Agropecuária Técnica

,
ISSN 0100-7467 -

v. 25,

n.1, 2004

Areia, PB, CCA/UFPB

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO

MARINICE O. CARDOSO
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Doutoranda em Agronomia do CCA/UFPB, Campus II, Areia – PB, CEP: 58397-000

RESUMO A biomassa microbiana do solo (BMS) é o principal componente do subsistema de decompositores, que regula a ciclagem de nutrientes, o fluxo de energia, a produtividade das plantas e dos ecossistemas. Portanto, sua quantificação é de grande importância para estudos sobre a melhoria ou perda da qualidade do solo. Para quantificação da BMS muitas e diversificadas técnicas foram criadas. Nos métodos pioneiros contavam-se células microbianas pela observação direta de lâminas de solo ao microscópio. Foram introduzidas, posteriormente, melhorias como o uso de corantes vitais e o cálculo da biomassa através do biovolume celular e da densidade média das estruturas vivas. Outros métodos, baseados na extração e determinação de algum componente celular específico (ácido murâmico para bactérias, quitina para fungos e A TP para a biomassa total, entre outros) surgiram em grande número. Entretanto, atualmente, os métodos da respiração induzida pelo substrato, da fumigação-incubação e da fumigação-extração são os mais utilizados para a quantificação da BMS. Nesta revisão, os principais métodos são apresentados e discutidos quanto à utilidade e confiabilidade. Palavras-chave: microscopia direta, constituintes celulares, respiração induzida, fumigação-incubação, fumigação-extração

METHODS FOR QUANTIFYING SOIL MICROBIAL BIOMASS

ABSTRACT Soil microbial biomass (SMB) is the main component of the decomposers subsystem that regulates nutrient cycling, energy flow, and productivity of plants and ecosystems. Thus, its quantification is of great importance for studies aiming to improve or to prevent loss of quality of soils. SMB quantification can be performed by many and diverse techniques. In the early methods, microbial cells were counted through direct observation of soil smear (soil samples spread on a microscope slide), under optical microscopy. Lately, improvements were introduced by using vital stains and subsequent calculation of biomass from cell biovolume and average density of living structures. Other methods based on extraction and determination of specific cell constituents (muramic acid of bacteria, chitin of fungi, and A TP of total biomass, among others), appeared to a large extent. However, the current methods of substrate-induced respiration, and fumigation-incubation and fumigation-extraction, are the most utilized methods for quantifying SMB. In the present review, the main methods are presented and discussed with respect to their usefulness and reliability. Key words: direct microscopy, cellular constituents, induced respiration, fumigation-incubation, fumigation-extraction

