Fabricacin de biosensores piezoelctricos para la lectura de interacciones protena-protena

J.M. Hernndez-Laraa, C. Mendoza-Barreraa,*, S. Muoz-Aguirreb, V. Altuzara, A. SaucedaCarvajala, S. Mendoza-Barrerac

a

Centro de Investigacin en Micro y Nanotecnologa, Universidad Veracruzana, Edif. F, Av. Ruiz Cortines 455, Fracc. Costa Verde, 94294, Boca del Ro, Veracruz, Mxico. b Facultad de Ciencias Fsico Matemticas, Benemrita Universidad Autnoma de Puebla, Av. Sn. Claudio y 18 Sur, Col. Sn. Manuel, 72570, Puebla, Puebla, Mxico. c GlobalZone Science & High Technology A.C., I.M. Altamirano 1830, Fracc. Satlite, 72320, Puebla, Puebla, Mxico.

e-mail: jumahela@hotmail.com; omendoza@uv.mx; smunoz@fcfm.buap.mx; valtuzar@uv.mx; asauceda@uv.mx, smendoza.barrera@gmail.com. *Corresponding Author Abstract In recent years, quartz crystal microbalances QCM have aroused great interest in scientific and industrial community due to their potential application in areas such as medicine, quality control, chemistry, and pharmaceutical industries. They are part of a rapid monitoring technique, and also present low cost, high reproducibility and low detection limits of the substance of interest. In this work we report the main steps for biosensors with fibrinogen (1.5 mg / ml) or bovine serum albumin (1.5 mg / ml) monolayers anchored on the gold electrode of quartz crystals fabrication. They were used for detecting the protein/protein interaction in saturated solution of antifibrinogen and anti-bovine serum albumin (1.5 mg / ml). Gold electrodes were prepared by sputtering technique of high purity gold onto quartz crystals surfaces which presented a fundamental frequency of 20 MHz. The morphology, roughness, thickness, and crystallography were characterized using scanning electron microscopy, atomic force microscopy, profilometry, and X-ray diffraction, respectively. Amino-functionalization of the gold electrodes and fibrinogen and bovine serum albumin sensitive films manufacture, were performed by using molecular self-assembly. Experimental data and Sauerbrey model allowed us to obtain the

adsorbed surface concentration of protein after protein/protein interaction. The protein surface coverage of fibrinogen/anti-fibrinogen and albumin/anti-albumin interactions was 3.20 g/cm2 and 2.02 g/cm2, respectively. On the other hand, the surface coverage for fibrinogen/albumin and albumin/anti-fibrinogen interactions was 0.37 g/cm2 and 0.08 g/cm2, respectively, that is in complete accordance due to the low homology.

Keywords: Proteins, biosensors, QCM PACS: 87.14.E; 87.15.km; 87.85.fk

Resumen En aos recientes las microbalanzas de cristal de cuarzo QCM han despertado un gran inters en la comunidad cientfica e industrial por su potencial aplicabilidad en reas como la mdica, control de calidad, qumica y farmacutica. Son parte de una tcnica de monitoreo rpida, de bajo costo, alta reproducibilidad y bajos lmites de deteccin de la sustancia de inters. En este trabajo se reporta la fabricacin de biosensores con monocapas de fibringeno (1.5 mg/ml) o albmina de suero de bovino (1.5 mg/ml) anclados sobre electrodos de oro de cristales de cuarzo para su aplicacin en la lectura de interacciones protena/protena en soluciones saturadas (1.5 mg/ml) de anti-fibringeno y anti-albmina de suero de bovino. Los electrodos de oro, empleados tambin como soportes de los biosensores, fueron depositados mediante la tcnica de erosin catdica sobre los cristales de cuarzo de frecuencia fundamental f de 20 MHz, mientras que su caracterizacin fue realizada empleando difraccin de rayos X, microscopia electrnica de barrido, microscopia de fuerza atmica y perfilometra. La amino-funcionalizacin de los electrodos de oro, as como la fabricacin de las pelculas sensibles de fibringeno y albmina de suero de bovino, se realizaron mediante auto-ensamblado molecular. Los resultados experimentales y el modelo Sauerbrey permitieron determinar la densidad superficial de masa de la protena adsorbida despus de la interaccin protena/protena. Se determin que en el caso de interacciones fibringeno/anti-fibringeno y albmina/anti-albmina la densidad superficial de masa correspondi al orden de 3.20 g/cm2 y 2.02 g/cm2, respectivamente. Por su lado, los casos de baja homologa presentes en la interaccin fibringeno/albmina y albmina/antifibringeno mostraron valores promedio de de 0.37 g/cm2 y 0.08 g/cm2, respectivamente. Palabras clave: Piezoelctricos, QCM, biosensores.

