N o nmero total de indivduos amostrados, k o nmero de alelos, e s o nmero de subpopulaes analisadas para o loco gnico. Um qui-quadrado significativo (com (k-1)(s-1) graus de liberdade), indica que a hiptese nula da panmixia pode ser rejeitada, ou seja, que a populao est estruturada. Um outro tipo de anlise da estruturao de populaes, que est se tornando muito disseminada, a Anlise Molecular de Varincia (AMOVA; Excoffier e Smouse, 1994). Nessa abordagem, de forma semelhante usada na anlise estatstica de co-varincia (Sokal e Rohlf, 1995), a varincia nas freqncias gnicas subdividida em vrios componentes hierarquicamente inclusivos, como a varincia entre regies geogrficas, a varincia entre subpopulaes (ST) ou a varincia residual entre os indivduos. Uma das vantagens desse tipo de abordagem que ele pode ser usado com um nmero grande de tipos de marcadores moleculares (ao contrrio do FST e do GST, que se aplicam mais a dados de marcadores codominantes). A interpretao dos valores de FST, GST ou ST semelhante: valores no significativos nos dizem que a hiptese nula da panmixia no pode ser rejeitada, e indicam a necessidade de outros estudos para verificao da homogeneidade. Para estimativas de FST, GST ou ST significativamente diferentes de zero, valores superiores a 0,05 so considerados Captulo 17

19 indicadores de alta estruturao populacional, enquanto que valores abaixo de 0,05 indicam baixa estruturao (Wright, 1978). As implicaes desse tipo de anlise para estudos de conservao so muito importantes: se uma espcie ameaada, que ocupa uma determinada rea, se apresenta estruturada, ento a estratgia de conservao deve procurar preservar a diversidade da espcie naquela rea, pois podem j existir adaptaes locais que se perderiam no caso da populao ser misturada com outras. Por outro lado, se a populao da espcie homognea ao longo de toda a rea de ocorrncia, ento vivel concentrar a proteo da espcie em apenas uma rea, usando indivduos dessa rea para recolonizao das outras quando necessrio (Haig, 1998). Em outras palavras, para estudos de recolonizao ou conservao de espcies ameaadas deve ser levado em conta no a espcie, mas as unidades de manejo, que so as subpopulaes diferenciadas geneticamente (Berg et al., 1996). Por exemplo, um estudo com seqenciamento da regio controle mitocondrial do veado dos pampas (Ozotoceros bezoarticus), revelou que as suas populaes estavam estruturadas (FST=0,20), indicando tambm uma relao entre diferenciao populacional e distncia geogrfica ao longo de um transecto entre as latitudes de 5 e 41 graus sul, desde o cerrado brasileiro at a Argentina (Gonzalez et al., 1998). A conseqncia para a conservao dessa espcie de que a preservao dos hbitats deve ser feita ao longo de toda a sua distribuio e, se polticas de reintroduo forem implementadas, elas devem ser feitas a partir de estoques reprodutores especficos para cada regio (estoques autctones). As populaes das tartarugas marinhas da espcie Eretmochelys imbricata (hawksbill turtle, em ingls), apesar de sua grande capacidade de disperso, tambm esto muito estruturadas, desta vez seguindo um modelo de ilhas (Bass et al., 1996). Graas ao conhecimento das diferenas genticas entre as vrias populaes dessa tartaruga, foi possvel verificar que os indivduos existentes em uma regio de alimentao, em Porto Rico, vinham de toda a regio caribenha. Esse resultado indicou que projetos de conservao das regies de desova dessas tartarugas, apesar de importantes, seriam inteis se no acompanhados de sua preservao tambm nas reas de alimentao, que podiam estar muito distantes (Bowen et al., 1996). Uma conseqncia interessante desse resultado que, para espcies com alto grau de disperso, as fronteiras polticas so irrelevantes, e a conservao do estoque nativo de uma espcie pode ter de ser feita de maneira coordenada entre vrios pases (Bowen e Avise, 1996). Na tabela 2 apresento uma compilao de resultados de vrios estudos moleculares feitos com populaes de espcies ameaadas. De uma maneira geral, observamos que populaes de espcies em declnio se encontram freqentemente estruturadas, o que esperado pois em geral a degradao ambiental leva formao de refgios ou osis onde pequenas populaes das espcies persistem, sem contudo poder trocar genes atravs das reas Captulo 17

20 impactadas que so o deserto em volta delas. A mata Atlntica um bom exemplo desse tipo de fenmeno: cobrindo originalmente quase toda a costa brasileira, a mata Atlntica atinge atualmente uma rea muito menor do que a original. Um estudo feito com marcadores moleculares (RAPD) sobre populaes do pau-brasil (Caesalpinia echinata) encontrou uma diferenciao de 29% entre reas, indicando que, a populao se encontra estruturada e fragmentada (Cardoso et al., 1998).

