CENTRO UNIVERSITÁRIO FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS - FMU

CISBEM

Camilly Alves Siqueira

ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP), SEMEADURA

EM MEIOS SÓLIDOS E COLORAÇÃO DE GRAM EM ALIMENTOS E LEITURA

São Paulo, 2021

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Camilly Alves Siqueira

ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP), SEMEADURA

EM MEIOS SÓLIDOS E COLORAÇÃO DE GRAM EM ALIMENTOS E LEITURA

Relatório técnico apresentado como requisito

parcial para obtenção de aprovação na disciplina
Análise de Alimentos, na FMU.

Prof. Msc. Viviane Cristina Longuini de Menezes

São Paulo, 2021

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.............................................................................................. 3
2 DESENVOLVIMENTO.................................................................................. 4
2.1 OBJETIVO GERAL....................................................................................... 4
2.2 METODOLOGIAS......................................................................................... 4
2.2.1 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS..................................................... 5
2.3 RESULTADOS.............................................................................................. 12
3 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES....................................................... 12
ANEXOS ....................................................... 13

REFERÊNCIAS.............................................................................................14
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1 INTRODUÇÃO

A técnica de tubos múltiplos é a mais tradicional para a análise

de coliformes (totais ou termotolerantes) e E.coli. Esta metodologia permite a
quantificação por “número mais provável” (NMP) de microrganismos e é dividida em
duas fases sucessivas, uma presuntiva e outra confirmativa. E esta última somente é
realizada se houver crescimento positivo na etapa presuntiva.

As técnicas de semeadura são o método pelo qual se transfere inóculos bacterianos

de um meio de cultura ou material a ser analisado (secreções, alimentos) para um
outro meio de cultura. Para garantir que apenas o microrganismo desejado seja
semeado, são utilizadas as técnicas assépticas: procedimentos que devem ser
adotados visando a não contaminação de materiais, meios e culturas.

O estudo começa com o tratamento da amostra com um corante primário, que é

o Cristal Violeta, que, como o nome sugere, colore as bactérias em um tom
arroxeado.

Como resultado, observam-se as bactérias Gram positivas coradas de roxo, devido

ao corante Cristal Violeta, e as Gram negativas coradas de vermelho, devido ao
contracorante Safranina.

As colônias coletadas para cultura foram identificadas como Escherichia coli,

Staphylococcus aureus.

Serão selecionados os meios de cultura Agar MacConkey, Agar Mannitol e os caldos

BHI e BHI NaCl para crescimento dos micro-organismos semeados.
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2 DESENVOLVIMENTO

2.1.1 OBJETIVO GERAL

ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP), SEMEADURA

EM MEIOS SÓLIDOS E COLORAÇÃO DE GRAM EM ALIMENTOS
Ao final desta atividade experimental espera-se que o aluno seja capaz de:
- Realizar análises de identificação coliformes por tubos múltiplos (NMP);
- Realizar a semeadura em meios sólidos específicos para alimentos e analisar
os principais microrganismos causadores de toxinfecções alimentares;
- Realizar coloração de Gram, analisar, identificar diferenças morfológicas e
arranjos;
- Realizar a técnica de diferenciação do microrganismo através da prova da
catalase.

2.2 METODOLOGIAS
ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP),
SEMEADURA EM MEIOS SÓLIDOS
COLORAÇÃO DE GRAM EM ALIMENTOS

2.2.1 ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP)

2.2.1.1 MATERIAL E REAGENTE
Bico de bunsen,
Alça de platina,
Pissete com Alcóol 70%,
tubos de Durham estéreis,
béquer de 100 mL,
proveta de 50 mL,
tubos de caldo EC ou caldo Mac Conkey ou caldo BHI estéreis com tampa.
tubos de caldo BHI com 7,5% NACL com tampa e estéril.
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2.2.1.2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