1. Introduccin En aos recientes, el inters de diversos grupos mexicanos se ha extendido hacia el desarrollo de investigaciones que guarden interaccin multidisciplinarias entre la biologa, medicina, ingeniera y fsica. Uno de los retos sigue siendo el desarrollo de equipamiento e instrumental propio que permitan cultivar dicha relacin y, al mismo tiempo, sean un campo frtil para el desarrollo de investigadores jvenes y la captacin de estudiantes interesados por la ciencia y la tecnologa. La fabricacin y aplicacin de biosensores se presenta en forma natural debido a la necesidad de contar con mecanismos de deteccin de un amplio rango de biomolculas de inters en la industria y en particular en el diagnstico clnico, a travs de la explotacin de diversos fenmenos fsicos como la variacin del ndice de refraccin, de masa, de esfuerzo, de resistencia, entre otros. Dichos biosensores requieren una alta sensibilidad, reproducibilidad, bajo costo y deteccin rpida. Una de las tendencias actuales para el anclaje de molculas selectivas, y su aplicacin en biosensado de molculas especficas (ADN, protenas, virus, enzimas), es a travs de la funcionalizacin de superficies [1-3]. La investigacin en el rea de biosensores posee una gran importancia por su amplio espectro de aplicaciones y por la generacin de nuevo conocimiento, sin embargo, en Mxico existen muy pocos grupos dedicados a estas ramas de la ciencia, por lo que sera deseable formar un nmero creciente de investigadores de alto nivel en Fsica Aplicada a la Biologa y a la Medicina. En este trabajo se presenta la fabricacin de biosensores con pelculas de fibringeno (FGN) o albmina de suero de bovino (BSA) sobre cristales piezoelctricos con electrodo de oro, los cuales han sido previamente aminofuncionalizados. La parte instrumental posee una amplia aplicabilidad y puede ser desarrollada fcilmente en un semestre de estudios a nivel universitario y, aplicndolo para desarrollar biomateriales y biosensores, puede fcilmente constituirse en desarrollo de tesis de licenciatura o de postgrado [4-5]. tema de investigacin para

Una microbalanza de cristal de cuarzo (QCM, quartz cristal microbalance) se fabrica cuando sobre un cristal piezoelctrico se deposita un electrodo metlico (oro, plata, platino en el caso particular para biosensores) y se incorpora en un sistema oscilador. Dependiendo del espesor y el corte del cristal, contarn con una frecuencia de resonancia fundamental fo. Estos dispositivos de deteccin son robustos, de bajo costo, estables en su frecuencia de resonancia y altamente sensibles a los cambios de masa que van de los miligramos (10-3 kg) a los picogramos (10-15 kg), particularmente si el tipo de corte del cristal de cuarzo es seleccionado de tal manera que su frecuencia de oscilacin no dependa de la temperatura en un cierto rango (corte AT) [6, 7]. Cuando un QCM es empleado como sensor se aprovechan los cambios en la frecuencia de resonancia del cristal debida a los cambios de masa en la superficie del electrodo metlico. Estos cambios son directamente proporcionales al corrimiento de la frecuencia de resonancia y pueden ser evaluados mediante la ecuacin de Sauerbrey [8-9].

2 f 0 m A q q
2

(1)

donde f es el cambio de frecuencia medido, f0 es la frecuencia fundamental de resonancia del cristal de cuarzo con electrodo metlico antes de producirse el cambio de masa, m es el cambio de masa, A es el rea piezoelctricamente activa (electrodo metlico), q es el mdulo de cizalla del cuarzo de corte AT (para fo = 20MHz corresponde un valor de 2.947 x 1011 dinacm-2) y q es la densidad del cuarzo (2.65 gcm-3). El signo negativo indica que un incremento de la masa en la superficie del cristal, por ejemplo por la adsorcin de una molcula, da lugar a una disminucin en su frecuencia de resonancia, y viceversa [6, 7, 10]. La fabricacin de un biosensor basado en QCMs consiste en la incorporacin de una monocapa orgnica con grupo terminal activo (i.e. grupo amino) depositada sobre los electrodos de oro, tal que sea posible el anclaje covalente de las biomolculas de inters. En este trabajo se inmovilizaron covalentemente protenas FGN y

