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ARTIGO ORIGINAL

ESTUDO DAS ALTERAES MORFO-HISTOLGICAS EM LARVAS DE Aedes aegypti (DIPTERA, CULICIDAE) SUBMETIDAS AO EXTRATO BRUTO ETANLICO DE Sapindus saponaria Lin (SAPINDACEAE)
Cleyde Ferreira Barreto,1 e 2 Glucia Maria Cavasin, 2 Helosa Helena Garcia da Silva 1 e Ionizete Garcia da Silva 1 RESUMO Dengue hoje a arbovirose mais importante no mundo e seu controle est restrito, basicamente, ao combate ao principal vetor, o Aedes aegypti. As aes tm como foco a aplicao de inseticidas qumicos sintticos que possuem ao rpida e ecaz no combate, porm so altamente txicos para os mamferos e o meio ambiente. Seu uso tem induzido ao desenvolvimento de resistncia do mosquito. Produtos naturais provenientes de plantas podero representar alternativas s medidas de controle em razo de sua baixa toxicidade para os mamferos e da ausncia de impacto ambiental. Neste estudo, so apresentadas as alteraes morfo-histolgicas e a atividade larvicida do extrato bruto etanlico (e.b.e.) da casca do fruto de Sapindus saponaria sobre o A. aegypti, visando ao controle desse mosquito. Larvas de terceiro estdio foram submetidas a diferentes concentraes do e.b.e., obtido da casca do fruto de S. saponaria, previamente solubilizado em gua, onde permaneceram por at 48 horas. As larvas que atingiram estado letrgico foram coletadas e xadas em paraformaldedo, includas em resina, seccionadas e as lminas coradas pela tcnica de hematoxilina-eosina e analisadas por microscospia de luz. A CL99 do e.b.e. da casca do fruto de S. saponaria sobre larvas de A. aegypti foi de 134,1 ppm. Os efeitos txicos desse e.b.e. foram observados em concentraes subletais e as trs regies do mesntero apresentaram vrias alteraes histopatolgicas: destruio total ou parcial das clulas, alta vacuolizao do citoplasma, hipersecreo das clulas epiteliais e
1 Laboratrio de Biologia, Fisiologia de Insetos/Bioatividade de Plantas do Instituto de Patologia Tropical e Sade Pblica (IPTSP) da Universidade Federal de Gois (UFG). 2 Departamento de Morfologia do Instituto de Cincias Biolgicas da UFG. Endereo para correspondncia: Ionizete Garcia da Silva, Rua 235, esq. com a 1 Avenida, Setor Universitrio. CEP 74605-050, Goinia, Gois. E-mail: ionizete@iptsp.ufg.br Recebido para publicao em 30/9/2005. Revisto em 27/1/2006. Aceito em 6/2/2006.
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pavimentao do epitlio. Essas alteraes celulares evidenciam o mecanismo de ao do e.b.e. de S. saponaria sobre larvas de A. aegypti. DESCRITORES: Aedes aegypti. Sapindus saponaria. Larvicida. Controle. INTRODUO A dengue constitui hoje a mais importante doena viral humana transmitida por mosquitos, cujo agente um Flavivirus, com quatro sorotipos conhecidos (Den1, Den-2, Den-3 e Den-4) que podem causar a dengue clssica (DC) e a febre hemorrgica da dengue (FHD). Esta ltima pode evoluir para uma forma mais severa conhecida como sndrome do choque da dengue (SCD). A infeco por um sorotipo prov imunidade vitalcia para aquele vrus, mas a proteo cruzada para outro sorotipo apenas passageira, o que torna possvel ocorrer uma infeco seqente por outro sorotipo (Henchal & Putnak, 1990; Monath, 1994; Schatzmayr, 2000; Derouich et al., 2003). A transmisso da dengue ao homem ocorre atravs da picada da fmea de Aedes aegypti infectada com um dos quatro sorotipos do vrus. Aps 8 a 12 dias da infeco ocorrem a incubao, a replicao e a disseminao do vrus por todo o corpo do mosquito. A fmea pode passar por ciclos de reproduo durante o perodo de incubao e replicao do vrus, dando a ele a oportunidade de entrar no ovo e de ser passado para a prole pela transmisso vertical (Monath, 1994). O A. aegypti apresenta hbitos antropoflicos e as fmeas realizam a hematofagia em perodo diurno, com maior pico no perodo entre 16 h e 18 h (Silva et al., 2002). As fmeas realizam a oviposio em criadouros articiais, geralmente em pequenas colees de gua limpa e parada, localizadas nas proximidades das casas. Contudo, Silva et al. (1999) demonstraram que o A.aegypti tambm se desenvolve em gua poluda. Nesse caso a oviposio feita nas paredes dos recipientes, imediatamente acima da