Tabela 17.2 Exemplos de populaes naturais ameaadas analisadas quanto aos seus nveis de estruturao gnica. Referncias: 1 - Mundy et al., 1997; 2 - Haig et al., 1993; 3 - Nusser et al., 1996; 4 - Piertney et al., 1998; 5 Lortscher et al., 1998; 6 - Grandjean et al., 1997; 7 Hoole et al., 1999; 8 - Boskovic et al., 1996; 9 - Walton, 1997; 10 - McMillan e Bermingham, 1996; 11 - Sinclair, 1996; 12 Fowler et al., 1998; 13 Gonzalez et al., 1998; 14 Matsuhashi et al., 1999; 15 - Wilson e Strobeck, 1999; 16 - Boskovic et al., 1996; 17 - Liu et al., 1996; 18 - Bass, 1996; 19 Castilla et al., 1998; 20 Gibbs et al., 1994; 21 Gibbs et al., 1997; 22 - Dowling et al., 1996; 23 - Perdices et al., 1996; 24 - Epifanio et al., 1996; 25 Cardoso et al., 1998; 26 - Weidema et al., 1996; 27 - Case, 1998. Grupo Ave Ave Ave Ave Crustceo Crustceo Inseto Mamfero Mamfero Mamfero Mamfero Mamfero Mamfero Mamfero Mamfero Mamfero Molusco Captulo 17 Nome vulgar Shrike Pica-pau
Clapper rail Espcie

Local Canad EUA EUA Esccia Sua Inglaterra Inglaterra Europa/Cana d Inglaterra Europa Europa Austrlia Brasil/Argenti na Japo EUA Atlntico Norte EUA

Gene mtDNA nuclear ambos nuclear nuclear mtDNA ambos mtDNA mtDNA mtDNA nuclear ambos mtDNA mtDNA nuclear mtDNA ambos

Mtodo seqenciamento minissatlites RAPD microssatlites aloenzimas PCR/RFLP RAPD PCR/RFLP PCR/RFLP PCR/RFLP RAPD/aloenzimas RAPD seqenciamento seqenciamento microssatlites PCR/RFLP aloenzimas/RFLP

Grouse Pitu Pitu

Mariposa

Foca cinza Boto Boto Morcego-raposa

Koala Veado dos pampas

Lanius ludovicianus Picoides borealis Rallus longirostris Lagopus lagopu Austropotamobius pallipes Austropotamobius pallipes Papilio machaon Halichoerus grypus Phocoena phocoena Phocoenoides dalli Pteropus scapulatus Phascolarctos cinereus Ozotoceros bezoarticus Ursus arctos Bison bison Halichoerus grypus

Urso Biso Foca cinza

Mexilho de gua Pyganodon grandis

21 doce Reptil Reptil Reptil Peixe Peixe Peixe Planta Planta Planta
Tartaruga marinha Lagarto Cascavel

Eretmochelys imbricata Podarcis atrata Sistrurus catenatus Xyrauchen texanus Valencia Polyodon spathula Caesalpinia echinata Armeria maritima Cypripedium kentuckiense

Caribe Espanha Canad EUA Espanha EUA Brasil Dinamarca EUA

mtDNA mtDNA ambos mtDNA nuclear mtDNA ambos nuclear nuclear

Razzorback sucker Cyrprinodontideo Esptula

Pau-brasil Orqudea

seqenciamento seqenciamento RAPD, microssatlites PCR/RFLP aloenzimas seqenciamento RAPD aloenzimas aloenzimas

Em uma espcie de golfinhos brasileiros (franciscana, Pontoporia blainvillei) foi observada uma alta diferenciao (ST = 0,401; P<0,0001) entre amostras do Rio de Janeiro e do Rio Grande do Sul (Secchi et al., 1998). Mais uma vez, esse resultado indica que devem existir pelo menos duas populaes dessa espcie na costa que, ento, devem ser manejadas de forma independente. A idia geral, portanto, de que, ao se manejarem populaes de espcies ameaadas, devemos procurar preservar tambm sua diversidade geogrfica, a no ser nos casos de pouca diferenciao gentica, ou seja, nos casos em que as populaes esto pouco estruturadas. No entanto, se a variabilidade local j tiver sido perdida devido ao endocruzamento, mas ainda houver uma alta diversidade entre populaes isoladas (como nas cadeias de Markov; Wollenberg et al., 1996; Finke e Jetschke, 1999), pode-se considerar, em casos extremos, o cruzamento de indivduos de populaes diferentes, para diminuir a depresso por endocruzamento. Por exemplo, a foca Havaiana Monachus schauinslei, apesar de dcadas de proteo e esforos de aumento das cinco populaes conhecidas se manteve at hoje com um nmero muito reduzido de indivduos. Um estudo com seqenciamento da regio controle do mtDNA e com minissatlites encontrou um baixssimo nvel de variabilidade dentro de cada populao, mas uma alta diferenciao entre elas (FST=0.17; Kretzmann et al., 1997). A baixa eficincia reprodutiva dessas focas foi interpretada como resultado do endocruzamento, e a nova poltica de proteo e tentativas de proliferao de suas populaes sero feitas atravs do cruzamento de indivduos de colnias diferentes, para tentar reverter o quadro de depresso por endocruzamento. Dentro deste esprito tambm foram reintroduzidas, com sucesso, aves de duas espcies de guanos, Penelope obscura bronzina e P. superciliaris jacupemba, em So Paulo, como parte de um esquema de reflorestamento posterior construo de uma represa hidreltrica. Marcadores moleculares (minissatlites) foram usados para acompanhar o processo de liberao Captulo 17

