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Colgio Dr.

Clvis Bevilcqua

Tcnico em Patologia Clnica

MICROBIOLOGIA

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MICROBIOLOGIA - BACTERIOLOGIA
Bactrias so seres procariontes, que possuem como principais estruturas morfolgicas: - Cpsula: revestimento importante na preveno da fagocitose bacteriana e no auxlio da aderncia das bactrias aos tecidos. reserva de gua e nutrientes, aumenta a capacidade invasiva de bactrias patognicas e lhes d resistncia. - Parede celular: manuteno da forma bacteriana, proteo contra rupturas causadas pela elevada presso osmtica, e local de determinantes antignicos (diferenciam microorganismos). - Membrana citoplasmtica: separa o meio exterior e o meio interior da bactria, realizando o transporte de eltrons e solutos. - Citoplasma: local onde ocorrem muitos processos metablicos. - Polirribossomos: sntese de protenas. - Incluso / grnulo: acmulo de alimentos. - Plasmdeo: contm informaes genticas (DNA) independente do ncleide. - Mesossomos: provvel concentrao de enzimas respiratrias. - Nucleide: contm informaes genticas (DNA ou ADN). - Fmbrias: auxiliam na adeso das bactrias s clulas-alvo e facilitam a troca de DNA na hora da conjugao bacteriana. - Flagelos: atuam na motilidade bacteriana, que muito importante para a sua sobrevivncia.

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DIVISO MORFOLGICA BACTERIANA A diviso morfolgica bacteriana baseada na constituio da parede celular. Isso nos permite agrupar as bactrias em trs grupos: - Cocos: clulas esfricas, que podem estar isoladas ou agrupadas. Caracterizam-se como diplococos, fileiras ou cadeias de cocos (estreptococos), ttrades, cubos ou cachos (estafilococos). - Bacilos: clulas cilndricas, que podem estar isoladas ou agrupadas. Caracterizam-se como diplobacilos, correntes, paliadas ou cocobacilos. - Espiraladas: clulas onduladas ou helicoidais que podem ter uma ou mais espirais. Quando tm o corpo rgido e so como vrgulas, so chamadas vibries; quando tm a forma de saca-rolhas so chamadas de espirilos; e quando tm forma espiralada, mas de corpo flexvel, so chamadas de espiroquetas.

1- ________________________________________________________ 2- ________________________________________________________ 3- ________________________________________________________ 4- ________________________________________________________ 5- ________________________________________________________ 6- ________________________________________________________ 7- ________________________________________________________ 8- ________________________________________________________

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NUTRIO E CRESCIMENTO BACTERIANO


Para que haja o crescimento bacteriano, so necessrios fatores como: 1- pH adequado: a maioria das bactrias cresce em pH neutro (6.5 7.0), porm h bactrias que crescem em pH muito cido ou muito bsico. 2- gua: gua disponvel presente nos alimentos ou nos veculos onde os microorganismos podem crescer (Aw= atividade de gua) e no ambiente (UR= umidade relativa do ar). 3- Nutrientes: fontes de energia (acares, lipdeos), fontes de nitrognio (aminocidos, peptdeos, protenas), vitaminas (principalmente complexo B) e sais minerais (quantidades reduzidas de Na, K, Fe, Cu, P, S). 4- Temperatura: o fator mais microorganismos em grupos: GRUPO Termfilos Mesfilos Psicrotrficos Psicrfilos TEMP. MN. 40C a 45C 5C a 15C -5C a 5C -15C a 5C importante, podendo dividir os

TEMP. TIMA 55C a 75C 30C a 37C 25C a 30C 12C a 15C

TEMP. MX. 60C a 90C 35C a 47C 30C a 35C 15C a 20C

5- Composio gasosa do ambiente: existe a variao de tolerncia de quantidade de O2 entre as bactrias, que as dividem em: - Aerbios estritos: necessitam de O2 para sobreviver - Aerbios facultativos: usam o O2 quando h, e na sua ausncia, crescem mesmo sem ele. - Anaerbios estritos: no crescem na presena de O2. - Anaerbios aerotolerantes: no respiram O2, mas crescem na sua presena. - Microaerfilos: necessitam de concentraes menores de O2 do que as encontradas no ar.

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CRESCIMENTO BACTERIANO
As bactrias se multiplicam por fisso numa progresso geomtrica, e o tempo que isso leva (surgimento de duas clulas idnticas clula me) chamado de tempo de gerao. O crescimento bacteriano demonstrado numa curva, onde so reconhecidas quatro fases: - Lag (pouca diviso celular, com aumento de tamanho da clula) - Log (crescimento logartmico rpido e constante) - Estacionria (nmero de mortes igual ao nmero de nascimentos) - Declnio (nmero de mortes superior ao nmero de nascimentos)

CURVA DO CRESCIMENTO BACTERIANO

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CONTROLE DO CRESCIMENTO DOS MICRORGANISMOS

Na Tab.1, encontram-se as definies de termos freqentemente utilizados em laboratrios de microbiologia.

Na Tab.2, encontra-se um resumo dos mtodos fsicos de controle do crescimento microbiano.

Tab.1 Terminologias Relacionadas ao Controle do Crescimento Bacteriano


Termo Esterilizao Desinfeco Definies e Comentrios Processo de destruio e/ou remoo de todas as formas de vida de um objeto ou material. um processo absoluto, no havendo graus de esterilizao. Destruio (morte) de microrganismos capazes de transmitir infeco (patgenos). So usadas geralmente substncias qumicas que so aplicadas em objetos ou materiais. Reduzem ou inibem o crescimento, mas no esterilizam necessariamente. Desinfeco qumica da pele, mucosa e tecidos vivos. Anti-sepsia um caso particular de desinfeco. Agente qumico genrico que mata germes, micrbios: bactericida mata bactrias; virucida mata vrus; fungicida mata fungos; esporocida mata esporos etc. Condio na qual o crescimento bacteriano est inibido, mas a bactria no est morta. Se o agente bacteriosttico for retirado, o crescimento pode recomear. Substncias qumicas, quimioterpicos, podem ser bacteriostticos. Refrigerao pode funcionar como microbiosttica para a maioria dos organismos.

Anti-sepsia Germicida

Bacteriostase

Assepsia (sem Ausncia de microrganismo em uma rea. Tcnicas asspticas previnem a infeco) entrada de microrganismos. Degermao Remoo de microrganismos da pele atravs de remoo mecnica ou pelo uso de anti-spticos. Antes das injees, o algodo embebido em lcool passado na pele, igualmente o lcool-iodado, preparando o campo cirrgico.

Microbiologia TRABULSI, L.R. 3 ed. p76. 2002.

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Tab.2 Sumrio dos Mtodos Fsicos Empregados no Controle do Crescimento Microbiano Mtodo 1. Calor mido
a) Fervura Desnaturao de protenas Mata bactrias, fungos e Processo de desinfeco muitos vrus, em 15 min de larga utilizao No eficaz para todos os caseira endsporos Mtodo eficaz de esterilizao Meios de cultura, Ficar atento ao trinmio: solues, utenslios e instrumentais que tempo x temp. x presso toleram temperatura e presso Mata bactrias patognicas Leite, creme de eventualmente transmissveis cerveja, vinho pelo leite e reduz o nmero de todos os microrganismos presentes leite,

Mecanismo de ao

Comentrios

Uso preferencial

b) Autoclavao

Desnaturao de protenas

c) Pasteurizao

Desnaturao de protenas

2. Calor seco
a) Flambagem Oxidao de todo material Mtodo eficaz de esterilizao at tornar cinzas Oxidao de todo material Mtodo eficaz de esterilizao at tornar cinzas Ala e fio de platina

b) Incinerao

Papis, carcaas de animais, restos de curativos, algodo e gazes utilizados em hospitais

c) Fornos

Oxidao

Mtodo eficaz de esterilizao Vidrarias e outros Ficar atento ao binmio materiais resistentes a tempo x temperatura altas temperaturas Separao de bactrias, fungos til na eliminao total em meios ou solues lquidas de bactrias e fungos em e gases produtos lquidos termolbeis e na filtrao do ar em cmaras e salas

3. Filtrao

Remoo mecnica

4. Radiaes
a) Ionizantes Destroem DNA Mtodo eficaz de esterilizao Usado para esterilizao mas custo elevado de produtos cirrgicos (raios gama) As radiaes ultravioletas tm Lmpadas emprego restrito como (UV) esterilizante germicidas

b) No-ionizantes

Alteram DNA

5. Baixas temperaturas
Geladeira (0C), Interrupo do metabolismo congelador (-20C) e nitrognio lquido (-179C) Efeito microbiosttico Preservao microrganismos e

Microbiologia TRABULSI, L.R. 3 ed. p77. 2002.

