2019 DOKKEDAL-SILVA, VINICIUS - Mestrado

VINÍCIUS DOKKEDAL SILVA
EFEITOS DO USO ASSOCIADO DA COCAÍNA E CLONAZEPAM NO

COMPORTAMENTO TIPO ANSIOSO, SONO E NEUROGÊNESE EM
RATOS
Dissertação apresentada à Universidade Federal

de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para
obtenção do título de Mestre em Ciências
São Paulo
2019
EFEITOS DO USO ASSOCIADO DA COCAÍNA E CLONAZEPAM NO

COMPORTAMENTO TIPO ANSIOSO, SONO E NEUROGÊNESE EM
RATOS
Dissertação desenvolvida durante o curso de Pós-

graduação em Psicobiologia, Departamento de
Psicobiologia, Disciplina de Medicina e Biologia do
Sono e apresentada à Universidade Federal de São
Paulo – Escola Paulista de Medicina, como requisito
para obtenção do título de Mestre em Ciências pelo
Programa de Pós-graduação em Psicobiologia
Orientador:
Profa. Dra. Monica Levy Andersen
Coorientador:
Prof. Dr. José Carlos Fernandes Galduróz
São Paulo
2019
FICHA CATALOGRÁFICA
Dokkedal Silva, Vinícius

Efeitos do Uso Associado da Cocaína e Clonazepam no Comportamento Tipo Ansioso, Sono e
Neurogênese em Ratos /Vinícius Dokkedal Silva – São Paulo, 2019. 80 p.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa
de Pós-graduação em Psicobiologia.
Título em inglês: Effects of the Associated Use of Cocaine and Clonazepam in the Anxiety-like
Behavior, Sleep and Neurogenesis in Rats
1. Cocaína. 2. Clonazepam. 3. Sono. 4. Comportamento. 5. Neurogênese
2. Cocaine. 2. Clonazepam. 3. Sleep. 4. Behavior. 5. Neurogenesis
Comissão de Ética ao Uso de Animais (CEUA) #7097040716
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA
Chefe do Departamento de Psicobiologia

Prof. Dr. José Carlos Fernandes Galduróz
Coordenadora do Curso de Pós-graduação

Profa. Dra. Vânia D’Almeida
Chefe da Disciplina de Medicina e Biologia do Sono

iii
EFEITOS DO USO ASSOCIADO DA COCAÍNA E
CLONAZEPAM SOBRE O COMPORTAMENTO TIPO
ANSIOSO, SONO E NEUROGÊNESE EM RATOS
Presidente da Banca
Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP (São Paulo, SP)
Banca Examinadora – Titulares

Prof. Dr. Ricardo Borges Machado
Universidade Ibirapuera – UNIB (São Paulo, SP)
Prof. Dr. Jorge Camilo Flório
Universidade de São Paulo – USP (São Paulo, SP)
Profa. Dra. Dalva Lúcia Rollemberg Poyares
Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP (São Paulo, SP)
Banca Examinadora – Suplentes