22 e introgresso das aves reintroduzidas nas populaes nativas (Pereira e Wajntal, 1999), que parece terem se adaptado bem reintroduo. Como vimos, portanto, a estimativa da estruturao populacional um passo importante em estudos de gentica da conservao, pois permite direcionar os esforos de conservao para um uso mais eficiente dos recursos disponveis. Naturalmente, os programas de conservao sugeridos por esse tipo de estudos so cenrios ideais, que nem sempre podem ser seguidos por questes de logstica ou vontade poltica. De qualquer forma, os instrumentos existem e podem ser usados como guias para a formulao de polticas de conservao, principalmente quando so realizados estudos comparativos de vrias espcies de um mesmo ambiente, permitindo a corroborao mtua das melhores estratgias (o que foi chamado por John Avise de perspectiva regional da conservao; Avise, 1996b, 1998).

17.3.4 - Revelando a biodiversidade escondida

A biodiversidade do planeta foi estimada em 13 milhes de espcies, das quais 1,75 milhes j foram descritas (Heywood e Watson, 1996; tabela 17.3), distribudas em 64 filos, 146 classes, 869 ordens e cerca de 7.000 famlias. Os animais, com 1,5 milhes de espcies (das quais cerca de 900.000 so insetos), excedem em muito o nmero de espcies de plantas (60.000 conhecidas, 200.000 total estimado). Nos ltimos 20 anos, cerca de 13.000 espcies novas tm sido descritas por ano (Heywood e Watson, 1996). Se for mantida essa taxa, e considerando-se as projees para o nmero de espcies existentes (tabela 3), sero necessrios mais de 900 anos para chegarmos a descrever toda a biodiversidade nominal do planeta. Lamentavelmente, da forma como os ambientes esto sendo destrudos atualmente, provvel que bem mais da metade das espcies atualmente existentes estejam extintas antes mesmo de termos tido a chance de conhec-las. Tabela 17.3 Estimativas globais de biodiversidade, em nmero de espcies (biodiversidade nominal). As estimativas alta, baixa e provvel so as dadas em Heywood eWatson (1996). Grupo Vrus Bactrias Fungos Protistas Captulo 17 Nmero de espcies 4.000 4.000 72.000 40.000 Estimativa alta 1.000.000 3.000.000 2.700.000 200.000 Estimativa baixa 50.000 50.000 200.000 60.000 Provvel 400.000 1.000.000 1.500.000 200.000 provvel / real 100 250 21 5

23 Algas Plantas Nematdeos Crustceos Aracndeos Insetos Moluscos Cordados Outros TOTAIS 40.000 270.000 25.000 40.000 75.000 950.000 70.000 45.000 115.000 1.750.000 1.000.000 500.000 1.000.000 200.000 1.000.000 100.000.000 200.000 55.000 800.000 111.655.000 150.000 300.000 100.000 75.000 300.000 2.000.000 100.000 50.000 200.000 3.635.000 400.000 320.000 400.000 150.000 750.000 8.000.000 200.000 50.000 250.000 13.620.000 10 1,2 16 3,8 10 8,5 2,9 1,1 2 7,78

Alm da subestimao da biodiversidade causada pela deficincia de financiamentos para estudos de zoologia e de botnica em levantamentos faunsticos de regies pouco conhecidas (Wheeler, 1995), existe tambm uma outra fonte de subestimao: a existncia de espcies crpticas dentro de espcies consideradas como bem conhecidas (Knowlton, 1993, 1999; Thorpe e Sol-Cava, 1994). Neste campo, a Gentica tem contribudo enormemente, descobrindo inmeras espcies novas, com a conseqente reduo da distribuio geogrfica suposta para espcies anteriormente consideradas cosmopolitas. Pelo menos para o ambiente marinho parece que, com exceo das espcies bioinvasoras (ver abaixo), devem ser muito raras as espcies verdadeiramente cosmopolitas. Por exemplo, um estudo recente feito por Klautau e colaboradores mostrou que, apenas para a regio anfiatlntica (Mediterrneo e Atlntico), existiam cinco espcies diferentes dentro da suposta espcie de esponja cosmopolita Chondrilla nucula, com duas outras possveis espcies novas nas Bermudas (Klautau et al., 1999). Dada essa diferenciao na regio anfiatlntica, pouco provvel que as outras ocorrncias atribudas a essa espcie no Mar Vermelho e nos oceanos ndico e Pacfico sejam realmente corretas, e a espcie pode ser, na verdade, um complexo de mais de 10 espcies diferentes. Da mesma forma, a anmona-do-mar Actinia equina, citada desde o Mediterrneo at o Japo, foi desmembrada, atravs de estudos moleculares, em 6 espcies diferentes somente na regio anfiatlntica (Sol-Cava e Thorpe, 1987; Monteiro et al., 1997) e possvel que ela tambm se constitua em um complexo de espcies (Perrin et al., 1999). Tambm uma ascdia colonial bastante comum no Brasil e na regio anfiatlntica, a Botrylloides niger, foi separada, atravs de aloenzimas, em duas espcies somente no Rio de Janeiro, mais uma vez Captulo 17