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MTODOS FSICOS DE CONTROLE DO CRESCIMENTO MICROBIANO


BAIXAS TEMPERATURAS: Servem apenas como mtodo de preservao de microrganismos, podendo ser realizado em geladeira (0C), congelador (-20C) ou nitrognio lquido (-179C). CALOR: O mtodo mais empregado para matar microrganismos o calor, por ser eficaz, barato e rpido. Quanto maior o nmero de microrganismos, maior dever ser o tempo de exposio ao calor. Os tipos de calor utilizados nos processos de controle microbiolgico so: Calor mido: compreende a fervura, a autoclavao e a pasteurizao. - Fervura (temperatura x tempo): mtodo de reduo do nmero de microrganismos (100C), que mata muitos vrus, fungos e seus esporos em at 15 minutos. Este no um mtodo de esterilizao, mas um mtodo eficiente para tornar alimentos e gua seguros para serem ingeridos. - Autoclavao (presso x temperatura x tempo): mtodo de esterilizao, pois requer temperaturas acima da fervura da gua (121C). Este mtodo o preferencial, desde que o material ou substncia a ser esterilizada no sofra alteraes pelo calor ou umidade. Esse tipo de esterilizao realizado pelas autoclaves, aonde quanto maior a presso interna, maior a temperatura atingida. Geralmente utiliza-se como padro, o calor mido de 121C e a presso de 15 lb/pol2, que matar todos os organismos (incluindo os endosporos) em cerca de 15 minutos. A autoclavao empregada para esterilizar meios de cultura, instrumentos cirrgicos, seringas de vidro, solues e numerosos materiais que suportam altas temperaturas e presses. - Pasteurizao (temperatura x tempo): mtodo de preveno da perda da qualidade, atravs da reduo do nmero de microrganismos. Consiste em aquecer o produto a uma dada temperatura, num dado tempo, e a seguir, resfriar bruscamente. Calor seco: compreende a flambagem, a incinerao e os fornos. - Flambagem: forma mais simples de esterilizao por calor rotineiramente em laboratrio para esterilizar fios e alas de platina. seco utilizada

- Incinerao: mtodo de esterilizao, usado para queimar sacos e copos de papel, plstico, carcaas de animais e materiais descartveis que j foram utilizados. - Fornos (temperatura x tempo): mtodo de esterilizao empregado em laboratrio para vidraria refratria. RADIAES: As radiaes tm seus efeitos dependentes do comprimento de onda, da intensidade, durao e distncia da fonte. H pelo menos dois tipos de radiaes empregadas no controle microbiolgico: Ionizantes: so utilizados istopos radioativos que emitem radiao, como por exemplo, as radiaes gama. Esse tipo de radiao possui comprimento de onda mais curto e carrega mais energia do que a radiao no-ionizante. O principal efeito da radiao ionizante a morte ou inativao do microrganismo, atravs da destruio do DNA celular. Produtos hospitalares descartveis como seringas plsticas, luvas, cateteres, fios e suturas so esterilizados por este mtodo. No-ionizantes: utilizam-se radiaes com comprimento de onda mais longo, como a luz ultra-violeta (UV), que provoca alterao no DNA. As lmpadas germicidas so empregadas para o controle dos microrganismos o ar e so encontradas em centros cirrgicos, enfermarias, berrios, capelas de fluxo laminar etc. As desvantagens do uso da UV so: baixo poder de penetrao (atua somente na superfcie dos materiais) e os efeitos nocivos sobre a pele e os olhos.

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MTODOS QUMICOS DE CONTROLE DO CRESCIMENTO MICROBIANO


LCOOIS (age sobre as protenas): O lcool etlico hidratado possui maior eficincia do que o absoluto, portanto deve ser utilizado na forma de soluo a 70%. Ele o anti-sptico mais empregado, especialmente em situaes que levam a ruptura da integridade da pele (injees, punes etc). O lcool isoproplico puro apresenta ao germicida superior do lcool etlico, alm de ser menos corrosivo para os instrumentos. FENIS (age sobre as protenas): Exs. Creolina, utilizada para desinfeco de pisos, vasos sanitrios; componentes de sabes. HALOGNIOS E DERIVADOS (age sobre as protenas): Ex. Iodo (soluo alcolica a 2% - tintura de iodo), que bactericida, fungicida e esporocida. Hipoclorito de Sdio ou Clcio (lquido de Dakin), que tem ao germicida e utilizado na desinfeco da gua. AGENTES DE SUPERFCIE (age sobre a membrana plasmtica): alteram a permeabilidade da membrana, inibem a respirao e a obteno de energia de formas bacterianas vegetativas, tendo tambm ao sobre fungos, vrus e esporos bacterianos. So os sabes aninicos e catinicos, sendo os catinicos mais eficazes. Ex.: Clorexidina, utilizada na anti-sepsia da pele (mos de cirurgies, mdicos e paramdicos em geral), preparao pr-cirrgica de pacientes, anti-spticos bucais etc. METAIS PESADOS: possuem efeito bactericida (baixo) e bacteriosttico (predominante). Seu uso vem diminuindo com o passar do tempo, pelo risco de intoxicao. Ex. Sais de mercrio, como merbromino (Mercurocromo) e timerosal (Mertiolate). Nitrato de prata, usado em solues oftlmicas. AGENTES OXIDANTES: age atravs da liberao de oxignio nascente, que extremamente reativo e oxida sistemas indispensveis para a sobrevivncia dos microrganismos. Ex. gua oxigenada H2O2 em soluo a 3%. Oznio O3, o qual tem sido utilizado em larga escala no tratamento de gua de consumo. ESTERILIZANTES GASOSOS (agem inativando certas enzimas): O xido de etileno, embora tenha atividade esterilizante lenta, tem sido empregado com sucesso na esterilizao de instrumentos cirrgicos, fios de agulhas para suturas e plsticos. Deve ser empregado com cautela e misturado com outros gases (N e CO2), pois, em combinao com o ar, forma mistura explosiva.

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MEIOS DE CULTURA
Sistema utilizado para isolar microorganismos em laboratrios, que permite o crescimento e a multiplicao dos agentes. Um bom meio de cultura deve preencher todas as necessidades nutricionais dos agentes, ser estril e possuir pH adequado. Os meios de cultura podem ser lquidos ou slidos. Podem ser ainda: - No seletivos: permitem crescimento de um grande nmero de espcies - Seletivos: meio geral no qual so adicionadas substncias que inibem ou reduzem certos grupos, salientando outros. Os meios de culturas possuem como principais componentes: H2O destilada, fonte de carbono (energia - CO2, lipdeos, acar, lcool e outras substncias), fonte de nitrognio, fatores de crescimento (vitaminas que variam de espcie para espcie), extratos (de carne, levedura, casena de leite, hidrolisado de protena de soja), minerais (P, Fe, Zn, Mn, Ca, Cu, Na em baixas concentraes). Eles se apresentam na forma desidratada, devendo ser diludos em H2O deionizada (sem ons) e esterilizados. A esterilizao um processo que elimina todos os contaminantes provenientes da gua ou do prprio meio de cultura. Esse processo feito em autoclave 121C por 15 minutos e o pH do meio deve ser ajustado conforme indicado pelo fabricante, ou de acordo com o microorganismo pesquisado.

SEMEADURA
o processo de isolamento de uma substncia que esteja sob suspeita de contaminao por algum microrganismo. Esse isolamento deve proporcionar as condies ideais de crescimento e desenvolvimento do microrganismo, caso este esteja presente. Portanto, semear um material (substncia suspeita) significa espalh-lo sobre o meio de cultura em Placa de Petri, e incub-la em temperatura ideal (geralmente em estufa a 37C por cerca de 24 - 48 h). Aps o perodo de incubao, realiza-se a leitura da placa. O no crescimento de colnias significa a ausncia de microrganismos na substncia pesquisada, enquanto que o crescimento significar a presena de um ou mais tipos de microrganismos.

Tcnicas de Semeadura
Tcnica I: Meio Slido (gar em Placa de Petri): Semeadura por esgotamento. 1- Mergulhe a ala de platina esterilizada na amostra que lhe apresentada. 2- Encoste a ala carregada de bactrias na superfcie do gar e inicie movimentos de zigue-zague retilneos, uniformes e bem prximos. 3- Desencoste levemente a ala de platina da superfcie, gire a placa ( 90), encoste novamente a ala de platina no final da primeira semeadura e inicie nova semeadura com movimentos em zigue-zague, retilneos, unifomes e um pouco mais espaados. 4- Desencoste levemente a ala de platina da superfcie, gire a placa ( 90), encoste novamente a ala de platina no final da segunda semeadura e inicie nova semeadura com os mesmos movimentos, mas desta vez, bem espaados. 5- Incube em estufa para crescimento sob tempo e temperatura sugeridos.