BSA (1.5 mg/ml) para detectar y cuantificar anti-fibringeno (anti-FGN) y anti-albmina de suero de bovino (anti-BSA), respectivamente, en soluciones saturadas (1.5mg/ml). 2. Detalles experimentales 2.1. Fabricacin de biosensores para la deteccin de anti-FGN y anti-BSA Las figuras 1a a 1e esquematizan los pasos para la fabricacin de las diversas pelculas que conforman el biosensor con monocapa de FGN o BSA, empleando cristales de cuarzo con electrodo de oro amino-funcionalizados como substratos. La figura 1a representa el cristal de cuarzo, con frecuencia de resonancia f, tal como se recibe de fbrica; la figura 1b y 1c corresponderan al cristal una vez que se ha depositado un electrodo de oro por erosin catdica, donde fo y fo son las respectivas frecuencias fundamentales, antes y despus de someterlo a un lavado con solucin piraa. La figura 1d muestra la modificacin orgnica (o activacin o funcionalizacin) de la superficie de oro limpia y depositada mediante autoensamblado molecular (SAM, self assembled monolayer), y que presenta una frecuencia f1. Las pelculas biosensoras, de frecuencia f2, se fabricaron por incubacin de los QCMs en soluciones saturadas de BSA y FGN (1.5 mg/ml) por un periodo de dos horas (figura 1e) [11,12]. Finalmente, la figura 1f ejemplifica la interaccin biomolecular entre dos protenas, de frecuencia f3, una que se encuentra anclada sobre una superficie plana (protena blanco, ligando o pelcula biosensora) y la otra en una solucin (analito o protena sonda) bajo condiciones de pH neutro, temperatura ambiente y concentracin saturada (1.5 mg/ml) [11,12]. 2.1.1 Cristales de cuarzo Se emplearon quince QCMs de corte AT y frecuencia fundamental base f de 20 MHz (International Crystal Manufacturing Co., Inc.), preparados como osciladores de cuarzo. Previo al depsito sobre los substratos de cuarzo, estos se limpiaron en solucin piraa 1:3 (una parte de cido sulfrico H2SO4 en tres partes de perxido de hidrgeno H2O2), se realizaron dos lavados

extensos con agua desionizada (18 Mcm-1) y uno con etanol absoluto (grado reactivo, Sigma). El secado empleado entre dos lavados se realiz con gas nitrgeno de alta pureza (Infra), despus de lo cual se procedi a la lectura de su frecuencia fundamental fo (figura 1a). 2.1.2. Depsito y caracterizacin de electrodos de oro mediante Sputtering En el depsito de las pelculas de oro se emple un sistema de erosin catdica (Sputterig, Denton vacuum desk IV) con un blanco de oro de 99.9999% por periodos de 2, 4, 6 u 8 min, 35 mA y 60 mTorr (muestras MD1 a MD4) y 2, 4, 6 u 8 min, 25 mA y 60 mTorr (muestras MD5 a MD8). La tcnica de sputtering consiste bsicamente en la extraccin o erosin de tomos de la superficie de un blanco de inters debido al intercambio de momento con iones que bombardean los tomos de la superficie de dicho blanco. Durante este proceso se produce plasma del material del blanco el cual se deposita sobre un substrato para fabricar una pelcula [13]. El rea de la mscara empleada para la fabricacin del electrodo de oro fue de 11.6274 mm2 en todos los casos (figura 1b). La forma de la mscara de aluminio fue circular e incluy dos pistas rectangulares que permiten el contacto con las terminales de lectura (electrodos). En la verificacin de la composicin y homogeneidad a lo largo de la superficie depositada, as como del espesor, los electrodos fabricados fueron analizados mediante difraccin de rayos X a ngulo rasante (XRD, difractmetro Bruker D8 Advanced), microscopia de fuerza atmica (AFM,

Thermomicroscopes), microscopia electrnica de barrido de emisin de campo (FE-SEM, JSM7401F) y perfilometra (Dektak IIA). Las condiciones buscadas fueron tales que el espesor de las pelculas de oro, en conjunto con el espesor del cristal de cuarzo, tuviesen una frecuencia fundamental de 20 MHz (correspondientes a un espesor total de 80 m). 2.1.3. Preparacin de monocapas orgnicas mediante SAM sobre los electrodos de oro Para fabricar una pelcula de cualquier biomolcula de inters sobre los electrodos depositados (pelcula biosensora), es necesario previamente activar la superficie metlica depositando una