24 levantando dvidas sobre o cosmopolitismo de um invertebrado bntico marinho (Aron e SolCava, 1991). As conseqncias da descoberta dessas espcies crpticas dentro de espcies consideradas anteriormente como cosmopolitas particularmente importante porque, justamente por sua abundncia e suposta ampla distribuio, essas espcies so freqentemente usadas como modelos para estudos biolgicos e para pesquisas em produtos naturais (Thorpe e SolCava, 1994; Knowlton, 1999). O mexilho europeu Mytilus edulis, por exemplo, foi escolhido, por sua ubiqidade no hemisfrio norte, como modelo de estudos de controle de poluio (The mussel watch programme; Fevolden e Garner, 1986; Kurelec et al., 1989; Daskalakis et al., 1997). No entanto, estudos moleculares indicaram que essa espcie tem regies de ampla hibridizao com outras duas espcies do gnero (M. trossolus e M. galloprovincialis), o que complica o seu uso para controle ambiental (Skibinski et al., 1978; Gardner, 1996; Quesada et al., 1995, 1999). Da mesma forma, descobriu-se que o anfpode Hyalella azteca, que h anos vinha sendo usado como indicador em testes de ecotoxicologia para estudo de qualidade da gua em vrios laboratrios do mundo, , na verdade, um aglomerado de pelo menos quatro espcies diferentes (Hogg et al., 1998). Outra conseqncia importante da subestimativa da biodiversidade para a conservao e a explorao racionais das populaes naturais acontece quando populaes de um organismo explorado comercialmente so constitudas, na verdade, de mais de uma espcie (ver Thorpe et al., 1999, para uma reviso desse problema para pesca de invertebrados marinhos). Ao se considerar espcies diferentes exploradas comercialmente como se fossem apenas uma espcie, corre-se um grande risco de se extinguir a espcie ecologicamente mais frgil sem que sequer se tenha percebido. Se o controle de estoques pesqueiros depende muito da delimitao dos estoques, conforme visto acima, ele depende ainda mais da deteco de espcies crpticas, que podem ser vistas como um caso mais extremo de diferenciao populacional. No Brasil, por exemplo, se considerava a existncia de apenas uma espcie de cao anjo (Squatina argentina), uma espcie pescada comercialmente principalmente na regio sul do pas. No entanto, um estudo molecular, provocado por diferenas observadas por bilogos pesqueiros na dinmica das populaes deste cao, revelou que, na verdade, existiam trs espcies diferentes do gnero no sul do Brasil, que eram confundidas como variao ontogentica ou polimorfismos naturais de S. argentina (Sol-Cava et al., 1983; Sol-Cava e Levy, 1987). Outros exemplos recentes so os da tartaruga de Ridley (Lepidochtys kempi) uma espcie rara, confundida com a tartaruga oliva (L. olivacea) e da orqudea do Arkansas (Cypripedium kentuchkiense) interpretada inicialmente como variedade de uma orqudea comum nos EUA, a C. parviflorum. Nos dois casos, o txon mais raro teria sido extinto se no Captulo 17

25 fossem consideradas suas distines evolutivas e, conseqentemente, tomadas medidas especficas de proteo. Isso s foi possvel com trabalhos de gentica da conservao, usando mtDNA no caso da tartaruga (Bowen et al., 1991), e aloenzimas no caso da orqudea (Case et al., 1998). A descoberta recente de espcies crpticas de peixe-boi (Trichechus manatus) tambm deve ter implicaes importantes para sua preservao (Garcia-Rodriguez et al., 1998), pois mostra que a espcie, j considerada ameaada em algumas regies, ainda mais frgil do que se pensava. A microbiologia foi uma outra rea em que a gentica permitiu descobrir uma grande biodiversidade escondida. A sistemtica das bactrias at hoje tem sido grandemente baseada em testes bioqumicos, que s so possveis quando as bactrias podem ser cultivadas. Apesar do cultivo de bactrias patognicas estar muito bem desenvolvido, o cultivo de bactrias de vida livre ainda deficiente. Uma conseqncia disso foi que o nmero de espcies reconhecidas de bactrias em solos ou na gua do mar estava severamente subestimado, at que experimentos com anlise de DNA total ambiental permitiram desvendar uma diversidade enorme nessas regies. Nessa abordagem, feita uma extrao total de DNA de amostras de solo ou de gua, sem separao prvia das bactrias. Esse DNA de solo ou de gua amplificado por PCR usando-se iniciadores especficos para genes de RNA ribossmico de bactrias, mas com amplo espectro de amplificao heterloga (ou seja, iniciadores que amplificam igualmente bem genes de bactrias de vrios grupos diferentes). Os produtos amplificados so misturas, portanto, da amplificao dos genes escolhidos, em todas as bactrias daquela amostra. Esses produtos so ento clonados e seqenciados, e as diversas seqncias obtidas so comparadas com as seqncias conhecidas da literatura (o banco de dados de seqncias de RNA de bactrias maior do que as bases de dados de qualquer outro gene de outros organismos). Assim, foram encontradas seqncias desconhecidas que indicam a existncia de espcies novas (os gneros em geral podem ser determinados por similaridade com outras espcies conhecidas) em lagos (Lee et al., 1996), subterrneas (Crozier et al., 1999), no mar (Schmidt et al., 1991) ou mesmo em pinturas antigas (Rolleke et al., 1996). Resultados semelhantes foram tambm obtidos com leveduras marinhas (Fell et al., 1992). Esses estudos so interessantes por seu carter paradoxal, onde a seqncia de DNA de um gene de um organismo conhecida antes mesmo dele ser conhecido ou descrito. Estudos de biodiversidade molecular aplicada estimativa da biodiversidade nominativa, portanto, serviram para aumentar, na maioria das vezes, o nmero de espcies. No entanto, em alguns casos, os estudos genticos serviram para indicar o contrrio, ou seja, que espcies consideradas distintas eram na verdade variedades ou hbridos de outras espcies. Esses resultados tm muita relevncia para a conservao, pois permitem que recursos no sejam desperdiados na proteo ou tentativa de manuteno em cativeiro de indivduos que no Captulo 17