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Tcnica II: Meio Lquido (caldo nutritivo) 6- Mergulhe a ala de platina esterilizada na cultura de isolamento bacteriano que lhe apresentada. 7- Mergulhe a ala carregada de bactrias no tubo com o meio de cultivo lquido (caldo) e agite a ala. 8- Incube em estufa para crescimento. Geralmente o tempo de crescimento varia de 4 6 h. Dependendo da bactria, pode levar de 18 a 24 h. Visualize o caldo aps incubao. Um caldo turvo demonstra crescimento bacteriano.

Tcnica III: Meio semi-slido 1- Mergulhe o fio de platina esterilizado na cultura bacteriana que lhe fornecida. 2- Inocule o fio de platina carregado com bactrias no centro do meio de cultivo semislido. 3- Incube em estufa para crescimento sob temperatura e tempo sugeridos.

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Tcnica IV: Meio slido (gar inclinado) para fungos 1- Pegue a amostra micolgica coletada com a ala de platina esterilizada que lhe apresentada. 2- Encoste levemente a ala na parte mais baixa do plano inclinado e suba fazendo estrias na superfcie do gar. 3- Incube sob temperatura e tempo sugeridos.

Tcnica V: Meio slido (gar inclinado) para bactrias. 1- Mergulhe o fio de platina esterilizado na cultura bacteriana que lhe fornecida. 2- Inocule o fio de platina carregado com bactrias na parte mais baixa do gar inclinado at quase encostar o fundo do tubo. 3- Durante a retirada do fio de platina, quando este atingir a superfcie, suba fazendo estrias na superfcie do gar. 4- Incube em estufa para crescimento sob temperatura e tempo sugeridos.

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REAES TINTORIAIS
Para que se enxergar as bactrias (que so transparentes), necessria a utilizao de corantes que evidenciam suas estruturas e auxiliam na separao por gnero e espcie. Para evidenciar estruturas gerais, utiliza-se a colorao simples, a qual contrasta apenas o corpo da bactria. J para se distinguir estruturas especficas, utiliza-se colorao diferencial, composta por mais de um corante, o que possibilita sua separao em espcies ou cepas. Dentre as coloraes existentes, duas se destacam por suas caractersticas, importncia e grupos de microrganismos que atingem. Mtodo ou Colorao de Gram: Essa colorao a que possui maior importncia no campo da microbiologia, pois permite separar as bactrias em dois grandes grupos (pela diferena na composio da parede celular), as Gram-positivas e as Gram-negativas. Ela realizada da seguinte forma: 1 Etapa: imerge-se o esfregao em soluo cristal-violeta por 1. Esse corante principal tingir os dois grupos de bactrias, ou seja, todas se coraro de violeta. 2 Etapa: imerge-se o esfregao em soluo de lugol por 1. Esse mordente far com que a colorao violeta das clulas permanea, atravs da formao do complexo CV-1. 3 Etapa: descora-se o esfregao com soluo lcool-acetona e depois lava-se em gua corrente. Esse descorante ir, no caso das gram-positivas, permitir a permanncia do complexo CV-1 no interior da clula atravs da desidratao, diminuio da porosidade e da permeabilidade da parede celular. J no caso das gram-negativas, ela vai remover o complexo CV-1 da clula atravs da extrao dos lipdeos e do aumento da porosidade da parede celular. 4 Etapa: imerge-se o esfregao em soluo contra-corante (fucsina) por 30- 40, logo depois lavando-o em gua corrente. Esse contra-corante ir, no caso das grampositivas, no surtir efeito, portanto as gram-positivas permanecero violetas. J no caso das gram-negativas, que foram descoradas anteriormente, esse corante penetrar na clula, tornando-a vermelha (arroseada). Ao final o processo, as bactrias gram-positivas coram-se de violeta, e as gramnegativas coram-se de vermelho (arroseado). A etapa mais importante dessa colorao a 3 etapa. Se no houvesse a etapa da descolorao, as gram-negativas no descorariam e no se corariam de vermelho (arroseado) na 4 etapa, assim no havendo a diferenciao dos dois grupos; sem contar que as gram-positivas no fixariam a colorao violeta, podendo assim, corar-se de forma diferente at o final do processo.

Mtodo ou Colorao de Ziehl-Neelsen: A colorao de Ziehl-Neelsen permite a diferenciao dos bacilos lcool-cido resistentes (BAAR) dos bacilos no lcool-cido resistentes (BNAAR). o mtodo mais utilizado para a pesquisa de micobactrias em diferentes materiais clnicos. A presena de BAAR no escarro fortemente sugestiva de tuberculose pulmonar (Micobacterium tuberculosis), e o encontro dessas bactrias nas secrees nasais ou no sangue colhido do lbulo da orelha, praticamente confirma o diagnstico clnico de lepra (Micobacterium leprae). Essa colorao realizada da seguinte forma: 1 Etapa: imerge-se o esfregao em soluo concentrada de fucsina, aquecendo-se a lmina at a emisso de vapores, durante cerca de 3(no deixando ocorrer ebulio). Esse corante principal tingir todas as bactrias, que se tornaro vermelhas. 2 Etapa: escorre-se o corante e descora-se o esfregao com soluo diferenciadora de lcool-cido (lcool + HCl). Lavar em gua corrente. Esse diferenciador ir, no caso dos BAAR, permitir a permanncia do corante fucsina. J no caso dos BNAAR, ele vai remover o corante fucsina. 3 Etapa: imerge-se o esfregao em soluo diluda de azul de metileno (1:10) por 1, logo depois lavando-o em gua corrente. O azul de metileno no surtir efeito sobre os BAAR, porm, corar os BNAAR, que foram descorados anteriormente. Ao final o processo, os BAAR se coram de vermelho, e os BNAAR se coram de azul.

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Staphylococcus sp
So cocos G+ arranjados em cachos, que fazem parte da microbiota da pele, porm podem causar patogenias e serem responsveis infees piognicas e septicemias fatais. Alguns fatores favorecem estas infeces, como alteraes hormonais (puberdade) e metablicas (diabetes). Possuem as seguintes caractersticas: so catalase positivos; crescem em vrios meios de cultura (gar-sangue, gar-chocolate, gar Meller-Hinton e gar Manitol Hipertnico) e fermentam carboidratos. Os Staphylococcus sp patognicos possuem a capacidade de hemolisao, coagulao do plasma, produo de toxinas/enzimas extracelulares e resistncia antimicrobianos. Esse gnero abrange mais ou menos 30 espcies, dentre as quais as de interesse clnico so trs:

S. aureus: Causam leses como furnculos, conjuntivite e impetigo bolhoso (acomete toda a pele com a formao de bolhas purulentas) que so doenas srias em pacientes imunocomprometidos, queimados ou com doenas crnicas. Podem gerar pneumonias, osteomelites, endocardites e meningites. Somente o S. aureus produz coagulase. Eles produzem tambm toxinas, as quais so: - Exotoxina: lisa as hemceas e lesa ou agrega as plaquetas. - Leucocidina: destri leuccitos. - Esfoliativa: causa descamao da pele, causando a Sndrome da pele escaldada. - TSSI-1: causada com uma quantidade de 106 bactrias. Seu quadro inicia com febre, infeco multisistmica, choque e bito, e uma doena de mulheres por causa do absorvente interno. - Enterotoxinas: causam intoxicaes alimentares. Elas so termoestveis (resistem ao congelamento e a fervura por 30 minutos) e so encontradas em doces cremosos.

S. epidermidis: So os principais agentes causadores de infeces associadas a prteses cardacas (endocardites) e cateteres, portanto so importantes agentes de infeces hospitalares (berrios, UTIs, centros cirrgicos e enfermarias ou unidades de quimioterapia). Evita-se essas infeces com boa assepsia (raspagem de pelos e uso de lcool iodado), assepsia do cirurgio, e utensllios e ambiente estreis.

S. saprophyticus: Segundo agente mais importante nas infeces urinrias. Elas so mais comuns em mulheres, podendo ser subclnicas ou crnicas.