Prof. Dr. Fúlvio Alexandre Scorza
Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP (São Paulo, SP)
iv
Esta dissertação foi realizada no Departamento de Psicobiologia, área de Medicina e
Biologia do Sono, da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de
Medicina, com o apoio financeiro da Associação Fundo de Incentivo à Pesquisa
(AFIP), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal Nível Superior – Brasil (CAPES)
– Código de Financiamento 001, e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico
e Tecnológico (CNPq) (processo #133397/2017-3).
v
Não é vergonha cair, vergonha é não se levantar.
(Provérbio Dinamarquês)
“Sucesso não é o final, falhar não é fatal: é a coragem para continuar que conta.”
(Winston Churchill)
vi
Dedicatória
Aos meus pais, Clidemar Ramos Silva Júnior e Olga
Cristina Dokkedal Silva. Vocês foram a luz que me
guiou por toda a vida e Mestrado adentro, mesmo nos
momentos mais escuros. Eu não sei como agradecer
o suficiente. Amo vocês.
vii
Agradecimentos
Partindo-se do pressuposto que uma força maior existe e rege os aspectos do
mundo natural, para ela vai meu primeiro agradecimento. E se essa força maior
colocou as pessoas abaixo em meu caminho, também vai meu segundo.
Aos meus pais, Clidemar Ramos Silva Júnior e Olga Cristina Dokkedal
Silva, por além de serem o motivo de eu existir, são o motivo de eu continuar aqui,
firme e forte, no fim desta trajetória. Vocês aguentaram cada vez em que eu quis jogar
tudo para o alto, cada vez que eu me desesperei, e mesmo com tudo isso, acreditaram
em mim. Eu ainda sou muito pequeno como pessoa, quando me coloco ao lado de
vocês.
À minha namorada, Karla Menezes e Vasconcelos, que também teve uma
paciência interminável com todas as etapas deste projeto e todos os dias e noites que
não pude estar presente. Não sei para onde a vida está nos levando, mas espero que
seja para o mesmo caminho, a percorrermos juntos.
À Monica Levy Andersen, orientadora e professora que me ensinou a
importância da dedicação ao trabalho e de expandir meus horizontes, e teve um papel
importantíssimo na minha formação como pesquisador.
Ao meu Coorientador, José Carlos Fernandes Galduróz, que foi uma fonte
de admiração e inspiração, e um grande conselheiro durante todo o meu Mestrado.
Aos meus tios, Anne Lígia Dokkedal Bosqueiro e José Roberto Bosqueiro
que foram as duas primeiras pessoas a me dar algum Norte quando escolhi começar
essa estrada difícil e árida que é a ciência, e ainda estão aqui, me apoiando.
viii
Aos meus padrinhos Mário Ernesto Silva e Beatriz Erlenne Dokkedal, e à
minha querida avó Erlenne Jensen Dokkedal, que mesmo com a distância, estiveram
aqui torcendo por mim e vibrando com cada pequena conquista que veio ao longo
dessa trajetória.
À minha melhor amiga, Thaís Bianchini Moretti Caprara. Somos irmãos de
coração, e um compartilhou com o outro seus melhores e piores momentos. Sua
amizade foi uma das coisas mais valiosas que a vida me proporcionou.
A todos os amigos da USP, sejam eles os 010, 011, 012 e assim por diante.
Estamos distantes fisicamente, mas vocês estão no meu coração.
Ao Prof. Sergio Tufik, que apoiou o desenvolvimento deste estudo e é uma
fonte inesgotável de inspiração para aqueles que trabalham com pesquisa, sempre
nos motivando a continuar em fascínio com a ciência.
Ao grupo Progressão, meu grupo de pesquisa, por todo o apoio e por me
ajudar a crescer como pesquisador ao longo desses 2 anos. Especialmente à Lenise,
que me orientou nos meus primeiros passos dentro deste grupo, à Rachel, pela
enorme cumplicidade durante esse período, e ao Guilherme, pelo companheirismo
durante diversas etapas do projeto.
À Laís Fernanda Berro, que mesmo na outra ponta do continente, me ajudou
até o último momento com conselhos valiosos para melhorar essa tese.
Ao Dunga, Ricardinho, Zé, Vinícius, Gilbertinho e Andrea, por terem me
ajudado com os meus experimentos, e durante todo esse processo, terem me
ensinado coisas valiosas sobre o meu trabalho.
ix
Ao pessoal do Centro de Microscopia Eletrônica (CEME), Dra. Rita Sinigaglia,
o André, o Marçal, a Paty e o Lú, por terem me acolhido mesmo com minha rápida
passagem pelo Centro durante o projeto, meu muito obrigado.
Aos membros de minha Banca de Qualificação e Defesa por aceitarem o
convite para participar dessas etapas, e pelas inestimáveis dicas que ajudaram a
melhorar este projeto.
Gostaria de dedicar este último parágrafo aos 90 ratos que participaram deste
experimento, por terem sido a base e o cerne deste projeto. Estes animais foram a
dádiva mais valiosa de meu Mestrado. Não posso agradecer à altura por terem cedido
o único bem que possuíam durante este projeto, a vida. Mas que eles sejam a
demonstração de como a pesquisa com animais é importante para todos nós.
x
Resumo
Introdução: O uso de substâncias psicotrópicas de forma recreativa é um problema
crescente, tanto na sociedade brasileira, como ao redor do mundo. Recentemente, o
uso do clonazepam para minimizar efeitos colaterais do uso da cocaína tem sido
relatado. Objetivos: Avaliar os efeitos da combinação da cocaína e do clonazepam
sobre o comportamento tipo-ansioso, o sono e a neurogênese em ratos. Métodos: No
experimento 1, os animais foram submetidos a 16 dias de tratamento com diferentes
doses de cocaína e clonazepam, e tiveram seu comportamento avaliado em campo
aberto e labirinto em cruz elevado, antes e depois da etapa de tratamento. No
experimento 2, os animais foram tratados por 16 dias com cocaína, clonazepam ou
ambas as drogas, recebendo doses escolhidas com base nos resultados do
experimento 1. Os efeitos agudos sobre o sono foram avaliados durante o primeiro dia
de tratamento. No dia seguinte ao término dos tratamentos, os animais passaram por
testes para avaliação do comportamento tipo-ansioso. Após estes procedimentos, os
animais foram submetidos à perfusão transcardíaca e tiveram seus cérebros
coletados para análise da neurogênese no giro denteado do hipocampo. Resultados:
No experimento 1, as doses que provocaram aumento mais significativo nos
comportamentos tipo-ansioso foram as de 1,25 mg/kg para o clonazepam e 15 mg/kg
para a cocaína. No experimento 2, os testes comportamentais encontraram alterações
nas atividades locomotora e exploratória. Os animais tratados de forma conjunta com
cocaína e clonazepam apresentaram, no registro de sono agudo, redução no sono
REM durante a fase clara e aumento da latência para início do sono REM, indicando
alterações na arquitetura do sono, o que foi observado no grupo tratado apenas com
cocaína. O grupo tratado exclusivamente com clonazepam não apresentou diferenças
significativas quanto a esses parâmetros. As análises imunohistoquímicas não
obtiveram resultados significativos. É possível que outros fatores participem das vias
pelas quais a cocaína e o clonazepam afetam esse processo, e modulem os efeitos
que ambas as substâncias podem ter na neurogênese. Conclusões: Os resultados
deste estudo mostram que a interação entre cocaína e clonazepam reduz o sono REM
em modelos animais, afetando a arquitetura do sono, e aumenta a frequência de
comportamentos tipo-ansioso, relacionados à instauração da dependência e à
síndrome de abstinência.
Palavras-chave: cocaína; clonazepam; comportamento tipo-ansioso; sono;
neurogênese.
xi
Abstract
Introduction: The recreational use of psychotropic substances is a growing problem
in the Brazilian society and around the world. Recently, the use of clonazepam to
ameliorate side-effects from cocaine use has been reported. Objectives: To evaluate
the effects of the combination of cocaine and clonazepam in the anxiety-like behavior,
sleep and neurogenesis in rats. Methods: In experiment 1, animals were treated for
16 days with different doses of cocaine and clonazepam and had their behavior
evaluated in open field and elevated plus-maze tests before and after the treatment
phase. In experiment 2, animals were treated for 16 days with cocaine, clonazepam or
both drugs, receiving doses based in the results from experiment 1. The acute effects
on sleep were evaluated during the first day of treatment. At the end of the treatment
phase, animals underwent tests for evaluation of anxiety-like behavior. After these
procedures, rats were subjected to transcardial perfusion and their brains were
collected for analysis of neurogenesis in the dentate gyrus of the hippocampus.
Results: In experiment 1, the doses which elicited the appearance of more
pronounced anxiety-like behaviors were 1.25 mg/kg of clonazepam and 15 mg/kg of
cocaine. In experiment 2, the behavioral tests found alterations in locomotor and
exploratory activities, indicating the emergence of withdrawal syndrome and
consequently, anxiety-like behavior. Animals treated with both cocaine and
clonazepam presented, in acute sleep recording, reduction of REM sleep during the
light phase and increase in REM sleep onset latency, indicating alterations in sleep
architecture, which was also observed in the group treated solely with cocaine. The
group treated solely with clonazepam did not present significant differences regarding
these parameters. Neurogenesis analyses did not find significant results. It is possible
that other factors participate in the pathways by which cocaine and clonazepam affect
this process and modulate the effects that both substances can have in neurogenesis.
Conclusions: The results from this study show that the interaction between cocaine
and clonazepam can have negative effects on different aspects of the organism in an
animal model, justifying more in-depth studies about this interaction.
Keywords: cocaine; clonazepam; anxiety-like behavior; sleep; neurogenesis.
xii
Lista de Figuras
Figura 1 Delineamento experimental do protocolo de análise comportamental em 2
momentos (Experimento 1) ........................................................................................27
Figura 2 Imagem esquemática do campo aberto ......................................................28
Figura 3 Imagem esquemática do labirinto em cruz elevado ....................................28
Figura 4 Delineamento experimental do protocolo para análise do sono,
comportamento e neurogênese em ratos (Experimento 2) ........................................30
Figura 5 Imagem representativa de um rato durante teste comportamental em campo
aberto .........................................................................................................................32
Figura 6 Imagem representativa de um rato durante teste comportamental em labirinto
em cruz elevado ........................................................................................................32
Figura 7 Imagem representativa da região de interesse para avaliação da
neurogênese do giro denteado do hipocampo (hemisfério esquerdo) .......................35
Figura 8 Imagem representativa da região de interesse para avaliação da
neurogênese do giro denteado do hipocampo (hemisfério direito) ...........................35
Figura 9 Resultados comportamentais para os experimentos de análise
comportamental em 2 momentos (Experimento 1) ....................................................39
Figura 10 Resultados comportamentais para o teste comportamental em campo
aberto realizado durante o Experimento 2 .................................................................40
Figura 11 Resultados comportamentais para o teste comportamental em labirinto em
cruz elevado realizado durante o Experimento 2 .......................................................42
xiii
Figura 12 Resultados para o registro de sono após tratamento agudo durante fase de
claridade ....................................................................................................................43
Figura 13 Resultados para o registro de sono após tratamento agudo durante fase de
escuridão ...................................................................................................................44
Figura 14 Resultados obtidos para número de células em proliferação/mm 3 no giro
denteado do hipocampo .............................................................................................47
xiv
Lista de Tabelas
Tabela 1 Lista de variáveis analisadas no campo aberto...........................................28
Tabela 2 Lista de variáveis analisadas no labirinto em cruz elevado .........................29
Tabela 3 Lista de variáveis analisadas no registro de sono agudo............................33
Tabela 4 Médias dos parâmetros comportamentais avaliados em campo aberto.......45
Tabela 5 Médias dos parâmetros comportamentais avaliados em labirinto em cruz
elevado.......................................................................................................................45
Tabela 6 Médias dos parâmetros de sono avaliados durante o registro agudo – fase
de claridade................................................................................................................46
Tabela 7 Médias dos parâmetros de sono avaliados durante o registro agudo – fase
de escuridão...............................................................................................................46
Tabela 8 Média de densidade celular por mm3 no giro denteado do
hipocampo..................................................................................................................47
Tabela 9 Média de densidade celular por mm3 no giro denteado do hipocampo,
considerando-se apenas animais com hipocampo completo.....................................47
xv
Lista de Abreviaturas
AR – número de episódios de avaliação de risco no labirinto em cruz elevado
AVC – acidente vascular cerebral
BrDU - 5-bromo-2’-deoxiuridina
CART - cocaine- and amphetamine-regulated peptide
CDK5 - cyclin dependent kinase-5
CLN – clonazepam
COC – cocaína
COCCLN – associação entre cocaína e clonazepam
CTRL – controle
CYP3A4 - cytochrome P450 family 3 subfamily A member 4
EntradaBA – número de entradas em braços abertos do labirinto em cruz
elevado
EntradaBF – número de entradas em braços fechados do labirinto em cruz
elevado
EPM – elevated plus-maze
FAM53B - family with sequence similarity 53, member B
GABA - gamma-aminobutyric acid
GLM – general linear model
GLzM – generalized linear model
xvi
LSD – least significant difference
MC – número de episódios de mergulhos de cabeça no labirinto em cruz elevado
NAc – núcleo accumbens
NAT2 - n-acetiltransferase 2
OF – open field
PermaBA – tempo de permanência em braços abertos do labirinto em cruz
elevado
PermaBF – tempo de permanência em braços fechados do labirinto em cruz
elevado
QC – número de quadrantes centrais percorridos no campo aberto
QP – número de quadrantes periféricos percorridos no campo aberto
REM – rapid eye movements
SLC6A4 - solute carrier family 6 member 4
SNC – sistema nervoso central
TPH – tryptophan hydroxylase
TempoQC – tempo de permanência nos quadrantes centrais do campo aberto
TempoQP – tempo de permanência nos quadrantes periféricos do campo aberto
TI – tempo de imobilidade
TREM – tempo de sono REM
TSI – tempo de sono intermediário
xvii
TTS – tempo total de sono
xviii
SUMÁRIO
Dedicatória .............................................................................................................................vii
Agradecimentos ...................................................................................................................viii
Resumo ...................................................................................................................................xi
Abstract ..................................................................................................................................xii
Lista de Figuras .....................................................................................................................xiii
Lista de Tabelas .....................................................................................................................xv
Lista de Abreviaturas ............................................................................................................xvi
1 Introdução .........................................................................................................................1
1.1 Panorama sobre substâncias psicoativas/psicotrópicas ..................................................2
1.2 Cocaína – aspectos gerais ..................................................................................................4
1.2.1 Desenvolvimento de dependência - neuroanatomia e bases genéticas .......................4
1.2.2 Efeitos da cocaína sobre o comportamento tipo-ansioso ............................................9
1.2.3 Efeitos da cocaína sobre o sono ...................................................................................10
1.2.4 Efeitos da cocaína sobre neurogênese .........................................................................11
1.3 Clonazepam - uso na sociedade e potencial de abuso .....................................................12
1.3.1 Efeitos do clonazepam sobre o comportamento tipo-ansioso .....................................14
1.3.2 Efeitos do clonazepam sobre o sono ............................................................................15
1.3.3 Efeitos do clonazepam sobre a neurogênese ...............................................................16
1.4 Associação entre cocaína e clonazepam: implicações para a saúde ............................... 17
2 Hipótese ............................................................................................................................ 21
3 Objetivos ........................................................................................................................... 23
3.1 Objetivo Geral ................................................................................................................... 24
3.2 Objetivo Específico ............................................................................................................. 24
4 Métodos ............................................................................................................................ 25
4.1 Cálculo da amostra ............................................................................................................ 26
4.2 Drogas utilizadas ............................................................................................................... 26
4.3 Delineamento experimental ............................................................................................... 27
4.3.1 Experimento 1: Construção de Curva Dose-Resposta com base na resposta

