N-2462 ABR / 92

DETECÇÃO DE BACTÉRIAS
REDUTORAS DE SULFATO

Método de Ensaio

Cabe à CONTEC - Subcomissão Autora, a orientação quanto à interpretação do texto

desta Norma. O Órgão da PETROBRAS usuário desta Norma é o responsável pela
adoção e aplicação dos itens da mesma.
Requisito Mandatório: Prescrição estabelecida como a mais adequada e que deve ser
CONTEC utilizada estritamente em conformidade com esta Norma. Uma eventual resolução de
Comissão de Normas não seguí-la ("não-conformidade" com esta Norma) deve ter fundamentos técnico-
Técnicas gerenciais e deve ser aprovada e registrada pelo Órgão da PETROBRAS usuário desta
Norma. É caracterizada pelos verbos: “dever”, “ser”, “exigir”, “determinar” e outros
verbos de caráter impositivo.

Prática Recomendada (não-mandatória): Prescrição que pode ser utilizada nas

condições previstas por esta Norma, mas que admite (e adverte sobre) a possibilidade
de alternativa (não escrita nesta Norma) mais adequada à aplicação específica. A
alternativa adotada deve ser aprovada e registrada pelo Órgão da PETROBRAS usuário
desta Norma. É caracterizada pelos verbos: “recomendar”, “poder”, “sugerir” e
“aconselhar” (verbos de caráter não-impositivo). É indicada pela expressão: [Prática
Recomendada].
SC - 20
Cópias dos registros das "não-conformidades" com esta Norma, que possam contribuir
Técnicas Analíticas
para o aprimoramento da mesma, devem ser enviadas para a CONTEC - Subcomissão
de Laboratório
Autora.

As propostas para revisão desta Norma devem ser enviadas à CONTEC - Subcomissão
Autora, indicando a sua identificação alfanumérica e revisão, o item a ser revisado, a
proposta de redação e a justificativa técnico-econômica. As propostas são apreciadas
durante os trabalhos para alteração desta Norma.

“A presente Norma é titularidade exclusiva da PETRÓLEO BRASILEIRO

S.A. - PETROBRAS, de uso interno na Companhia, e qualquer reprodução
para utilização ou divulgação externa, sem a prévia e expressa autorização
da titular, importa em ato ilícito nos termos da legislação pertinente,
através da qual serão imputadas as responsabilidades cabíveis. A
circulação externa será regulada mediante cláusula própria de Sigilo e
Confidencialidade, nos termos do direito intelectual e propriedade
industrial.”

Apresentação

As normas técnicas PETROBRAS são elaboradas por Grupos de Trabalho –

GTs (formados por especialistas da Companhia e das suas Subsidiárias), são comentadas pelos
Representantes Locais (representantes das Unidades Industriais, Empreendimentos de Engenharia,
Divisões Técnicas e Subsidiárias), são aprovadas pelas Subcomissões Autoras – SCs (formadas por
técnicos de uma mesma especialidade, representando os Órgãos da Companhia e as Subsidiárias) e
aprovadas pelo Plenário da CONTEC (formado pelos representantes das Superintendências dos
Órgãos da Companhia e das suas Subsidiárias, usuários das normas). Uma norma técnica
PETROBRAS está sujeita a revisão em qualquer tempo pela sua Subcomissão Autora e deve ser
reanalisada a cada 5 (cinco) anos para ser revalidada, revisada ou cancelada. As normas técnicas
PETROBRAS são elaboradas em conformidade com a norma PETROBRAS N -1. Para
informações completas sobre as normas técnicas PETROBRAS, ver Catálogo de Normas Técnicas
PETROBRAS.

PROPRIEDADE DA PETROBRAS
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| DETECÇÃO DE BACTÉRIAS |
| | N-2462
| REDUTORAS DE SULFATO |
| | ABR/1992
| Método de Ensaio |
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1 OBJETIVO

Esta Norma prescreve o método para a detecção da presença de

bactérias redutoras de sulfato (BRS) em águas, resíduos sólidos,
petróleo e seus derivados.

2 CAMPO DE APLICAÇÃO

Esta Norma é aplicável para detecção de BRS sésseis ou plantônicas.