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Streptococcus sp
So cocos G+ arranjados em cordes ou em duplas (forma de gota), catalase negativos. Embora esses microrganismos faam parte da microbiota normal da pele, vias areas, aparelho genito-urinrio e trato intestinal, muitos deles so responsveis por uma variedade de manifestaes clnicas. Os estreptococos necessitam de meios de cultura enriquecidos pela adio de sangue (gar-sangue) e possuem capacidade hemoltica. Sendo assim, so classificados como -hemolticos (hemlise total), hemolticos (hemlise parcial) e -hemolticos / no-hemolticos (no causam hemlise). Os estreptococos de maior importncia clnica so:

S. pyogenes: As infeces mais freqentes localizam-se na faringe e amdalas (faringoamidalites) e na pele. Disseminando-se a partir de focos primrios (particularmente das faringoamidalites), a bactria pode infectar diferentes rgos e tecidos do organismo, podendo evoluir para bacteremias e meningites. So bactrias capsuladas, -hemolticas, sensveis a bacitracina e resistentes a optoquina (ambos so agentes antimicrobianos). Elas produzem: - Estreptolisina S: responsvel pelo halo de hemlise. - Estreptolisina O: hemolisina ativa somente na ausncia de O2. Pacientes convalescentes da infeco por esse microrganismo costumam apresentar anticorpos sricos contra a estreptolisina O (Anti-estreptolisina O, chamado de ASO ou ASLO). A pesquisa desses anticorpos tem grande importncia no diagnstico da febre reumtica. - Estreptoquinase, Desorirribonuclease e Hialuronidase: a estreptoquinase tem a capacidade de dissolver cogulos, a desoxirribonuclease degrada o DNA e a hialuronidase dissolve a substncia fundamental do tecido conjuntivo. Todas as trs so imunognicas, portanto, a pesquisa de anticorpos especficos deve ser utilizada para fins de diagnstico.

S. agalactiae: As infeces mais freqentes so as meningites, septicemias e pneumonias em neonatos, os quais se contaminam na passagem pela vagina, durante o parto. Para o diagnstico laboratorial, o material dever ser colhido da vagina, crvix e regio retal, ou ao nascimento a partir do cordo umbilical, canal auditivo externo, garganta e reto. So bactrias hemolticas, resistentes a bacitracina e a optoquina. A identificao presuntiva desse tipo de microrganismo pode ser feita atravs do teste de CAMP, o qual baseado na deteco de uma enzima (fator CAMP) produzidas pelo Streptococcus agalactiae, que potencializa a ao ltica da -hemolisina do S. aureus sobre hemceas de carneiro (gar-sangue).

S. pneumoniae: diplococos com formato de chama de vela, -hemolticos, resistentes a bradicinina e sensveis a optoquina. So associados a pneumonia, meningite, septicemia e otite mdia. Eles podem ser normalmente encontrados no trato respiratrio superior de seres humanos, e s causam infeco se forem capazes de escapar da fagocitose. Esse microrganismo possui uma substncia em sua parede celular, denominada Substncia C. Essa substncia C reage com uma protena do soro humano, denominada Protena Creativa.

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DIAGNSTICO LABORATORIAL PARA Staphylococcus sp

1- Bacterioscpico: identificao da forma bacteriana, colorao de Gram (+ ou -) e arranjo especial. 2- Prova da Catalase: diferencia Staphylococcus sp e Streptococcus sp. realizada em lmina, aonde se coloca 01 ou 02 gotas de H2O2 e uma colnia suspeita observandose a formao ou no de bolhas. 3- Prova da Coagulase: identifica a presena de S. aureus. Pode ser realizada em lmina (econmico e rpido, porm pode ter interferentes e pode no diagnosticar algumas cepas dessa bactria) ou em tubo (maior preciso, porm maior quantidade de plasma, e possibilidade de falso-negativos). Em tubo, mistura-se uma colnia suspeita em mL de plasma de coelho, incuba-se a 37C por 4 h. Se no houver a formao de cogulo, incubar por mais 12 horas, observando o material num intervalo de 2 em 2 h. 4- Teste de Resistncia ou Sensibilidade a Novobiocina: diferencia S. epidermides e S. saprophyticus. Semeia-se a bactria em meio Meller-Hinton, adiciona-se um disquinho de novobiocina e incuba-se a 37C por 24 h. Verifica-se a sensibilidade (halo maior de 16 mm - S. epidermides) ou a resistncia (halo menor ou igual a 16 mm - S. saprophyticus) da bactria analisada. Nunca deve-se usar o meio garsangue para essa prova, pois algumas cepas de Staphycoloccus sp causam hemlise, o que poderia parecer um halo. 5- Manitol: o S. aureus fermenta o meio manitol (tornando-o amarelo), enquanto que as outras duas espcies no fermentam o mesmo.

Esquema simplificado para a diferenciao das espcies de Staphylococcus sp mais frequentemente envolvidas em infeces em seres humanos Espcie S. aureus S. epidermides S. saprophyticus Catalase + + + Coagulase + Manitol + Novobiocina Sensvel Sensvel Resistente

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DIAGNSTICO LABORATORIAL PARA Streptococcus sp


1- Bacterioscpico 2- Prova da Catalase 3- Teste de Hemlise: diferencia -hemlise, -hemlise e -hemlise. Realizada em gar-Sangue. 4- Teste de Resistncia ou Sensibilidade a Bacitracina e a Optoquina: diferencia as trs espcies de estreptococos. Semeia-se a bactria em meio Meller-Hinton, adiciona-se um disquinho de bacitracina e um disquinho de optoquina e incuba-se a 37C por 24 h. Verifica-se a sensibilidade (halo maior de 16 mm) ou a resistncia (halo menor ou igual a 16 mm) da bactria analisada. Nunca deve-se usar o meio gar-sangue para essa prova, por causa da capacidade hemoltica das bactrias. 5- Teste de CAMP: teste confirmatrio para S. agalactiae. Em gar-Sangue, semeia-se a bactria suspeita em uma nica estria. Paralelamente a esta estria, semeia-se outra estria de uma amostra conhecida de Staphylococcus aureus. Observa-se ento, aps incubao a 37C, a potencializao ou no da hemlise do Streptococcus agalactiae.

Esquema simplificado para diferenciao das principais categorias ou espcies de estreptococos encontrados em espcimes clnicos de origem humana Espcie S. pyogenes S. agalactiae S. pneumoniae Catalase Hemlise Bacitracina Sensvel Resistente Resistente Optoquina Resistente Resistente Sensvel CAMP + -

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Neisseria sp

So diplococos G-, com formato de feijo.

Neisseria gonorrhoeae (Gonorria) No homem, a uretrite a principal forma clnica da infeco gonoccica. A partir da uretra, a infeco pode se estender para a prstata, epiddimo e vescula seminal. Na mulher, a forma clnica de infeco mais comum a cervicite. Essa infeco pode ascender para as tubas uterinas (salpingite), podendo atingir o peritnio. A infeco mais comum em crianas a conjutivite neonatal adquirida durante o nascimento. Ocasionalmente o gonococo invade a corrente circulatria, dando origem a artrites, endocardites, meningites e leses cutneas. A disseminao da infeco mais freqente na mulher do que no homem. O diagnstico feito pelo exame bacterioscpico de esfregaos corados por Gram e pelo isolamento e identificao do gonococo. No homem, o exame bacterioscpico extremamente importante porque revela a presena do gonococo em secreo uretral, na grande maioria das vezes. O quadro microscpico costuma ser bastante caracterstico, consistindo em grande nmero de leuccitos, vrios deles contendo diplococos G- em seu interior. Na mulher, o exame bacterioscpico tem valor bastante limitado para o diagnstico de infeco gonoccica. A cultura deve ser feita por semeadura da secreo, seja uretral, cervical, retal ou farngea, no meio de Thayer-Martin, que seletivo para gonococos.

Neisseria meningitidis (Meningite) Essa bactria inicia suas infeces colonizando a nasofaringe. Na maioria das vezes a infeco assintomtica, mas ocasionalmente apresenta manifestaes clnicas discretas. Da nasofaringe, o meningococo pode ganhar a circulao, determinando meningococcemia e meningite. A infeco assintomtica da nasofaringe determina o aparecimento de anticorpos protetores contra o meningococo. Isso significa que a maioria dos casos de meningite meningoccica ocorre por falta de resistncia do hospedeiro. O exame bacterioscpico de esfregaos, preparados com o sedimento do lquor, corados por Gram, de grande utilidade para o diagnstico. A presena de diplococos G-, intra e extracelulares, praticamente garante o diagnstico de meningite meningoccica.

