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Protocolos de Microbiologia Clnica

Coprocultura
Parte 2 - Outros enteropatgenos
Escherichia coli causadoras de diarria E. coli enteropatognica (EPEC) So assim definidas as E. coli pertencentes ao sorogrupo epidemiologicamente implicado como patgeno, onde o mecanismo de virulncia no est relacionado excreo de tpicas enterotoxinas. Origem e prevalncia ainda hoje so controvertidas, pois surtos de infeco so espordicos. Homem, bovinos e sunos podem ser infectados. A proporo de cepas patognicas e no patognicas, embora objeto de intensas pesquisas, ainda desconhecida. Denomina-se diarria infantil a doena usualmente associada EPEC. Causa a destruio das microvilosidades intestinais a partir da aderncia da bactria membrana plasmtica do entercito, aderncia esta mediada por fmbrias codificadas por plasmdeos, ocasionando uma diarria com febre, nuseas e vmitos. EPEC so potencialmente infectantes para crianas e lactentes e a dose infectante muito baixa. Em alguns casos de doenas em adultos, o inculo geralmente similar a outros enteropatgenos (cerca de 106) para causar infeco. Surtos de EPEC esto geralmente implicados com contaminao alimentar (como ingesto de carne crua e galinha), embora qualquer alimento exposto contaminao fecal seja bastante suspeito. Apesar de espordicos, os surtos de EPEC so mais freqentes em pases que possuam prticas sanitrias deficientes (cerca de 50% dos ndices de

Carlos Henrique Pessa de Menezes e Silva Doutor em Microbiologia Microbiologista do Centro Tecnolgico de Anlises (CETAN), Vila Velha-ES Consultor em Microbiologia do Laboratrio Landsteiner, Vitria-ES : carloshenrique@cetan.com.br
mortalidade so reportados em pases do terceiro mundo). E. coli enteroinvasora (EIEC) Produz uma doena conhecida como disenteria bacilar muito semelhante causada por Shigella. Qualquer alimento contaminado com fezes de indivduos infectados, bem como gua contaminada, ir causar a doena. Surtos de EIEC so freqentemente associados com a contaminao de carnes e leite no pasteurizado. A bactria ingerida e invade as clulas epiteliais do intestino, resultando em uma doena caracterizada por febre, vmitos e clicas, com sangue e leuccitos PMN nas fezes. A disenteria causada por EIEC geralmente ocorre de 12 a 72 horas aps a ingesto do alimento contaminado, sendo

Quadro 1. Caractersticas de infeces intestinais por Escherichia coli

ETEC Mecanismo patognico primrio Stio primrio de infeco Dano mucosa intestinal Epidemiologia Enterotoxina LT e/ ou ST Intestino delgado Ausente (intacta)

EIEC Invaso de entercitos Intestino grosso Necrose, ulcerao, inflamao Espordica

EHEC Citotoxina semelhante da Shigella Intestino grosso Destruio de microvilosidades, morte celular Colite hemorrgica, sndrome hemoltica urmica Ausente Sanguinolenta Proeminente Ausente

EPEC Aderncia a entercitos

Intestino delgado Destruio de microvilosidades

Diarria de viajantes, diarria infantil Ausente Aquosa Ausente Ausente

Diarria infantil

Febre Fezes: - Natureza - Sangue - Pus (PMN)