26 tm independncia evolutiva. como se, ao observarmos um eventual declnio na populao de jumentos, resolvssemos investir grandes somas de dinheiro na sua preservao em zoolgicos, etc., sem saber que na verdade eles so hbridos de burros com guas... Como a biologia dos jumentos bem conhecida, isso no aconteceria. Mas e se isso acontecesse com espcies menos conhecidas? Por exemplo, uma subespcie de um pardal caiara americano (o dusky sea-side sparrow, Amnodramus maritimus nigrescenses) foi descrita no sculo XIX e era relativamente abundante na Flrida at a metade do sculo. Quando a destruio de seus hbitats pela especulao imobiliria levou a uma grande diminuio da populao dessa ave, foram feitos programas na tentativa de preservao desses pardais. Esses programas foram mal-sucedidos at que o ltimo exemplar morreu, em cativeiro, em 1987. No entanto, um estudo posterior, feito com marcadores de DNA mitocondrial, revelou que o A. maritimus nigrescens era geneticamente indistinguvel de outras supostas raas dessa espcie na costa leste Americana (mas diferente das raas da parte prxima ao Golfo do Mxico), sendo, provavelmente, apenas uma forma melnica de alguma delas (Avise e Nelson, 1989). Apesar da perda daquela populao ser de qualquer forma lamentvel, ela foi, do ponto de vista gentico, uma perda limitada de alguns genes diferenciados naquela populao. Da mesma forma, populaes do lobo vermelho (Canis rufus), que se extinguiram na natureza em 1975, e das quais resta apenas uma colnia em cativeiro, receberam uma grande ateno de programas de reintroduo, mas estudos com mtDNA e microssatlites indicam que esses lobos so resultantes da hibridizao recente de lobos cinza (Canis lupus) e coiotes (Canis latrans) (Wayne, 1996, Wayne et al., 1997). Faria mais sentido, portanto, concentrar os recursos na preservao das duas espcies originais, principalmente levando-se em conta que os lobos cinza j esto ameaados de extino. A Gentica, portanto tem tido um papel fundamental na reavaliao da biodiversidade nominal. J se passaram 25 anos desde a publicao do artigo visionrio de John Avise sobre o uso de mtodos moleculares na sistemtica (Avise, 1974). Desde ento, um nmero enorme de trabalhos cientficos demonstraram que os sistematas freqentemente haviam sido conservadores demais na atribuio de espcies, aceitando como variaes intraespecficas diferenas sutis que na verdade marcavam espcies diferentes. As pessoas trabalhando atualmente com biodiversidade esto mais conscientes desse problema e mais preocupadas em analisar melhor a biologia das espcies (e, quando necessrio, sua gentica) antes de construrem amplas listas de sinonmia ou de expandirem a distribuio geogrfica de espcies atravs da citao de novas ocorrncias. A sistemtica molecular, certamente, nunca substituir os mtodos descritivos criteriosos da sistemtica clssica. No entanto, ela tem auxiliado enormemente na deteco de espcies crpticas (Thorpe e Sol-Cava, 1994; Knowlton, 1999) e poder ser muito til, tambm, na definio de taxa supra-especficos, talvez funcionando como Captulo 17

27 base de um padro universal que permita atribuir a esses nveis algum sentido evolutivo (Avise e Johns, 1999).