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ENTEROBACTRIAS
Grupo de bacilos G- encurvados ou retos, anaerbios facultativos, que podem ou no apresentar motilidade (flagelos) e que possuem muitas propriedades em comum. Embora possam ser encontradas amplamente na natureza, a maioria habita os intestinos do homem e dos animais. Elas so associadas quadros diarricos e desintricos, podendo tambm estar associadas quadros de meningite, pneumonias, intoxicao alimentar e infeces urinrias. O representante clssico deste grupo a Escherichia coli, um dos mais importantes membros da flora intestinal dos mamferos e um importante patgeno, causador de infeco no trato intestinal e urinrio. As outras enterobactrias tambm podem ser chamadas de coliformes, devido a importncia da E. coli na medicina.

Principais gneros de Enterobactrias


Escherichia coli: Habita o trato intestinal do homem e animais, sendo disseminada atravs de veculos contaminados com material fecal (gua, alimentos). Est associada a infeces urinrias, bacteremias, meningite do recm nascido e quadros desintricos. Existem cinco cepas associadas aos quadros disentricos: - EPEC (Escherichia coli entero-patognica clssica): causadora de diarria em crianas com menos de um ano de idade, atravs da destruio das microvilosidades, o que gera a diarria por m absoro. - ETEC (Escherichia coli entero-toxignica): produz dois tipos de toxinas, chamadas enterotoxina LT (termolbil) e enterotoxina ST (termoestvel suporta 100C durante 30 min). Essa bactria somente adere s clulas intestinais, no destruindo as microvilosidades. A diarria proveniente da ao das enterotoxinas. - EIEC (Escherichia coli entero-invasora): invade as clulas das microvilosidades, destruindo-as e causando diarria. - EHEC (Escherichia coli entero-hemorrgica): causadora de diarrias leves, sanguinolentas ou colite disentrica. Ela destri as microvilosidades e produtora de uma citotoxina chamada verotoxina (toxina de Shiga ou Shiga-like), gerando assim um quadro disentrico parecido com o quadro causado pela shigelose. - EAEC (Escherichia coli entero-agregativa): Possui a caracterstica de se agregarem sobre as microvilosidades. Est associada com quadros de diarria protrada, ou seja, aquelas que apresentam durao de 7 a 14 dias. Salmonella sp: Habita o trato intestinal do homem e de animais (frango, peru, pato, roedores, gato, cachorro e tartaruga), sendo disseminada por alimentos, principalmente de origem animal, carnes preparadas, aves, ovos, derivados do leite, produtos de panificao, saladas diversas. Est associada febre tifide, febre paratifide, meningite em crianas e infeces intestinais. - Salmonella typhi: causadora da febre tifide, caracterizada por febre, dor de cabea, diarria e dor abdominal. - Salmonella paratyphi: causadora da febre paratifide, clinicalmente semelhante febre tifide. - Salmonella typhimurium: causadora de meningite infantil, sendo um agente comum em So Paulo. - Demais espcies: Causadoras de enterocolites de evoluo no complicada que desaparecem em uma semana. Shigella sp: Causadora da shigelose ou desinteria bacilar. A principal espcie a Shigella dysenteriae, que produz a toxina Shiga, que possui atividade de citotoxina, neurotoxina e enterotoxina. Atinge geralmente crianas, e transmitida pela ingesto de gua contaminada ou de alimentos preparados com gua contaminada.

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Proteus sp, Morganella sp e Provindencia sp: Encontradas regularmente nos intestinos do homem, sendo encontradas causando infeces urinrias. Antigamente, esses trs gneros faziam parte apenas do gnero Proteus sp. Edwardsiella tarda: uma bactria raramente isolada do homem. Pode causar infeces intestinais com a presena de sangue, muco e leuccitos nas fezes, e infeces extra-intestinais. Citrobacter sp: So encontradas frequentemente nos intestinos do homem. Causam pielonefrites, meningites do recm-nascido, endocardite e bacteremias. Estas infeces tendem a predominar em indivduos imunocomprometidos, e por esta razo, ocorrem basicamente em hospitais. Klebsiella sp: Este gnero est associado pneumonia lobar, infeces do aparelho urinrio, endocardites e vrios tipos de infeces ps-cirrgicas. um importante agente de infeces hospitalares. Enterobacter sp: Geralmente encontrada como agente secundrio de outras infeces. Hafnia alvei: No um agente raro, e sua patogenicidade semalhante a da Enterobacter sp. Serratia sp: Importante agente de infeces hospitalares, devido a sua mltipla resistncias a antibiticos. Yersinia sp: Causadora de enterocolite (Yersinia enterocolitica e Yersinia pseudotuberculosis) e da Peste Bubnica / Negra (Yersinia pestis). - Enterocolite: seus sintomas variam de leves a severos, e so caracterizados por diarria, febre e dor abdominal. As bactrias so transmitidas por via fecal-oral, por ingesto de gua e alimentos contaminados, como leite e carne suna contaminados. Peste Bubnica / Peste Negra: o reservatrio da Y. pestis so roedores selvagens ou domsticos, e a via de transmisso se d pela picada de pulgas infectadas, que injetam a bactria atravs da pele. Uma vez dentro do organismo, a bactria se instala nos linfonodos, gerando resposta inflamatria que resulta no inchao (bubo) caracterstico da febre bubnica. Eventualmente, essa bactria pode atingir os pulmes, gerando a forma pulmonar da doena, a qual apresenta alta fatalidade, podendo levar ao bito em poucos dias. Quando as bactrias atingem os pulmes, podem ser transmitidas atravs de perdigotos a outros indivduos. Os doentes com peste frequentemente desenvolvem leses necrticas nos vasos sanguneos perifricos, as quais do aspecto enegrecido pele; da o nome de Peste Negra. Pseudomonas sp: Bacilos flagelados, aerbicos, no formadores de esporos, oportunistas que podem causar vrias doenas. Esto presentes no solo, gua, ar e esgoto, crescendo em meios simples. A Pseudomonas aeruginosa considerada um dos principais agentes de infeco hospitalar, estando associada com infeces dos tratos urinrio e respiratrio, e infeces em pacientes com queimaduras graves e leses de pele. Uma importante caracterstica dessa espcie e a produo de um pigmento azulesverdeado denominado piocianina, e por isso, tambm conhecida como bacilo piocinico.

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DIAGNSTICO DAS ENTEROBACTRIAS


O diagnstico das infeces por enterobactrias normalmente realizado atravs do isolamento e da identificao da bactria responsvel pela infeco. Pode-se recorrer tambm, no caso de algumas espcies, a diagnstico sorolgico ou molecular. As amostras so provenientes de vrios locais do corpo, de acordo com o local de infeco. Podem ser fezes, urina, liquor ou qualquer outro material. Primeiramente se realiza a semeadura em meio de isolamento, para depois de serem realizadas as provas bioqumicas e sorolgicas. Os meios de cultura lquidos (tambm chamados de caldos) so utilizados para a promoo da multiplicao das bactrias, sendo os mais utilizados o tetrationato e o selenito (para a coprocultura). So utilizados apenas para aumentar o nmero de bactrias existentes na amostra, permitindo assim um resultado mais exato e eficaz. As enterobactrias no so muito exigentes quanto ao meio de cultura. Geralmente os meios mais utilizados so aqueles que so impedientes para outras bactrias, principalmente as G+. Os meios slidos no seletivos so o gar MacConkey e o gar-Eosina-Azul-de-Metileno (gar Teague). Os meios seletivos para algumas das bactrias enteropatognicas, como a Shigella sp, a Salmonella sp e a Yersinia enterocolitica, impedem o crescimento da maioria das enterobactrias encontradas normalmente nos intestinos, facilitando assim o isolamento das enteropatognicas quando se realiza a coprocultura (cultura de fezes). Esses meios seletivos slidos seriam o gar SS, o gar-Verde Brilhante (VB) e o gar Wilson-Blair. Todos os meios slidos utilizados para o cultivo das enterobactrias contm um ou mais acares que, quando metabolizados, formam produtos que acidificam o meio, o que detectado pela presena de um indicador de pH. Por exemplo, as bactrias que fermentam lactose formam colnias vermelhas na presena do indicador vermelho neutro. Por outro lado, se a enterobactria produz H2S e o meio contm ferro, as colnias sero de cor escura, devido a formao de sulfeto de ferro. Segue uma tabela contendo os principais meios de cultura utilizados no isolamento das enterobactrias.