Agropecuária Técnica, v.25, n.1, p.1-12, 2004

foi realizada uma revisão de literatura sobre esses métodos. visto que a BMS não é uma estimativa da atividade dos microrganismos do solo. 1975. 2003). 2001. 1999). 1994. Através da rápida imobilização de nutrientes.2 M. 1999). Ressalva-se que as atividades de algumas enzimas podem ser relacionadas com a BMS e são auxiliares na µm . diluições da amostra do solo são adicionadas a tubos contendo meio liquefeito e resfriado. 2002). Pelczar Jr. CARDOSO INTRODUÇÃO A biomassa microbiana do solo (BMS) compreende a parte viva da matéria orgânica do solo. A relação C C orgânico microrganismos : transformadores da matéria orgânica do solo... 2 a 5% do carbono orgânico e 1 a 5% do nitrogênio total do solo (Cerri et al. posteriormente o conteúdo desses tubos é distribuído em placas de Petri. 1999.. Grisi.. de fonte/dreno de nutrientes e de catalisador pela execução de processos enzimáticos no solo. a BMS pode ser enquadrada como o interpretação da condição funcional da BMS total ou de algum compartimento (Marchiori Júnior e Melo. a avaliação da BMS permite obter informações rápidas sobre mudanças nas propriedades orgânicas do solo. Nessa técnica.1-12.. 1999. principalmente. 1996. é calculado o número de organismos vivos por grama de solo (Jackson e Raw. (1999) para determinação do número mais provável de fungos e bactérias do solo. 2002. 1989. na ciclagem de nutrientes e no fluxo de energia (Wardle e Giller. O estudo quantitativo da BMS é de fundamental importância para o estudo da extensão dos processos no solo em que atua. Constituindo a maior parte da fração ativa da matéria orgânica. 2002).. Neste trabalho. em média. porque sofrem influência das condições experimentais (Rodrigues et al. 1989). As possibilidades metodológicas existentes para avaliação da BMS são várias e contemplam diferentes abordagens. detectar mudanças causadas por cultivos ou por devastação de florestas.1. A dupla função da BMS.. sendo mais sensível que o resultado quantitativo do C orgânico e do N total para aferir alterações na matéria orgânica do solo (Gama-Rodrigues. Agropecuária Técnica. 1984). T empler et al. P S e outros nutrientes para as plantas. 1984). e avaliar os efeitos dos poluentes como metais pesados e pesticidas entre outros (Frighetto. 2000). por adaptação. Alguns métodos bastante utilizados têm sua confiabilidade questionada. e a partir do número de colônias desenvolvidas na placa. deve-se distinguir a biomassa de sua atividade (Siqueira et al. Operacionalmente. Kouno et al. os trabalhos sobre BMS tratavam.. considerando-se a população microbiana como uma entidade única (De-Polli e Guerra. 1999). 2001). 1996. 1999). A BMS compreende uma fonte potencial de N. após incubação. Matsuoka et al. resultaram na criação e diversificação de muitas técnicas. foi introduzido o método de diluição em placas para contagem de bactérias do solo. Antecedentes O aumento do interesse em microrganismos de solo e. as investigações em bacteriologia de solo foram realizadas com métodos desenvolvidos em bacteriologia médica: amostras de solo eram diluídas com água esterilizada. Posteriormente.25. Marchiori Júnior e Melo. excluídas as raízes e organismos maiores do que 5 x 10 3 1994). bem como para monitoramento e aplicação de modelagens (Leal e De-Polli.. Wang et al. Inicialmente. que são discutidos quanto aos vários aspectos de sua utilidade e limitações. 3 contendo... DePolli e Guerra. determinava-se o número de bactérias (Grisi. 1992. medir regeneração dos solos após a remoção da camada superficial. Neste sentido. 2003). com base na concentração de algum elemento ou de alguma substância celular. mas da massa microbiana viva total do solo. identificação e enumeração desses agentes compartimento central do ciclo do carbono. 1999. O método de plaqueamento por gotas é recomendado por Jahnel et al. Turner et al. Gonçalves et al. que pode reduzir a disponibilidade de nutrientes para as plantas. e os fluxos . a necessidade de isolamento. Taylor et al. p. et al. 1999). Melloni et al. Até o início da década de 90. a BMS atua como agente de transformação da matéria orgânica... é amplamente aceita (Duxbury et al. O. 1975. disseminadas em placas com gelatina e. 2004 . Em seguida. 2003).. e total do solo aumenta e diminui rapidamente conforme ocorram elevação ou redução da matéria orgânica do solo num sistema ecológico. foi introduzida a técnica de plaqueamento para isolamento de fungos de solo (Jackson e Raw. v. de ajustes metodológicos (Gama-Rodrigues. 1989). Como parâmetro ecológico. a BMS funciona como dreno competitivo (Duxbury et al. paralelamente. e a constância dessa relação indica o novo equilíbrio desse sistema (Anderson e Domsch. através do reservatório microbiano podem ser de particular relevância no solo (De-Polli e Guerra. n.