3 RESUMO

A amostra é inoculada em meio de cultura apropriada, com ausência de

oxigênio e contendo íon ferroso como indicador de crescimento
bacteriano. Após incubação em estufa à temperatura próxima à original
da amostra, observa-se o crescimento até 28 dias (Nota 1). A formação
de precipitado preto de sulfeto ferroso (FeS) no meio, indica a
detecção positiva de BRS.

Nota 1: Esse período de 28 dias pode ser reduzido conforme a

experiência do campo para um determinado meio de cultura e
para um determinado tipo de amostra e/ou com a introdução de
um sistema de agitação durante a incubação.

4 SIGNIFICADO E USO

As BRS’s podem desenvolver-se em sistemas que contenham nutrientes e

ricas de fontes de sulfato, por exemplo, água do mar desaerada a ser
injetada em reservatórios de petróleo. A presença de BRS pode causar
corrosão microbiológica devido à eliminação de excretas (ácidos e
gases) e/ou deposição de resíduos formados por reações desses
excretas com o meio, assim como, de polímeros excretados, nas
tubulações, tanques e equipamentos de processo. As BRS’s podem,
também, contaminar e/ou causar tamponamento do reservatório.

5 INTERFERENTES

A inoculação de amostras contendo gás sulfídrico (H2S) dissolvido

pode provocar a formação imediata de sulfeto ferroso, escurecendo o
meio de culturas e fornecendo resultado falso positivo.
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Origem: CONTEC - Subcomissão no 20 - Técnicas Analíticas de
Laboratório.
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Toda Norma é dinâmica, estando sujeita a revisões. Comentários
e sugestões, para seu aprimoramento, devem ser encaminhados à
Comissão de Normas Técnicas da PETROBRAS - CONTEC.
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Palavras-chave: bactérias - BRS - detecção.
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6 DEFINIÇÕES

As definições de termos utilizados nesta Norma obedecem à norma

PETROBRÁS N-2465.

7 NORMAS E/OU DOCUMENTOS COMPLEMENTARES

Na aplicação desta Norma é necessário consultar:

N-2282 - Segurança em testes de formação e produção na

presença de gás sulfídrico - Procedimento;
N-2464 - Preparação de meio de cultura e de fluido para
microbiologia - Procedimento;
N-2465 - Microbiologia - Terminologia.

8 PRECAUÇÕES DE SEGURANÇA

8.1 Antes de iniciar qualquer manuseio com reagentes, materiais e

equipamentos, consultar e aplicar os procedimentos apropriados de
segurança e de operação dos equipamentos.

8.2 O ANEXO A contém algumas informações de segurança referentes aos

reagentes e produtos de reação.

8.3 Proceder ao descarte dos meios de cultura utilizados, conforme

indicado no ANEXO B.

8.4 Esterilizar, em autoclave, todo o material utilizado, antes de

ser descartado, à temperatura de 121oC/1,1 atm, por 30 min.

9 APARELHAGEM E MATERIAIS

9.1 Agitador de tubos.

9.2 Recravadeira de selos de alumínio.

9.3 Estufa incubadora.

9.4 Banho ultra-sonificador, com capacidade para freqüência de 40

kHz.

9.5 Frascos de vidro transparente, termoresistentes, tipo

antibiótico, com capacidade para 50 mL e com boca de diâmetro externo
de 20 mm.

9.6 Rolhas de borracha para os frascos especificados no item 9.5.

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9.7 Selos de alumínio auto-rasgáveis para os frascos especificados

no item 9.5.

9.8 Seringas plásticas descartáveis ou seringas de vidro,

esterilizadas, de 5 mL de capacidade.

9.9 Pinças estéreis.

9.10 Frascos de vidro esterilizados com capacidade de 50, 500 e

1000 mL, para a coleta da amostra.

9.11 Autoclave para operar a 121oC/1,1 atm.

9.12 Centrífuga para operar em 1500 rpm.

9.13 Banho termostático.

10 REAGENTES, MEIOS DE CULTURA E SOLUÇÕES

10.1 Meio de cultura para BRS, conforme norma PETROBRÁS N-2464.

10.2 Parafina.

10.3 Solução de hidróxido de sódio (NaOH), 6%.

10.4 Solução de ácido nítrico (HNO3), 1:1 v/v.

10.5 Solução redutora de preservação, conforme norma PETROBRÁS

N-2464.