Meios de cultura mais comumente utilizados para o isolamento de enterobactrias Meio MacConkey Teague SS gar-VB Wilson-Blair Impediente para: Bactrias Gram-positivas Bactrias Gram-positivas Bactrias Gram-positivas microbiota intestinal normal Bactrias Gram-positivas microbiota intestinal normal Bactrias Gram-positivas microbiota intestinal normal e e e germes germes germes Indicado no isolamento de: Enterobactrias em geral Enterobactrias em geral da Shigella sp, Salmonella sp, Y. enterocolitica da Salmonella sp (exceto S. typhi) da S. typhi

Aps o isolamento das enterobactrias em Placa de Petri, realiza-se a sua identificao atravs de provas bioqumicas, seguidas ou no de provas sorolgicas. A srie bioqumica composta de doze provas analticas, das quais algumas podem ser feitas em conjunto num nico tubo de ensaio, e outras devem ser feitas separadamente. Essas provas verificam basicamente a presena de determinadas enzimas, emisso de gs e motilidade. A partir da comparao dos resultados de todas as provas, verifica-se o gnero bacteriano analisado. A srie bioqumica clssica composta por 8 tubos de ensaio, cada um contendo um determinado meio de cultura com caractersticas analticas diferentes.

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Provas Bioqumicas para Diagnstico Presuntivo de Enterobactrias

TSI (Triple-Sugar-Iron): O meio TSI se encontra inclinado dentro de um tubo de ensaio. Esse tubo permite visualizar: - Produo de gs: (+) formao de bolhas e/ou arrebentamento do meio - Presena de H2S: (+) enegrecimento do meio - Fermentao de glicose, sacarose e/ou lactose: quando no ocorre fermentao, o meio permanece com pice e base vermelhos; Quando Glicose (+) e Sacarose/Lactose (-), o meio possui pice vermelho e base amarela; Quando ocorre fermentao total (Glicose, Sacarose e Lactose), o meio possui pice e base amarelas.

MIO (Motilidade, Indol e Ornitina): O meio MIO um meio semi-slido no inclinado que permite avaliar: - Motilidade: (+) presena de turbidez, ou crescimento alm da semeadura. - Indol: aps incubao, adiciona-se de 1 a 2 gotas de reativo de Kovacs superfcie do meio. A prova positiva quando ocorre a formao de um anel de cor vermelha na superfcie do meio. - Ornitina: (+) colorao amarela do meio.

VM (Vermelho de Metila): um caldo que possui glicose e indicador de pH. Aps incubao, verifica-se a colorao do meio. Vermelho= pH 4,4 (+); Amarelo= pH 6,0 (-).

VP (Voges-Proskauer): um caldo que avalia a fermentao butilenogliclica. Aps incubao, adiciona-se o reativo de Voges-Proskauer e verifica-se a colorao instantaneamente. Vermelho (+).

Citrato: um meio de cultura que avalia a metabolizao do citrato. Azul (+) e Verde (-)

Urease: um meio de cultura que avalia a metabolizao da uria. Pink (+)

Lisina descarboxilase (LDC): um meio de cultura que avalia a metabolizao da lisina. Roxa (+) e Amarela (-)

Fenilalanina desaminase (FAD): um meio de cultura que avalia a metabolizao da fenilalanina. Verde (+)

Existem dois meios para a identificao de enterobactrias amplamente utilizados em laboratrio de anlises clnicas, por serem mais prticos. Eles so o EPM-MILI (Probac) e Rugai (Newprov).

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EPM-MILI (Probac)
Meio EPM: este meio uma modificao do meio de Rugai e Arajo, e contm os testes de produo de gs por fermentao da glicose, produo de H2S, metabolizao da uria e do triptofano (LTD). Meio MILI: so determinadas a motilidade, produo de indol e metabolizao da lisina. Os sete testes do EPM-MILI associados fermentao da lactose, observada nas placas de isolamento (gar SS ou MacConkey), permitem a identificao presuntiva das seguintes enterobactrias: E. coli, Salmonella sp, Shigella sp e Yersinia enterocolitica. Semeadura: Tocar com o fio de platina uma colnia bem isolada e inocular nos 2 meios. Para inocular o meio EPM, introduzir at o fundo do tubo e ao retir-la, semear a superfcie do meio. A inoculao do meio MILI deve se feita por picada central, introduzindo o fio de platina at o fundo do tubo. Incubar os tubos com as tampas semi-rosqueadas a 37C e fazer leitura aps 18 a 24 horas. Leitura e Interpretao: Meio EPM: Produo de gs: aparecimento de bolhas ou deslocamento do meio de cultura para cima. Produo de H2S: enegrecimento do meio em qualquer grau. Metabolizao da uria: aparecimento de cor azul ou verde-azulada (reao fraca) que estende para a base do meio, envolvendo-o totalmente ou no. LTD: aparecimento de cor verde-escuro na superfcie do meio; quando a reao negativa, a superfcie do meio adquire colorao azul ou amarela (rara). Meio MILI: Motilidade: a bactria mvel cresce alm da picada, turvando parcial ou totalmente o meio; a bactria imvel cresce somente na linha de semeadura. Metabolizao da lisina: se a lisina metabolizada, o meio adquire colorao arroxeada; quando o aminocido no metabolizado, o meio se torna amarelo nos seus 2/3 inferiores. Produo de indol: aps a leitura dos testes de motilidade e lisina, adicionar 3 a 4 gotas do reativo de Kovacs superfcie do meio e agita levemente; quando a bactria produz indol, o reativo adquire cor rosa ou vermelha; quando no produz, o reativo mantm sua cor original.

Caractersticas das enterobactrias nos meios EPM-MILI Meio EPM


Lactose (placa de isolamento) Shigella (dysenteriae, flexneri e boydii) Shigella sonnei EIEC +/EPEC, ETEC e outras Salmonella sp Yersinia enterocolitica Aspecto geral Gs H2S Urease LTD

Meio MILI
Motilidade Indol Lisina

Base amarela e superfcie Ausncia de bolhas de gs enegrecimento. Base amarela e superfcie Ausncia de bolhas de gs enegrecimento.

azul. e de azul. e de

-a

+/-

Base amarela, superfcie azul, com ou sem bolhas de gs. Ausncia de enegrecimento. Base amarela, superfcie azul. Presena de bolhas de gs. Ausncia de enegrecimento. Base amarela, superfcie azul. Presena de bolhas de gs e de enegrecimento. Meio azul na base e na superfcie. Ausncia de bolhas de gs e de enegrecimento.

+/-

+/-

+/-

-b

+/-

a) b)

Alguns sorotipos de Shigella flexneri e Shigella boydii produzem gs. A S. typhimurium lactose (+) raramente isolada atualmente.

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Meio de Rugai (Newprov)


Inoculao: Com o auxlio de um fio de platina, coletar a amostra da colnia a ser pesquisada e inocular atravs de picada at o fundo do tubo, realizando estrias na superfcie do meio de Rugai. Incubar em estufa a 36C por 24 horas. Leitura e Interpretao dos Resultados das Provas 1. Parte Superior (Meio de Rugai): cor original azul-esverdeada. pice podem ser realizadas as seguintes leturas: LTD - Reao positiva: Cor verde garrafa (o microrganismo LTD negativo) Cor marrom (o microrganismo LTD positivo) Fermentao da sacarose Reao positiva: cor amarela Produo de gs Reao positiva: formao de bolhas e/ou arrebentamento do meio Uria Reao positiva: cor azul intensa Produo de H2S Reao positiva: cor negra 2. Parte Inferior (Meio de Lisina): cor original ppura. Podem ser realizadas as seguintes leituras: Lisina: Reao positiva: qualquer cor diferente do amarelo Reao negativa: cor amarela Motilidade: Reao positiva: turvao do meio, qualquer crescimento alm da picada Reao negativa: crescimento apenas na picada 3. Tampa: pode ser realizada a seguinte leitura: - Indol Reao positiva: cor vermelha aps adio de uma gota de reativo de Kovacs no papel de filtro existente na parte interna da tampa. OBS.: Esta leitura deve ser realizada aps incubao. Aspecto bioqumico presuntivo (principais cepas) Microrganismo E. coli Shigella sp Salmonella sp Proteus sp Enterobacter sp Citrobacter sp Klebsiella sp Serratia sp Providencia sp
+ = prova positiva - = prova negativa

Indol + +/-/+ -/+ +

LTD + +

Sacarose Glicose + + V + + V + + + + + + + + +

Gs + + + + + V

Uria + + -

H2 S + + +/-

Lisina + + + + + -

Mot + + + + + + +

+/- = para a maioria das cepas a prova positiva -/+ = para a maioria das cepas a prova negativa V = prova varivel podendo ser positiva ou negativa

Esta tabela vlida somente para o meio de Rugai e este aspecto apresentado refere-se a amostras de perfil bioqumico tpico. Outros fatores como procedncia do material, resistncia a antimicrobianos, sorologia e provas bioqumicas adicionais devem ser necessrias para a o identificao final do microrganismo em questo. Neste meio, devido grande diversidade de substratos, pode ocorrer interferncia entre as reaes observadas. O microbiologista deve estar atento a este fato.