superfcie da gua, onde os ovos podem ser vistos como pequenos pontos escuros. O desenvolvimento do mosquito ocorre por metamorfose completa, passando pelas seguintes fases: ovo, quatro estdios larvais, pupa e adulto (Marzochi, 1994; Gubler, 1998; Silva et al., 1998; Silva et al., 1999; Silva et al., 2002; Forattini & Brito, 2003). O A. aegypti encontrou no mundo moderno condies muito favorveis sua rpida propagao como, por exemplo, a crescente urbanizao, as decincias no fornecimento, tratamento e armazenamento de gua e o uso intensivo de materiais descartveis. Uma das conseqncias dessa situao tem sido o aumento do nmero de criadouros potenciais para o mosquito vetor (Guzman & Kouri, 1996; Tauil, 2001). A dengue se dissemina conforme a expanso do A. aegypti, que hoje ocupa praticamente toda a faixa cosmotropical da terra. No Brasil, a partir de 1986 se desencadearam epidemias de dengue, sempre relacionadas com a introduo de um novo sorotipo do vrus que se dissemina para as unidades federadas (Uribe, 1983;
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Serufo et al., 1993; Marzochi, 1994; Monath, 1994; OPAS, 1997; Gubler, 1998; Schatzmayr, 2000; Tauil, 2001; FUNASA, 2002). At o momento, no h uma vacina pronta para uso contra os quatro sorotipos do vrus da dengue, embora pesquisas estejam em andamento (Whitehead et al., 2003; Rothman, 2004). A opo para combater a dengue continua sendo o controle do A. aegypti por meio de inseticidas qumicos sintticos usados nas campanhas nacionais. Contudo, tm surgido problemas signicativos como o aparecimento de resistncia (OPAS, 1997; FUNASA, 2002; Campos & Andrade, 2001; Carvalho et al., 2004; Luna et al., 2004). Formas alternativas de controle de vetores vm sendo avaliadas. Merece destaque o controle biolgico com o Bacillus thuringiensis israelensis (Bti), com possibilidade de uso integrado com os produtos sintticos (Andrade & Modolo, 1991; Polanczyk et al., 2003; Praa et al., 2004). Nessa busca por novas alternativas de combate aos insetos vetores, substncias extradas de plantas tm recebido especial ateno. Vrios estudos vm sendo realizados com plantas como forma de controle desse mosquito (Pizarro et al., 1999; Aguilera et al., 2003; Silva et al., 2003; Silva et al., 2004; Cavalcanti et al., 2004; Simas et al., 2004). Assim, procurou-se, atravs da prospeco em plantas, substncias potencialmente capazes de exercer controle sobre o A. aegypti, buscando elucidar o seu mecanismo de ao atravs de estudos morfohistolgicos de toxicidade. Estudos morfolgicos que esclarecem os efeitos txicos de extratos de plantas sobre larvas de A. aegypti auxiliam na compreenso das diversas formas de ao desses produtos (Gusmo et al., 2002, Arruda et al., 2003a, b). A demonstrao do local de atuao e da forma de ao tem grande importncia para a potencializao de seus efeitos e para o desenvolvimento do produto inseticida. A Sapindus saponaria (Figura 1A) uma planta que se encontra distribuda nas Amricas Central e Sul, desde a mata luxuriante at o Cerrado. No Brasil, ocorre do Par ao Rio Grande do Sul. Sua madeira amplamente utilizada na indstria, na construo civil, no reorestamento de reas degradadas e na confeco de brinquedos e caixotaria. As sementes (Figura 1C) so usadas no artesanato. A casca, a raiz e o fruto (Figura 1C) so utilizados na medicina popular como calmante, adstringente, diurtico, expectorante, tnico, depurativo do sangue e contra tosse. A rvore bastante ornamental, principalmente por sua copa globosa, sendo amplamente empregada no paisagismo urbano (Lorenzi, 2004). Estudos com o extrato da folha (Figura 1B) de S. saponaria demonstraram que a planta apresentou atividade neutralizadora de hemorragia provocada por serpentes do gnero Bothrops em animais de laboratrio (Castro et al., 1999). Este extrato constitudo por avonides capazes de inibir atividade plaquetria e antitrombtica. Outros estudos demonstraram propriedades cicatrizantes para lceras provocadas pelo estresse em ratos (Albiero et al., 2002). A administrao dos extratos reduziu signicativamente o nmero de ulceraes severas e moderadas nos ratos, alm de apresentarem atividade anti-secretora e citoprotetora.