comportamental............................................................................................................27
xix
4.3.2 Experimento 2: Efeitos do Tratamento Conjunto Entre Clonazepam e Cocaína no
Comportamento, Sono e Neurogênese..........................................................................30
4.3.2.1 Avaliação comportamental .......................................................................................... 31
4.3.2.2 Registro de sono ........................................................................................................... 33
4.3.2.3 Perfusão transcardíaca e eutanásia ............................................................................. 34
4.3.2.4 Análises histológicas ..................................................................................................... 35
4.3.3 Análises estatísticas ...................................................................................................... 36
5 Resultados …………………….................................................................................................... 38
5.1 Experimento 1 ….………………………………………………………………………………………..………………….. 39
5.2 Experimento 2 ….……………………………………………………………………………………………………………. 40
5.2.1 Teste em campo aberto …..………………………………………………………………...………………..… 40
5.2.2 Teste em labirinto em cruz elevado ……....……………………………………………..………………… 42
5.2.3 Registro de sono agudo – fase clara ............................................................................ 43
5.2.4 Registro de sono agudo – fase escura ......................................................................... 44
5.2.5 Avaliação da Neurogênese no Giro Denteado ............................................................. 47
6 Discussão ........................................................................................................................... 49
6.1 Experimento 1 .................................................................................................................... 50
6.2 Experimento 2 .................................................................................................................... 51
6.2.1 Testes comportamentais ............................................................................................. 51
6.2.2 Registro de sono .......................................................................................................... 54
6.2.3 Neurogênese hipocampal ............................................................................................ 57
7 Conclusões ......................................................................................................................... 60
7.1 Implicações ........................................................................................................................ 61
Referências .............................................................................................................................. 63
Anexos ..................................................................................................................................... 78
Anexo 1 Carta de aprovação do projeto na Comissão de Ética no Uso de
Animais na UNIFESP (CEUA n° 7097040716) .......................................................................... 79
Anexo 2 Publicações científicas .......................................................................................... 81
xx
Introdução
Introdução
__________________________________________________________________________________
1 INTRODUÇÃO
1.1 Panorama sobre substâncias psicoativas/psicotrópicas
Define-se como substância psicoativa aquela que altera o comportamento,

cognição e humor, tendo, portanto, ação no Sistema Nervoso Central (SNC).
Substância psicotrópica, por sua vez, é uma definição que engloba compostos
psicoativos que também possuem uma grande capacidade reforçadora, sendo, dessa
forma, passíveis de autoadministração (Carlini et al., 2001). Esta categoria engloba
tanto drogas ilícitas, como a cocaína e maconha, como também medicamentos
comercializados, a exemplo dos benzodiazepínicos, barbitúricos e estimulantes como
o metilfenidato.
Chaloult (1971) classificou as drogas psicotrópicas quanto à sua ação sobre o
SNC, subdividindo-se em depressoras ou lentificadoras, estimulantes ou aceleradoras
e alucinógenas ou perturbadoras. Drogas depressoras diminuem a atividade do SNC,
podendo ocasionar sonolência, sedação e lentificação de atividades psicomotoras.
Esta classe inclui, entre outras drogas, os benzodiazepínicos e o álcool. Drogas
estimulantes provocam aumento da atividade do SNC, causando redução no sono e
agitação psicomotora. Estão nessa categoria a cocaína, a anfetamina, nicotina e
cafeína. Drogas perturbadoras, por sua vez, alteram o funcionamento central em
escala qualitativa, podendo desencadear delírios e alucinações. Nessa categoria
incluem-se o LSD, a mescalina, a Cannabis, certos cogumelos e o chá de lírio (Carlini
et al., 2001).
O uso prolongado de drogas psicotrópicas tem o potencial de influenciar o
comportamento do indivíduo, que passa a ser motivado a obter a substância, mesmo
em situações adversas. Este quadro é denominado dependência química. Ao longo
do desenvolvimento da dependência química ocorrem mudanças em relação ao efeito
reforçador gerado pela substância. Em um primeiro momento, a busca pela droga é
primariamente motivada pela sensação de prazer provocada, caracterizando um
reforço positivo (Wise e Koob, 2014). Uma vez dependente, a parada abrupta do uso,
ou ao menos uma diminuição da quantidade normalmente usada, pode levar à
síndrome de abstinência, podendo levar o indivíduo a buscar a substância para reduzir
esses efeitos. Este novo reforço é denominado negativo (Wise e Koob, 2014). A
2
Introdução
__________________________________________________________________________________
décima edição do Código Internacional de Doenças (CID-10) apresenta os seguintes

critérios para diagnosticar dependência química:
1. Um desejo forte ou compulsão para consumir a substância.

2. Dificuldade de controlar o consumo da substância em termos de seu início,
término ou níveis de consumo.
3. Síndrome de abstinência fisiológica quando o uso da substância cessou ou foi
reduzido. Os sintomas da síndrome de abstinência são característicos para
cada substância.
4. Evidência de tolerância de forma que doses crescentes da substância
psicoativa são requeridas para alcançar efeitos originalmente produzidos por
doses mais baixas.
5. Abandono progressivo de outros prazeres em função do uso da substância.
6. Persistência no uso da substância, a despeito de evidência clara de
consequências nocivas, tais como: danos ao fígado, por consumo excessivo
de bebidas alcoólicas, estados de humor depressivos, períodos de consumo
excessivo da substância, comprometimento do funcionamento cognitivo etc.
Nesse caso, deve-se fazer esforço para determinar se o usuário estava
realmente (ou se poderia esperar que estivesse) consciente da natureza e
extensão do dano.
O uso de substâncias psicotrópicas é uma prática crescente na sociedade

atual. Além do número crescente de substâncias cujo uso vem sendo relatado,
diferentes práticas têm se popularizado. Dentre essas práticas, o uso combinado de
drogas psicotrópicas de ações distintas no organismo é cada vez mais comum. O
intuito por trás da associação de duas ou mais drogas inclui o uso recreativo e a
automedicação. Nesse cenário, duas drogas comumente encontradas em associação
são a cocaína e o clonazepam.
3
Introdução
__________________________________________________________________________________
1.2 Cocaína – aspectos gerais
A cocaína é uma substância derivada da Erythroxylon coca, arbusto de