. Na impossibilidade da obtenção de uma medida de lâminas de solo ao microscópio. destacandose os dois últimos. 2002. 1984). por métodos culturais ou por meio da outras técnicas capazes de avaliar a massa dos microrganismos. os microrganismos podem ser contados pelo exame microscópico (Pelczar Jr. 1999). 1979). há para quantificação da biomassa como por exemplo. Grisi e Gray. O método está fundamentado no princípio de que o A TP pode ser quantificado através do sistema enzimático luciferina-luciferase (Oades e Jenkinson. segundo Paul e Clark (1989): A TP: C: N: P: S.. 1985. 1999). v. bem como o cálculo da biomassa através da determinação dos volumes celulares Grisi e Gray. Métodos microbiana Os métodos da microscopia direta. Haubensak et al. a clorofila.. 1999). 1984. Bailey et al. O A TP oriundo das células vivas é extraído com solução de H SO 2 4 0. .Microscopia direta No exame microscópico direto. ácidos nucléicos e outros. Na microscopia direta. é baseado no aumento inicial da taxa de Agropecuária Técnica. o trifosfato de adenosina (Grisi. 1994). . a sua concentração nas células é razoavelmente uniforme em relação à concentração de carbono celular (De-Polli e Guerra. que tem gerado valores proporcionais aos obtidos por outros métodos (Fritze et al. uma diluição da amostra do solo é espalhada em camada fina sobre uma lâmina de vidro. Para solos bem drenados. Fierer et al. et al. a quitina. n. da fumigação-incubação e da fumigação-extração são os mais utilizados para quantificação da BMS. 2002). Grisi e Gray. Como o princípio básico da metodologia é estimar a biomassa microbiana através do biovolume dos microrganismos. 1982). na extração e determinação de constituintes celulares específicos de microrganismos.. técnicas de colorações especiais são Esse método. 1999).Respiração induzida pelo substrato ou fisiologia da taxa de respiração necessidade da estimativa da densidade específica e do conteúdo de umidade dos microrganismos. Os métodos de extração dos componentes celulares baseiam-se no fato de que a célula microbiana quiescente mantém as seguintes relações. na presença do sistema enzimático. 1980. sendo a quantidade de luz emitida proporcional à concentração de A TP no extrato (De-Polli e Guerra.Método do trifosfato de adenosina (ATP) Este método inclui-se num grupo de métodos que se baseia. para estimar a BMS.25. é medida através de fotômetros comerciais disponíveis para esta situação. 2000.. Os primeiros métodos utilizados consistiam na contagem do O desenvolvimento de técnicas microscópicas para necessárias para discriminar microrganismos vivos de mortos. 1996). 1976. número de células microbianas pela observação direta depois o uso de corantes vitais. Embora esse método possa ser utilizado para estimar a população microbiana total. a BMS (Pelczar et al. respectivamente. facilitando separação microrganismos vivos e mortos. bem como. fungos. proposto por Anderson e Domsch (1978). algas e protozoários). 1989). do trifosfato de adenosina. ou outros extratores com eficiências de recuperação variáveis. sendo introduzido e da densidade média das estruturas vivas (Grisi. 1971). 1977. para conversão de biovolume a biomassa (Alexander. 1: 250: 40: 9: 2. 2004 . o ácido murâmico. sendo a expectativa geral de que todos os demais métodos apresentem boa correlação com o mesmo (Seganfredo. foram desenvolvidas ecossistema.MÉTODOS P ARA QUANTIFICAÇÃO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 3 exame de microrganismos provenientes de amostras dos ambientes naturais ocorreu no início do século XX. A técnica do A TP vem sendo utilizada para estimar a BMS (Tate e Jenkinson. e. e a emissão luminosa do material. 2003). tendo sido melhorado por Tate e Jenkinson (1982). 1985.3 mol L -1 . Convém mencionar a técnica de análise de PLFAs (phospholipid fatty acids) totais extraídos para estimar a BMS. 1985). p.1-12.6. além de não ser confundido com as moléculas de A TP provenientes de fragmentos de raízes. e após fixação e coloração do esfregaço. De-Polli e Guerra. em razão de algumas características favoráveis deste constituinte celular: é degradado rapidamente após a morte das a células dos entre microrganismos. . da respiração induzida pelo substrato. Scheu e Parkinson. ou seja. os microrganismos podem ser corados por várias formas e observados por diferentes técnicas ópticas (Casida. apontada como sendo de 1: 250 (Paul e Clark. está presente nas diferentes células microbianas (bactérias.. este método é freqüentemente utilizado como padrão. quantitativa exata da população microbiana total em um observação microscópica direta.1. no caso. bem como muitas vezes é difícil distinguir partículas microscópicas do solo de células microbianas (Casida.