A técnica de tubos múltiplos é a mais tradicional para a análise de coliformes (totais
ou termotolerantes) e E.coli. Esta metodologia permite a quantificação por “número
mais provável” (NMP) de microrganismos e é dividida em duas fases sucessivas,
uma presuntiva e outra confirmativa. E esta última somente é realizada se houver
crescimento positivo na etapa presuntiva.
O procedimento da fase presuntiva consiste em fazer a homogeneização e
transferência de alíquotas e/ou diluições da amostra para tubos de ensaios
contendo, no fundo, um tubo invertido para coleta de gás (tubo de Durhan), e o meio
de cultura apropriado (caldo lauril triptose). Todos os tubos são incubados a 35°C
durante 24 a 48 horas e posterior identificação dos que tiverem crescimento
(positivo) de coliformes totais, resultado identificado pela ocorrência de reação ácida
(coloração amarelada) ou produção de gás (retida no tudo de Durhan).
Na fase confirmativa, efetua-se o repique (transferência de alíquotas com alça de
platina) dos tubos presuntivos positivos para tubos preparados da mesma forma que
no anterior, porém contendo caldo. Todos os tubos são incubados a 35°C durante 24
a 48 horas e posterior identificação dos que tiverem crescimento (positivo) de
coliformes totais, identificado pela ocorrência de produção de gás nos tubos de
Durhan.
Na fase confirmativa, efetua-se o repique (transferência de alíquotas com alça de
platina) dos tubos presuntivos positivos para tubos preparados da mesma forma que
no anterior, porém contendo caldo. Todos os tubos são incubados a 35°C durante 24
a 48 horas e posterior identificação dos que tiverem crescimento (positivo) de
coliformes totais, identificado pela ocorrência de produção de gás nos tubos de
Durhan.
(A fase complementar serve para identificação dos coliformes termotolerantes,
na qual faz-se o repique dos tubos presuntivos para outros tubos, desta vez
contendo meio EC (recomenda-se que seja feito simultaneamente ao teste
confirmativo), que deverão ser incubados a 44,5ºC durante 24 horas. Todo este
procedimento totaliza no mínimo 72 horas para obtenção de resultado positivo para
coliformes termotolerantes.)
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2.2.1.3 ANÁLISE DOS TUBOS (ESSA ETAPA SERÁ ANALISADA

POSTERIORMENTE NA AULA DA PRÓXIMA SEMANA)

De acordo com o número de tubos positivos em cada uma das diluições e das fases
utilizadas, determina-se o número mais provável (NMP), tendo como base tabelas
estatísticas.
Acesse as tabelas de NMP e os procedimentos completos para análise de
coliformes, segundo o FDA, no link:
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm109656.htm
#tab1
Usando a Tabela, é possível estimar o número de organismos a partir de qualquer
combinação de resultados positivos e negativos com 95% de confiança dos dados.

2.2.2 SEMEADURA EM MEIOS SÓLIDOS

Semeadura e isolamento
Material enriquecido em caldo TSB de swab ou “in natura”:
Placas: esgotar o material em um ponto da placa e com a alça comum de níquel-
cromo flambada e fria, realizar a semeadura com estrias para isolamento a partir do
ponto de aplicação da amostra (semeadura direta) (Fig 1 a 4);
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Fig 1 Fig 2 Fig 3 Fig 4 Fig 5

As placas a serem utilizadas serão Agar MacConkey e Agar Manitol.

Levar para a estufa a 36,5°C por 24h, para obter a multiplicação dos Mos. Do meio.

2.2.3 Avaliar o crescimento microbiano nos diferentes meios de cultura e realizar a

identificação dos microrganismos.
(ESSA ETAPA SERÁ ANALISADA POSTERIORMENTE NA AULA DA PRÓXIMA
SEMANA)

Interpretação
Crescimento no Agar MacConkey – Gram Negativos
Fermentadores de Lactose – Colônia Rosa
Não Fermentadores de Lactose – Colônia Incolor ou Branca
Crescimento no Agar Manitol – Gram Positivas
Colônia pequeno e rodeadas de uma zona vermelha – estafilococos não-
patogênicos
Colônia maiores e rodeadas de uma zona amarela – Staphylococcus aureus
fermentadores do manitol