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Figura 1. Planta Sapindus saponaria. Figura A rvore. Figura B Folhas. Figura C Frutos maduros e sementes. A partir de uma seleo de plantas com propriedades larvicidas para A. aegypti, realizada no Laboratrio de Bioatividade de Plantas e Entomologia do Instituto de Patologia Tropical e Sade Pblica (IPTSP) da Universidade Federal de Gois (UFG), a S. saponaria apresentou potencial, despertando o interesse por conhecer seu mecanismo de ao em larvas do mosquito. Produtos naturais provenientes de plantas podem representar alternativas s medidas de controle por apresentarem baixa toxicidade para os mamferos e pouco impacto ambiental. Neste estudo, so apresentadas a atividade larvicida e as alteraes morfohistolgicas do extrato bruto etanlico (e.b.e.) de S. saponaria sobre o A. aegypti, visando esclarecer os mecanismos de ao sobre as larvas desse mosquito. Estudos realizados com inseticidas botnicos demonstraram que sua principal ao ocorre no nvel do mesntero das larvas, motivo pelo qual este trabalho focalizou nesta regio do tubo digestivo as anlises morfo-histolgicas (Abed, 2003, Arruda et al., 2003a, b, Borges et al., 2004). MATERIAIS E MTODOS A S. saponaria foi coletada em 12 de setembro de 2004 e, aps sua identicao botnica, partes da planta foram guardadas no herbrio da UFG com o n 28.528. Frutos dessa planta foram coletados na regio central da cidade de Goinia (GO) e processados no Laboratrio de Bioatividade de Plantas e Entomologia do IPTSP/UFG. O material foi colocado em estufa de uxo de ar forado a 40C para secagem. Feita a separao da casca e da semente, ambas foram modas separadamente at atingirem baixa granulometria. Em seguida, os produtos foram percolados a frio, colocando-se cerca de 1 litro do p em um bquer,
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ao qual se acrescentou etanol at atingir aproximadamente 4 centmetros acima do produto. O bquer foi coberto com papel alumnio e permaneceu em repouso por 72 horas. Aps a percolao, o ltrado foi recolhido e concentrado em evaporador rotativo. O extrato bruto etanlico (e.b.e.) obtido foi transferido para placas de vidro e dessecado em uma capela de exausto, com o auxlio de jato de ar quente at a completa evaporao do solvente e, posteriormente, armazenado em dessecador at a utilizao nos testes de atividade larvicida. As larvas do mosquito A. aegypti foram obtidas da criao do Laboratrio de Biologia e Fisiologia de Insetos do IPTSP/UFG. A criao do mosquito se processou numa cmara biolgica climatizada, com temperatura de 281C, umidade relativa de 805% e fotoperodo de 12 horas de acordo com a metodologia de Silva et al. (1998). Cartelas de papel de ltro contendo ovos de A. aegypti foram colocadas em bacias plsticas com gua proveniente da rede pblica de abastecimento. medida que ocorriam as ecloses, as larvas eram retiradas e separadas em outras bacias para dar continuidade ao ciclo. As larvas foram alimentadas com rao para gato triturada. Para o experimento, foram utilizadas larvas de terceiro estdio, imediatamente aps a muda, por se tratarem de larvas mais resistentes para tais estudos (Silva et al., 1998; Silva et al., 2003). Utilizou-se concentrao mxima de 100 ppm. Para tanto, foi feita a pesagem de 0,05 g do extrato em balana analtica de preciso e, em seguida, foi dissolvido em 500 mL de gua destilada. A concentrao de 100 ppm foi, posteriormente, diluda em concentraes menores de 75 ppm e 50 ppm. Essas solues foram colocadas em frascos de 25 mL e em cada frasco foram colocadas 25 larvas. Os experimentos foram feitos em duplicata, utilizando-se em cada um deles o total de 200 larvas de terceiro estdio. Os grupos experimentais utilizados foram: Grupo I= larvas em e.b.e. de 100 ppm; Grupo II = larvas em e.b.e. de 75 ppm; Grupo III = larvas em e.b.e. de 50 ppm; Grupo IV = larvas controle. As larvas usadas como controle foram submetidas s mesmas condies do teste, utilizando-se apenas gua destilada. Todos os grupos foram alimentados com rao para gato triturada, segundo a metodologia de Silva et al. (1998). As larvas foram deixadas no e.b.e por tempos variados, sendo coletadas a cada trs horas, durante um perodo de 48 horas para a vericao das alteraes. Para vericar a letalidade, foram observadas a mobilidade das larvas e sua reao a estmulos externos como foco de luz (luz de lanterna) e mecnico (toque com estilete, toque com basto de vidro na parte externa do recipiente). As larvas foram observadas em estereomicroscpio modelo MZS 250 e coletadas apenas as que se apresentavam em estado letrgico. As mortas foram descartadas. Aps serem retiradas das solues para teste e controle, as larvas foram imediatamente colocadas em xador. As preparaes em historesina foram realizadas no Laboratrio de Histologia do Departamento de Morfologia do Instituto de Cincias Biolgicas (ICB) da UFG.
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Experimentos foram realizados para se obter o xador que melhor conservaria a integridade celular. Dois xadores foram testados: a) Soluo aquosa de paraformaldedo a 4% em tampo cacodilato de sdio 0,1 M pH 7,2; b) mistura de Bouin. Optou-se pelo xador A, visto que as clulas apresentaram melhor estado de preservao. As larvas foram xadas em temperatura ambiente por um perodo de, no mnimo, duas horas, segundo metodologia utilizada por Arruda et al. (2003a). Depois de xadas, foram lavadas no mesmo tampo e submetidas desidratao em solues com concentraes crescentes de etanol (50%, 70%, 80%, 90% e 95%) por um perodo de dez minutos em cada soluo. Aps a desidratao, as larvas foram embebidas em resina (resina bsica + ativador) Leica Historesin Embedding Kit, por um perodo de 12 horas em temperatura ambiente. Aps a embebio, o material foi includo em resina (resina de embebio + catalisador), pertencente ao mesmo kit (solues preparadas segundo especicaes do fabricante), utilizandose para isso moldes de silicone que possibilitaram a colocao das larvas na posio desejada. Os moldes com o material foram deixados em temperatura