ETEC = E. coli enterotoxignica

Comum Purulenta Comum Presente

Comum Aquosa Ausente Ausente


EPEC = E. coli enteropatognica

EIEC = E. coli enteroinvasora

EHEC = E. coli enterohemorrgica

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a dose infectante muito baixa (estimada em pouco mais de 10 clulas bacterianas). So freqentemente fermentadores tardios (ou no fermentadores) de lactose, imveis, com prova de lisina descarboxilase negativa, sendo, portanto, facilmente confundidos com Shigella. E. coli enterotoxignica (ETEC) Tem sido etiologicamente associada com doena diarrica de todos os grupos etrios de diversas localizaes em todo o mundo. O microrganismo causa diarria em crianas principalmente em pases menos desenvolvidos e em turistas em visita a pases em desenvolvimento (por esse motivo freqentemente denominada de diarria dos viajantes). A etiologia dessa doena (similar clera) reconhecida h cerca de 20 anos. Produz dois tipos de enterotoxinas: LT (uma toxina termolbil) e ST (uma toxina termoestvel, que resiste ao aquecimento a 100C por 15 minutos). A enterotoxina LT de ETEC uma protena complexa e de alto peso molecular que est estrutural e funcionalmente relacionada toxina colrica. A dose infectante relativamente alta (100 milhes a 10 bilhes de bactrias). O microrganismo precisa colonizar o intestino delgado e se estabilizar (perodo de incubao de um a dois dias), onde ento se prolifera e produz as toxinas que induzem secreo de fluidos (provocando uma diarria intensa e aquosa). Com uma dose infectante muito alta, a diarria pode ser induzida em 24 horas. Em crianas, a dose infectante bem menor para se ter um quadro instalado. A contaminao da gua com dejetos humanos pode levar a uma contaminao cruzada dos alimentos. Contaminaes de alimentos por manipuladores tambm freqente, principalmente em alimentos base de carne e leite. A doena usualmente autolimitada. Em crianas ou idosos debilitados, uma reposio apropriada de eletrlitos necessria. E. coli enterohemorrgica (EHEC) O subtipo de EHEC mais comum o

A) ETEC se liga firmemente s microvilosidades intestinais atravs de suas fmbrias, secreta enterotoxinas no interior das clulas intestinais. B) EPEC destri as microvilosidades intestinais e se torna firmemente ligada atravs de um pedestal constitudo de actina e protenas ligadoras de actina. C) EIEC penetra na clula intestinal, podendo se multiplicar no interior do fagolisossoma e invadir clulas vizinhas, digerindo suas membranas citoplasmticas. D) EHEC atua de forma similar EPEC, mas alm disso libera Shiga-toxinas nas clulas intestinais, promovendo a sua lise.

Figura 1. Interao dos diversos tipos de E. coli causadoras de diarria com as clulas intestinais humanas

O157, a famosa bactria responsvel pelo grande surto que matou cerca de 20 pessoas e infectou outras 500 nos Estados Unidos em 1996, devido ingesto de bolo de carne contaminado. caracteristicamente responsvel pela colite hemorrgica, causando dores abdominais intensas, diarria sanguinolenta, com pouca ou nenhuma febre. Cerca de 80% das cepas isoladas pertencem ao sorogrupo O157:H7 e as crianas com menos de cinco anos so as mais acometidas. Produz uma potente toxina (denominada verotoxina ou toxina shiga-like, pois semelhante toxina produzida pela Shigella dysenteriae). Carnes cruas ou mal cozidas contaminadas tm sido implicadas como potentes fontes de contaminao humana. A dose infectante ainda desconhecida, mas muito prxima de Shigella (cerca de 10 clulas bacterianas). A doena pode ter

ndices de mortalidade acima de 50% em pacientes idosos. Uma seqela comum associada com a infeco, especialmente no caso de crianas infectadas, a sndrome hemoltica urmica. Diagnstico laboratorial: Com exceo das cepas de EHEC (no fermentadoras de sorbitol), no h um teste bioqumico especfico que diferencie as E. coli causadoras de diarria das E. coli presentes em amostras fecais normais e devem, portanto, ser diferenciadas atravs de provas sorolgicas (com a caracterizao dos antgenos somtico [O] e flagelar [H] das mesmas). A utilizao dos meios de cultura sugeridos na Parte 1 deste protocolo (gar MacConkey + gar XLD + caldo GN) suficiente para o isolamento destes sorogrupos enteropatognicos de E. coli. No entanto, deve-se ficar atento ao fato das caractersticas apresentadas pelas amostras fecais, uma vez que muito