1994). o flush de CO .41 foi proposto para amostras de alguns solos no Brasil. Tiunov e Scheu. O aumento da taxa respiratória (liberação de CO )..5 C o (Anderson e Domsch. 2004 . que é justamente o componente de maior interesse para os microbiologistas do solo. como a quantidade de CCO produzido por unidade de C da biomassa microbiana (Thirukkumaran e Parkinson. a conversão para a biomassa. ou pelas novas populações a partir de um inóculo de solo fresco introduzido na amostra fumigada (Jenkinson. livre de álcool. v. 2001).45 a 25 C (Anderson e Domsch. 2000). para a determinação da biomassa (Anderson e Domsch. 1992. isto é. o uso da glicose sólida foi substituído por solução de glicose e o analisador de gás para medir o CO 2 respirado por cromatógrafo a gás (Sparling e West. Entretanto.35 e 6. 1978. devendo-se atentar para o fato de que há variações na resposta à 2 2 (Pfenning et al. CARDOSO respiração da população microbiana. representada pelo carbono microbiano..1. Este termo (k C1 ) corresponde ao fator de mineralização do C. 2003). Originalmente. 1986.41 à o o temperatura de 22 C e 0. devendo ser determinada para cada tipo de solo (Lin e Brookes. que provoca o rompimento da célula. Os procedimentos sobre o método de fumigação-incubação encontram-se descritos detalhadamente em De-Polli e Guerra (1999) e Matsuoka et al. Wang et al. 2000.25. 2000. 1994). 1988. (1985) e Stevenson e Elliott (1989) explicam a determinação do N da BMS pelo método de Agropecuária Técnica.Fumigação-incubação O método de fumigação-incubação se fundamenta na ocorrência dos seguintes eventos: interrupção da atividade microbiana de uma dada amostra de solo pela fumigação com clorofórmio (CHCl ). Lin e Brookes.. 1999. Fisk et al. ele deverá ser determinado para cada tipo de solo (Wardle.. Mercante. 1999). 1984. De acordo com Wardle (1994) é esperado que apenas os microrganismos ativos respondam à adição de glicose. O quociente metabólico microbiano (qCO ) é calculado como a razão da respiração microbiana em relação à biomassa. 1999) ou respirômetro automatizado a partir de microcompensação de O 2 / k eletrolítico (Tiunov e Scheu. A fonte usual é a glicose porque a maioria dos microrganismos pode utilizá-la imediatamente como fonte de carbono (Grisi. prontamente adição da glicose em diferentes solos. é adicionada em excesso ao solo. (2003). 2 2 gerado durante um período de incubação predeterminado.1-12. O. A quantidade de glicose requerida para ativar a máxima taxa respiratória inicial varia grandemente. o fator k não é precisamente o mesmo para todos os solos (Stevenson e Elliott. A respeito do fator de correção. . seguido por um pico de CO . 1994. pode ser estimada pela relação B = C I 2 2 3 decomponível. 2001). enquanto em outros verifica-se inicialmente uma queda e depois uma elevação da respiração (Anderson e Domsch. n. 1999). ou seja. Alternativamente à proposta original. pois é esse componente que está reciclando ativamente os nutrientes e é responsável pela decomposição dos restos culturais. é acompanhado por algumas horas. Um grave erro técnico quanto a este método é a realização de medidas de taxas de respiração após o crescimento microbiano. dependendo das propriedades físicas e químicas dos solos. Lin e Brookes. até um máximo. 1994). Entretanto. onde C I = C-CO 2 de modo particular a avaliação do quociente metabólico ou taxa de respiração específica. Os procedimentos envolvem a medida da emanação de CO devido à decomposição da população microbiana na amostra fumigada. e é de 0.4 M. há necessidade de calibração. Por esta razão. um fator médio de 0. não-fumigada (Rodrigues et al. 1999). que permite verificar o estado de equilíbrio do solo (Wardle. 1989). Lin e Brookes. V oroney e Paul (1984) estudaram sua determinação “in situ” para calibração desse método. Este método facilita liberado do solo fumigado no período de 10 dias de incubação menos o C-CO liberado do solo testemunha 2 CI .. esse método pode ser extremamente útil como medida relativa da biomassa microbiana. mineralização entre 0. devido à decomposição dos organismos mortos pelos sobreviventes à fumigação. p. Siqueira et al. visto que em alguns ocorre um aumento rápido na respiração.. realizando-se em seguida. foi correlacionado com a BMS. 1966). e em uma amostra testemunha. 2003). 1978). com um método padrão. à proporção de carbono microbiano liberado na forma de CO 2 nos 10 dias de incubação.5 ml de CO 2 100 g de solo -1 h -1 e temperatura de 22 ± 0. antes que o crescimento microbiano ocorra. Mercante. Brookes et al. De-Polli e Guerra. e no caso de solos muito diferentes daqueles utilizados na determinação dos valores de k C1 C1 tradicionalmente usados. 1978). 1978. visto que o mesmo tende a ser mais baixo em solos ácidos e de textura argilosa das zonas tropicais (Sampaio et al. A biomassa. quando uma fonte de carbono. mas a equação obtida é válida somente nas condições de proposição. No método de fumigação-incubação. isto é.