10.6 Solução seqüestrante de oxigênio, conforme norma PETROBRÁS

N-2464.

10.7 Nitrogênio ultrapuro, superseco, filtrado em filtro de algodão

cardado estéril ou similar.

11 PROCEDIMENTO

11.1 Amostragem

11.1.1 Amostra de água

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11.1.1.1 Conectar uma mangueira de borracha cirúrgica esterilizada

no ponto de amostragem.

11.1.1.2 Inserir a agulha da seringa coletora, a uma distância de 5

a 10 cm da extremidade da mangueira, e coletar do fluxo,
aproximadamente, 50 mL da amostra para o frasco de coleta vazio,
selado e estéril.

11.1.1.3 Envolver o bocal do frasco com fita teflon ou parafina.

11.1.1.4 Caso o procedimento descrito acima não seja possível,

coletar a amostra em recipiente esterilizado e transferir com seringa
estéril 50 mL para um frasco tipo antibiótico vazio, selado e estéril
(Nota 2).

11.1.2 Amostra de petróleo

Para amostras de petróleo, coletar um litro em frasco de vidro vazio

e estéril.

11.1.3 Conservação das amostras

Conservar as amostras coletadas em 11.1.1 ou 11.1.2 sob resfriamento

até a realização do ensaio, no menor tempo possível.

Nota 2: Caso a amostra contenha elevado teor de gás sulfídrico (H2S)

dissolvido, recomenda-se borbulhar nitrogênio no frasco de
coleta, possibilitando assim a retirada do gás. Realizar esta
operação em capela.

11.1.4 Amostra de água ou de petróleo inoculada diretamente no campo

Coletar 5 mL da amostra conforme os itens 11.1.1 ou 11.1.2 e inocular

diretamente no frasco de detecção.

11.1.5 Amostra sólida

Raspar, com auxílio de uma espátula ou pinça estéril, uma amostra da

incrustação ou depósito, colocar em frasco estéril e vedar. Evitar
pontos que foram expostos ao ar ou ao calor excessivo.

11.1.6 Amostra pastosa

Coletar a amostra em frasco de boca larga estéril e vedar.

11.1.7 Amostra do sistema e corpo de prova

Retirar a amostra do sistema ou corpo de prova e imergir na solução

redutora de preservação.

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11.2 Execução do ensaio

11.2.1 Fluidos aquosos

11.2.1.1 Inocular 5 mL da amostra, com auxílio de uma seringa

estéril, em frasco de detecção.

11.2.1.2 Mergulhar o frasco invertido em parafina derretida, de modo

a cobrir o bocal do frasco, e incubar em estufa à temperatura próxima
à da amostra, permitindo variação de +/- 5oC, por até 28 dias (Notas
1, 3, 4 e 5).

11.2.2 Fluidos oleosos

11.2.2.1 Com teor de água menor que 5%

a) Homogeneizar a amostra coletada conforme os itens 11.1.1

ou 11.1.2, por agitação manual. Tomar alguns frascos
tipo antibiótico, vazios e estéreis, e inserir, com
auxílio de uma seringa, 50 mL da amostra em cada um, de
modo que somados tenha-se um volume final de 10 mL de
água produzida.
b) Adicionar a cada frasco, com auxílio de uma seringa,
gotas de produto desemulsificante apropriado. Selar os
frascos e homogeneizar por um minuto ou mais, em um
agitador de tubos.
c) Imergir os frascos invertidos em um banho termostático à
temperatura próxima da amostra, por 30 minutos ou até
que ocorra uma boa separação da água.
d) Centrifugar a amostra, ainda com os frascos invertidos,
por 10 min a 1200 rpm.
e) Coletar alíquotas da água produzida, fase inferior, em
todos os frascos, perfazendo um total de 5 mL. Se a
quantidade de água separada não for suficiente,
completar com o próprio óleo.
f) Proceder conforme o item 11.2.1.2.

11.2.2.2 Com teor de água maior que 5%

a) Homogeneizar a amostra coletada conforme o item 11.1.1,

por agitação manual.
b) Proceder conforme o item 11.2.1.