monocapa orgnica mediante algn proceso fsico o qumico. En este trabajo se utiliz el mtodo de autoensamblado molecular para crear sitios reactivos amino con la protena para fabricar la monocapa biosensora. Las molculas de la solucin del SAM cuentan con tres regiones fundamentales, un grupo funcional cabezal, que se adsorber qumicamente a la superficie a modificar; un grupo funcional terminal, que brindar reactividad para el anclaje covalente de las biomolculas deseadas; y un separador del grupo, formado por las cadenas intermedias de H, C y O, generalmente [14-16]. La activacin orgnica de los electrodos de oro, empleada en este trabajo, fue con grupos orgnicos terminales amino-reactivos lo que permiti el anclaje covalente entre las protenas y los electrodos activados [17] (Ver figura 1d). Es decir, el radical amino (NH2+) servir como sitio de anclaje molecular covalente para los sitios activos negativos (COO-) de las protenas a inmovilizar. La activacin de la superficie se realiza bsicamente en tres pasos: 1) Monocapas de Mercaptopropiltrietoxisilano HS(CH2)3Si(OCH3)3, 5 mM (Sigma-Aldrich) 2) Hidrolizacin de monocapas en cido Clorhdrico HCl, 0.5 M (Sigma-Aldrich) 3) Monocapas de Tiocianatopril C10H21NO3SSi, 5% (Sigma-Aldrich). Previo a la amino-funcionalizacin de los electrodos de oro de los QCMs, se realiz una limpieza mediante su inmersin por 10 seg. en solucin piraa 3:1 (H2O2:H2SO4), lavado abundante con agua desionizada (18 Mcm-1) y etanol absoluto para erradicar xidos de oro formados sobre la superficie (figura 1c). Una vez lavados los QCMs se procedi a su amino-funcionalizacin inmediata. 2.1.4. Protocolo de adsorcin de protenas En la fabricacin de las pelculas biosensoras sobre los electrodos activados se emplearon las protenas FGN (Sigma-Aldrich) y BSA (Sigma-Aldrich), de peso molecular de 340 y 67 kDa, respectivamente, en concentraciones saturadas (1.5 mg/ml) [11-12]. El protocolo consisti en realizar soluciones de fibringeno de humano y de Albmina de Suero de Bovino (BSA) en

solucin buffer de fosfato (PBS) a pH 7, temperatura ambiente y por un periodo de 2 hrs, tal que se genere la adsorcin espontnea de protenas sobre los grupos terminal amino (radicales NH2+) de la superficie de oro modificada, con aquellos presentes en las terminales carboxilo (terminal COO-) de las protenas (figura 1e). 2.1.6. Biosensor de anti-FGN La evaluacin de los QCMs con pelculas de FGN se realiz empleando un control negativo (BSA, 1.5 mg/ml) y un control positivo (anti-FGN, 1.5 mg/ml) en base PBS (pH 7). Los experimentos de interaccin protena/protena se llevaron a cabo a temperatura ambiente con un pH neutro y por un periodo de dos horas (figura 1f). Para evitar la formacin de multicapas, transcurrido el tiempo establecido se realizaron lavados con PBS y posteriormente con agua desionizada (18 Mcm-1). Inmediatamente despus del lavado se procedi a medir la frecuencia de la interaccin protena/protena de los QCMs, y empleando la ecuacin de Sauerbrey se determin la densidad superficial de masa adsorbida . La estabilidad del biosensor en aire y a temperatura ambiente fue monitoreada cada 20 minutos durante las primeras ocho horas; y posteriormente de la hora ocho a la 36, se monitore en periodos de 12 horas. Empleamos un frecuencmetro de cuatro canales para el monitoreo del cambio de frecuencia de los biosensores. 2.1.7. Biosensor de anti-BSA De manera similar, los biosensores con pelcula de BSA fueron evaluados en soluciones saturadas de anti-BSA (150 kDa, control positivo) y anti-FGN (160 kDa, control negativo). En este caso la estabilidad del biosensor fue registrada cada 20 minutos en las primeras cuatro horas; y cada 1.5 horas de la hora 16 a la 24. La ltima medicin se obtuvo en la hora 36.

2.1.8. Medicin de la variacin de frecuencia de los QCMs Se emple un frecuencmetro comercial para la lectura de las frecuencias f, fo, fo, f1, f2 y f3 correspondientes al cristal de cuarzo sin electrodo, con electrodo de oro, con electrodo de oro limpio, con electrodo de oro funcionalizado, con pelcula biosensora de FGN o BSA y correspondiente a la interaccin protena-protena, respectivamente. La frecuencia f0 de cada QCM fue tomada como referencia experimental respecto a ese biosensor durante el proceso de medicin de la interaccin biomolecular. La figura 2 muestra esquemticamente las etapas del experimento de medicin de frecuencia de los biosensores fabricados, a travs del empleo un frecuencmetro de cuatro canales. 3. Resultados y Discusin 3.1. Electrodos de oro Para establecer las mejores condiciones de depsito de pelculas de electrodos de oro sobre los cristales de cuarzo, se usaron cuatro tcnicas que rutinariamente se emplean en el anlisis de pelculas delgadas y ultradelgadas: XRD, FE-SEM, perfilometra y AFM. La fase cristalogrfica del oro depositada sobre las superficies de cristales de cuarzo fue corroborada a travs de difraccin de rayos X (muestras MD1 a MD8). La figura 3 muestra un difractograma tpico de una de las muestras depositadas mediante sputtering (muestra MD5; 2 min, 25 mA y 60mTorr). Se observ que en todas las muestras (datos no mostrados) se obtuvieron los patrones caractersticos del oro con fase cbica centrada en las caras (FCC, face-centered cubic). Mediante la ecuacin de Scherrer [18] se calcul el parmetro de red, el cual fue alrededor de a = 4.078 en todas las muestras [19]. Para que los cristales de cuarzo en configuracin de microbalanzas tuvieran una frecuencia fundamental de 20MHz fue necesario que el rea de 11.6274 mm2 depositada correspondiese a un cambio de espesor en el cuarzo de 20 nm, lo cual corresponde a su vez a una masa de 487.17 ng.