2.2.4 Prova da catalase

Quando houver suspeita de cocos Gram-positivos, realizar uma bacterioscopia e
depois a prova da catalase.
a) Em um tubo de ensaio limpo, colocar cerca de 5 mL de peróxido de hidrogênio 20
volumes
b) Com auxílio de uma alça, transferir uma colônia para o tubo e emulsioná-la no
peróxido.
c) Um desprendimento intenso de bolhas indica resultado POSITIVO.
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2.2.4 Coloração de Gram

1 INTRODUÇÃO
A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias que consiste no
tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os
reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite
a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a
determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. O método da
coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias
Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um
tratamento com etanol-acetona enquanto as paredes celulares de bactérias Gram
negativas não o fazem.

2.2.4.1 OBJETIVO
Nesta aula o aluno irá executar o método de coloração de Gram, em esfregaços já
previamente preparados e fixados pelo calor. Posteriormente, o aluno realizará a
visualização dos esfregaços corados no microscópio óptico empregando a objetiva
de imersão, deverão ser capazes de caracterizar a morfologia individual, a formação
de agrupamentos e diferenciação da coloração da célula bacteriana.

2.2.4.2 MATERIAL E REAGENTE

Bico de Bulsen,
• Alça de Platina;
• Tubos de Ensaio;
• Algodão;
• Estante para tubo de ensaio;
• Conta-gotas;
• Placa de Patrick;
• Hagar Chocolate;
• Microscópio Ótico
• Lâmina
• Lamínula
• Cristal Violeta
• Lugol
• Fucsina
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2.2.4.3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Com todos os materiais sobre a bancada inicia-se pelo processo de esterilização da
alça de platina sobre o bico de bulsen, para esterilizá-la deve-se segurá-la da
mesma forma como se segura uma caneta, e rodá-la em cima do bico de bulsen
para que o fogo percorra toda sua extensão, depois deve-se incliná-la
aproximadamente 45º e esperar que ela fique incandescente; após a esterilização a
alça de platina deve ficar apoiada no bico de bulsen para que ela não saia da área
de proteção do mesmo. Tudo que for pego com a mão direita ou esquerda deve-se
permanecer neste mesmo lado, visto que a troca de objetos de uma mão para a
outra pode ocasionar acidentes devido ao risco que o bico de bulsen apresenta por
se tratar de um emissor de chama.
Manuseando na área de segurança, pega-se o tubo de ensaio, retira-se o algodão
que está tampando-o e com um conta gotas coleta-se a salina que está no tubo;
esta salina deve ser pingada (uma gota) na lâmina que vai ao microscópio; no final
deste procedimento deve-se passar o tubo de ensaio no bico de bulsen e tampá-lo
novamente com algodão. Segurando de maneira leve a alça de platina, deve se abrir
a placa de Patrick e esfregar a alça nela superficialmente para que possa ser
retirada uma finíssima camada de microrganismos
que ali cresceram; tampa-se novamente a placa e realiza-se um esfregaço desta
camada na lâmina que contêm a salina.
Com o bico de bulsen aceso, e com um prendedor segurando a lâmina, realiza-se a
secagem da placa de maneira lenta, sem que ela corra risco de estourar.
Após a secagem foi realizado o processo de coloração; para corar devem-se realizar
os seguintes passos:
a. Pingar o cristal violeta e esperar um minuto
b. Sobre ele pingar lugol e esperar mais um minuto,
c. Colocar solução de álcool cetona e lavar com água,
d. Cobrir com Fucsina e esperar 30 segundos,
e. Lavar e deixar secar.
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2.2.4.4 ANÁLISE E LEITURA (ESSA ETAPA SERÁ ANALISADA

POSTERIORMENTE NA AULA DA PRÓXIMA SEMANA)

Observar ao microscópio em menor aumento e, a seguir, colocar 1 gota de óleo

mineral na lâmina e focalizar com objetiva de imersão.
Desenhar as bactérias observadas considerando o tipo de coloração (Gram + ou -),
a forma e o arranjo das células.
Após o uso, a objetiva de imersão deve ser limpa com papel absorvente.
As bactérias que tiverem a característica irão formar cristais violeta em seu interior e
se diferenciarão das demais pela coloração mais acentuada.