distribuição na América do Sul (regiões amazônicas e andinas). Pode ser apresentada
na forma de sal (cloridrato de cocaína; forma cheirada ou injetada), ou na forma de
pedra ou pasta, subdividida em pasta base, crack, oxi e merla, variando de acordo
com os solventes com que são preparados (Dias e Pinto, 2006).
Na forma de pó, a absorção da cocaína se dá pela mucosa das narinas e
laringe, sendo a via mais “lenta” devido à vasoconstrição que gera nessas mucosas.
A via intravenosa e a pulmonar (fumada) são mais rápidas e logo introduzem a
substância na circulação sistêmica e no cérebro. Os efeitos agudos da cocaína são:
euforia intensa, sensação de energia aumentada, sensação de aumento das
percepções sensoriais (ouvir, ver, sentir), diminuição do apetite, da necessidade de
sono, do cansaço e fadiga, aumento da ansiedade e da autoconfiança, egocentrismo,
e pode causar também delírios de cunho persecutório (Van Dyke et al., 1981; Carlini
et al., 2001).
A cocaína pode gerar overdose se consumida em quantidades excessivas,
levando à morte em certos casos, devido ao infarto do miocárdio, arritmia cardíaca,
acidente vascular cerebral (AVC), hiperpirexia (aumento exagerado da temperatura
corporal) e convulsões. O consumo crônico ou episódio de consumo excessivo
(denominado binge) leva aos seguintes efeitos colaterais (o chamado “crash”):
surgimento de sonolência, paranoia, irritabilidade, sintomas de depressão e falta de
motivação (Sanchez e Santos, 2013).
A evolução no uso da cocaína segue o padrão previamente descrito: em um
primeiro momento, há reforço positivo no uso da cocaína, com o usuário procurando
a substância devido à sensação prazerosa que ela desencadeia. Com o
desenvolvimento da dependência, o usuário busca a cocaína para reduzir os sintomas
depressivos que surgem com a abstinência, caracterizando o reforço negativo.
1.2.1 Desenvolvimento de dependência - neuroanatomia e bases genéticas
O mecanismo por meio do qual a cocaína age é o de inibição da recaptação de

dopamina, que mantém os níveis deste neurotransmissor elevados nas fendas
4
Introdução
__________________________________________________________________________________
sinápticas, resultando no fenômeno de upregulation ou supersensibilidade. A cocaína

disponível nas fendas sinápticas é degradada antes da recaptação ocorrer por ação
da enzima catecol O-metiltransferase, levando a um esgotamento na disponibilidade
de dopamina do cérebro. Este déficit dopaminérgico está vinculado com a
manifestação dos sintomas do crash e caracteriza a hipótese de esgotamento de
dopamina (dopamine depletion hypothesis) (Dackis e Gold, 1985). Com o uso
constante da cocaína, o sistema dopaminérgico apresenta alterações em seu
funcionamento que contribuem para a formação de dependência e ao
desenvolvimento de tolerância. O uso crônico de cocaína leva a uma queda acentuada
nos níveis dopaminérgicos uma vez que o consumo da substância é interrompido
(Karoum et al., 1990; Willuhn et al., 2014). Essa queda é acompanhada por um
desbalanço no sistema de transmissão sináptico inibitório e excitatório, resultando
numa hiperexcitabilidade dos neurônios dopaminérgicos. A associação entre baixos
níveis de dopamina e excitabilidade exacerbada neuronal reforçam a hipótese de
esgotamento de dopamina e seria um fator crítico para a reinstauração da busca pela
droga em modelos animais e desenvolvimento da dependência à cocaína (Francis et
al., 2019). A reparação do descompasso entre excitabilidade neuronal e as quedas
nos níveis de dopamina é um processo difícil, pois são alterações acompanhadas por
redução na síntese e liberação de dopamina e na formação de vesículas
transportadoras (Francis et al., 2019).
Os efeitos da cocaína sobre o sistema dopaminérgico podem ser influenciados
por fatores hormonais e até mesmo pela liberação de outros neurotransmissores. Há
evidências de que o risco de desenvolvimento de dependência à cocaína está
relacionado ao gênero do usuário e é maior no sexo feminino, devido a alterações
hormonais que ocorrem durante o ciclo menstrual (Andersen et al., 2012). Mulheres
apresentariam uma ativação reduzida da amígdala e do córtex orbitofrontal diante do
estímulo da cocaína. Essas diferenças podem ocorrer devido à secreção de
estrogênio, como demonstrado em ratas ovariectomizadas expostas à cocaína por
tempo prolongado enquanto eram tratadas ou não com esse hormônio (Febo et al.,
2005). Em relação à influência de outros neurotransmissores, o sistema
hipocretinérgico pode ter uma participação no desenvolvimento de dependência à
cocaína. Em um estudo recente, camundongos nocaute para hipocretina
apresentaram uma sensibilização comportamental atenuada e tardia em relação ao
5
Introdução
__________________________________________________________________________________
grupo controle, além de terem manifestado uma fissura reduzida e um

desaparecimento mais rápido da preferência a lugar condicionada por cocaína
(Steiner et al., 2018).
Além da inibição sobre a recaptação de dopamina, a cocaína também age
sobre os níveis de outros neurotransmissores, como a serotonina e a noradrenalina
(Pomara et al., 2012). No sistema serotoninérgico, a cocaína afeta sobretudo os
receptores 5HT2 e 5HT3, e sua ação está vinculada a aumento da hiperlocomoção e
à sensibilização comportamental promovida pela droga. O uso de outros antagonistas
do receptor 5HT3 em conjunto à cocaína promovem redução da hiperlocomoção e da
sensibilização comportamental provocadas pela droga (Reith, 1990; King et al., 2000;
Salazar-Juaréz et al., 2016). Há indícios de que o sistema de neurotransmissão
colinérgico também é afetado pela cocaína, sendo responsável por modular a
instauração da dependência. Previamente, demonstrou-se que lesões em neurônios
colinérgicos no núcleo accumbens podem estar relacionadas a um aumento na
sensibilidade à cocaína (Hikida et al., 2001). Estudos mais recentes mostraram que a
cocaína especificamente age como antagonista em receptores muscarínicos, o que
colaboraria para a preferência por cocaína ou por antagonistas muscarínicos de efeito
semelhante em estudos de estímulo discriminativo (Joseph e Thomsen, 2017). Por
outro lado, o uso de um antagonista muscarínico como o biperideno atenua a
preferência por lugar condicionada (conditioned place preference – CPP) em animais
tratados com esse medicamento (Zacarias et al., 2012). Assim, receptores
colinérgicos muscarínicos têm sido estudados como alvos de intervenção
farmacológica no tratamento à dependência à cocaína (Dall et al., 2017). Por fim, a
cocaína também age como inibidora de recaptação da noradrenalina, provocando
maior disponibilidade deste neurotransmissor em diferentes regiões do cérebro
relacionadas ao efeito reforçador e formação de dependência à cocaína (Hadfield et
al., 1980; Pomara et al., 2012). A liberação de noradrenalina na medula adrenal,
provocada pela cocaína, desencadeia vasoconstrição central e periférica, contribuindo
para a ocorrência de complicações cardiovasculares decorrentes de seu uso (Pomara
et al., 2012). Adicionalmente, hipotetiza-se que o receptor noradrenérgico α-1 tenha
um papel na instauração da dependência a cocaína, como demonstrado em estudos
avaliando o efeito de agonistas deste receptor sobre a reinstauração de cocaína em
6
Introdução
__________________________________________________________________________________
ratos (Schmidt et al., 2017), o que pode trazer implicações promissoras no uso de
antagonistas noradrenérgicos no tratamento à dependência a cocaína.
Efeitos da cocaína sobre comportamento, como a euforia e a perda de controle
devem-se às suas ações sobre o sistema límbico, rico em células dopaminérgicas e
do qual o núcleo accumbens (NAc), envolvido no processo de reforço positivo do
abuso de drogas, faz parte. O NAc, com sua capacidade de nos fazer sentir satisfação,
ajuda no desempenho de funções de sobrevivência e reprodução, já que é estimulado
em atividades como tomar água quando se sente sede, ou realizar atividade sexual.
Dessa forma, pode-se dizer que, ao aumentar a disponibilidade de dopamina nas
fendas sinápticas do NAc, a cocaína desencadeia uma forma exagerada dessa
sensação de satisfação (Nestler, 2005).
O córtex pré-frontal, por sua vez, serve como uma área opositora ao NAc,
sendo relacionado à avaliação das ações do indivíduo. Essa região é a que permite
uma pessoa sem transtorno de uso de substância avaliar os riscos envolvidos antes
de atender aos impulsos de uso da droga. Com o desenvolvimento do transtorno de
uso de cocaína, no entanto, o indivíduo apresentará falhas no controle exercido pelo
córtex pré-frontal sobre o sistema de recompensa nessa região, o que está
relacionado com uma dificuldade em refrear seus impulsos (Volkow et al., 2003).
O desencadeamento de sensações prazerosas pela cocaína afeta o
armazenamento de memórias, pois certas partes do hipocampo e da amígdala
acumulam memórias associadas às formas pelas quais essas sensações foram
atingidas. Essas memórias auxiliam o cérebro a manter a informação de como voltar
a sentir essas sensações. A cocaína, provocando seus picos de dopamina, leva a uma
deturpação desse mecanismo, fazendo com que memórias associadas ao intenso
prazer gerado pela cocaína resultem em uma compulsão por obter mais droga (Grant
et al., 1996). Isso leva às chamadas pistas ambientais que ativam a compulsão pela
cocaína, como, por exemplo, uma pessoa visitar o local onde consumiu a droga pelas
últimas vezes, sentindo uma intensa vontade de consumir a droga (Childress et al.,
1999). Dessa forma, as pistas ambientais condicionadas ao efeito da droga
representam um fator importante no favorecimento da recaída ao abuso de drogas.
A cocaína também tem suas ações baseadas em mecanismos genéticos,
alterando, por exemplo, a expressão gênica nos neurônios do NAc. Uma proteína cuja
expressão pode ser significativamente afetada pela cocaína é a ΔFosB (Nestler et al.,
7
Introdução
__________________________________________________________________________________
2001). Ela é um fator de transcrição genética encontrado no NAc com durabilidade