Los anlisis de perfilometra y microscopia electrnica de barrido nos permitieron corroborar que las muestras que contaban con este espesor fueron aquellas depositadas en condiciones de 4 min, 25 mA y 60 mTorr. La figura 4 corresponde a dos micrografas de barrido en corte transversal de muestras de pelculas de oro depositadas sobre los cuarzos. En ambas muestras se determin que el espesor es alrededor de 125 nm para tiempos de 6 min, 25 o 35 mA y 60 mTorr. Las flechas, en las figuras 4a y 4b, indican la presencia del depsito de oro a lo largo del borde en direccin axial. La presencia de algunas impurezas fue producto de la preparacin de las muestras para su observacin en el microscopio de barrido. Por otro lado, los anlisis de perfilometra corroboraron un espesor de 304 nm para la muestra MD8 (figura 5a), mientras que la muestra MD2 present un espesor de 20.08 nm (figura 5b). Dichos espesores correspondieron al mayor y menor valores obtenidos con las condiciones de depsito aplicadas. La diferencia en la forma de los perfiles de las mediciones con perfilometra se debi a la preparacin del escaln de la muestra analizada. En el caso de la figura 5a, se realiz la lectura sobre el escaln de la pelcula de oro depositada sobre el cuarzo, mientras que en el caso de la figura 5b se realiz un rayado sobre la superficie de oro una vez depositada. Ambos mtodos de preparacin de una pelcula son vlidos para su estudio con perfilometra. Dado que nos interesa conocer si las superficies de los electrodos de oro son altamente planas para obtener una mejor uniformidad de anclaje de las biomolculas (conformacin y orientacin) que formen la pelcula biosensora y por lo tanto una mejor seal [20], es que los dichos electrodos se examinaron mediante AFM. Se estim la rugosidad superficial mediante la raz cuadrtica media (RMS) directamente de las imgenes de AFM empleando el software del microscopio. La figura 6a presenta la rugosidad media de 9.3 y la morfologa (figura 6b) de la superficie del electrodo de oro limpia (muestra MD2).

3.2. Medicin de frecuencias y determinacin de masa de las monocapas Cuando se emplean las microbalanzas de cristal de cuarzo como biosensores, el parmetro importante a medir es la diferencia de frecuencias f entre dos pelculas adyacentes; y es mediante la ecuacin de Sauerbrey que se relaciona con la diferencia de masas m. Entonces, an y cuando se presenten variaciones entre las frecuencias fundamentales fo de dos diferentes microbalanzas, no se adicionar un error a la lectura de interaccin entre la pelcula biosensora y la muestra a detectar (analito) debido a que se registraron las correspondientes diferencias de frecuencias. La figura 7 muestra los comportamientos tpicos de las frecuencias fo, fo, f1 y f2, medidas empleando un frecuencmetro (entradas digitales, 5 V de alimentacin, salida a pantalla LCD 8 dgitos y rangos de medicin: 1 Hz a 3.5 M Hz, 2 Hz a 7 MHz, 4 Hz a 14 MHz y 8 Hz a 28 MHz), correspondientes al electrodo de oro sin lavar, limpio, amino-funcionalizado y con pelcula sensora, respectivamente. La figura 7a muestra los resultados experimentales durante el proceso de fabricacin de los biosensores con pelcula sensible de FGN y la figura 7b con pelcula sensora de BSA. Se observa que el fenmeno de piezoelectricidad para el tipo de corte AT de las microbalanzas de cristal de cuarzo empleadas se presenta durante todo el proceso de fabricacin del biosensor. Se registr un incremento en la frecuencia fundamental fo en todos los electrodos analizados respecto de los correspondientes cuando son lavados con solucin piraa (fo). En el caso de la pelcula amino-funcional (monocapa caracterizada por f1) y pelcula biosensora (monocapa f2) se present un decremento en sus frecuencias y por tanto un aumento en masa. Se recomienda que si los QCMs con electrodos de oro no son empleados inmediatamente despus de la amino-funcionalizacin, se proceda a su refrigeracin a 8 C. Una vez preparados los QCMs como biosensores, es recomendable su uso inmediato. La figura 8 muestra los correspondientes cambios de frecuencias correspondientes a las monocapas fabricadas en los biosensores de la Fig. 7. Dichos resultados estn en concordancia