ambiente por, aproximadamente, 12 horas para total polimerizao da resina. Aps a polimerizao, os blocos de resina foram montados em suportes de madeira com cola araldite e, posteriormente, seccionados com navalha de vidro, em micrtomo modelo Leitz 1512 adaptado para cortes seminos, com espessura de 3 m. Os cortes foram distendidos em uma cuba contendo gua em temperatura ambiente e transferidos para lminas de vidro; em seguida, corados em hematoxilina e eosina (HE), segundo Pearse (1972). As lminas foram fotomicrografadas em Fotomicroscpio modelo MC80, do laboratrio de Botnica do Departamento de Biologia Geral da UFG, utilizandose lmes de 35 mm coloridos. RESULTADOS O e.b.e. da casca do fruto de S. saponaria apresentou aparncia pastosa e escura, sendo facilmente dissolvido em gua. Embora a CL99 tenha sido de 134,1 ppm (IC = 93,8 223,8), foram utilizadas concentraes subletais para evitar interferncias da decomposio na anlise histolgica. Na concentrao de 100 ppm, obteve-se uma letalidade de 100% das larvas tratadas nas 48 horas em que se realizou o experimento; em 75 ppm, obtevese 70% de letalidade e, em 50 ppm, apenas 40% das larvas morreram. Durante os bioensaios algumas mudanas foram observadas no comportamento das larvas. Houve diminuio gradativa dos movimentos larvais quando comparados aos do grupo controle. As larvas dos grupos I e II comearam a apresentar movimentos mais lentos aps 30 minutos do incio dos testes e tornaram-se lentas ou imveis aps trs horas. As do grupo III, a partir de duas horas, apresentavam-se mais lentas e depois de seis horas algumas j estavam imveis. Algumas larvas j entravam em estado letrgico, permanecendo imveis mesmo
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quando estimuladas por toque. As larvas mortas, caracterizadas pelo escurecimento da cpsula ceflica, foram descartadas. A Figura 2 A mostra a morfologia do tubo digestivo das larvas de A. aegypti do grupo controle. O proventrculo apresenta-se em perfeito estado de conservao. Internamente, observa-se a vlvula crdia revestida por uma camada quitinosa e, em sua base, os cecos gstricos associados s clulas do mesntero. H tambm parte do ramo traqueal em volta da superfcie externa do tubo digestivo. No mesntero identicam-se trs regies distintas denominadas de anterior, mediana e posterior. A regio anterior (Figura 2B) caracteriza-se por clulas epiteliais cilndricas, com algumas mais fracamente coradas que as outras, citoplasma heterogneo, acidolia moderada, superfcie apical com um no bordo em escova, ncleo esfrico e basal com alta atividade, apresentando um ou mais nuclolos. Nesta regio, observa-se uma na membrana refringente luz que envolve todo o contedo alimentar, denominada matriz peritrca. A regio mediana (Figura 2C) apresenta clulas epiteliais cilndricas altas, com citoplasma evidenciando reas mais e outras menos acidlas, ncleo esfrico e nuclolos evidentes. Algumas clulas esto agrupadas e com maior basolia, o bordo em escova mostra-se mais espesso e mais corado do que o encontrado na regio anterior. A matriz peritrca to evidente quanto na regio anterior (Figura 2B). A regio posterior (Figuras 2D, E) apresenta clulas cilndricas, intensa basolia e ncleo esfrico basal. A superfcie apical mostra-se com espesso bordo em escova, levemente acidlo, que provavelmente representa a grande quantidade de microvilosidades existentes nesta regio. O espao subperitrco apresenta-se maior e preenchido por substncia acidla, tornando difcil a delimitao entre ele e o bordo em escova. Na parte distal dessa regio (Figura 2E), nota-se uma intensa atividade secretora, na qual as clulas cilndricas liberam sua poro apical em forma de grandes vesculas. As larvas de A. aegypti tratadas com o e.b.e. da S. saponaria mostraram vrias alteraes. As anlises basearam-se na concentrao e no tempo de exposio. Na concentrao de 50 ppm, as alteraes celulares mais relevantes foram observadas com 9 horas; de 75 ppm, com 3 e 12 horas e de 100 ppm, com 3 e 20 horas. A Figura 3A mostra seces completas do mesntero de larvas expostas durante nove horas ao e.b.e. de 50 ppm, evidenciando a presena de grandes dobras na cutcula e basolia na regio mediana mais intensa do que na anterior e na posterior. Nas Figuras 3B, C, D e E observam-se: estraticao do epitlio, pouca vacuolizao celular na regio anterior, alta basolia, estraticao do epitlio com intensa atividade secretora e formao de grandes vesculas na superfcie apical celular na regio mediana. Verica-se tambm um encolhimento do tubo digestivo atravs da luz intestinal que se projeta em dobra (Figura 3D). A transio de epitlio cilndrico para pavimentoso ocorre da regio mediana para a posterior do mesntero. Essa transio acompanhada de um estreitamento do tubo digestivo na regio posterior do mesntero com aparncia recurvada (Figura 3E).
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Figura 2. Fotomicrograas de seces em historesina, coradas em HematoxilinaEosina (HE), de larvas de 3 estdio de Aedes aegypti do grupo controle. A. Vista geral. 50X. B. Regio anterior (RA). 400X. C. Regio mediana (RM). 1000X. D. Regio posterior (RP). 1000X. E. Regio posterior evidenciando grande atividade secretora. 1000X. CG = cecos gstricos, VC = vlvula crdia, T = traquia, CE = clula epitelial, N = ncleo, seta = matriz peritrca, cabea de seta = bordo em escova, Nu = nuclolo, ES = espao subperitrco, V = vescula secretora.
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Figura 3. Fotomicrograas de seces em historesina, coradas em HE, de larvas de 3 estdio de Aedes aegypti mantidas por 9 h em soluo do e.b.e. de Sapindus saponaria a 50 ppm. A: Vista geral.100X. B. Regio anterior (RA) com aparente estraticao do epitlio. 100X. C e D. Regio mediana (RM) em intensa atividade secretora e luz intestinal (L) que se projeta em dobra em conseqncia do encolhimento do tubo digestivo. 400X. E. Detalhe do estreitamento na regio posterior do mesntero com aparncia recurvada (seta). 400X. RP = regio posterior, C = cutcula, CE = clula epitelial, Mu = msculo, V = vescula secretora.