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raramente fezes slidas/pastosas carreiam algum destes sorogrupos. Neste tipo de amostra, geralmente as E. coli crescidas so meramente pertencentes microbiota intestinal normal. Para o isolamento seletivo de EHEC, pode-se utilizar meios especficos como o gar MacConkey-sorbitol (Figura 2) ou meios cromognicos (Figura 3). Yersinia O gnero Yersinia possui trs espcies de importncia clnica: Y. estis (o agente causal da peste bubnica), Y. seudotuberculosis e Y. nterocolitica (muito implicadas em casos severos de gastroenterites, com formao de abscessos locais e at morte causada por peritonites). Y. nterocolitica tem sido implicada na gastroenterite aguda, podendo causar uma forma grave que simula a apendicite. Das trs espcies patognicas de Yersinia, somente Y. nterocolitica e Y. seudotuberculosis causam diarrias. Surtos de infeco atravs de alimentos causados por Y. seudotuberculosis tm sido reportados nos Estados Unidos nos ltimos tempos e transmitidos por gua e alimentos no Japo. Cepas de Y. nterocolitica podem ser encontradas em carnes (de porco, carneiro, boi, etc), ostras, peixes e leite cru. A causa exata da contaminao alimentar ainda desconhecida. Entretanto, a prevalncia destes microrganismos no solo, na gua e em animais como porcos e animais silvestres oferece ampla oportunidade para a contaminao alimentar. A doena freqentemente caracterizada por sintomas como gastroenterite com diarria e/ou vmitos; entretanto, febre e fortes dores abdominais so os sintomas mais marcantes. Diagnstico laboratorial: Y. enterocolitica um microrganismo com morfologia de pequenos cocobacilos Gram-negativos que produzem colnias pequenas e puntiformes em gar MacConkey. Deve-se suspeitar de Yersinia sempre que o meio de T.S.I. apresentar uma colorao amareloplida ou alaranjada aps 24 horas de incubao. Isto se deve fraca produo de cido na superfcie do gar, mostrando ausncia de acidificao na base. A bactria cresce mais rapidamente temperatura de
Figura 2. gar MacConkey-sorbitol: EHEC = colnias incolores (sorbitol-negativas)

Figura 3. Meio cromognico seletivo para EHEC (colnias vermelhas)

altas (0,50%) de KOH foram relatadas como sendo letais para Y. enterocolitica. Da mesma forma, o enriquecimento a frio tambm eficaz, mas demorado e conseqentemente pode no permitir a deteco do microrganismo numa escala temporal clinicamente relevante. O gar de cefsulodina-irgasan-novobiocina (CIN) um meio seletivo e diferencial para a recuperao de Y. enterocolitica a partir de espcimes fecais. As colnias desta bactria aparecem chatas, com um centro vermelho (Figura 4). Algumas propriedades que podem distinguir esta bactria de outras Yersinia incluem resultados positivos para ornitina descarboxilase e a fermentao da sacarose e resultados negativos para a fermentao da rafinose, melibiose e ramnose. Mais de 70% dos isolados so urease(+). Devido baixa prevalncia deste microrganismo em certas reas geogrficas, cada laboratrio precisa determinar se cada lote de fezes vai ser avaliado quanto presena desta bactria ou se estas culturas s sero realizadas quando solicitadas.

Aeromonas e Plesiomonas Aeromonas hydrophila amplamente encontrada em guas naturais, solo e guas salgadas. Algumas cepas so capazes de causar doena em peixes e anfbios bem como no homem, que adquire a infeco atravs de feridas abertas que entram em contato com guas contaminadas ou pela ingesto de um nmero suficientemente grande de microrganismos presentes na gua ou em alimentos. Pouco sabido sobre outras Aeromonas, mas elas so tambm microrganismos aquticos e em alguns casos tambm so implicadas em infeces humanas. A. hydrophila pode causar de uma diarria leve, autolimitada, disenteria aguda ou uma diarria aquosa crnica persistindo por semanas ou meses, alm de ser tambm implicada em alguns casos de sepsis em indivduos imunologicamente comprometidos, bem como naqueles portadores de patologias malignas como o cncer. A. caviae e A.

Figura 4. gar CIN (Cefsulodina-IrgasanNovobiocina), meio seletivo para Yersinia enterocolitica (colnias vermelhas)

22-29C do que a 37 C. As colnias so tipicamente pequenas, plidas ou incolores nos meios entricos usuais (como gar S.S. e MacConkey), que devem ser incubados por mais de 24 horas temperatura ambiente. As placas devem ser examinadas a 24 e 48 horas para colnias diminutas suspeitas. O enriquecimento alcalino um mtodo que pode auxiliar na deteco desta bactria. O mtodo envolve a mistura de uma parte de fezes com duas partes de KOH a 0,25% em soluo salina. Concentraes mais