para estimar a concentração de C. o analisador de carbono Dohrman DC-180 é utilizado para quantificação do C extraído (Wu et al.. v. sem fumigação) ou fumigação seguida de extração. 2002). 1985). 2004 .Fumigação-extração • Carbono da biomassa microbiana Como alternativa promissora à técnica de fumigaçãoi n c u b a ç ã o . Convém ressaltar que a correção da umidade do solo para 40% da sua capacidade de saturação é parte do procedimento metodológico. De acordo com Turner 0. Portanto. representada pelo carbono microbiano.1-12. o que é adotado também no método de fumigação-incubação. antes comentado. 2002. Segundo esses autores. e a determinação do carbono nos extratos fumigado e não-fumigado é feita por dicromatometria a partir da retirada de uma alíquota do extrato (V ance et al. (1999) utilizaram a irradiação do forno de microondas em substituição ao clorofórmio. visto que os resultados foram fortemente correlacionados com aqueles determinados pelos métodos convencionais. precisa e relativamente barata para estimar a BMS. eliminando-se os dez dias de incubação do método anterior. 2003). De-Polli e et al. recomendação correntemente utilizada (Tate et al. 1990. 2003). p. O carbono representa cerca de 47% do peso seco da célula microbiana. revelou-se rápida.. Na fase de pré-condicionamento.. a amostra é dividida em subamostras que sofrerão extração imediata (o controle.5 M (Tate et al.64 ou 0. Agropecuária Técnica. Zimmermann e Frey. inclusive em solos do Brasil para os quais o fator k CE substituição da incubação por uma extração do carbono da biomassa.. e ambiente.64 ou do solo fumigado menos o carbono extraído do solo controle (Pfenning et al. Ferreira et al. P e S microbianos também facilidade na quantificação devido ao seu teor ser mais podem ser determinados por fumigação-extração no mesmo extrato de solo (Brookes et al.38. ou o analisador de C solúvel Shimadzu TOC-5000A (Bailey et al. 1999). O N.. 1999). pode ser E estimada pela E relação B = C B = C / 0. rompe as células microbianas liberando o constituinte microbiano para o solo e permitindo assim sua extração (Frighetto. presente na biomassa microbiana nos procedimentos de incubação e extração. quando da preparação das amostras de solo para fumigação (Grisi. além de matar. Este último valor de k CE encontra-se no intervalo proposto (0.. O extrato da amostra não-fumigada contém somente a matéria orgânica extracelular e o extrato fumigado contém ambos. 1988) logo após a fumigação. 1992). 1985. para estimar o C e o N da BMS. Aoyama et al. 1987b).. pela maior elevado na célula. a biomassa microbiana é proporcional ao aumento de carbono orgânico que se torna extraível do solo após uma fumigação. a técnica de absorvância ultravioleta (UV) em 280 nm de extratos de K SO 2 4 0. 1997).. A biomassa. Roy e Sing. Guerra. Os procedimentos para execução da técnica de fumigação-extração foram explicados detalhadamente por De-Polli e Guerra (1999) e Frighetto (2000).1. . e também o N. e concluíram que a irradiação durante dois minutos foi suficiente para estimar o C. Numa modificação do procedimento de fumigaçãoextração originalmente proposto.MÉTODOS P ARA QUANTIFICAÇÃO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 5 fumigação-incubação e afirmam que o maior problema para sua estimativa é a desnitrificação ou imobilização poder alterar as quantidades de N calculadas para as formas solúveis após a incubação. 2000. matéria orgânica intracelular (biomassa) e matéria orgânica extracelular (Hofman e Dusek. Roy e Sing (2003) deixaram as amostras de solo com a umidade do campo com o CO removido. (1987a) propuseram a Hargreaves et al. o fator k CE para conversão do carbono extraído em biomassa microbiana (V ance et al. por sete dias em temperatura em um recipiente fechado com 100% de umidade. onde C representa o carbono extraído E x 2. 1988).. n. sendo o mesmo aberto diariamente por alguns minutos para aeração. sendo 2. A fumigação do solo com o clorofórmio. • Nitrogênio.33 ± 0..25. De-Polli e Guerra. Em termos de procedimento. 1987a. O material celular liberado pelo rompimento das células microbianas é recuperado com um extrator fraco como o K SO 2 4 não foi determinado (De-Polli e Guerra.5 M de solos fumigados e não-fumigados. N e P da biomassa microbiana. que é igualmente liberado pela ação do agente fumigante clorofórmio..08) por Sparling e West (1988) para solos minerais com baixo pH e menos de 10% de carbono orgânico. Va n c e et al. fósforo e enxofre da biomassa 2 microbiana do solo Os métodos de quantificação da BMS geralmente baseiam-se na estimativa do C microbiano.38. 1999. 2000). simples. (2001). é mais conveniente mensurar o N da BMS pela fumigaçãoextração 24 horas após a fumigação (Brookes et al. 2003). Na etapa de fumigação.