elevada, cuja liberação é estimulada pela cocaína e capaz de se acumular, no
organismo, com o abuso da droga. A ΔFosB intensifica comportamentos aditivos em
modelos animais, causando sensibilização à cocaína e aumentando a motivação para
obtenção dessa droga (Whisler et al., 1999; Nestler et al., 2001) A ΔFosB tem sua
secreção estimulada em outras regiões além do NAc, incluindo o córtex pré-frontal,
podendo estar implicada no seu mal funcionamento. Outros mecanismos que
participam da formação de dependência de cocaína incluem alelos dos genes TPH1,
TPH2 e SLC6A4, envolvidos na síntese e transporte de serotonina, e que influenciam
a intensidade dos efeitos subjetivos da cocaína em seres humanos (Patriquin et al.,
2017). Além disso, a enzima CDK5, relacionada ao crescimento de células neurais e
estimulada pela presença de ΔFosB, pode ser responsável pela formação de novos
circuitos neurais relacionados à dependência de cocaína e a alterações na sinalização
do receptor dopaminérgico D1, que também participa dos processos neuroadaptativos
da dependência de cocaína (Bibb et al., 2001; Norrholm et al., 2003).
Deve-se lembrar, também, que o risco de dependência de cocaína é uma
característica herdável, e que, portanto, há um conjunto de possíveis genes
relacionados à transmissão dessa característica (Pierce et al., 2018). Um dos
candidatos a transmitir a suscetibilidade a desenvolver dependência por cocaína é o
gene FAM53B (Gelernter et al., 2014), de função ainda desconhecida no organismo.
A cocaína promove também mudanças estruturais que estão relacionadas com
a presença de fissura mesmo em pessoas que há muito tempo deixaram de usar
cocaína. Essas mudanças incluem surgimento de novas ramificações dendríticas nos
neurônios do NAc. Isso significa um aumento nas ligações neuronais entre as células
do NAc, e também com células de outras regiões. Nestler (2005) sugere que isso
aumentaria a influência de outras regiões sobre o NAc, como por exemplo, os centros
de memória. Isso resultaria numa intensificação do efeito das pistas ambientais que
levariam ao surgimento da fissura. Novamente, a CDK5, que tem sua produção
estimulada pela ΔFosB, seria responsável por esse efeito.
8
Introdução
__________________________________________________________________________________
1.2.2 Efeitos da cocaína sobre o comportamento tipo-ansioso
As mudanças comportamentais que a cocaína provoca de imediato são a

principal razão pela qual essa droga é utilizada. Sensação de euforia, autoconfiança,
bem-estar e aceleração de desempenho cognitivo são característicos (Zimmerman,
2012). Alterações comportamentais também já foram identificadas em modelos
animais por meio de diferentes testes (Ramos, 2008). As evidências sobre o efeito da
cocaína nos padrões comportamentais em modelos animais diferem em alguns
momentos. Em ratos, foi observado aumento da impulsividade e atividade locomotora
utilizando-se de aparelhos como o campo aberto (Yeh e Haertzen, 1991; Andersen et
al., 2005). Por outro lado, a cocaína pode levar à ansiogênese, conforme demonstrado
em um experimento que avaliou a latência para ratos saírem de uma câmara pequena
e fechada e explorarem o campo aberto anexo a essa câmara (Yang et al., 1992). O
tratamento com cocaína resultou em uma latência maior para abandonar a câmara e
maior tempo de permanência nela, além de surgimento de padrões comportamentais
tipo-ansioso. Em 2008, Perrine e colaboradores relataram que a retirada da cocaína
intensificou comportamentos tipo-ansioso em ratos. Outros experimentos também
demonstraram que efeitos da cocaína sobre a ansiedade podem se refletir na prole
de mães que receberam cocaína. White e colaboradores (2016) descreveram um
aumento nos comportamentos tipo-ansioso em filhotes machos de ratos cujos pais
haviam autoadministrado cocaína por 60 dias antes de serem apresentados às
fêmeas com as quais copularam. O conjunto de evidências apresentado sugere,
portanto, que a cocaína possui fortes efeitos ansiogênicos.
Mecanismos ansiogênicos a nível molecular possuem uma relação íntima com
a administração de cocaína. Um mecanismo possível seria a ativação do peptídeo
CART (Cocaine- and Amphetamine-Regulated Peptide), que passa por upregulation
com a administração de cocaína ou anfetamina. A administração direta do CART levou
ao aparecimento de comportamentos tipo-ansioso em ratos testados em labirinto em
cruz elevado e submetidos a testes de interação social (Chaki et al., 2003).
9
Introdução
__________________________________________________________________________________
1.2.3 Efeitos da cocaína sobre o sono
A cocaína prejudica a qualidade e manutenção do sono, como observado por

Pace-Schott e colaboradores (2005). Este grupo analisou a qualidade de sono ao
longo de um ciclo de uso de cocaína em homens jovens, seguido por um período de
abstinência, constatando redução no tempo total e na eficiência de sono, e aumento
no tempo acordado após o início do sono e na latência para seu início. Durante a fase
de retirada da cocaína, observou-se aumento do sono REM e latência reduzida para
o início dessa fase de sono, resultados estes também encontrados em diversos outros
estudos, como revisado por Valladares e Irwin (2007). Em estudos básicos, Knapp e
colaboradores (2007) mostraram que a administração de doses diferentes de cocaína
causou redução significativa do sono de ondas lentas em ratos. Adicionalmente, doses
baixas e altas de cocaína, respectivamente, suprimiram e extinguiram completamente
o sono REM dos animais nas primeiras 3 horas de registro. Embora a retirada de
cocaína provoque, em um primeiro momento, uma queda na eficiência, qualidade e
tempo total de sono, com o passar do tempo, há uma melhora em todos os parâmetros
relacionados ao sono, assim como em outros sintomas relacionados à abstinência de
cocaína (Schierenbeck et al., 2007; Angarita et al., 2016).
Estudos com animais apontam que a relação entre cocaína e sono possui
aspectos bidirecionais. Por exemplo, assim como a cocaína afeta o sono, o caminho
inverso, no qual a falta de sono afetaria o efeito da cocaína, também já foi observado.
No estudo de Andersen e colaboradores (2005), em animais privados de sono REM
por 4 dias observou-se uma potencialização dos efeitos da cocaína quando
comparados com animais tratados apenas com salina, ou que não haviam passado
por privação de sono.
Estudos com seres humanos descrevem que os efeitos subjetivos da cocaína
são mais intensos após 24 horas de privação de sono. Curiosamente, após 48 horas
de privação de sono, essa sensação subjetiva desaparece (Fischman e Schuster,
1980). No mesmo estudo, os batimentos cardíacos após uso de cocaína em uma
situação de privação de sono não apresentavam a mesma elevação quando
comparados ao uso de cocaína sem privação de sono em associação.
10
Introdução
__________________________________________________________________________________
1.2.4 Efeitos da cocaína sobre a neurogênese
De acordo com a literatura, tem sido proposto que o hipocampo desempenha