11.2.3 Amostra pastosa e sólida

11.2.3.1 Transferir, com auxílio de uma seringa, 5 mL do meio de

cultura do próprio frasco de detecção a ser usado, para um frasco
tipo antibiótico contendo cerca de 5 g de amostra sólida ou pastosa.
Agitar o frasco, por 1 min, ou mais, em um agitador de tubos.
Reinjetar os 5 mL de meio com a amostra dispersa no frasco de
detecção (Nota 6).
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11.2.3.2 Proceder conforme o item 11.2.1.2.

11.2.4 Amostra do sistema e corpo de prova

11.2.4.1 Abrir o frasco de detecção contendo 45 mL do meio de

cultura e introduzir a amostra do sistema ou corpo de prova. Tampar e
lacrar novamente com selo de alumínio. Sonificar em banho ultra-
sonificador de 40 kHz de freqüência, por 40 min.

11.2.4.2 Injetar 1,0 mL de solução seqüestrante de oxigênio e

proceder conforme o item 11.2.1.2.

Nota 3: Frascos de detecção que se apresentem enegrecidos

imediatamente após a inoculação, mascarando a detecção devem
ser repicados. Neste caso, coletar, com auxílio de uma
seringa, 5 mL de meio pouco enegrecido ou 1 mL de meio muito
enegrecido e injetar em um novo frasco de detecção com 45 mL
de meio de cultura estéril.

Nota 4: Recomenda-se que o ensaio negativo à temperatura próxima da

amostra, fora da faixa de 32 a 42oC, seja repetido a 37oC, uma
vez que o microorganismo pode desenvolver-se quando submetido
a outra condição de temperatura.

Nota 5: O ensaio de detecção deve ser feito em duplicata.

Nota 6: Como alternativa, pode-se inocular diretamente a amostra,

abrindo-se o frasco de detecção. Neste caso, após a
inoculação, tampar e lacrar novamente o frasco com selo de
alumínio, e injetar 1,0 mL de solução seqüestrante de
oxigênio,

12 RESULTADOS

12.1 Interpretação do ensaio

O ensaio deve ser considerado positivo, caso haja enegrecimento do

meio ou formação de precipitado preto de FeS no frasco de detecção,
em pelo menos uma das duplicatas (Nota 7).

Nota 7: A formação de precipitado preto, indicando desenvolvimento de

BRS, no caso de amostras de petróleo, pode ser observada
devido à imiscibilidade do óleo na água.

12.2 Expressão dos resultados

Reportar os resultados como a seguir:

- teste negativo: (-) em m dias ou;

- teste positivo: (+) em n dias.

Onde:
m = é o número máximo de dias convencionado para observação do
teste (Nota 1);
n = é o número de dias a partir do qual foi observado
crescimento microbiano.

/ANEXO A
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ANEXO A - INFORMAÇÕES DE SEGURANÇA

A.1 NITROGÊNIO

- Gás comprimido sob alta pressão.

- O nitrogênio reduz a quantidade de oxigênio necessária à
respiração.
- Manter a válvula do cilindro fechada, quando não estiver em
uso.
- Não estocar cilindros em locais que não tenham ventilação
adequada.
- Usar sempre uma válvula reguladora de pressão.
- Manter a válvula redutora fechada antes de abrir a válvula do
cilindro.
- Não transferir o gás de um cilindro para outro.
- Não fazer mistura de gases no cilindro.
- Nunca deixar o cilindro cair.
- Assegurar de que o cilindro está preso no suporte.
- Não ficar na frente da saída da válvula do cilindro durante
manuseio.
- Não expor o cilindro aos raios solares e manter longe do
calor.
- Manter o cilindro longe de ambiente corrosivo.
- Não usar cilindros que não estejam identificados.
- Não usar cilindros amassados ou danificados.
- Não usar para inalação.

A.2 ÁCIDO NÍTRICO

A.2.1 Características

Líquido corrosivo, odor característico, altamente irritante e

sufocante. Em contato com a pele e os olhos causa severas
queimaduras, conjuntivite e ulceração córnea. Seus vapores podem
causar edema pulmonar, bronquite, broncopneumonia e nefrite.

A.2.2 Primeiros socorros

A.2.2.1 Em contato com a pele e os olhos, lavar em abundância e

procurar um especialista.

