UNIVERSIDADE DE CAXIAS DO SUL – UCS

PRINCÍPIOS DE BIOLOGIA MOLECULAR

Profa. Raquel Balestrin

GUIA DE BOAS PRÁTICAS LABORATORIAIS EM GENÉTICA MOLECULAR

1. Espaço físico e equipamentos

Grande parte dos exames realizados em laboratórios de Genética Molecular Humana utiliza a reação em
cadeia da polimerase (PCR) como ferramenta básica. É conhecido que a PCR, dependendo das condições
técnicas e laboratoriais, está sujeita a interferências graves se houver contaminação da amostra a ser
amplificada por outras moléculas de DNA ou RNA. As moléculas de DNA previamente amplificadas em
outras reações (amplicons) são as que representam as maiores ameaças de contaminação. Detalhes da
organização do espaço físico dos laboratórios podem minimizar esse risco de contaminação. Essa
organização deve também prever espaços seguros e apropriados para manipulação de amostras e de
substâncias tóxicas, correto funcionamento dos equipamentos, estocagem de reagentes, estocagem de
amostras e laudos e setores administrativos.

1.1. É recomendado que as reações pré-PCR sejam preparadas em capelas exclusivas para esse fim ou
em salas isoladas daquelas onde são manuseadas amostras com DNA amplificado ou material clonado,
como, por exemplo, locais onde são realizadas as eletroforeses (salas de pós-PCR). Os ambientes para
preparação de pré-PCR devem conter lâmpada de luz ultra-violeta, que deve ser ligada cerca de 15
minutos antes e depois do preparo de cada bateria de reações pré-PCR.
1.2. A localização das máquinas de PCR (termocicladores) é optativa: podem ficar em recintos de pré-
PCR bem como de pós-PCR. Caso fiquem em recinto de pré-PCR, os tubos contendo amostras
amplificadas nunca devem ser abertos nesse compartimento, mas somente em salas de manuseio de
amostras pós-PCR.
1.3. O armazenamento de frascos contendo DNA amplificado pela PCR ou DNA clonado deve ser feito em
local distinto dos locais de armazenamento de reagentes utilizados na preparação de reações pré-PCR.
1.4. Os locais onde são realizadas as extrações de DNA devem ser preferencialmente isolados daqueles
onde as amostras de DNA amplificado são manuseadas como, por exemplo, salas de eletroforese. O
objetivo desta medida é evitar que amostras de DNA recém-extraídas sejam contaminadas por
amplicons.
1.5. É também recomendado que equipamentos, vidrarias e reagentes (centrífugas, micropipetadores,
soluções etc) utilizados nas etapas de pré-PCR sejam distintos daqueles utilizados nas etapas de pós-
PCR.
1.6. Os espaços destinados a laboratórios devem ter um tamanho apropriado que contribua para a
qualidade do trabalho e para a segurança dos funcionários.
1.7. Se for realizado atendimento a pacientes, deve ser destinado espaço adequado para essa atividade.
Espaços adicionais separados do ambiente laboratorial devem ser reservados para administração e para
outros serviços relacionados.
1.8. Os equipamentos e instrumentos devem ter uma rotina de limpeza, manutenção e calibragem. Os
manuais de operação devem estar disponíveis na bancada, ao lado do equipamento. Equipamentos,
reagentes e amostras temperatura-dependentes devem ser controlados adequadamente.

AULA PRÁTICA 1 : EXTRAÇÃO DE DNA TOTAL (GENÔMICO) DE SANGUE

Objetivo: Extrair DNA genômico de sangue.

Material:
 Sangue Humano
 Tubos eppendorf (2,0 ml)
 Ponteiras 1000ul, 200ul, 10ul
 Pipetadores automáticos 1000ul, 200ul, 10ul
 Centrífuga
 Banho Maria
 Vortex
 Freezer
 Reagentes
o kit de extração de DNA Wizard Genomic – DNA Purification Kit – Promega ®
o Isopropanol
o Etanol 70%

Procedimentos:
 
1. Adicionar 900 µL de solução de lise de células a 300 µL de amostra em um microtubo de 1,5 mL.
 UNIVERSIDADE DE CAXIAS DO SUL – UCS
PRINCÍPIOS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Profa. Raquel Balestrin
2. Agitar gentilmente o tubo (inverter 5-6 vezes)

3. Incubar por 10 minutos a temperatura ambiente, invertendo o tubo 2 ou 3 vezes.

4. Centrifugar a 14.000 rpm por 20 segundos.

5. Descartar o máximo possível do sobrenadante sem mover o pellet.

6. Agitar vigorosamente em vortex até a suspensão total do pellet.

7. Adicionar 300 µL de solução de lise nuclear. Se uma nuvem de células for visível após agitação,
incubar a 37ºC até o rompimento da mesma.