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Na Figura 4A, observa-se a regio anterior do mesntero de larvas submetidas a 3 horas de tratamento em concentrao de 75 ppm. Verica-se a formao de constrio nessa regio, onde as clulas se mostram cilndricas e com formaes vesiculares apicais (Figura 4B). Alm disso, essa gura mostra a transio entre a regio anterior e a mediana. As clulas da regio mediana (Figura 4C) so pavimentosas, com citoplasma ntegro e ncleo de aspecto normal, evidenciando seu estado de conservao. A regio posterior apresenta clulas epiteliais com aspecto similar ao controle.

Figura 4. Fotomicrograas de seces em historesina, coradas em HE, de larvas de 3 estdio de Aedes aegypti mantidas por 3 h em soluo do e.b.e. de Sapindus saponaria a 75 ppm. A. Regio anterior do mesntero mostrando constrio (seta). 200X. B. Detalhe da constrio evidenciando clulas epiteliais com vesculas apicais (V). 400X. Notar a transio entre epitlio colunar para plano (seta). 200X. C. Regio mediana formada por epitlio pavimentoso. 400X. C = cutcula, T = traquia, L = luz intestinal, Mu = msculo, CE = clulas epiteliais.
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A Figura 5A mostra seces completas do mesntero da larva submetida ao e.b.e. de 100 ppm, por 3 horas. Nota-se, claramente, a diviso das regies do mesntero separadas por constries. As clulas da regio anterior (Figura 5B) mostram-se mais baslas que as demais, com o citoplasma vacuolizado, ncleo basal e nuclolos evidentes e liberao de contedo citoplasmtico atravs das vesculas apicais. A constrio que a separa da segunda regio parece fechar a luz intestinal. A segunda e a terceira regio (Figuras 5A e 5C) so formadas por um epitlio pavimentoso no qual as clulas epiteliais apresentam-se muito baixas, sem formao de vesculas e sem bordo em escova aparente. Entre as duas ltimas regies, h a formao de uma outra constrio (Figura 5C), com aspecto mais alongado que a primeira, porm ambas apresentam as mesmas caractersticas morfolgicas. A Figura 6A mostra um aspecto geral do intestino de larvas submetidas ao e.b.e. em concentrao de 75 ppm, por 12 horas, evidenciando o aspecto encolhido e as intensas dobras da cutcula. A regio anterior do mesntero (Figura 6B) mostra-se sinuosa acompanhando essas dobras. Na Figura 7A v-se todo o mesntero da larva submetida ao e.b.e. de 100 ppm, por 20 horas de tratamento. A regio anterior (Figura 7B) apresenta-se com clulas epiteliais altamente vacuolizadas e com vesiculao apical (Figura 7C). Esta gura mostra tambm a vacuolizao do citoplasma, ncleos mais claros, porm com aspecto de alta atividade. Outra alterao que merece destaque a transio de um epitlio cilndrico simples (regio anterior) para um epitlio pavimentoso (regio mediana e posterior do mesntero), similar ao que se observa nos indivduos com trs horas de exposio (Figuras 5A). Na transio entre as duas ltimas regies, verica-se a formao de uma dobra no mesntero com obstruo intestinal (Figura 7E).

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Figura 5. Fotomicrograas de seces em historesina, coradas em HE, de larvas de 3 estdio de Aedes aegypti mantidas por 3 h em soluo do e.b.e. de Sapindus saponaria a 100 ppm. A: Vista geral evidenciando a diviso do mesntero atravs de constries. 50X. B. Regio anterior com clulas epiteliais vesiculadas (V) e constrio formada logo aps essa regio (seta). 200X. C. Regio mediana formada por epitlio pavimentoso e detalhe das duas constries (cabea de seta). 200X. RA = regio anterior do mesntero, RM = regio mediana, RP = regio posterior, TM = tbulos de Malpighi, Mu = msculo, C = cutcula, CE = clulas epiteliais, L = lmen intestinal.
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Figura 6. Fotomicrografias de seces em historesina, coradas em HE, do mesntero de larvas de 3estdio de Aedes aegypti mantidas por 12 h em soluo do e.b.e. de Sapindus saponaria a 75 ppm. A: Vista geral da larva evidenciando o aspecto encolhido da larva observado atravs das intensas dobras formadas na cutcula (C). 100X. B. Regio anterior. Notar as curvas formadas na parede celular que acompanham as dobras da cutcula. 200X. Mu = msculo, CE = clulas epiteliais, T = traquia, C = cutcula.

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Figura 7. Fotomicrograas de seces em historesina, coradas em HE, de larvas de 3 estdio de Aedes aegypti mantidas por 20 h em soluo do e.b.e. de Sapindus saponaria a 100 ppm. A. Vista geral mostrando a transio entre a regio anterior (RA), mediana (RM) e posterior (RP) do mesntero. Notar a presena de constrio na regio posterior (seta). 50X. B. Regio anterior. 100X. C. Detalhe da vacuolizao citoplasmtica e da formao de vesculas (V) nas clulas da regio anterior. 400X. D. Transio entre epitlio cilndrico e pavimentoso (seta). 400X. E. Detalhe da obstruo na luz intestinal na regio posterior causada pela ocorrncia de dobra no mesntero. 400X. VC = vlvula crdia, CG = cecos gstricos, CE = clula epitelial, N = ncleo, L = luz intestinal, V = vesculas secretoras, Mu = msculo, TM = tbulos de Malpighi.