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ANTIBIOGRAMA (ATB)
Antibiogramas so bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade de bactrias frente aos antimicrobianos. A proposta primria deste teste guiar o clnico na escolha do agente apropriado para a terapia. Alm disso, estes testes so utilizados para avaliar in vitro a atividade de novos agentes.

ANTIMICROBIANOS
Os antimicrobianos compreendem: Agentes quimioterpicos: substncias qumicas sintetizadas em laboratrio Agentes antibiticos: molculas produzidas por seres vivos como bactrias e fungos. (Ex: Penicilinas, produzidas pelo Penicillium sp e Cefalosporinas produzidas pelo Cephalosporium sp) Agentes antibiticos semi-sintticos: molculas parcialmente sintetizadas por microrganismos, concludas em laboratrio

Os quimioterpicos e antibiticos podem ter ao antibacteriana, antifngica e antiviral. Esta ao pode levar inibio do crescimento, inativao ou morte do agente infeccioso.

MECANISMOS DE AO DOS ANTIBACTERIANOS


Os antibiticos e os quimioterpicos interferem com diferentes atividades da clula bacteriana, possuindo efeito bactericida ou bacteriosttico, sendo ambos efeitos extremamente eficientes. As interaes dos antibacterianos com a clula bacteriana podem ocorrem no nvel da parede celular, membrana citoplasmtica, ribossomos, DNA e metabolismo intermedirio. Antibacterianos que atuam na parede celular - agem bloqueando a etapa final da sntese da parede celular, o que quase sempre resulta na morte da bactria. Alm disso, eles aumentam indiretamente a sntese das autolisinas. Antibacterianos que atuam na membrana citoplasmtica - estes antibiticos se intercalam com as molculas da membrana e a desorganizam. Isso permite a sada de componentes celulares e a morte da bactria. Antibacterianos que atuam nos ribossomos - agem impedindo a sntese protica da clula bacteriana, ou provocando a sntese de protenas no-funcionais. Antibacterianos que atuam no DNA - agem quebrando a molcula de DNA, bloqueando sua transcrio, ou inibindo a enzima DNA girase (promove o enrolamento da molcula de DNA, para que ocupe menos espao na clula). Antibacterianos que atuam no metabolismo intermedirio - atuam bloqueando processos metablicos da clula bacteriana.

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PRINCIPAIS GRUPOS DE ANTIMICROBIANOS


BETALACTMICOS - Nesta categoria so includas as Penicilinas, as Cefalosporinas, os Monobactmicos e as Carbapenemas. Todos estes possuem em comum o anel betalactmico (composto por 3 tomos de carbono e 1 de nitrognio). As Betalactamases so enzimas que degradam os antibiticos da classe dos betalactmicos. Essas enzimas so produzidas por vrios grupos de bactrias, conferindo-lhes resistncia aos antibiticos desse grupo. Penicilinas Foi o primeiro antibitico descoberto (Fleming, 1929), e continua sendo at hoje um dos melhores antibacterianos disponveis, se considerarmos sua alta atividade em bactrias sensveis e sua baixa toxicidade para o ser humano. Exemplos de Penicilinas: Ampicilina e Amoxacilina (largo espectro), Meticilina e Oxacilina (pequeno espectro, resistentes as betalactamases), Carbenicilina e Piperacilina (Penicilinas Antipseudomonas ativas sobre P. aeruginosa, Proteus sp indol-positivos, Klebsiella sp e Enterobacter sp. Cefalosporinas So divididas em 3 grupos: Cefalosporinas de primeira gerao (ativas contra bactrias G+ e G-, com algumas excees); Cefalosporinas de segunda gerao (mais resistentes as betalactamases das bactrias G- e boa atividade sobre enterobactrias) e Cefalosporinas de terceira gerao (ainda mais resistentes inativao pelas betalactamases das bactrias G-; so muito utilizadas em infeces intrahospitalares). Carbapenemas A Imiprenema tem praticamente atividade contra todos os cocos G+ e G- e contra bacilos G+ e G-, aerbios e anaerbios. Monobactmicos O mais utilizado o Aztreonama. Ele possui grande atividade sobre G- e nenhuma atividade sobre G+ e anaerbios.

AMINOGLICOSDEOS - Possuem atividade contra bactrias G- aerbias e contra estafilococos. Principais agentes: Estreptomicina, Canamicina, Neomicina e Gentamicina. GLICOPEPTDEOS - So ativas sobre bactrias G+, tendo maior indicao no tratamento de infeces provocadas por S. sureus e S. epidermidis resistentes a oxalicina. A resistncia adquirida a esses medicamentos um fato raro, e por isso so muito utilizadas em infeces hospitalares. Principais agentes: Vancomicina e Teicoplanina. TETRACICLINAS - Antibacterianos de largo espectro, embora a resistncia adquirida seja um fato muito freqente hoje em dia. CLORANFENICOL - Possui amplo espectro de ao, embora seja alto o ndice de G+ e Gresistentes ao Cloranfenicol. altamente ativo frente bactrias anaerbias estritas. a droga de primeira escolha no tratamento da febre tifide, e na meningite causada pelo Haemophilus influenzae. MACROLDEOS Age sobre G+, cocos G-, espiroquetas e alguns bacilos G-. Principal agente: Eritromicina. LINCOSAMINAS - Ativas sobre estafilococos e estreptococos. Principais agentes: Lincomicina e Clindamicina. QUINOLONAS - Ativas sobre enterobactrias, principalmente as que causam infeces no trato urinrio. Principais agentes: cido Nalidxico e Oxolnico, bem como os Flor Derivados, Norfloxacino e Ciprofloxacino. SULFONAMIDAS - Drogas de largo espectro que so pouco utilizadas devido existncia de agentes antimicrobianos mais eficazes. utilizada em associaes. POLIPEPTIDEOS Principais agentes: Bacitracina e Polimixina METRONIDAZOL - Quimioterpico que vem sendo utilizado no tratamento de infeces por germes anaerbios. efetivo contra Gardnerella vaginalis, Campylobacter fetus e Helicobacter pylori.

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RESISTNCIA BACTERIANA A DROGAS


As bactrias podem ser classificadas em sensveis antimicrobianos. A resistncia de uma bactria pode ser: e resistentes aos

Natural: Todas as amostras de uma espcie so resistentes. Adquirida: Somente parte das amostras de uma espcie so resistentes. A resistncia adquirida um fenmeno espontneo da bactria, sendo os antimicrobianos apenas agentes seletores de amostras resistentes. Geralmente a resistncia adquirida d-se por alteraes genticas ou alteraes dos mecanismos qumicos das bactrias.

A capacidade de adquirir resistncia, bem como o grau de resistncia adquirida, propriedade bastante varivel entre as bactrias. Algumas raramente adquirem resistncia e outras adquirem com grande freqncia, podendo a resistncia ser moderada ou intensa. Quando moderada, a bactria pode ser eliminada do organismo por um simples aumento da dose de antimicrobiano; quando intensa, o antimicrobiano no pode ser utilizado. A capacidade das principais bactrias patognicas de adquirirem resistncia apresentada na tabela abaixo:

Bactria Staphyococcus sp Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Enterobacteriaceae Pseudomonas sp Haemophilus influenzae Anaerbios Micobactrias Espiroquetdeos

Grau de capacidade +++ a a ++ ++++b +++ ++ c ++

a. Adquirem resistncia com alguma facilidade para certos Antibiticos, mas no para as penicilinas. b. A S. typhi raramente se torna resistente. c. O Bacteroides fragilis adquire resistncia com facilidade. a ++++, graus de capacidade.