17.3.5 - Bioinvases
Se, por um lado, um dos resultados dos estudos genticos tem sido a descoberta de que as distribuies geogrficas amplas atribudas a muitas espcies esto exageradas (ver acima), por outro, esses estudos tm servido tambm para detectar e acompanhar um processo inverso o da invaso, com auxlio antropognico direto ou indireto, de vrias regies do planeta por espcies exticas (Holland, 1999). As espcies mais intimamente associadas nossa espcie, como nossos parasitas e comensais, tm distribuio to cosmopolita quanto ns, de modo que podemos encontrar, por exemplo, piolhos, camundongos e caros das mesmas espcies distribudos desde as regies equatoriais at os crculos polares. O mesmo se observa com os animais e plantas domesticados, que atualmente tm distribuies completamente cosmopolitas. A questo das bioinvases, no entanto, se refere a espcies no to diretamente associadas nossa espcie e, conseqentemente, menos conhecidas, sem por isso serem menos importantes. O impacto causado por bioinvases muito maior do que se reconhece geralmente. Nos Estados Unidos, por exemplo, j foram registradas mais de 4.500 espcies invasoras (Mills et al., 1994). Um nmero enorme de espcies marinhas teve sua distribuio geogrfica aumentada atravs do transporte involuntrio nos cascos de navios (Carlton e Hodder, 1995; Southward et al., 1998) e, mais recentemente, nos tanques de lastro (Carlton e Geller, 1993). Os navios so vetores importantes na introduo de espcies exticas: existe atualmente mais de 35.000 navios cargueiros circulando no globo (Carlton, 1985). Considerando-se que um nico grande cargueiro pode carregar mais de 150.000 toneladas de gua de lastro (Schormann et al., 1990), podemos verificar o potencial desse tipo de transporte para as bioinvases (Pierce et al., 1997). Vrias das espcies bioinvasoras marinhas representam verdadeiras pragas, atravs da destruio de hbitats naturais (Lafferty e Kuris, 1996); competio (Russell e Balacz, 1994) ou predao (Kuris, 1991) de espcies nativas; produo de toxinas (Hamer, 1991; Hallegraeff, 1993) e encrustamento de estruturas construdas pelos seres humanos, como pilares em cais de portos, tubos de refrigerao de usinas nucleares, plataformas de petrleo, etc. (Cohen e Carlton, 1998; Lafferty e Kuris, 1996). Marcadores moleculares podem ser usados para auxiliar tanto na identificao das espcies invasoras (May e Marsden, 1992; Geller et al., 1994; Southward et al., 1998) e sua origem geogrfica (Holland, 1999), como no acompanhamento da evoluo do processo invasivo (Cohen et al., 1995; Holland, 1999). Captulo 17

28 No ambiente terrestre as bioinvases tambm so um grande problema. Um exemplo bastante prximo de ns foi a bioinvaso causada pela liberao acidental de abelhas africanizadas (as chamadas abelhas assassinas) da espcie Apis melifera, no Estado de So Paulo, nos anos 50. Essa variedade bastante agressiva e desde ento se espalhou por todo o pais, chegando a atingir, atravs da Amrica Central, o sul dos EUA. Existia um debate se a alta disperso desta variedade de abelha se devia aos zanges, que regularmente se soltariam da colnia e migrariam, cruzando com a variedade europia onde fossem parar, ou se seriam enxames completos que fariam de vez em quando uma migrao. Essas hipteses foram testadas atravs da comparao da estruturao gentica das populaes dessas abelhas nas regies invadidas estimada usando marcadores nucleares (transmitidos pelos zanges e pelas rainhas) e usando marcadores mitocondriais (transmitidos apenas pelas rainhas). O resultado observado foi que, apesar da ocorrncia de alguma introgresso entre as duas variedades (Lobo et al., 1989), ao longo da distribuio atual das abelhas africanas o padro de mtDNA no mudava muito, e era diferente do padro da abelha europia, apoiando, assim, a hiptese dos enxames (Hall e Smith, 1991; Hall, 1992). Um problema na aplicao de marcadores moleculares no estudo de populaes bioinvasoras que os modelos de estruturao gnica geralmente usados foram desenvolvidos para um estado de equilbrio de endocruzamento, que leva muitas geraes para ser atingido depois de eventos de fundao de novas reas. Por exemplo, se estudarmos uma populao de uma ascdia que ocorre em Hong Kong e a compararmos com uma outra, introduzida por acidente h 100 anos no Rio de Janeiro, poderemos encontrar, atravs de um estudo com marcadores moleculares, um FST baixo, indicando um alto fluxo gnico entre as duas reas, mesmo que este no tenha mais ocorrido desde ento! Isso ocorre porque as freqncias gnicas no tero tido tempo para divergir, deflacionando, assim, nossa estimativa de endocruzamento local (Crochet, 1996; Avise, 1999). Uma soluo para esse problema o uso de marcadores com taxas de mutao muito elevadas (como os microssatlites), que podem ser interpretados usando-se modelos genticos de desequilbrio (Davies et al., 1999).