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DISCUSSO Neste estudo, constatou-se a perda da atividade larvicida do extrato conforme se prolongava seu tempo de armazenamento, indicando uma degradao da parte ativa do e.b.e. A primeira alterao causada pelo e.b.e. da planta S. saponaria nas larvas de A. aegypti est relacionada com sua movimentao. As larvas do grupo controle apresentaram grande mobilidade e sua locomoo em meio lquido realizou-se atravs das contraes do corpo e da movimentao das escovas, reagindo rapidamente a qualquer toque, o que est de acordo com Forattini & Brito (2003). Porm, nas larvas submetidas ao e.b.e. na concentrao de 50 ppm, a perda da mobilidade teve incio com duas horas de tratamento e o estado letrgico foi estabelecido aps seis horas de exposio. Mas as larvas submetidas s concentraes de 75 ppm e 100 ppm comearam a apresentar diminuio de seus movimentos com 30 minutos de exposio e caram totalmente letrgicas com trs horas. A reduo da mobilidade das larvas de A. aegypti, resultado obtido neste trabalho, est de acordo com os de Arruda et al. (2003b) em relao Magonia pubescens. O mesmo fato tambm ocorreu com larvas de Culex nigripalpus infectadas por um baculovirus, que se tornaram letrgicas aps 72 horas (Moser et al., 2001); com A. aegypti e C. quinquefasciatus aps meia hora de exposio ao Bacillus thuringiensis e com larvas de Anopheles albimanus, aps duas horas. Esses trabalhos evidenciam que a reduo da mobilidade larval o primeiro sinal da atividade larvicida (Ruiz et al., 2004). As larvas tratadas neste estudo apresentaram-se menores e mais escuras que as larvas utilizadas como controle. O aspecto encolhido pode ser notado atravs das grandes dobras da cutcula. Resultados semelhantes foram descritos por Salvador (2002), que evidenciou em larvas de A. aegypti, expostas ao temephos, uma reduo de cerca de 50% no comprimento e o escurecimento causado pela sobreposio das cutculas dos segmentos abdominais. Borges et al. (2004), utilizando o inibidor de crescimento diubezuron em larvas desse mosquito, encontraram um tamanho menor e aspecto alterado em razo do acmulo de mudas incompletas. Nas anlises histopatolgicas aqui realizadas, larvas do grupo controle apresentaram trs regies distintas no mesntero, denominadas anterior, mediana e posterior. Essas observaes so compatveis com as descritas por Snodgrass (1935), Arruda et al. (2003a, b) e Borges et al. (2004). Nas preparaes em resina coradas por HE, todo o mesntero apresentouse revestido por um epitlio cilndrico simples. As clulas da regio anterior mostraram-se com citoplasma esponjoso e com superfcie apical coberta por um no bordo em escova, indicando se tratar de clulas absortivas. Observou-se a presena de clulas coradas mais fracamente que as outras dessa regio. Observaes semelhantes foram feitas por Shahabuddin & Pimenta (1998) com adultos de A. aegypti. A presena de clulas claras no mesntero de larvas desse mesmo mosquito
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foi tambm observada por Arruda et al. (2003a), que, embora tenham realizado estudos histoqumicos, no conrmaram uma funo endcrina dessas clulas, j que somente estudos especcos podero esclarecer sua funcionalidade. A regio mediana apresentou caractersticas de transio entre a regio anterior e a posterior do mesntero, o que est de acordo com Snodgrass (1935). A regio posterior evidenciou maior basolia celular e um espesso bordo em escova. Algumas clulas dessa regio apresentaram uma intensa atividade secretora com formao de vesculas apicais e liberao de parte do citoplasma para a luz intestinal. De acordo com Snodgrass (1935), as clulas digestivas do mesntero dos insetos em geral participam ativamente nos processos de secreo e absoro e o processo de degenerao dessas clulas ocorre atravs do acmulo de material granular na poro apical da clula e da liberao desse material na luz intestinal do inseto. Na regio apical das clulas de todo o mesntero de larvas de A. aegypti, foi observado um no bordo em escova, provavelmente com funo de absoro de nutrientes, como j foi demonstrado por Levy et al. (2004) em larvas de Lepidoptera. Observou-se uma matriz peritrfica envolvendo todo o contedo alimentar no tubo digestivo das larvas controle. Snodgrass (1935) arma que em Diptera ela secretada por clulas especializadas da poro nal da regio anterior do mesntero. Contudo, Beerntsen et al. (2000) mencionam que a matriz peritrca dos mosquitos vetores funciona como um ltro semipermevel para as enzimas digestivas e que a mesma possui funo de proteo contra os alimentos ingeridos e contra patgenos. Os efeitos txicos do e.b.e. da casca de S. saponaria foram observados em todo o mesntero de larvas de A. aegypti, que se mostrou afetado, entretanto as alteraes nas regies anterior e mediana foram mais evidentes. Nos estudos realizados por Arruda et al. (2003a), as alteraes causadas pelo extrato de M. pubescens no mesntero de larvas do mesmo mosquito atingiram principalmente a regio anterior, tornando-se progressivas para as outras regies. Estudos histopatolgicos de larvas de Diptera submetidas ao biolarvicida B. thuringiensis medellin (Cry11Bb) mostraram que o mesntero posterior e os cecos gstricos so os principais stios de localizao