A.2.2.2 Em caso de ingestão, lavar completamente a boca, beber

bastante água e em seguida leite de magnésia. Procurar um
especialista.

A.2.3 EPI’s

Na manipulação, usar óculos de segurança, luvas de borracha, e

avental. O uso deve ser efetuado em capela com boa exaustão. Diluir
sempre pela adição do ácido na água.

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A.3 HIDRÓXIDO DE SÓDIO

A.3.1 Características

Pastilhas, escamas ou palitos deliqüescentes. Em contato com a pele e

os olhos causa queimaduras graves. Se ingerido causa severos danos e
irritações internas. Reação exotérmica com limitada quantidade de
água.

A.3.2 Primeiros socorros

Em contato com a pele e os olhos, lavar com água em abundância. Se

ingerido, lavar a boca com água e beber vinagre ou ácido acético 1%.

A.3.3 EPI’s

Usar protetor facial ou óculos de segurança e luvas de borracha.

A.4 Sulfeto de hidrogênio (H2S)

A.4.1 H2S (gás sulfídrico ou sulfeto de hidrogênio) é extremamente

tóxico e por ser mais pesado que o ar, se acumula nas regiões mais
baixas.

A.4.2 É um gás venenoso, e dependendo da concentração é capaz de

paralisar o sistema respiratório e matar em questão de minutos.

A.4.3 O limite de tolerância de exposição ao gás sulfídrico, é de 8

ppm para uma jornada de oito horas diárias, conforme NR-15 da
Portaria no 3214 do Ministério do Trabalho.

A.4.4 É um gás hipersensibilizante, isto é, a exposição freqüente

torna o organismo cada vez mais vulnerável.

A.4.5 Em baixas concentrações tem odor forte e desagradável,

semelhante ao de ovo podre. Para concentrações entre 8 e 50 ppm,
provoca perda de olfato em até 1 hora, e problemas nos olhos e
garganta a seguir: entre 100 e 150 ppm de H2S na atmosfera provoca
perda de olfato em até 15 min., podendo causar a morte a partir de 8
horas de exposição: 200 ppm podem causar a morte do indivíduo a
partir de 4 horas de exposição. A concentração letal é de 600 ppm:
neste teor, o H2S mata em instantes.

A.4.6 O H2S age da seguinte forma sobre o organismo: quando se

respira, o H2S, através dos pulmões, entra na corrente sangüínea.
Para se proteger, o organismo oxida (queima) o H2S o mais rápido
possível, formando um composto não prejudicial. Quando a concentração
aumenta, o organismo não consegue oxidá-lo totalmente e o excesso de
H2S age no centro nervoso do cérebro que comanda a respiração,
resultando na paralisação total do sistema respiratório. Como
conseqüência, os pulmões param de funcionar, e a pessoa se asfixia.

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A.4.7 O H2S queima com uma chama de coloração azulada, produzindo o

SO2, que também é venenoso, apresentando como concentração letal 1000
ppm. Entretanto, sua presença na atmosfera é mais facilmente
perceptível do que no caso do H2S, na medida em que o SO2 não atua
inibindo o olfato, mas sim provocando sufocação do homem, obrigando
ao abandono imediato do local de trabalho.

A.4.8 Consultar os procedimentos de segurança estabelecidos no ANEXO

A da norma PETROBRÁS N-2282.

/ANEXO B

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ANEXO B - PROCEDIMENTO PARA DESCARTE DOS MEIOS

DE CULTURA UTILIZADOS

B.1 Esterilizar a 121oC/1,1 atm, por 30 min., os frascos contendo

meios de cultura utilizados.

B.2 Injetar em cada frasco, com auxílio de uma seringa, uma

quantidade suficiente de solução de hidróxido de sódio 1N, para
precipitar todo o sulfeto.

B.3 Abrir os frascos e descartar o material, em capela, devido ao

desprendimento de gás sulfídrico (H2S) residual.

B.4 Imergir os frascos em solução detergente e, em seguida,

enxagüar. Os frascos amarelados, devido à aderência do ferro, devem
ser colocados em solução de ácido nítrico (HNO3) a 10% (v/v), e
novamente lavados com solução detergente e enxagüados. Secar em
estufa a 110oC.

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