sendo N -1 nitrogênio microbiano do solo. p.5 M em pH=8. CARDOSO Na metodologia convencional.41 e 0. fator de correção k =0. sendo razoável esperar que equações de calibração derivadas a partir de ampla faixa de valores abrangendo maior área geográfica sejam mais consistentes do que na faixa estreita de pequena área geográfica (Wardle e Ghani. que expressa a fração do N da biomassa microbiana do solo recuperada após os processos de fumigação-extração (Brookes et al.1. Limitações associadas aos métodos Muito se discute ainda sobre a confiabilidade dos atuais métodos. 1994). bem como a adsorção dessa molécula pelos colóides inorgânicos do solo (Martens. mas estão muitas vezes sujeitos à variabilidade da eficiência de extração e rompimento das células (Frighetto e S c h n e i d e r. ou a hidrólise química do A TP durante o processo de extração. 2000). 1981. 2000. e o cálculo é dado pela seguinte fórmula: N mic (mg kg ) = FN / k . Pelczar Jr.4. Para o P da biomassa. Algumas dificuldades estão a ele associadas como a extração incompleta de A TP das células.. o N da biomassa é avaliado à maneira do C da biomassa. e k N t . Os métodos extrativos não apresentam os problemas daqueles que dependem do crescimento microbiano.01 M. dois extratores têm sido utilizados para determinar o S da biomassa. fumigação-extração e PLFAs totais. O. além de ser difícil diferenciar partículas microscópicas do solo de células microbianas (Casida. Rheinheimer et al. NaHCO valores de k s 3 0. respectivamente 2 0.fluxo obtido da t N mic - correlações através de diferentes amostras de solos..5 M (relação solo:extrator de 1:4. 1995. bem como requer o ajuste na capacidade de adsorção de P pelo solo (Stevenson e Elliott. Morel et al. Algumas críticas específicas sobre esses métodos são apresentadas abaixo: Microscopia direta. ou seja. têm sido usados para determinação do P e S da BMS. 1995). 1999). (2003) discutem em suas pesquisas as razões de estimativas distintas da BMS com os métodos que utilizaram: respiração induzida pelo substrato.. antes do processo de fumigação com clorofórmio e extração com NaHCO p 3 0. 1999). 2002). principalmente quando se deseja estimar a biomassa dos microrganismos “in situ”. O conteúdo de N microbiano é quantificado em extrato de K SO 2 4 0. a decomposição enzimática. que é somente de 40%. é mais conveniente.35. com (Saggar et al. tem possibilitado resultados válidos quando sua execução é cuidadosa.1-12. mas usando o fator k EN valor absoluto. Joergensen e Mueller. para solos com alta capacidade de fixação de P foi a da . E. acima mencionados. 1995). Apesar da variação entre o conteúdo do A TP e o do C da BMS. visto que na estimativa da biomassa microbiana do solo deve ser considerada a massa viva de microrganismos. que tem dois valores amplamente utilizados. Brookes e Jenkinson (1989) consideram que os valores de ATP podem não ser indicadores fiéis do estado metabólico de um organismo ou de uma população.5.. 1985. são altamente variáveis. 0.. em diferentes condições edafoecológicas. sempre que possível.1 M e CaCl de 0. de maneira mais próxima da realidade. as .25. Entretanto. Dessa forma. A dificuldade para discriminação entre microrganismos vivos e mortos se torna uma limitação. 1996). v. 1993. a utilização de mais de um método para estudos sobre a biomassa microbiana (Gama-Rodrigues. et al. e. (1994) e Fierer et al.54 o do método original.. através do autoanalisador Scalar-UV é . o método prevê a extração do P inorgânico disponível com resina. 1989.54 (Wardle. estimando-se seu Agropecuária Técnica. e admitem como . De-Polli e Guerra. extração por 30 minutos e análise após digestão de Kjeldahl) a partir do fluxo de N solúvel total de amostras fumigadas e não-fumigadas. Método do trifosfato de adenosina (ATP).45 e 0. sendo 0. também utilizada (Cabrera e Beare. ou tipos de solos. Friedel e Scheller.fator de correção (0. n. Também. 1989). FN diferença entre a quantidade de N total recuperado no extrato da amostra fumigada e o recuperado na amostra não fumigada. Este método pioneiro é raramente utilizado em amostras naturais de solo porque apresenta enorme dificuldade operacional e maior tempo de execução dos procedimentos.. Smolander et al. 1985). membrana de troca de ânions (Kuono et al. Guerra et al. 1996. 2002).. para compensar a incompleta liberação do P microbiano pela fumigação com clorofórmio e a incompleta extração do P microbiano liberado pelo extrator. 1995. Stevenson e Elliott. Uma proposição adaptada para medida do P da BMS. 1976. 1996). A oxidação de persulfato alcalino para determinação automática do N total em extratos da biomassa microbiana. 2004 . Entre pares de métodos. Procedimentos similares de fumigação-extração.6 M. Conte et al. visto que apenas uma parte da população poderá estar em crescimento. é útil quando se comparam diferentes metodologias para aferição da biomassa (Martens.54).