dessa toxina (Ruiz et al., 2004). Larvas de Culex nigripalpus infectadas com um baculovirus tambm apresentaram os cecos gstricos e a regio posterior do mesntero com maiores alteraes citopatolgicas (Moser et al., 2001). As alteraes deletrias causadas nas clulas do mesntero incluram vrias mudanas histopatolgicas: alta vacuolizao do citoplasma, desintegrao do bordo em escova, hipersecreo pelas clulas epiteliais, lise celular, pavimentao do epitlio e aumento do nmero de camadas epiteliais de forma irregular. O aumento dessas camadas pode ter ocorrido em virtude da proliferao de clulas regenerativas, dando, assim, origem a novas clulas que tambm manifestaram aspecto morfolgico alterado. Vrias dessas alteraes tambm foram observadas por Shahabuddin & Pimenta (1998) quando estudaram clulas do mesntero de adultos de A. aegypti
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infectado por P. gallinaceum. Estas no apresentaram as densas microvilosidades comumente encontradas nas clulas colunares, o retculo endoplasmtico mostrouse escasso e sem grnulos de secreo eltron-densos. Foi observado um grande nmero de vacolos claros localizados principalmente na poro apical celular. Moser et al. (2001), em anlises histolgicas de larvas de C. nigripalpus infectados por um baculovirus, relataram como sinais de infeco: presena de clulas arredondadas, citoplasma granular e denso, hipertroa do ncleo e alta vacuolizao citoplasmtica das clulas epiteliais do mesntero dessas larvas. Essas alteraes so similares aos resultados encontrados no presente estudo. Em estudos ultra-estruturais realizados em larvas de A. aegypti submetidas ao extrato de Derris urucu, Gusmo et al. (2002) observaram que a mortalidade larval estava relacionada com o rompimento da estrutura da matriz peritrca e com a desintegrao das clulas do mesntero. Estas apresentaram alteraes de colorao, com clulas menos coradas e algumas separadas da lmina basal. Os autores tambm relataram a presena de clulas colunares do mesntero expulsando o contedo citoplasmtico no lmen intestinal. De fato, neste trabalho, alteraes celulares tambm foram notadas nas larvas submetidas S. saponaria. Arruda et al. (2003a), estudando larvas de A. aegypti submetidas ao extrato da planta M. pubescens, descreveram vrias alteraes deletrias provocadas nas clulas do mesntero, como alta vacuolizao do citoplasma, aparente aumento do nmero de camadas do epitlio, hipertroa das clulas, desintegrao do bordo em escova e hipersecreo pelas clulas epiteliais, o que tambm foi observado, em diferentes graus, pela ao do extrato da planta S. saponaria. Por outro lado, Arruda et al. (2003b), em suas observaes, ainda evidenciaram a extruso da matriz peritrca, junto com o contedo alimentar do tubo digestivo, indicando um processo de defesa da larva ao tentar eliminar do seu interior agentes txicos do extrato, fato que no foi notado neste estudo. Ruiz et al. (2004), em estudos realizados em larvas de A. aegypti, A. albimanus e C. quinquefasciatus expostas toxina Cry11Bd de B. thunrigiensis medellin, descreveram srias mudanas histopatolgicas, como vacuolizao do citoplasma, hipertroa das clulas epiteliais e de seus ncleos, deteriorao do bordo em escova e desintegrao celular e formao de vesculas apicais que liberavam seu material no lmen intestinal. Neste trabalho, o e.b.e. de S. saponaria provocou alteraes similares. Outro aspecto observado nas preparaes em resina foi a mudana de um epitlio colunar, formado por clulas cilndricas com diferentes graus de degenerao celular, para um epitlio pavimentoso desprovido de bordo em escova. Nenhum relato bibliogrco semelhante foi encontrado. A hiptese mais provvel a de que o epitlio original tenha sido lesado pela ao larvicida do extrato e rapidamente outro epitlio foi reposto na tentativa imediata de proteger o tecido conjuntivo, porm as clulas epiteliais recm-formadas adquiriram apenas a funo de proteo e no a de absoro. Talvez por esta razo apresentaram o aspecto
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achatado e a ausncia das microvilosidades como conseqncia de uma rpida reao ao e.b.e. e sua ao destrutiva. Em algumas larvas tratadas, observou-se o estreitamento do tubo digestivo com formao de constries que ora separavam as regies do mesntero, dando um aspecto segmentado ao mesmo, ora restringiam-se a apenas uma regio. Nenhuma referncia foi encontrada com relao a constries formadas; provvel, porm, que se trate de uma reao defensiva da larva na tentativa de impedir um contato maior com o larvicida, ou mesmo da realizao de movimentos peristlticos realizados pela larva para a extruso do agente agressor de seu tubo digestivo, ao similar ao mecanismo relatado por Arruda et al. (2003b). O isolamento do tubo digestivo em pores separadas por constries pode indicar um processo de defesa da larva a m de impedir a passagem dos agentes txicos contidos no extrato para as outras pores do mesntero, assim a destruio celular se limitaria ao incio do trato digestivo, diminuindo a letalidade das leses. Outra hiptese que justicaria a formao das constries seria o isolamento do extrato larvicida em pores do tubo digestivo. O extrato, ento, atingiria um segmento por vez, dando tempo para a recuperao de parte do epitlio antes que