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veronii biovar sobria (considerados como supostos patgenos) podem tambm causar gastroenterite e at sepsis nestes pacientes. Plesiomonas shigelloides tem sido envolvida em muitos casos de infeces humanas, com evidncias fortes de contaminao principalmente pela gua. O microrganismo pode estar presente em guas poludas que so usadas para recreao, para consumo humano direto e naquelas usadas para lavar alimentos que sero consumidos sem um cozimento adequado, alm de serem encontradas tambm em pescados crus. A maioria das infeces causadas por P. shigelloides ocorre principalmente nos meses de vero. A ingesto desta bactria nem sempre causa doena humana, mas o microrganismo pode ficar alojado temporria e transitoriamente no organismo como microbiota no infectante do trato gastrointestinal. A bactria na maioria das vezes isolada de pacientes com diarria, mas em alguns casos tambm isolada de pacientes sadios (0,2 a 3,2% da populao). A diarria provocada por P. shigelloides normalmente branda e autolimitada, com episdios de febre, calafrios, dores abdominais e nusea. Os sintomas comeam a aparecer 2024 horas aps o consumo do alimento e/ou gua contaminados. Manifesta-se como uma diarria aquosa, no mucide e no sanguinolenta; em casos severos, as fezes podem tomar uma colorao amarelo-esverdeada e tingidas de sangue. A durao da doena geralmente limita-se no mximo a sete dias. A patognese da infeco causada por P. shigelloides ainda desconhecida. H suspeitas de que esta bactria seja toxignica e invasora. Seu significado como um patgeno entrico presumido, pois predominam os isolamentos a partir de fezes de pacientes com diarria. Complicaes extra-intestinais (como sepsis) podem ocorrer em indivduos imunocomprometidos ou com patologias como cncer, hepatopatias e leucemia. Diagnstico laboratorial: A. hydrophila pode ser cultivada a partir de amostras fecais ou de sangue, utilizando-se gar contendo sangue de carneiro acrescido de ampicilina. Esta droga previne o desenvolvimento da

Figura 5. gar MacConkey: colnias lactose(+) de Aeromonas hydrophila

maioria dos microrganismos acompanhantes indesejveis. Os laboratrios de Microbiologia, utilizando procedimentos rotineiros, no demonstrariam facilmente esses microrganismos, pois eles tenderiam a ser confundidos com enterobactrias, a no ser que fosse feito um teste de oxidase (positivo para o gnero Aeromonas). A identificao da espcie pode ser confirmada por testes bioqumicos. Recomenda-se o uso de gar E.M.B. ou MacConkey (Figura 5) em conjunto com outro meio mais seletivo (como o gar X.L.D.) e gar sangue de carneiro com ampicilina (10 g/mL). P. shigelloides cresce na maioria dos meios de cultura de rotina, embora no cresa em gar TCBS (tiossulfato-citrato-sais biliares-sacarose) ou gar bismuto-sulfito. Em gar E.M.B., gar S.S. ou gar MacConkey a bactria se apresenta como no fermentadora (ou com fermentao tardia) de lactose (Figura 6), tendo ainda reao positiva para a prova de oxidase e negativa para H2S.

Diagnstico laboratorial: Quando se suspeita da presena de Vibrio, o espcime fecal deve ser examinado fazendo-se inicialmente um esfregao, corando-o pelo mtodo de Gram, procurando por clulas bacterianas morfologicamente semelhantes s dos vibrios. Os vibries so sensveis ao pH cido e morrem rapidamente em solues com pH abaixo de 6. Entretanto, eles so muito tolerantes a meios alcalinos. Paralelamente, o espcime deve ser semeado em meio de TCBS (tiossulfato-citrato-sais biliares-sacarose), que tanto seletivo como diferencial (Figura 7), tendo como etapa inicial o enriquecimento prvio da amostra em gua peptonada alcalina (pH 9,0), incubada a 37C por cerca de 6-8 horas e subcultivado ento no gar TCBS. V. cholerae forma tipicamente colnias amarelas, chatas, grandes, enquanto que V. parahaemolyticus aparece tipicamente como colnias azul-esverdeadas. As colnias tpicas de V. cholerae devem ser subcultivadas em gar nutriente antes de se realizar um teste de aglutinao em lmina com soro O1. Um inculo bacteriano pode ser transferido para o gar T.S.I. e aps incubao de 24 horas a 37C h uma reao sem produo

Figura 6. gar MacConkey: colnias lactose(-) de Plesiomonas shigelloides

Vibrio Os vibries so microrganismos altamente mveis, Gram-negativos, com morfologia de bacilos curvos (com aparncia de vrgula), possuindo um nico flagelo polar. Dos vibries clinicamente significantes para o homem, Vibrio cholerae, o agente causal da clera, o mais importante. adquirido atravs da ingesto de gua e alimentos contaminados. Outro vibrio muito importante o V. parahaemolyticus, um vibrio haloflico associado a gastroenterites, adquirido atravs da ingesto de pescados crus ou mal-cozidos.