um papel fundamental, como um todo, na neuro-circuitaria da dependência de
cocaína. O processamento de memórias relacionadas ao uso da droga ocorre nesta
região, que também seria responsável pela formação da fissura ou craving, que é o
desejo incontrolável pela droga sentido pelos usuários (revisado em Castilla-Ortega et
al., 2016). Em uma situação de abuso da cocaína, há perda de conectividade do
hipocampo, bem como de outros componentes do sistema relacionado à dependência
de cocaína, com prejuízos na conectividade entre hemisférios cerebrais (Kelly et al.,
2011) e entre o sistema envolvido na dependência e outras áreas do sistema límbico,
como o córtex pré-frontal. Essas alterações na conectividade também se mostram
aparentes em trabalhos que avaliaram a capacidade cognitiva e emocional de
usuários, como já descrito em diferentes estudos (Sinha et al., 2005; Mitchell et al.,
2013). O hipocampo é uma das principais regiões cerebrais que apresentam processo
de proliferação neuronal após a fase adulta. Esse processo neurogênico ocorre no
giro denteado, região localizada na extremidade do hipocampo (Castilla-Ortega et al.,
2016).
Nesse sentido, o uso de cocaína pode afetar diretamente o processo
neurogênico hipocampal. Andersen e colaboradores (2007) observaram que, após
administração crônica de cocaína em ratos, foi constatada uma diminuição de 38% no
número de novas células nervosas em ratos no giro denteado em relação ao grupo
controle. Em outro estudo foi observada uma queda significativa no número de células
novas formadas e na neurogênese nessa mesma região em ratos submetidos à
autoadministração de cocaína, acarretando um prejuízo na memória de trabalho
(vinculado à redução na neurogênese), que agravaria a compulsão pela droga (Sudai
et al., 2011). Inversamente, há evidências que redução na neurogênese aumenta o
número de episódios de autoadministração e busca pela cocaína em ratos, sugerindo
uma relação bidirecional entre suscetibilidade ao uso de drogas e proliferação
neuronal (Noonan et al., 2010; DeRoche-Gamonet et al., 2019). A indução do aumento
da neurogênese também facilita o esquecimento de memória contextual relacionada
à administração de cocaína, com diminuição na preferência condicionada por lugar
induzida pela droga (Ladron de Guevara-Miranda et al., 2018). Adicionando
11
Introdução
__________________________________________________________________________________
complexidade à relação entre neurogênese e o uso de cocaína, já se demonstrou que

a redução na proliferação neuronal é reversível, uma vez que o tratamento com
cocaína é cessado. O processo neurogênico após a retirada da cocaína, inclusive, é
exacerbado quando comparado a condições pré- uso da droga (Castilla-Ortega et al.,
2016). Nota-se, portanto, que a relação entre a cocaína e o processo neurogênico
possui características que ainda precisam ser melhor exploradas.
1.3 Clonazepam - uso na sociedade e potencial de abuso
O clonazepam é um medicamento pertencente à classe dos benzodiazepínicos,

drogas controladas obtidas com prescrição médica e que possuem ação ansiolítica,
sedativa, anticonvulsivante e/ou hipnótica sobre o organismo. Seu uso excessivo,
assim como o de outros benzodiazepínicos pode levar aos seguintes sintomas:
sonolência, confusão mental, alterações motoras, dificuldade de concentração e pode
levar também ao desenvolvimento de dependência (Sjo et al. 1975; Griffin III et al.,
2013). Os benzodiazepínicos podem ser divididos de acordo com sua meia-vida, ou
seja, seu tempo de duração. Os benzodiazepínicos de curta duração são comumente
associados a uma potência mais elevada e a um maior potencial de abuso em geral,
como o triazolam e o alprazolam. O clonazepam, no caso, é um benzodiazepínico de
duração intermediária. Além de efeitos hipnóticos, sedativos e anticonvulsivantes,
benzodiazepínicos podem ser utilizados para amenizar a síndrome de abstinência
alcoólica e combater síndromes do pânico. Deve-se lembrar, no entanto, que o uso
de benzodiazepínicos pode ser potencializado com combinação com o álcool, e assim
levar à intoxicação (Moody, 2004).
No caso do clonazepam, seus efeitos são primariamente ansiolíticos e
anticonvulsivantes. Dessa forma, o clonazepam tem seu uso aprovado para o
tratamento de crises de ansiedade, ausências, e status epilepticus. Além disso, há um
grande número de evidências de que o clonazepam pode ser utilizado para diversas
outras condições, como o distúrbio comportamental de sono REM, síndrome das
pernas inquietas, acatisia induzida por uso de neurolépticos, dor neuropática, e até
mesmo como tratamento conjunto para depressão (Pujalte et al., 1994; Joy, 1997;
Molnar et al., 2006; Morishita, 2009; Meeus et al., 2011). Graças aos seus usos amplos
no cenário clínico, o número de prescrições de clonazepam, nos últimos anos, tem
12
Introdução
__________________________________________________________________________________
sido crescente sobretudo na sociedade brasileira. Uma de suas apresentações

comerciais se tornou um dos medicamentos mais prescritos do país nos últimos anos
(dados da Anvisa, 2012).
O metabolismo do clonazepam no organismo possui certas peculiaridades
quando comparado com os demais benzodiazepínicos. Em um primeiro momento, ele
é nitro-reduzido pela enzima CYP3A4, se tornando 7-aminoclonazepam, um
metabólito sem ação farmacológica claramente estabelecida. Posteriormente, este
metabólito é submetido à ação da enzima NAT2, passando por acetilação (processo
metabólico observado, dentre benzodiazepínicos, apenas no clonazepam) e se
tornando 7-acetamido-clonazepam. Todas as etapas de transformação da molécula
de clonazepam também podem sofrer hidroxilação, ainda que em pequena escala.
Acredita-se, atualmente, que o balanço na concentração de clonazepam e seus
metabólitos (sobretudo o 7-aminoclonazepam) esteja relacionado com a manifestação
e persistência de sintomas de dependência e síndrome de abstinência deste
medicamento (Sjö et al., 1975; Tóth et al., 2016).
O clonazepam, além de ser amplamente prescrito, muitas vezes para
condições pelas quais seu uso não foi aprovado, também possui um potencial de
abuso que nos últimos anos tem sido constatado crescentemente. Relatos de seu uso
nas ruas se tornaram comuns, com o medicamento substituindo outro
benzodiazepínico comumente utilizado, o flunitrazepam. Segundo levantamentos
realizados por Frauger e colaboradores (2011, 2012), o clonazepam é muitas vezes
obtido, assim como outras drogas, nas ruas, fora de farmácias e sem prescrição
médica, a exemplo do que ocorre com os opioides metadona e buprenorfina, também
monitoradas nesses estudos. Adicionalmente, foi identificada, nessa pesquisa, o
“doctor shopping”, prática de se visitar diferentes médicos e obter mais de uma
prescrição para o clonazepam, fazendo-se também visitas a múltiplas farmácias para
obtenção de grandes quantidades da substância. Além disso, assim como outros
benzodiazepínicos, o clonazepam é comumente misturado com outras substâncias,
seja com a finalidade de se amplificar os efeitos desejados sobre o organismo
(combinação com opioides), seja para minimizar efeitos colaterais indesejáveis
(combinação com estimulantes e alucinógenos). Em um estudo recente que investigou
o número de admissões a prontos-socorros na Europa entre 2013 e 2014 decorrentes
do uso recreacional de benzodiazepínicos e drogas-Z, o clonazepam foi o
13
Introdução
__________________________________________________________________________________
benzodiazepínico mais frequentemente detectado (Lyphout et al., 2019). Há relatos

de caso exemplificando os riscos elevados dessa combinação de drogas (Burrows et
al. 2012), mas estudos sobre os efeitos provocados por essas combinações são
escassos. O clonazepam também foi considerado uma das drogas mais comumente
utilizadas para facilitar abuso sexual, sendo detectado em exames toxicológicos de
7,6% das vítimas (Fiorentin e Logan, 2019).
Apesar dos riscos associados, o medicamento, assim como outros
benzodiazepínicos, possui uma margem de segurança alta. Na maioria das vezes, a
dose tóxica de benzodiazepínicos é 20 a 40 vezes maior do que a dose comumente
usada no meio clínico.
1.3.1 Efeitos do clonazepam sobre o comportamento tipo-ansioso
Embora benzodiazepínicos sejam comumente indicados para tratamento de