con el modelo de Sauerbrey que relaciona una disminucin de masa con el aumento en la frecuencia del QCM, y viceversa (Ec. 1). La disminucin en masa sobre el electrodo, una vez lavados, puede atribuirse a la remocin de xidos, polvo y grasas sobre la superficie del

electrodo cuando estos han sido expuestos a aire, como fue en este caso [21]. Para el caso de la diferencia de frecuencias entre f1 (SAM/Au/QCM) y f0 (Au/QCM); y de f2 (pelcula sensora/SAM/Au/QCM) con f1 tambin se obedece la Ec. 1. En estos casos el aumento de masa se debe a las pelculas amino-funcional y sensible adsorbidas, respectivamente. El tamao de la protena FGN (Fig. 8a) cuenta con una masa de un orden de magnitud superior que las correspondientes de los biosensores con pelcula de BSA (Fig. 8b), por lo que se present una disminucin de frecuencia de entre 1176 Hz y 3256 Hz, mientras que en el caso de una molcula de menor tamao y peso como BSA la disminucin oscila entre 350 Hz y 720 Hz. En la Fig. 9 se muestra el cambio de la frecuencia entre f3 y f2 en funcin del tiempo para experimentos de interacciones protena/protena empleando microabalanzas de cristal de cuarzo con pelculas de FGN o BSA. En todos los casos se emplearon soluciones saturadas de protenas que sirvieron como controles positivos o negativos (1.5 mg/ml), considerndose como t = 0 minutos la medicin de la frecuencia antes de la interaccin protena/protena (pelcula sensora). Inmediatamente despus los biosensores se incubaron durante dos horas en las soluciones de protena. Posteriormente los QCMs fueron lavados profusamente para eliminar las posibles multicapas que pudiesen haberse depositado (interacciones inicas) sobre los biosensores. En el caso de los biosensores con pelcula de FGN (Fig. 9a) se emple como control negativo a BSA y como positivo a anti-FGN; mientras que en el caso de los biosensores con pelcula de BSA (Fig. 9b) el control negativo empleado fue la protena anti-FGN y el positivo correspondi al antgeno anti-BSA.

Las correspondientes interacciones entre pelculas biosensoras y controles negativos (BSA /Q5_FGN y anti-FGN/Q4_BSA) no presentaron grandes variaciones en la frecuencia dado que presentan una baja constante de asociacin Ka entre ellas [22]. Por el contrario, se observan variaciones de ~3000 Hz para la interaccin altamente reactiva entre anti-FGN y FGN (antiFGN/Q4_FGN) dado que es una interaccin antgeno/anticuerpo con una constante de asociacin Ka de 9.15 2.16 X 107 M-1 [23]. Para el caso de la interaccin entre anti-BSA y BSA (antiBSA/Q2_BSA se registr una variacin de ~1800 Hz, la cual presenta una constante de asociacin Ka de 3.5 0.6 X 107 M-1 [24]. Estos rangos se pueden atribuir tambin al tamao y peso de los antgenos a los cuales fueron expuestas las pelculas sensibles de las microbalanzas. Se observa un incremento en la variacin de la frecuencia despus de los 120 min de exposicin de las microbalanzas con la solucin analito de protena (anti-FGN /Q4_FGN y antiBSA/Q2_BSA). Dicho incremento se debe a la interaccin de anti-FGN sobre los respectivos biosensores; a los 140 minutos se observa otro cambio en la frecuencia que podra ser asociado con la prdida de conformacin de las protenas anti-FGN y anti-BSA. La evolucin del cambio de la frecuencia en funcin de tiempo a partir del minuto 120 se realiz exponiendo los biosensores a condiciones normales de presin y temperatura (20 oC), lo que podra ocasionar la presencia de una masa aparente y por tanto un incremento en la variacin de la frecuencia al minuto 140. Sin embargo, son necesarios estudios adicionales para la corroboracin de esta hiptesis. La tabla 1 resume el cambio de frecuencia debida a la interaccin protena/protena f3 = f3 f2 (Hz) y la correspondiente variacin de densidad superficial de masa 3 (gr/cm2) sobre los QCMs despus de la interaccin protena/protena. Esta densidad fue calculada mediante la ecuacin de Sauerbrey que permite determinar cambios de masas sobre los electrodos considerando la masa