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DETERMINAO DA SENSIBILIDADE DAS BACTRIAS AOS ANTIMICROBIANOS


Uma bactria considerada sensvel a um antimicrobiano quando seu crescimento inibido in vitro por uma concentrao 3, ou mais vezes, inferior quela que o antimicrobiano atinge no sangue. Se a concentrao inibitria in vitro igual ou superior quela que o antimicrobiano atinge no sangue, a bactria considerada resistente. A bactria moderadamente resistente aquela cujo crescimento inibido por concentraes intermedirias. A concentrao inibitria dos antimicrobianos pode ser determinada atravs de mtodos diretos (mtodos de diluio) ou indiretos (difuso em placa). O mtodo de difuso em placa tem por base dois fatos bem estabelecidos: 1- Quando se coloca um disco de papel impregnado com um antimicrobiano na superfcie de um meio de cultura slido, j semeado com uma bactria, o crescimento bacteriano poder ser inibido formando-se um halo de inibio em torno do disco, cujo dimetro varia de acordo com a velocidade de difuso do antimicrobiano e a sensibilidade da bactria. Se a bactria for muito resistente, no haver halo de inibio. 2- O dimetro do halo de inibio inversamente proporcional concentrao inibitria mnima do antimicrobiano, isto , quanto maior o dimetro do halo, menos a concentrao inibitria. Em concluso, tomando-se por base o tamanho do halo de inibio, possvel inferir se a bactria sensvel, moderadamente resistente ou resistente a este antimicrobiano, comparando-se os halos obtidos com tabelas padronizadas internacionalmente.

Tcnica do Mtodo de Difuso em Placa:


1Sature um swab de algodo com a suspenso bacteriana. Remova o excesso de umidade girando o swab contra a parede do tubo.

2-

Semeie a suspenso sobre a superfcie estril de uma placa contendo gar MellerHinton, utilizando sucessivamente trs direes para obter um inculo uniformemente espalhado sobre toda a superfcie do gar.

3-

Distribua os discos de antibitico, sendo cada um de um antimicrobiano diferente, sobre a superfcie do gar inoculado. Deixe uma distncia de aproximadamente 1 cm entre a borda da placa e o disco. Pressione levemente os discos para que no se desprendam durante a incubao. Incube as placas por 24 horas a 37C. Atravs da anlise dos resultados poderemos classificar os microrganismos testados em: resistente, intermedirio, moderadamente sensvel, e sensvel, dependendo da formao ou no de halo inibitrio e tambm de seu dimetro. No caso de formao de um halo inibitrio, este deve ter seu dimetro medido, e a medida encontrada deve ser comparada com tabelas padronizadas. De modo geral, estas tabelas determinam medidas de dimetro, e dessa forma a medida encontrada em cada caso pode ento ser enquadrada em uma das quatro categorias supracitadas.

45-

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MICOLOGIA
Os fungos so seres eucariticos pertencentes ao Reino Fungi, que podem possuir um s ncleo (leveduras) ou vrios ncleos (filamentosos ou bolores). Eles podem ser saprfitas (nutrem-se de matria orgnica morta) ou parasitrios (nutrem-se de matria orgnica viva). Um fungo formado estruturalmente por: Parede celular: estrutura rgida que protege a clula de choques osmticos e mantm sua forma. Membrana citoplasmtica: atua como uma barreira entre os meio exterior e interior da clula fngica, e realiza o transporte de solutos alm de outras funes. Ncleo: contm genoma fngico composto por DNA, RNA e protenas. Ribossomos: sntese protica. Mitocndria: produo de energia. Retculo endoplasmtico: produo de protenas e lipdeos. Aparelho de Golgi: armazenam substncias desprezadas pela clula, glicognio e lipdeos. Lomassomos: corpculos de funo ainda desconhecida. Para que um fungo se desenvolva, eles necessitam de algumas substncias como: O2, H2O, carboidratos simples (glicose, sacarose, maltose, amido, celulose), substncias nitrogenadas e vitaminas. Os meios de cultura fngica mais utilizados so o gar Sabouraud e o gar batata. Em meios de cultura, dependendo das condies nutricionais e de temperatura, os fungos podem se desenvolvem e obter morfologias diferentes, como acontece no dimorfismo fngico (capacidade fngica de se desenvolver sob a forma de levedura e/ou bolor). Podem ser encontradas duas formas de manifestao fngica: Leveduriforme: colnias pastosas ou cremosas, formadas por microorganismos unicelulares que cumprem funes vegetativas e reprodutivas. Filamentosas / bolores: colnias algodanosas, aveludadas e pulverulentas, formadas por microorganismos multicelulares em forma de hifas (conjunto de hifas = miclio).

Colnias leveduriformes

Leveduras

Colnias filamentosas

Hifa septada e condios

Colgio Dr. Clvis Bevilcqua

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MICOSES
MICOSES SUPERFICIAIS e CUTNEAS Ptirase Versicolor (micose de praia) dermatose cosmopolita, que produz aparecimento de manchas esbranquiadas pela pele, principalmente no tronco e abdmen. causada pela Malassezia furfur.

Tneas (Tinhas) causadas pelos gneros Microsporum sp, Trichophyton sp e Epidermophyton sp. Dependendo do local onde o dermatfito se instala, esse tipo de micose recebe um nome (Tinea cruris regio inguinal; Tinea corporis corpo; Tinea barbae barba; Tinea manus mos; Tinea pedis ps; Tinea unguium unha; Tinea capitis couro cabeludo).

Candidase pode acometer boca, garganta, couro cabeludo, vagina, dedos, unhas, brnquios, pulmes, trato gastrintestinal ou fungemia. Seu principal agente a espcie Cndida albicans.

MICOSES SUBCUTNEAS Os agentes de micoses subcutneas vivem em estado saproftico no solo, nos vegetais e nos animais de vida livre, sendo parasitas acidentais do homem e dos animais, que se infectam por ocasio de um traumatismo na pele, com material contaminado. Em geral, a micose se localiza na pele e tecido subcutneo, prximo ao ponto de inoculao, sendo rara sua disseminao.

Esporotricose Causada pelo Sporothrix schenkii, gera formao de pequenos tumores ao longo dos vasos linfticos, com supurao e ulcerao.

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Cromomicose Causada por vrios fungos, dentre os quais, o mais comum o Fonsecaea pedrosoi. Gera formao de ndulos, leses papulosas, eritmatodescamativas, verrucosas, com ou sem ulcerao.

Doena de Jorge-Lobo Causada pelo Lacazia loboi, que ainda no foi cultivado. Gera leses quelides, multilobuladas, ulceradas, endurecidas, localizadas ou disseminadas.

MICOSES PROFUNDAS

Criptococose infeco subaguda ou crnica de comprometimento pulmonar, sistmico e, principalmente, do sistema nervoso central, causada pelo Cryptococcus neoformans

Paracoccidioidomicose doena de localizao sistmica, grave, que se manifesta por diversas formas clnicas, causada pelo Paracoccidioides braziliensis.

Histoplasmose - uma doena fngica granulomatosa, causada pelo Histoplasma capsulatum.

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DIAGNSTICO LABORATORIAL MICOLGICO


EXAME DIRETO - Recomendado para a maioria das amostras. - As amostras de consistncia lquida e clara devero so examinadas ao MO, com soluo salina. - Os materiais densos ou opacos (escamas de pele, raspados de unhas e plos), devero ser emulsionados em uma gota de KOH a 10% sobre lmina de vidro. Aquecer a mistura suavemente ao bico Bunsen. Cobrir com lamnula e examinar aps 15 minutos. As hifas e leveduras resistem digesto do KOH. A observao deve ser feita contra fundo homogneo. O KOH dissolve a queratina e intensifica o contraste das estruturas fngicas com outros materiais presentes na preparao.

MICROCULTIVO DE BOLORES Recomendado para a identificao e diferenciao fngica, atravs da visualizao de hifas. Utilizar placas de Petri contendo lminas dispostas sobre um basto de vidro. Com todo cuidado de assepsia, coloque um pequeno quadrado (1 cm) de gar Sabouraud, sobre a lmina. Com ala de platina, retire um pequeno fragmento de uma colnia escolhida (placa de fungo do ambiente) e semeie os lados do gar. Coloque uma lamnula estril sobre o gar e gua destilada estril na placa para evitar dessecamento do meio. Feche a placa e deixe temperatura ambiente. Quando houver desenvolvimento satisfatrio, retire a lamnula e o fragmento do meio de cultura. Coloque numa lmina, uma gota de corante lactofenol azul algodo e a lamnula em cima. Examinar ao microscpico e identificar as hifas.

AULA PRTICA MICOLOGIA:


Pegar uma placa de Petri (j preenchida com o meio de cultura) e lev-la para casa. Deixar essa placa aberta durante 24 horas em um local da casa (que seja escolhido pelo estudante), fechando-a e lacrando-a com a fita adesiva logo que o tempo se esgotar. Aps aproximadamente uma semana, deve-se retornar ao laboratrio com a placa, e realizar os seguintes procedimentos: Procedimento 1 Exame macroscpico das colnias, com descrio. Procedimento 2 Exame direto. Procedimento 3 Microcultivo.