ansiedade devido às suas propriedades ansiolíticas, dependendo da forma como o
tratamento é realizado, efeitos comportamentais adversos podem surgir. O uso
prolongado desse tipo de medicamento favorece o desenvolvimento de dependência
e tolerância, o que implica na constante necessidade de se aumentar a dose para
manutenção dos efeitos. É possível que com o surgimento de tolerância, o efeito
terapêutico desses medicamentos se reduza de forma acentuada ou desapareça,
podendo dar lugar a uma síndrome de abstinência ainda que o medicamento continue
sendo tomado (Ashton, 2002). Dessa forma, o tratamento prolongado pode estar
associado com a persistência ou agravamento da ansiedade e surgimento de
irritabilidade ou mesmo insônia, sintomas que podem se atenuar com a interrupção
cuidadosa do medicamento (Michelini et al., 1996). A retirada abrupta do clonazepam
(assim como ocorre com outros medicamentos da mesma classe) pode levar ao
desencadeamento da síndrome de abstinência, com o surgimento de sintomas de
ansiedade e depressão, agitação, insônia e até mesmo crises convulsivas (Pétursson,
1994).
Em modelos animais, evidências do efeito ansiolítico do clonazepam já foram
obtidas em alguns estudos. Nin e colaboradores (2012) relataram redução do
comportamento tipo-ansioso em fêmeas de ratos expostas ao labirinto em cruz
elevado. Foram analisados, em conjunto, no mesmo estudo, o estágio do ciclo estral
14
Introdução
__________________________________________________________________________________
e os episódios de grooming (autolimpeza) das fêmeas, tendo sido observada uma

correlação positiva dessas duas variáveis com as alterações comportamentais. Testes
com camundongos, em uma arena dividida em porções escura e iluminada, revelaram
aumento na atividade locomotora e no número de transições entre as partes escura e
iluminada da arena (Crawley e Goodwin, 1980). Estes comportamentos indicam
redução no comportamento tipo-ansioso e se tornaram mais intensos com doses
maiores de clonazepam. O efeito de tratamento prolongado com clonazepam sobre
modelos animais, no entanto, ainda precisa ser investigado. A avaliação de
comportamentos tipo-ansioso ao término de uma longa etapa de administração
poderia identificar um paralelo com o fenômeno acima descrito, de aparição de
sintomas de abstinência mesmo com a continuidade do tratamento (Ashton, 2002).
1.3.2 Efeitos do clonazepam sobre o sono
Assim como outros benzodiazepínicos, o clonazepam pode provocar

sonolência em seus usuários. Apesar de não se tratar de um medicamento indicado
como hipnótico, mas sim como ansiolítico e anticonvulsivante, seu uso como “remédio
para dormir” é uma prática comum no Brasil e no mundo, embora nem sempre seja
uma opção aconselhável (Contreras-González et al., 2016).
O clonazepam é considerado opção de tratamento para um distúrbio específico
de sono, o distúrbio comportamental de sono REM (Schenck et al., 1996). Diretrizes
médicas previamente chegaram a recomendar o clonazepam para tratamento de
insônia (Thomée et al., 2011). No estudo realizado por Contreras-González e
colaboradores (2016), no entanto, foi evidenciado que pacientes com insônia tratados
com clonazepam apresentavam um desempenho pior em testes para avaliação da
função executiva. O clonazepam pode suprimir o sono REM e reduzir o sono de ondas
lentas, provocando superficialização do sono (Johnson, 1981; Placidi et al., 2000;
Saletu et al., 2001). Estudos mostram que o uso prolongado de benzodiazepínicos
pode estar relacionado à baixa qualidade do sono, com melhorias sendo observadas
após a retirada do medicamento (Poyares et al., 2004). O uso prolongado de
clonazepam, especificamente, está associado com a piora da qualidade de sono
(Lader, 2011). Em relação à apneia obstrutiva do sono, o clonazepam está relacionado
com redução de eventos de apneia central, decorrente da melhor consolidação do
15
Introdução
__________________________________________________________________________________
sono causada pelo medicamento, e aumento nos eventos de apneia obstrutiva (Placidi
et al., 2000). O clonazepam também já foi investigado como tratamento adjunto para
depressão administrado em combinação à fluoxetina (revisado por Minkel e Krystal,
2013; Smith et al. 1998; Londborg et al., 2000; Smith et al., 2002). Nessas situações,
seu uso melhorou o sono dos pacientes e em certos casos também contribuiu para
melhora dos sintomas depressivos, embora o tratamento prolongado não tenha
trazido benefícios (Smith et al., 2002). Efeitos residuais também são comuns, com
sonolência e prejuízo na função motora se manifestando no dia seguinte ao uso do
medicamento (Wildin, 1990). Outros usos já identificados para o clonazepam
envolvem o tratamento de síndrome de pernas inquietas (Saletu et al., 2001; Manconi
et al., 2012). Pesquisas com animais avaliando o sono após a administração de
clonazepam, no entanto, ainda não foram descritas.
Pode-se observar, portanto, que o uso do clonazepam para tratamento de
problemas de sono tem se mostrado eficaz em casos como o distúrbio
comportamental de sono REM e certos casos de insônia. No entanto, há pouca
evidência concreta que reforçaria sua utilidade como hipnótico, e uma série de efeitos
colaterais devem ser considerados no uso desse medicamento para essa finalidade.
1.3.3 Efeitos do clonazepam sobre a neurogênese
O impacto causado pelo uso de benzodiazepínicos (e dentro desta classe, do

clonazepam) sobre processos de proliferação neuronal tem sido descrito em
diferentes estudos, e deve ser considerado como um dos efeitos prejudiciais do mau
uso desse tipo de medicamento.
Chen e colaboradores (2009), em um estudo investigando o efeito de diferentes
anticonvulsivantes sobre a neurogênese no giro denteado em ratos jovens,
observaram que o clonazepam provocou redução de até 60% no número de eventos
de proliferação neuronal. Adicionalmente, o número de células, dentre aquelas recém-
formadas, que chegavam a amadurecer posteriormente também apresentou queda.
O efeito de benzodiazepínicos nos processos neurogênicos em seres humanos
também já foi previamente investigado. Análises post-mortem de amostras do giro
denteado de pacientes que usaram benzodiazepínicos e antidepressivos em
associação identificaram quantidade menor de células progenitoras de neurônios, em
16
Introdução
__________________________________________________________________________________
comparação a amostras de pacientes que haviam feito tratamento apenas com

antidepressivos. Não foram encontradas diferenças significativas em relação ao grupo
controle, que não havia passado por tratamento farmacológico para transtornos de
humor (Boldrini et al., 2014). É sugerido, por esses autores, que os benzodiazepínicos
interferem com a capacidade neurogênica dos antidepressivos. Em outro estudo, a
combinação de clonazepam com o opioide tramadol levou a um aumento no número
de neurônios com indicadores de apoptose (Mohamed et al., 2015). Em conjunto,
acredita-se que benzodiazepínicos aumentem o número de eventos de apoptose de
células precursoras neurais devido a uma participação dos receptores GABA-A
ativados por eles (Chen et al., 2009). Previamente, já foram publicados indícios de
que o receptor GABA-A pode estar relacionado com a inatividade de células
precursoras de neurônios, mantendo-as quiescentes (Pallotto e Deprez, 2014). Em
uma revisão de Ge e colaboradores (2007), os diferentes papéis executados pelo
GABA na neurogênese foram discutidos. O GABA seria um responsável pela
regulação geral da neurogênese, controlaria o processo de diferenciação terminal das
células geradas, estaria envolvido na velocidade de migração de neurônios imaturos,
e poderia auxiliar no desenvolvimento dendrítico e estabelecimento de sinapses
destes neurônios no giro denteado e no bulbo olfatório. Dentro dessa possibilidade, já
foi cogitada a existência de um mecanismo de feedback negativo causado pelo GABA
(Duveau et al., 2011). Benzodiazepínicos, como moduladores alostéricos positivos de
receptores GABAérgicos do tipo GABA-A, atuariam na ativação dessa via de
retroalimentação negativa.
1.4 Associação entre cocaína e clonazepam: implicações para a saúde
Embora em um primeiro momento a cocaína e o clonazepam sejam

substâncias completamente diferentes, ambas se assemelham quanto à sua
capacidade de afetar parâmetros neurológicos e comportamentais em seus usuários.
O uso indevido de substâncias psicotrópicas é uma prática crescente na população
mundial, seja considerando o uso de substâncias isoladamente, seja a combinação
de duas ou mais drogas de abuso (McCabe et al., 2006; Jones et al., 2012; Iudici et
al., 2015). A cocaína, por exemplo, foi considerada a 2ª droga ilegal mais consumida
17
Introdução
__________________________________________________________________________________
no Brasil, como relatado pelo II Levantamento Nacional de Álcool e Drogas,