depositada como una pelcula rgida. Se observa que la densidad superficial de masa del analito (anti-FGN y anti-BSA, 1.5 mg/ml) para los biosensores de FGN corresponden a 3.29, 0.63, 3.26 y 0.12 g/cm2, para las microbalanzas Q2_FGN, Q3_FGN, Q4_FGN y Q5_FGN, respectivamente; mientras que para Q2_BSA, Q3_BSA y Q4_BSA se calcularon valores de 2.02, 0.14 y 0.04 g/cm2. Se puede ver que en el caso de Q3_FGN y Q5_FGN (controles negativos), los valores de las densidad superficial de masa son pequeas en comparacin con los valores obtenidos para Q2_FGN y Q4_FGN (alta afinidad) por lo cual se puede asegurar que sobre los QCMs de control negativo no se present interaccin protena/protena. Esta misma tendencia se observa para los biosensores anti-FGN /Q3_BSAy anti-FGN/Q4_BSA los cuales tienen un cambio de frecuencia mnimo en comparacin con anti-BSA/Q2_BSA (control positivo); entonces para ambos tipos de biosensores se comprueba la especificidad de los biosensores. El estudio de la estabilidad de la medicin de las frecuencias de la pelculas biosensora (f2) y de interaccin (f3) con el tiempo, se muestra en la Fig. 10. La Fig. 10a corresponde a la evolucin de la pelcula de FGN anclada sobre la superficie aminofuncionalizada de oro, mientras que la Fig. 10b corresponde a la interaccin protena/protena de pelculas de BSA con anti-BSA y antiFGN, respectivamente. Se observa que la variacin de la frecuencia de la monocapa autoensamblada de FGN no vara hasta 10 hrs. an estando expuesta a aire. Con ello se garantiza la utilidad de los QCMs fabricados como biosensores hasta por un periodo de 8 h expuestos al aire. Para el caso de la interaccin de anti-FGN con BSA se presenta un comportamiento cuasiesttico con el tiempo de medicin (anti-FGN/Q4_BSA), mientras que para la monocapa de interaccin antgeno/anticuerpo (anti-BSA/Q2_BSA) se present una disminucin significativa de la frecuencia a las 16 hrs. posiblemente debida a la prdida de conformacin a causa de la disminucin de humedad en la pelcula sensible al no encontrarse en solucin lquida.

Conclusiones Se fabricaron biosensores con pelculas de FGN y de BSA basados en microbalanzas de cristal de cuarzo para la deteccin de interacciones protena/protena de anti-FGN/FGN y antiBSA/BSA. Los electrodos de oro, de espesor nanomtrico, fueron depositados por la tcnica de erosin catdica a radiofrecuencia; mientras que las capas orgnicas, correspondientes a la activacin superficial del oro y la pelcula biosensora de FGN o BSA, fueron fabricadas mediante autoensamblado molecular. Se demostr la especificidad de los biosensores con las protenas anti-FGN o anti-BSA en concentraciones saturadas, empleando el modelo de Sauerbrey para la determinacin de la densidad superficial de masa de protena adsorbida sobre el biosensor. Se demostr que la vida til de las pelculas sensoras de FGN y BSA es de al menos 8 horas despus de su exposicin al aire. As mismo, se present un comportamiento estable en aire de las monocapas de la interaccin protena/protena hasta por un periodo de 12 hrs.

Agradecimientos Los autores agradecen a Ana B. Soto, Rogelio Fragoso (Departamento de Fsica, CINVESTAVIPN), Miguel Luna (SEES, Departamento de Ingeniera Elctrica, CINVESTAV-IPN), Erika Luna y Hugo Snchez Torres (MICRONA-UV) por el apoyo tcnico prestado. Este trabajo fue apoyado por el proyecto No. 105491 (CB-2008, CMB) y parcialmente por el proyecto No. 82926 (CB-2007, ASC).