2003). sendo essencial uma testemunha não-fumigada (W ardle. a porção zimógena da comunidade microbiana.1-12... 1994). obtidos mais rapidamente e com menores variações entre as repetições. portanto. de imediato. que provoca uma subestimativa da biomassa microbiana do solo (Jenkinson. Seu valor. onde o método de fumigação-incubação mostra limitações (Wardle. De-Polli e Guerra. Esse método. a fumigação afeta pouco os microrganismos (Frighetto. (1984) sugeriram algumas adaptações para solos sob estas condições.. Gonçalves et al. Ele não é recomendado para solos ácidos com elevado teor de Al (Siqueira et al. Haubensak et al. Neste sentido. Respiração induzida pelo substrato. Ta m b é m . pelo fato da fumigação ser seguida. 1966.. 1992).25. 2000. Sobre isto.. que não são destruídos pelo clorofórmio (Siqueira et al. O alto teor de argila protege a matéria orgânica da decomposição e torna os microrganismos menos ativos pelo confinamento em pequenos poros ( Wa n g et al.1. quantifica preferencialmente o rápido crescimento microbiano. ocorrerá um fluxo de CO 2 2 das amostras fumigadas. como terra fina secada ao ar (TFSA).MÉTODOS P ARA QUANTIFICAÇÃO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO 7 melhor indicador a carga energética de adenilato. ou seja. os resultados são. são evitados os fatores químicos e/ou biológicos que interferem na reconstituição da população microbiana. porém Inubushi et al. o que pode interferir na reconstituição da população microbiana. Por outro lado. a partir de dados de vários autores é na faixa de 0. onde. quando uma grande proporção de massa microbiana do solo foi morta pela seca.5 (ADP)] / [(A TP) + (ADP) + (AMP)]. Diferentes autores fazem referência à marcante influência dos fatores ambientais neste método. os zero a 10 dias (estabelecido no método). visto que é aceito ser a BMS proporcional à taxa de respiração de curto prazo.. Hashimoto (2002) descreveu um método simples para medição de um volume pequeno do gás CO usando um analisador de gás infravermelho. Contudo. 1984). para solos no período de da matéria orgânica do solo. como a glicose. Igualmente. o que leva à subestimação da biomassa microbiana (Siqueira et al. E o pré-condicionamento de curta duração de dependem dos materiais do solo (Scheu e Parkinson. Fumigação-extração. adotados determinação da biomassa microbiana com o uso dessa técnica. as aludidas condições dos solos tenham interferido na homogeneidade da fumigação e na capacidade de reconstituição da Agropecuária Técnica. 1992. 1994). 2002). 1994)..8 a 0. É considerado um método prático e rápido para estimar a quantidade de m i c r o rg a n i s m o s vivos do solo. p. não é adequado para solos alagados. (2002) concluíram pela necessidade de mais estudos quanto ao tempo de exposição ao clorofórmio. Em relação à condição de transporte. Neste método. 1996). Também foi sugerido que as populações microbianas inoculadas nas amostras fumigadas não são capazes de metabolizar matéria orgânica não-microbiana tão rapidamente quanto as nativas do solo não-fumigado. 1988). que pode variar sensivelmente em diferentes tipos de solo (Grisi. tanto para laboratório como para condições de campo. Sampaio et al. De-Polli e Guerra. v. pois o tempo de exposição afeta a extração de C e N de distintos compartimentos condições de umidade. em solos com alto teor de argila aliado à umidade foram encontradas dificuldades para efeitos da secagem ao ar sobre bactérias e fungos 1994). devido à decomposição dos microrganismos mortos. medida após a adição de um substrato lábil... Em solos muito secos.. Fumigação-incubação. 2002). pela extração do carbono das amostras. teve resultados promissores somente quando níveis e períodos adequados de reumedecimento foram (Gonçalves et al. n. Por exemplo. Messias et al. A principal população microbiana (Pfenning et al. 1994). provavelmente. 2003). 1999). 1994). o que se reflete em coeficientes de variação baixos (Pfenning et al. ou solos com recente adição de matéria orgânica. 2002). dada por [(A TP) + 0.. na sua forma padrão.. 2004 . Stevenson e Elliott (1989) afirmam que o mesmo é inadequado para análises de solos secos ao ar. como ocorre na fumigação-incubação. as regras não estão bem definidas (Gonçalves et al. ao solo (Fierer et al. armazenagem e pré-condicionamento da amostra anteriormente à fumigação. o seu emprego requer a disponibilidade de equipamento que possa determinar acuradamente o CO 2 respirado (Wardle. Os valores do fator de correção do carbono extraído (k CE ) não foram exatamente determinados para solos tropicais (Pfenning et al. amostras.. O método encontra-se bem padronizado em seu protocolo laboratorial por diferentes usuários (Frighetto.95 (Grisi. bem como aqueles da rizosfera de pastagem permanente e solos sob encharcamento ou seca (Tate et al. 1992. responsável pelo aumento da liberação de CO 2 desvantagem deste método está relacionada com o fator de conversão.. antes da amostragem. em diferentes contrastantes de florestas. Por outro lado. 1999). 2000). 1986. Esse método é particularmente útil em solos ácidos e orgânicos de florestas e em solos secos reidratados. 1999). 1994). e em solos encharcados a água poderá proteger os microrganismos.