17.3.6 - Identificao forense

Um aspecto importante da conservao da biodiversidade a formulao de leis de controle do uso, comrcio e exportao de produtos de animais e plantas ameaadas de extino. O problema que, pelo menos at a cultura do consumo daquele produto se extinguir, o aumento da demanda causado pelo controle e conseqente escassez do produto faz com que o preo aumente, estimulando os comerciantes a burlar a lei (Baker et al., 1996; De Salle e Birstein, 1996; Rehbein et al., 1997; Palumbi e Cipriano, 1998). A quantidade de dinheiro Captulo 17

29 envolvida pode ser muito alta. Por exemplo, os atuns maiores podem render mais de U$6.000 por peixe (Ward et al., 1995); as ovas de esturjo custam U$2.400 por kg (De Salle e Birstein, 1996); a pele de crocodilo pode custar de U$ 200-500 por pele (Brazaitis et al., 1998) e a carne de vrias espcies de baleia pode custar mais de U$ 50 o kg (Sweijd et al., 1999). O problema ainda mais complicado quando existem espcies prximas cujo comrcio legalizado ou quando a espcie protegida pode ser comercializada se proveniente de cultivo. Nesses casos, as fazendas de cultivo podem ser usadas para a legalizao fraudulenta das espcies protegidas e sua insero no mercado. J se observou, por exemplo, que a comercializao mundial de peles de jacars (gnero Caiman) superior a um milho de peles por ano, das quais apenas a metade vm realmente de fontes legalizadas (Brazaitis et al., 1998). A espcie brasileira do gnero mais ameaada Caiman yacare, e sua importao pelos EUA est proibida. No entanto, numa tentativa de driblar esse bloqueio de importao, foi argumentado recentemente que essa espcie teria trs subespcies, uma das quais poderia ser explorada (ver Brazaitis et al., 1996 para um histrico do caso). Felizmente, estudos genticos, com seqenciamento de DNA, demonstraram que essa subdiviso no era justificada (Brazaitis et al., 1998) e a importao de pele de C. yacare continua proibida nos EUA. No caso do jacar, a identificao das peles pode ser feita pelo padro de manchas e pelo seu relevo. No entanto, em outras situaes, como na comercializao da carne de animais protegidos, essa identificao no to simples. Nesses casos, marcadores moleculares podem ser de extrema valia, pois permitem a identificao no ambgua mesmo de produtos industrializados, como carnes salgadas, cozidas, defumadas ou enlatadas (Ram et al., 1996; Quintero et al., 1998). Mtodos moleculares foram usados, por exemplo, para demonstrar que um carregamento de carne de caranguejo (Paralithodes camtschatica) havia sido obtido em uma rea de sua distribuio onde era ilegal a pesca (Seeb et al., 1990). Em outro caso, esses mtodos foram usados para provar, na justia, que a carne do halite (os gastrpodes de maior valor comercial do mundo, do gnero Haliotis) vendida na frica do Sul como Haliote Australiano na verdade pertencia a Haliotis midae, uma espcie local cuja pesca estava proibida (Sweijd et al., 1998). A demonstrao mais dramtica e elegante do uso de marcadores moleculares foi o trabalho feito pelo grupo de Stephen Palumbi com o comrcio ilegal de carne de baleia no Japo. As baleias eram animais abundantes nos oceanos at o advento, no incio deste sculo, dos navios a vapor e seus arpes. Estima-se, por exemplo, que de 1920 at 1986, quando uma moratria na pesca indiscriminada das baleias foi imposto, mais de um milho de baleias tenham sido mortas pelos baleeiros (Baker e Palumbi, 1996). A moratria teve um efeito importante na proteo das baleias. No entanto, um buraco na lei permitindo que baleias pescadas para fins cientficos fossem consumidas nos pases onde elas tivessem sido Captulo 17

30 pescadas (ou seja, proibindo a exportao mas permitindo o consumo), teve dois resultados: a) o Japo passou a ser o pas com o maior nmero de pesquisas sobre baleias (o Japo tambm o maior consumidor de carne de baleia do mundo...) e b) o comrcio de carne de baleia legalizada nos mercados japoneses continuou. O trabalho feito por S. Palumbi e seu grupo consistiu na construo inicial de uma biblioteca de seqncias um banco de dados com as seqncias de DNA da regio controle mitocondrial de todas as baleias conhecidas, incluindo amostras intraespecficas de vrias partes do globo, coletadas atravs de dardos de bipsia, que retiram uma pequena quantidade de tecido sem ferir a baleia. A regio controle mitocondrial altamente varivel em mamferos, permitindo a distino fcil de todas as espcies e inclusive, em muitos casos, possibilitando at a determinao da origem geogrfica de cada baleia (Baker e Palumbi, 1994). Tendo construdo essa biblioteca, amostras de carne rotulada como carne de baleia foram compradas, em feiras e mercados do Japo por agentes da ONG ambientalista Earththrust, e enviadas clandestinamente para os laboratrios de Palumbi nos EUA, para um estudo preliminar. Nesse estudo, foi descoberto que, das 17 amostras compradas, apenas 9 pertenciam a baleias minke, as quais o governo japons tinha permisso de pescar (para fins cientficos). As outras oito amostras eram provenientes de baleias de pesca proibida, como a jubarte, cuja pesca proibida desde 1966, ou de botos e golfinhos (ou seja, enganando tambm o consumidor japons). Esse estudo preliminar estimulou um novo estudo, dessa vez com uma preocupao forense, a fim de processar as companhias responsveis pela comercializao ilegal da carne da baleia. Como a exportao de produtos de baleia proibida, e o DNA um produto da baleia, os dados do estudo, se envolvessem DNA de baleia exportado do Japo para os EUA, no poderiam ser usados como prova de acusao, por terem sido obtidas ilegalmente (Palumbi e Cipriano, 1998, 1999). A soluo encontrada foi montar um laboratrio porttil de extrao de DNA, PCR e purificao dos produtos do PCR e us-lo, in loco, no Japo. O procedimento realizado foi comprar a carne de forma documentada por fotos, extrair o DNA, e fazer o PCR, usando primers biotinados. Depois do PCR, a biotina ligada aos primers foi usada para auxiliar a remoo do DNA original da baleia, atravs do uso de minsculas bolas magnticas cobertas de estreptavidina, que se liga fortemente biotina que estava nos primers e, portanto, aos fragmentos de DNA amplificados por PCR. Esse DNA livre de DNA original de baleia foi ento exportado para os EUA onde foi analisado em seqenciadores automticos. Nesse segundo estudo tambm foram usados primers de genes nucleares, para evitar o possvel argumento, pela defesa, de que as espcies estavam identificadas incorretamente porque teriam vindo de hibridaes na natureza (em cujo caso seriam identificadas erroneamente como se pertencessem espcie da me, como visto por Wayne, 1996 com os lobos vermelhos). O resultado desse estudo foi que, num total de 237 amostras analisadas, 149 pertenciam a baleias Captulo 17