Referencias [1] L. Hood L, J.R. Heath, M.E. Phelps ME y B. Lin, Science 306 (2004) 640. [2] N. Christodoulides, P.N. Floriano, S.A. Acosta, K.L. Ballard, S.E. Weigum, S. Mohanty, P. Dharshan, D. Romanovicz y J.T. McDevitt, Clin Chem. 51 (2005) 2391. [3] R. Kirby, E.J. Cho, B. Gehrke, T. Bayer, Y.S. Park, D.P. Neikirk, J.T. McDevitt y A.D. Ellington, Anal. Chem. 76 (2004) 4066. [4] F.C. Wardle, D.T. Odom, G.W. Bell, B. Yuan, T.W. Danford, E.L. Wiellette, E. Herbolsheimer, H.L. Sive, R.A. Young y J.C. Smith, Nat. Biotechnol. 24 (2006) 963. [5] J.S. Shumaker-Parry, R. Aebersold y C.T. Campbell, Anal. Chem. 76 (2004) 2071. [6] A. Arnau, T. Sogorb, Y. Jimnez y J.C. Gmez, Rev. Colombiana de Fsica, 33 (2001) 503. [7] S. Muoz-Aguirre, T. Nakamoto y T. Moriizumi, Sensors and Actuators B: Chemical 105 (2005) 144. [8] J.W. Gardner y P. N. Bartlett, Electronic noses, principles and applications (Oxford Science Publications, UK, 1999). [9] M.C. Dixon, J. Biomol. Tech. 19 (2008) 15. [10] B. Godber, M. Frogley, M. Rehak, A. Sleptsov, K.S.J. Thompson, Y. Uludag, M.A. Cooper, Biosen. and Bioelectr. 22 (2007) 2382. [11] C. Mendoza-Barrera, Rev. Sup. Vaco 10 (2005) 31. [12] F. Vazquez-Hernndez, C. Mendoza-Barrera, V. Altuzar, M.A. Melndez-Lira, M.A. Santana-Aranda y M.L.Olvera, Mater. Sci. Eng. B 174 (2010) 290. [13] K. Wasa, M. Kitabatake y H. Adachi, Thin Films Material Technolgy: Sputtering of Compound Materials, (Springer, William. Andrew Pub., NY, 2004). [14] W.C. Bigelow, D.L. Pickett y W.A. Zisman, J. Colloid Interface Sci. 1 (1946) 513. [15] R.H. Tredgold, Order in Thin Organic Films, (Camdridge University Press, UK, 1992). [16] R.G. Nuzzo y D.L. Allara, J. Am. Chem. Soc. 105 (1983) 4481. [17] C.L. Love, L.A. Estroff, J.K. Hriebel, R.G. Nuzzo y G.M. Whitesides, Chem. Rev. 1005 (2005) 1103. [18] B. D. Cullity, Elements of X-Ray Diffraction, (Addison-Wesley Publishing Company Inc, USA, 2001). [19] Carta cristalogrfica 00-004-0784

[20] X. Chen, M. Pan, K. Jiang, Microelectr. 87 (2010) 790. [21] H. Ron, S. Matlis e I. Rubinstein, Langmuir 14 (1998) 1116. [22] V. Altuzar, C. Mendoza-Barrera, M.L. Muoz, J. G. Mendoza-Alvarez y F. SnchezSinencio, Rev. Mex. Fis. 56 (2010) 147. [23] Melvin E. Klegermana, Shaoling Huanga, Devang Parikhb, Janet Martinezb, Sasha M. Demosc, Hayat A. Onyukselc, and David D. McPhersona, Biochim Biophys Acta.1768 (2007)1703. [24] N.H. Chiem and D.J. Harrison, Electrophoresis 19 (1998) 3040.

FIGURA 1

FIGURA 2

FIGURA 3

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FIGURA 8

FIGURA 9

FIGURA 10

Figura 1. Diagrama del proceso de fabricacin de las diversas monocapas, y sus frecuencias asociadas, que componen un biosensor de protenas. Figura 2. Configuracin experimental de medicin de las frecuencias de los QCMs como un arreglo de biosensores. Figura 3. Difractograma tpico de una muestra de pelcula de oro depositada sobre cristal de cuarzo empleando erosin catdica a RF (muestra MD5). Figura 4. Micrografas electrnicas de barrido de muestras fabricadas empleando erosin catdica a 6 min, 25 o 35 mA y 60 mTorr. a) MD3 y b) MD7. Figura 5. Perfilometra de las dos muestras que presentaron el mayor espesor (muestra MD8, Fig. 5a) y menos espesor (MD2, Fig. 5b). Figura 6. Micrografa por fuerza atmica de la muestra MD2. a) Topografa y b) rugosidad media. Figura 7. Comportamiento de la frecuencia de oscilacin de la microbalanza de cristal cuarzo durante las diferentes etapas de fabricacin del biosensor. Figura 8. Cambio de frecuencia de las microbalanzas de cristal cuarzo durante la fabricacin del biosensor. Figura 9. Comportamiento de la variacin de la frecuencia de los biosensores durante la interaccin protena/protena con el tiempo (minutos). Figura 10. Estabilidad de la frecuencia de los biosensores: a) pelcula sensora y b) interaccin protena/protena.

Tabla 1. Cambio en las frecuencias y determinacin de la densidad superficial de masa de la interaccin protena/protena mediante QCMs.
Cristal
anti-FGN/Q2_FGN BSA/Q3_FGN anti-FGN/Q4_FGN BSA/Q5_FGN anti-BSA/Q2_BSA anti-FGN/Q3_BSA anti-FGN/ Q4_BSA

f3 = f3 f2 3 (Hz) (g/cm2) 2,964 3.29 568 2,941 112 1824 128 -32 0.63 3.26 0.12 2.02 0.14 0.04