v. para avaliação da BMS. As informações sobre calibração desses métodos para solos tropicais ainda são B A I L E Y. D...4.. Campinas: SBCS.. Os métodos mais recentes.32. C .605-608..L. BOLTON JR. 1985. L.E. de certa forma. NEVES. Fósforo da biomassa microbiana e atividade de fosfatase ácida após aplicação de fosfato em solo no sistema plantio direto.119-127.L.M.. PRUDEN. M. Alkaline persulfate oxidation for determining total nitrogen in microbial biomass extracts.21.... J. V ANCE. Soil Biology & Biochemistry.. n.C. CASIDA. ainda não são técnicas de fácil manipulação.S. C.E. p. TSAI. 2002. ainda existem lacunas que devem ser preenchidas no tocante à melhoria das metodologias para determinação da BMS.S. and phospholipids fatty acid analysis.B. ANGERS.. p.1-12. Revista Brasileira de Ciência do Solo. CASIDA. Ratios of microbial biomass carbon to total organic carbon in arable soils. Soil Biology & Biochemistry. SMITH. têm sido preferidos por serem.26. Continuously variable amplitude contrast microscopy for the detection and study of REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALEXANDER. M. v..P . Soil Biology & Biochemistry.S. p. L. substrate-induced respiration. . SMITHER.ed. R. n. Chloroform fumigation and the release of soil nitrogen: a rapid direct extraction method to measure microbial biomass nitrogen in the soil. ANDERSON. Comumente são identificadas dificuldades técnicas dos métodos mais utilizados para quantificação da BMS que necessitam ser superadas.M. p.de A.H. N DA YEGGAMIYE. v. 1999. V. p. E.31. In: STANLEY P.9. CONTE. p. as informações quantitativas fornecidas por esses métodos sejam complementadas por aquelas de natureza qualitativa referentes à diversidade e funcionamento da BMS.1385-1389.. Applied and Environmental Microbiology.1007-1012. posteriormente. ATP a n d insuficientes. Oxford: Blackwell Scientific Publications. P. E. M.17.295-300. S.E.P (Coords). 1989.. 1971. gerados em condições temperadas.1040-1045. N e P na biomassa microbiana do solo. A physiological method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. A. 467p. Soil Biology & Biochemistry. (Eds. CARDOSO CONSIDERAÇÕES FINAIS Embora as possibilidades metodológicas existentes. H. L. JORDAN. 1989. K. não deve ser esperado que esses métodos apresentem a precisão e exatidão dos métodos de análises químicas. p. p. F. BROOKES. do solo. adenylate energy charge levels in the soil microbial biomass... EDUARDO. O. ANDREUX.M. p.73-90.J. ANGHINOI. Agropecuária Técnica.389-412.4.3. v.1. BROOKES. p. J.925-930.P.. n.A. M. Relationships between soil microbial biomass determined by chloroform fumigation-extration. PEACOCK. JENKINSON.471479.. GUERRA.25.JR. G.215-221.P. ´ A. C. 2004 . n. E. v. sejam várias e com diferentes abordagens.J. M. CERRI.. Applied Microbiology. .JR. BEARE. A. In: CARDOSO. .D. SMITH.837-842. J..C.C. F..) Fundamentos da matéria orgânica do solo: ecossistemas tropicais e subtropicais. DE-POLLI. n.H. J. Portanto. CAMARGO. Rapid methods in microbiology. v. 2002. v.. v. BISSONNETTE. p.E. Soil Science Society of America Journal. 1977. M. p. Porto Alegre: Gênesis.. P. de uso mais fácil e de possibilitarem o acesso às quantidades dos elementos contidos dentro da BMS. I. 2000. com o aperfeiçoamento das técnicas de biologia molecular aplicadas ao solo.4. B. v.. O ciclo do carbono no solo. LANDMAN. S .8 M.57.3. AOY AMA. C. Introduction to soil microorganisms in soil..4. McCARTHY B. CABRERA.de O. Separata.L. G . 1976.34. Soil organic microbiology. 2. n..H. v. DOMSCH. Existe uma expectativa de que.N. J. da fumigação-incubação e fumigação-extração. Soil Biology & Biochemistry. n. 1978. In: SANTOS. D. p. n.10. D . JENKINSON.W. Microorganisms in unamended soil as observed by various forms of microscopy and staining. SZOTT. No entanto. DUXBURY. DOMSCH. Metabolism of glucose in aggregates from soils 13 C-labeled manure with application.) ATP luminescence.21. ANDERSON. J.G . RHEINHEIMER. 1993. (Eds.6. New Y ork: John Wiley & Sons. K. N.A. e em muitos trabalhos de pesquisa continuam sendo utilizados fatores de correção dos métodos originais. DORAN. Microbiologia . n..E. H. 1992. D.

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