Figura 7. gar TCBS (TiossulfatoCitrato-Bile-Sacarose): Vibrio cholerae (colnias amarelas sacarose[+]) e V. parahaemolyticus (colnias verdes sacarose [-])

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senvolvimento da microbiota fecal normal, facilitando o isolamento bacteriano. Caso seja utilizado um meio lquido para enriquecimento da amostra, normalmente usa-se o caldo Tioglicolato adicionado dos mesmos suplementos. A incubao das placas inoculadas deve ser feita a 42C em uma atmosfera de aproximadamente 5-15% de oxignio e 5-12% de CO2. C. jejuni apresenta colnias pequenas, no hemolticas e mucides, geralmente acinzentadas e com bordas irregulares. Estas colnias tendem a se espalhar pelo gar (Figura 8). Outro meio muito utilizado (Karmali) contm carvo ativado e as colnias de Campylobacter possuem cor branca (Figura 9). Caso as placas sejam examinadas com 24h de incubao, trat-las como se elas fossem culturas para anaerbios, ou seja, examin-las e rapidamente recoloc-las na jarra, refazendo a atmosfera. Os padres de crescimento a 25, 37 e 42C, bem como as reaes bioqumicas e a susceptibilidade ao cido nalidxico e cefalotina so dados teis no auxlio correta identificao e diferenciao das espcies, sobretudo se os estudos forem realizados pela metodologia tradicional, ou seja, sem automao.

Figura 8. gar seletivo para Campylobacter (colnias espalhadas e transparentes)

Figura 9. gar seletivo (Karmali) para Campylobacter (colnias brancas)

de gs ou H2S. O teste de oxidase tambm bastante indicado para caracterizar o microrganismo (teste positivo). Outros testes bioqumicos teis na identificao de V. cholerae incluem: catalase, indol, lisina e ornitina descarboxilases, fermentao de sacarose (todos positivos). Estas bactrias do reaes negativas para os seguintes testes bioqumicos: produo de gs a partir da glicose, fermentao da lactose, inositol, hidrlise da esculina e arginina dehidrolase.

Campylobacter Campylobacter jejuni e C. coli so bacilos Gram-negativos curvos, mveis, microaerfilos, reconhecidos como importantes patgenos entricos. A importncia dos membros do gnero Campylobacter como patgenos entricos somente foi realmente reconhecida aps 1970. O desenvolvimento de meios de cultura especficos e de procedimentos de isolamento foi a maior barreira para que s a partir desta poca fossem introduzidos mtodos sensveis e especficos para tal fim. Estima-se que o nmero de casos de infeces por Campylobacter nos Estados Unidos seja equivalente quele por Salmonella, excedendo o nmero de casos de shigeloses. No Brasil, esta situao bem semelhante. Os sinais e sintomas clnicos das infeces causadas por Campylobacter incluem febre, dores abdominais e diarria. A bactria pode invadir a corrente sangnea e causar endocardites, artrites spticas ou meningites. Alguns indivduos so portadores assintomticos destes microrganismos, servindo portanto de reservatrios da infeco.

Diagnstico laboratorial: As fezes contm, caracteristicamente, leuccitos PMN e hemcias. Estes elementos so facilmente observados em esfregaos corados pelo mtodo de Gram. Um gar contendo uma mistura de antimicrobianos e adicionado de 10% de sangue de carneiro o meio de cultura seletivo recomendado para o isolamento de Campylobacter spp. Este meio possui hoje vrias formulaes modificadas, disponveis comercialmente. O meio constitudo basicamente de uma base rica e nutritiva (tipo gar-base Brucella) suplementado com anfotericina-B, cefalotina, polimixina-B, trimetoprim, vancomicina e sangue de carneiro. Os antimicrobianos suprimem o de-

Referncias Bibliogrficas
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