31 minke (sendo 107 do hemisfrio sul), 49 eram golfinhos e botos, e as demais amostras eram de outras espcies de baleias. Ou seja, cerca de 37% das amostras no pertenciam a baleias legalmente pescadas (Palumbi e Cipriano, 1998). Devido ao sucesso dessas pesquisas, a comisso internacional da pesca da baleia (IWC) decidiu, em 1999, empregar a tcnica desenvolvida por Palumbi e seu grupo como metodologia oficial de controle da comercializao da carne de cetceos.

17.4 PERSPECTIVAS FUTURAS

A Gentica da conservao, como pudemos ver ao longo deste texto, um ramo fascinante da cincia, com um nmero grande de abordagens e desafios diferentes. Marcadores moleculares de vrios tipos podem ser usados para a identificao de carne de uma espcie protegida, servindo de subsdio para o cumprimento da lei. Eles podem servir para determinar o sexo de animais antes de serem tentados cruzamentos em cativeiro, servem para a descoberta de espcies crpticas permitindo a reavaliao da biodiversidade e para a verificao da heterogeneidade espacial na biodiversidade molecular de cada espcie. Com marcadores moleculares podemos fazer propostas de reintroduo na natureza de espcies ameaadas, detectar a origem de espcies bioinvasoras ou a existncia de hbridos dentro de espcies protegidas. A maior parte dos estudos em Gentica da conservao feitos at hoje envolveu espcies carismticas, que atraem grande interesse pblico e, portanto, bons financiamentos para pesquisa. No entanto, provvel que esses processos tenham acontecido e estejam acontecendo em muitos outros animais menos felizes na sua atrao da ateno pblica. Muitos desses animais j podem ter se extinguido, por exemplo, por colapso decorrente de endocruzamento ou por falta de variabilidade em sistemas como o MHC ou equivalentes, sem que sequer tenhamos notado. fundamental que as polticas de preservao das espcies se preocupem com a variabilidade gnica como um todo, para que no preservemos apenas espcies aleijadas geneticamente, que permanecero indefinidamente sob custdia de nossa espcie. O custo da proteo de uma espcie , em geral, exponencialmente inversamente proporcional sua abundncia: proteger uma rea, atravs da demarcao e fiscalizao de parques nacionais, tem um custo infinitamente menor do que tentar manter/reproduzir em cativeiro cada uma das espcies daquela rea uma vez elas estejam ameaadas (Adams e Carwardine, 1990; Sol-Cava, 1993). Estudos genticos podem ser teis tambm na sugesto de polticas de preservao nos seus estgios iniciais e mais simples, como na determinao de estruturas populacionais e na anlise filogeogrfica. No entanto, devido miopia evolutiva de nossa espcie, e Captulo 17

32 particularmente daqueles em posies com poder para tomada de decises, a cincia tem sido usada mais freqentemente no estudo de espcies com populaes j muito reduzidas e, muitas vezes, em fase terminal, como pde ser visto ao longo deste artigo. A Gentica certamente instrumento poderoso nesses estudos, juntamente com a ecologia. Mas no seria um uso mais inteligente dos recursos a preveno do processo de extino, atravs da proteo ambiental? Lamentavelmente, no s no Brasil mas na maioria dos pases, a preocupao com a cura somente vem aps a catstrofe. Enquanto perdurar essa situao, a Gentica da conservao continuar dando sua contribuio para a preservao das espcies ameaadas, sem deixar de sonhar, no entanto, com o momento em que ela se tornar uma cincia desnecessria. AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer a Sergio R. Matioli pela oportunidade de apresentar esse assunto fascinante, a Marisa Brando por sugestes ao manuscrito, aos orientados e amigos do LBDM pelo apoio constante, e aos meus alunos dos cursos de Gentica Marinha e Biodiversidade Molecular por tantas perguntas instigantes. O Laboratrio de Biodiversidade Molecular apoiado por projetos do CNPq, FAPERJ, FUJB e PADCT.

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