Quando as estruturas celulares, como você explicaria a possibilidade de

comportamento das bactérias G + e G - na coloração de Gram?
 O comportamento das bactérias G+ e G- dependem da estrutura da parede celular.
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2.3 RESULTADOS

Relatar os resultados obtidos a partir dos experimentos e dos estudos realizados

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3 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES
 
A coloração de Gram é um passo muito importante na caracterização e classificação
inicial das bactérias. Afinal, esse método de coloração permite que as bactérias
sejam visualizadas no microscópio óptico, uma vez que sem a coloração é
impossível observá-las ou identificar sua estrutura.

ANEXO
TÉCNICAS DE SEMEADURA
Semeadura em Placas de Petri:
O material a ser semeado deverá conter poucos microrganismos porque o inóculo
para o isolamento deve ser leve. Lembrar que cada colônia formada na superfície de
um meio sólido é originada de um ou alguns microrganismos. Quanto maior o
número, menor possibilidade de isolamento e maior probabilidade de crescimento
confluente. Quando o inóculo for obtido a partir de meio sólido (inóculo pesado), este
poderá ser diluído em salina estéril ou ser utilizada a técnica de esgotamento
adequada.
Estrias Múltiplas para Isolamento: Consiste em espalhar o material com o auxílio de
uma alça bacteriológica, fazendo estrias sucessivas até o esgotamento do material,
de modo a obter-se um perfeito isolamento das bactérias existentes na amostra.
Quando o material é muito denso, a alça deverá ser flambada. A semeadura poderá
ser realizada em um sentido ou em vários, de acordo com a pessoa que realizará a
técnica, lembrando-se sempre que o objetivo principal desta técnica de semeadura é
a obtenção do isolamento bacteriano.

Semeadura em Meio Líquidos:

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Difusão: Técnica que consiste em acrescentar microrganismos através da alça ou

agulha de platina em meios líquidos. Tem como principal finalidade a observação de
propriedades bioquímicas através de testes microbiológicos, bem como poderá ser
utilizada para o favorecimento do crescimento bacteriano, quando é realizada em
meios que possibilitem o enriquecimento.

Técnica para semeadura em meios líquidos:

Segurar a alça com a mão direita, flambar primeiro na chama azul, depois na
amarela. Esperar esfriar (a alça é flambada na posição vertical e deverá ficar atrás
da chama para proteção do operador);
Retirar a rolha de algodão do tubo que contém o microrganismo a ser semeado ou
repicado (que deverá estar na mão esquerda) utilizando-se o dedo mínimo da mão
direita. A ROLHA OU TAMPA DEVERÁ PERMANECER SENDO SEGURA COM O
DEDO MÍNIMO, ATÉ
O FINAL DA OPERAÇÃO;
Flambar a boca do tubo, e retirar o inóculo com a alça fria;
Flambar novamente a boca do tubo e fechar;
Pegar o tubo onde se irá realizar a semeadura, retirar a rolha e flambar;
Semear o material, flambar a boca do tubo e fechar;
Esterilizar a alça, identificar o tubo semeado e levar para incubação em estufa

REFERÊNCIAS

ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS – ABNT. NBR 10719:

apresentação de relatórios técnico-científicos. Rio de Janeiro, 1989. 9 p.
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bsjoi.ufsc.br/files/2010/.../Modelo_de_relatorio_tecnico-cientifico.do

https://bancadapronta.wordpress.com/2013/09/03/analises-de-coliformes-por-tubos-
multiplos/

https://www.biomedicinapadrao.com.br/2012/09/tecnicas-de-semeadura.html

https://blog.jaleko.com.br/como-e-feito-o-metodo-de-gram/