outra poro fosse destruda, assim apenas parte do intestino caria lesada ao invs de todo o tubo, o que poderia ser fatal para a larva. De qualquer forma, as constries ao longo do mesntero larval parecem ser uma tentativa de isolar o contedo alimentar nocivo ao inseto, para posterior eliminao, de modo que o menor nmero de danos celulares sejam provocados neste tubo. Nas larvas submetidas ao extrato nas concentraes de 100ppm e 75 ppm, a pavimentao do epitlio aparece atingindo o mesntero mdio e posterior, enquanto na concentrao de 50ppm essa alterao mantm-se restrita regio posterior do mesntero, indicando que essa seria a primeira regio a ser atingida pela ao do larvicida. Nesta concentrao no notamos a formao de constries no mesntero das larvas, fato que provavelmente s ocorre em concentraes maiores. Na literatura, h relatos de modicaes ocorridas na estrutura da matriz peritrca de larvas de A. aegypti expostas ao extrato de D. urucu (Gusmo et al., 2002), causando rompimento da mesma. Nos trabalhos de Arruda et al. (2003a) foi relatado o espessamento da matriz peritrca como uma forma de impedir o contato do extrato de M. pubescens com as clulas do mesntero de larvas de A. aegypti, cando, assim, demonstrada a funo de defesa. No presente estudo, porm, no foram vericadas diferenas signicantes entre a matriz peritrca das larvas tratadas e a das larvas utilizadas como controle. A toxicidade do e.b.e. de S. saponaria sobre as larvas de A. aegypti foi demonstrada pelo estudo morfohistolgico, sendo evidenciada pelos vrios danos s clulas do mesntero, sinalizando que esse extrato botnico pode representar um larvicida alternativo ao controle do A. aegypti.
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ABSTRACT Study of the morphohistological modications in larvae of Aedes aegypti (Diptera, Culicidae) submitted to the pure ethanolic extract of Sapindus saponaria lin. (Sapindaceae). Dengue is reported as the most important virus disease in the world. This disease is controlled by combating the vector Aedes aegypti using chemical insecticides. Although chemical insecticides have efcient action against the mosquito A. aegypti, they are toxic to humans and the environment and therefore they are not recommended for controlling the mosquito spread. Products of botanic origin may be an alternative to the insecticides to combat the mosquito because they have low toxicity levels for human life and cause less environmental impact. The present study describes the morphological changes and larvicidal activity of the ethanol extract, obtained from the peel of the fruit of Sapindus saponaria, against 3rd larval instars of the A. aegypti. The larvae were incubated in water solutions of the extract at different concentrations up to 48 hours. The larvae in lethargic stages were colleted and xed in paraformaldehyde and included in resin. The laminas were then stained using hematoxiline eosine method and analyzed through light microscope. The toxic effects of the ethanol extract of S. saponaria against larvae of A. aegypti were observed in all three mesentery regions with several histopathological changes, such as complete or partial cells destruction, high cytoplasm vacuolization, hyper secretion of epithelial cells, and epithelia pavimentation. The cellular changes demonstrate the action mechanism of the ethanol extract of S. saponaria against A. aegypti. KEYWORDS: Aedes aegypti. Sapindus saponaria. Larvicidal. Control. REFERNCIAS
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I CONGRESO PANAMERICANO DE ZOONOSIS V CONGRESO ARGENTINO DE ZOONOSIS II CONGRESO BONAERENSE DE ZOONOSIS 10, 11 y 12 de mayo de 2006. Ciudad de la Plata Buenos Aires Republica Argentina TEMARIO GENERAL Proteccin de la Salud: Una barrera para las zoonosis. Zoonosis bacterianas, virales, parasitarias y micticas. Enfermedades transmitidas por alimentos. Infectologa humana y animal. Enfermedades emergentes. Trazabilidad alimentaria. Bioseguridad. Salud pblica y zoonosis. Antimicrobianos y antiparasitarios. Gentica y zoonosis. Enfermedades exticas. Laboratorio en la zoonosis. Atencin Primaria y Control de las Zoonosis rurales Animales ponzoosos y zoonosis. Agua y recursos hdricos. Biotecnologa. Normas y control de calidad en la zoonosis. Estrategia de educacin para la salud y el medio ambiente. Zoonosis y animales exticos. El desarrollo local y la evolucin de las zoonosis El consorcio Intersectorial: Conocimiento y gestin de zoonosis. Reunin Internacional de Expertos Organizacin Panamericana de la Salud/ Organizacin Mundial de la Salud (OPS/OMS). ORGANISMOS INTERNACIONALES QUE INTERVENDRAN 1 Dr. Schudel, Alejandro (OIE) 2 Dr. Belotto, Albino (OPS/OMS) 3 Dr. Meslin Franoise-M (Suiza/OMS) 4 Dr. Torroba Jorge (RILAA/OPS Argentina) 5 Dr. Vargas Tern Moises (FAO) LOS TRABAJOS PRESENTADOS CONCURSARN POR LOS PREMIOS: Premio Panamericano de Zoonosis Premio de la Asociacin Argentina de Zoonosis Premio Fundacin Manzullo Premio Chagas-Mazza Premio Control e Inocuidad de los Alimentos Premio Ambiente Saludable
Los trabajos presentados seran publicados en la Revista Acta Bioquimica clinica Latinoamericana. Fecha limite de recepcin de resmenes 15 de marzo de 2006 58
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