8. Adicionar 100 µL de solução de precipitação de proteínas agitando em vortex por 10-20 segundos.

9. Centrifugar a 14.000 rpm por 2 minutos

10. Transferir sobrenadante para um microtubo contendo 300 µL de isopropanol.

11. Agitar por inversão até a formação de uma massa visível de DNA.

12. Centrifugar a 14.000 rpm por 3 minutos.

13. Adicionar 300 µL de etanol 70º GL ao DNA e gentilmente inverter o tubo várias vezes.

14. Centrifugar a 14.000 rpm por 3 minutos.

15. Descartar o sobrenadante.

16. Inverter o tubo para secagem por 10-15 minutos.

17. Adicionar 50 µL de solução de reidratação e incubar a 65ºC por uma hora ou a 4ºC overnight.

18. Conservar a amostra de 0 a –20ºC.

*O material extraído será adequadamente armazenado e poderá ser utilizado nas aulas
posteriores para análise.

AULA PRÁTICA 2 : Reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction – PCR)

______________________________________________________________________________

Introdução:
O processo de PCR foi descrito por Kary Mullis no final da década de 1980, tendo-lhe sido posteriormente,
em 1993, atribuído o Prémio Nobel da Química pelo seu trabalho. Em 1989, a Hoffman La Roche & Per-
kin-Elmer Corporation patenteou este processo. O métodA PCR é usado habitualmente nos laboratórios
de investigação médica e biológica para uma variedade de tarefas, como a detecção de doenças hereditá -
rias, que é a identificação de "impressões digitais" genéticas, a construção de árvores filogenéticas (árvo-
res de relação entre espécies), a clonagem de genes (ver adiante), testes de paternidade, exames para
detecção de agentes patogênicos e etc.

Aplicações
A PCR encontra sua principal aplicação em situações onde a quantidade de DNA disponível é reduzida.
Em teoria, é possível amplificar qualquer DNA. Uma das principais aplicações dA PCR é na medicina fo-
rense, onde pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaços de cabelo, gotas de
sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA deixada em uma im-
pressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo método de fingerprinting. A PCR também é
 UNIVERSIDADE DE CAXIAS DO SUL – UCS
PRINCÍPIOS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Profa. Raquel Balestrin
rotineiramente utilizado em procedimentos científicos de Biologia Molecular como amplificação para gerar
mutagênese, detecção de mutações ou preparação de fragmentos de DNA para clonagem (inserção em
plasmídeo, por exemplo) como também pode ser utilizado para identificação de patógenos que estão pre-
sentes em amostras como por a exemplo identificação de agentes como Cândida sp, Chlamydia tracho-
matis, HPV Vírus do papiloma humano e seus genótipos, HBV Vírus da Hepatite B. Etc

Procedimentos
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método muito sensível de análise e por isso é realizado
com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou tornar errôneo o resultado. Em
primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo:
vestígios de crimes) sem danificá-lo. Normalmente o material extraído é o DNA, mas pode-se trabalhar
com o RNA em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras aplicações.
Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura (também conhecida como pré-mix) que con-
tém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases nitrogenadas ligadas com um três
fosfato, os primers também chamados de oligonucleotídeos (ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase
em uma solução tampão. Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura
pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado).
Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96ºC por pouco tempo para que haja a sepa -
ração da dupla cadeia de DNA (Desnaturação). Na segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a
60ºC dependendo da quantidade de C e G encontrada no primer, para que os primers se anelem (parei-
em) com a fita molde de DNA (anelamento). Na última etapa do ciclo a temperatura é elevada a 72ºC
para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é
iniciado. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é
exponencial.
O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida.

Otimização da PCR
 
· [MgCl2]
DNA molde, agentes quelantes na amostra (ex. EDTA), dNTPs e proteínas alteram a [Mg 2+] livre.
Ausência de [Mg2+] adequada: Taq DNA Polimerase é inativa.
Excesso de Mg2+ livre: redução da fidelidade enzimática e aumento de produtos não específicos.
Importante: determinar empiricamente [Mg 2+] ótima para cada reação.
 
· [Tampão]
Ausência de Triton X-100: pouca ou nenhuma atividade da Taq DNA
Polimerase.
 
· [Enzima]
Recomendado: 1,25U da Taq DNA Polimerase em 50 ml de reação.
Adicionando mais enzima não altera a quantidade de produto formado ao final da reação. Rastro
de DNA em gel de agarose: tempo de extensão muito longo e excesso de enzima ocasionam o aumento
da probabilidade da atividade exonucleásica 5'®3' da Taq DNA Polimerase.
 
· [Desenho dos iniciadores de cadeia]
Tamanho: 15 - 30 bases
Devem conter: ~ 40 - 60% G+C
Evitar:
Sequências que produzam estruturas secundárias
ex: 5' CCCCATTGGGG 3' ® T
A T
C G
C G
C G
C G
 
Extremidades 3' não devem ser complementares a fim de evitar a formação de dímeros de
iniciadores na reação de PCR
 
Tm similares dos iniciadores: a temperatura de anelamento depende do iniciador com menor Tm.
 
·[Solução do DNA molde]
Ao purificar o DNA deve-se evitar os seguintes compostos, pois são fortes inibidores da Taq DNA
Polimerase: sais, guanidina, proteases, solventes orgânicos e SDS.
 UNIVERSIDADE DE CAXIAS DO SUL – UCS
PRINCÍPIOS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Profa. Raquel Balestrin
 · [Quantidade de DNA]
Erros muito comuns:
DNA molde em excesso
Aconselha-se iniciar com mais do que 10 4 cópias do DNA molde
(mas manter [DNA] £ 10ng/ml)
(1 mg de 1kb dsDNA = 9,12 x 1011 moléculas)

PCR PARVOVÍRUS CANINO TIPO 2 E VÍRUS DA PANLEUCOPENIA FELINA

MIX 25 μL
PRIMER SENSO (10 pmol) - CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC
5' 3'
1 μL
PRIMER ANTISENSO (10 pmol) - 5'GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC3' 1 μL
MIX PROMEGA** 12,5 μL
ÁGUA MILLI-Q AUTOCLAVADA ___ μL

DNA (AMOSTRA) 3 μL

** Mix Promega: TAMPÃO da Taq (10X) (Buffer), dNTP (2mM), MgCl2 (50mM), Taq (Platinum)

Este protocolo foi adaptado para o termociclador da sala 414, bloco S, UCS, termociclador GeneAmp
2400 da Applied Biosystems. A polimerase utilizada é o Master Mix 2x da Promega ®.

TERMOCICLADOR – PROGRAMA DE CICLAGEM

94ºC / 2 minutos
38 ciclos de:
94ºC / 30 segundos
___ºC / 30 segundos
72ºC / 30 segundos
72 C / 2 minutos
º

Resfriamento a 10ºC

CÁLCULO DE TEMPERATURA DE ANELAMENTO:

Tm= [(A+T)X2 + (G+C)X4] - 4

AULA PRÁTICA 3: AVALIAÇÃO ELETROFORÉTICA DO DNA - AGAROSE

Introdução:
A eletroforese em gel de agarose consiste no método padrão usado para separar, identificar,
analisar, caracterizar e purificar fragmentos de DNA. A técnica é simples, rápida e capaz de separar
misturas de fragmentos de DNA que não podem ser separados por outros métodos, tais como
centrifugação com densidade de gradiente ou por velocidade de sedimentação. A localização do DNA no
gel pode ser determinada diretamente. As bandas no gel são coloridas principalmente por Brometo de
Etídeo em baixa concentração, que colore por intercalar-se na dupla fita de DNA. Concentrações de até 1
ng de DNA podem ser visualizadas por exame direto de gel na luz ultravioleta.
Uma molécula de DNA, quando exposta a um campo elétrico, migra para o eletrodo na velocidade
ou mobilidade eletroforética, proporcional a força do campo e a carga líquida da molécula. A mobilidade
eletroforética é também inversamente proporcional ao coeficiente friccional da molécula, que, por sua
vez, é função do tamanho e forma da molécula, e da viscosidade do meio.
A agarose consiste num polissacarídeo linear de galactose e um derivativo de galactose
associados através de ponte de hidrogênio. Agarose é composta de unidades de -D-galactopiranose
com ligação 1,3 e 3,6 anidro-a-L-galactopiranose com ligação 1,4. Essa unidade básica de agarobiose é
repetida cerca de 4000 vezes, formando longas cadeias de com peso molecular médio de 120.000
Daltons. Também podem ocorrer no polissacarídeo, grupos com carga, tipicamente piruvato e sulfato.
 UNIVERSIDADE DE CAXIAS DO SUL – UCS
PRINCÍPIOS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Profa. Raquel Balestrin
Esses grupos são responsáveis por várias propriedades da agarose, e a seleção cuidadosa de matéria
prima para o preparo da agarose controla a qualidade para fins específicos.
Tipos de eletroforese

●    Eletroforese em gel de agarose: a agarose é utilizada como gel para a eletroforese. A agarose é um
polissacarídeo, e forma uma rede que segura as moléculas durante a migração. Dependendo da
concentração de agarose, têm-se uma diferença no gradiente de separação. Para preparar um gel de
agarose, simplesmente faz-se a mistura entre o pó de agarose e solução tampão (TBE). Após fundir,
coloca-se brometo de etideo (moderadamente tóxico e altamente mutagênico)ou SYBR Safe DNA gel
stain, que fará o DNA ou RNA "brilhar" quando exposto ao UV. Quando a mistura esfriar o gel estará
duro. Esse endurecimento é feito em um local apropriado, o mesmo local onde será feita a corrida da
amostra. Um detalhe importante é a colocação do pente no gel durante o endurecimento. O pente cria
poços que serão utilizados para a colocação das amostras.

 ●    Eletroforese em gel de poliacrilamida - A poliacrilamida também pode ser utilizada com gel para a
eletroforese. A poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros, acrilamida e bisacrilamida. A acrilamida é
uma molécula linear, enquanto que a bisacrilamida é em forma de "T". Misturando essas duas moléculas,
temos a formação de uma "rede". Diferentes relações entre as concentrações dessa moléculas permitem
a criação de diferentes gradientes de separação. Para preparar um gel de poliacrilamida, deve-se
misturar as duas substâncias formadoras nas concentrações desejadas, coloca-las em um suporte de
vidro, e adicionar Temed e Persulfato de amônio 10%, que atuam como catalizadores da polimerização.

 ●    Eletroforese desnaturante - inclui um agente desnaturante (normalmente uréia), o que ajuda a tornar
a separação melhor entre moléculas que apresentam diferenciação em suas estruturas secundárias.

 ●    Eletroforese capilar - Funciona como a eletroforese normal, porém o gel e a amostra estão dentro de
um capilar, e a amostra é detectada automaticamente por um detector. Isso possibilita a automação do
processo. Essa é a eletroforese atualmente utilizada em sequenciadores de DNA.

Objetivo: Visualizar, fotografar e analisar em gel de agarose (horizontal) os produtos das reações de
PCR.

Material:

o TBE 10X: 60,55g/L Tris; 30,90g/L ácido bórico; 9,3g/L EDTA.

o Agarose
o Água destilada
o Tampão de Amostra 5X : ficoll 15%; Azul de bromofenol 0,15%; xilenocianol 0,15%.
o Gel Red ou Brometo de Etídeo
o Amostras de DNA (PCR)
o Controles (positivo e negativo)
o Balança
o Papel para pesar
o Espátula
o Pipetadores automáticos
o Ponteiras
o Cuba de eletroforese
o Acessórios da cuba de eletroforese (pentes, espaçadores..)
o Fonte
o Micro-ondas
o Luvas térmicas
o Erlenmeyer 250 ml
o Sistema de Fotodocumentação ou transiluminador
o Marcador de peso molecular: µX174 RF DNA / III Fragments

Procedimentos:
Avaliacão eletroforética do DNA em gel de agarose 1,5%.
 Pesar 1,5g de agarose.
 Em frasco Erlenmeyer, adicionar a agarose e 100mL de TBE 1X.
 UNIVERSIDADE DE CAXIAS DO SUL – UCS
PRINCÍPIOS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Profa. Raquel Balestrin
 Aquecer em micro-ondas até sua completa dissolução.
 Resfriar à temperatura ambiente.
 Adicionar GELRED 10.000x (1:10.000) – 10 ul GelRed ou Brometo de Etídeo (4 ul) diretamente
no gel de agarose concentrado para 100ml de gel de agarose.
 Homogenizar até completa dissolução.
 Colocar o gel na cama.
 Colocar o pente com cuidado e na posição correta (não aprofundar demais)
 Aguardar até sua completa polimerização à temperatura ambiente (+ou - 30minutos).
 Retirar o pente com cuidado para não rasgar o gel e as canaletas.
 Colocar cuidadosamente o gel na cuba contendo TBE 1X.
 Limpar as canaletas e tirar bolhas de ar com auxílio do tampão da cuba.
 Preparar as amostras, adicionando 5µl de tampão de amostra às preparações de DNA clivados
com enzimas de restrição (volume total 25µl).
 Aplicar no gel de agarose todo o volume das reações de clivagem, controles positivos, controle
negativo e marcador.
 Submeter as amostras à eletroforese: 90V ~70-75mA, 40 minutos.
 Visualizar os fragmentos de DNA no gel de agarose em sistema de foto documentação.
 Fotografar e analisar.
P.S.: Diluição do TBE 10X para TBE 1X: 100mL de TBE 10X em 900mL de água destilada.

         PREPARO E APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS

 Preparo das amostras:                      1,0 μL de tampão glicerol

                                               10,0 μL de produto de PCR

Preparo do Marcador de peso Molecular:        2,0 µL marcador (diluído 1:6)

                                                                           2,0 µL tampão glicerol

CORRIDA  - Correr o gel na cuba por +- 40 minutos a 90V e 70mA (Livre)

 VISUALIZAÇÃO DO GEL - Em luz UV, utilizando EPI’s adequados.