considerando-se apenas a sua forma aspirada (Laranjeira et al., 2014). Estima-se que
o Brasil seja o segundo país que mais consome cocaína no mundo, perdendo apenas
para os Estados Unidos (Abdalla et al., 2014). Um levantamento sobre o uso de
cocaína, na população norte-americana, em 2 períodos (2002-2003 e 2012-2013),
encontrou um aumento, em uma década, de 0,6% para 1,0% na prevalência do uso
de cocaína, o que representa um crescimento numérico de 1,2 milhões para 2,4
milhões de usuários (Kerridge et al., 2019). O mesmo estudo mostrou que os casos
de transtorno de uso de cocaína aumentaram de 0,3% para 0,4%.
Por outro lado, o clonazepam, muito utilizado para tratar transtornos
psiquiátricos, é notável pelo seu histórico de uso recreativo tanto isoladamente quanto
em combinação com outras substâncias (Burrows et al.,2012; Gjerde et al., 2015). A
detecção de clonazepam e outros benzodiazepínicos em amostras de fluidos orais e
sangue se tornou frequente em diferentes públicos, como frequentadores de casas
noturnas, população carcerária e motoristas envolvidos em acidentes automobilísticos
(Simonsen et al., 2013; Gjerde et al., 2015). A detecção de clonazepam, nesses
estudos, é tão elevada quanto a de cocaína e outras drogas ilícitas.
A interação entre clonazepam e cocaína teria como finalidade, a princípio, o de
modulação dos efeitos da cocaína. Estes efeitos constituem o “crash”, o conjunto de
sintomas disfóricos que surgem após os efeitos da cocaína se reduzirem no
organismo, envolvendo comprometimento do humor, com surgimento de ansiedade e
irritabilidade, e redução no tempo total e qualidade do sono. Assim, o clonazepam
seria uma das substâncias utilizadas como opção para reduzir os efeitos desse
“crash”. A associação de ambas as substâncias em um contexto recreativo foi
detectada em ocorrências envolvendo intoxicação por cocaína em outras partes do
mundo (Vroegop et al., 2009) enquanto que no Brasil a combinação das duas
substâncias é uma prática emergente observada na população mais jovem.
Atualmente estudos científicos avaliando os efeitos nocivos da combinação entre as
duas substâncias são escassos. Em um relato de caso, um usuário de cocaína teria
consumido a droga junto a 10 comprimidos de clonazepam, embora esta situação
possa ter sido uma tentativa de suicídio. O usuário em questão sofria de ideias
persecutórias e estava tratando sintomas psicóticos com risperidona. O clonazepam
começou a ser utilizado pelo indivíduo após uma primeira internação para tratamento
18
Introdução
__________________________________________________________________________________
do uso de cocaína (Messas, 2006). Gasior e colaboradores (2000) realizaram um dos

poucos estudos pré-clínicos investigando o potencial terapêutico dessa interação,
tendo relatado que o clonazepam não constituía um fator protetor para eventos
convulsivos em ratos injetados com doses tóxicas de cocaína. Dugovic e
colaboradores (1991) também analisaram os efeitos da combinação entre cocaína e
benzodiazepínicos, administrando clordiazepóxido a ratos tratados previamente com
cocaína. O clordiazepóxido, um benzodiazepínico menos potente que o clonazepam,
não apenas falhou em reverter os efeitos da cocaína no padrão de sono dos animais,
como também levou a um agravamento dessas alterações.
O uso de ambas as substâncias em conjunto pode causar amplificação de
efeitos nocivos relacionados ao seu abuso. Tanto a cocaína como o clonazepam
impactam a qualidade de sono, afetam o comportamento e podem estar relacionados
a alterações neurológicas do usuário. Estes 3 eixos, ainda, encontram-se interligados
de forma que alterações em um podem refletir em alterações em outro. Por exemplo,
sabe-se que a privação de sono pode ser ansiogênica (Pires et al., 2016), e que
transtornos de ansiedade podem ser agravados devido a prejuízos na neurogênese
(Santarelli et al., 2003; Revest et al., 2009). Por fim, a neurogênese também pode ser
afetada por distúrbios como a fragmentação do sono (Guzmán-Marin et al., 2007).
Levando-se em conta essa rede complexa de interações entre os 3 eixos (sono,
ansiedade e neurogênese) e a capacidade de perturbar esta rede por parte de ambas
as drogas estudadas, pode-se hipotetizar que a combinação entre cocaína e
clonazepam teria efeitos deletérios na saúde. O estudo da associação entre cocaína
e clonazepam, portanto, mostra-se necessário considerando-se uma melhor
compreensão dos mecanismos pelas quais essas drogas podem interagir.
Considerando-se um protocolo experimental utilizando-se animais, é possível
identificar os impactos da interação entre cocaína e clonazepam nos 3 eixos,
comportamento tipo-ansioso, sono e neurogênese. A administração de ambas as
drogas poderia comprometer a proliferação neuronal no giro denteado. Com relação
ao comportamento, esperava-se que a exposição prolongada à cocaína e ao
clonazepam desencadeasse a manifestação de comportamento tipo-ansioso, com
redução na locomoção e nos comportamentos exploratórios. Parâmetros básicos
relacionados ao sono, como arquitetura, continuidade e tempo total de sono devem
19
Introdução
__________________________________________________________________________________
ser prejudicados. Assim, este estudo verificou a possível amplificação dos efeitos
negativos dessas 2 drogas.
20
Hipótese
Hipótese
__________________________________________________________________________________
2 Hipótese
A hipótese deste estudo é de que a administração combinada de cocaína e

clonazepam potencializa os efeitos negativos dessas drogas nos animais que as
receberem, acarretando prejuízos no padrão de sono, na neurogênese e no
comportamento de ratos.
22
Objetivos
Objetivos
__________________________________________________________________________________
3 Objetivos
3.1 Objetivo Geral
Investigar o efeito da administração crônica e conjunta de clonazepam e de

cocaína no padrão de sono, comportamento e neurogênese de ratos machos
adultos.
3.2 Objetivos Específicos
1. Avaliar o efeito da administração crônica e conjunta de clonazepam e cocaína no

comportamento tipo-ansioso de ratos, na locomoção e na atividade exploratória;
2. Avaliar o efeito da administração crônica e conjunta de clonazepam e cocaína na
distribuição, quantidade e frequência dos estágios de sono de ratos;
3. Avaliar o efeito da administração crônica e conjunta de clonazepam e cocaína na
proliferação neuronal na região do giro denteado de ratos.
24
Métodos
Métodos
__________________________________________________________________________________
4 Métodos
Nos 2 experimentos, foram utilizados um total de 90 ratos Wistar machos

adultos com 90 dias de idade provenientes do Biotério de Produção de Ratos do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (ICB-USP). Todos os
animais foram acondicionados no Biotério do Departamento de Psicobiologia sob
condições controladas de temperatura a 22±1°C, ciclo claro-escuro de 12 horas/12
horas (início do período claro às 7:00) e água e ração ad libitum. Todos os
procedimentos foram conduzidos mediante aprovação da Comissão de Ética no Uso
de Animais (CEUA) da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) (processo
#7097040716).
4.1 Cálculo da amostra
O tamanho amostral neste estudo foi calculado com o auxílio do software

GPower. Para estimar um poder estatístico de 80% e um alfa de 5%, o tamanho
estimado do efeito foi de 0,25, e da amostra foi de 10 animais por grupo. Ao longo dos
experimentos, este número amostral foi respeitado de maneira a se utilizar o menor
número possível de animais para a obtenção de dados com significância estatística,
seguindo, assim, as diretrizes da política de 3R’s em relação ao bem-estar animal:
Reduce (Reduzir), Replace (Substituir), Refine (Refinar) (Russell e Burch, 1959). Ao
se considerar a elevada taxa de mortalidade observada em diferentes etapas do
Experimento 2, foi solicitado, mediante a aprovação da CEUA da UNIFESP, o
aumento no número de animais. Dessa forma, o número amostral total foi elevado
para 90 animais, como mencionado anteriormente.
4.2 Drogas utilizadas
Foram utilizados, para tratamento dos animais em cada experimento, cloridrato

de cocaína com 99,5% de pureza fornecido pela Sigma-Aldrich® (St. Louis, MO, EUA)
e clonazepam, em forma líquida, obtido dos Laboratórios Roche®. Para
administração, as duas substâncias foram diluídas em salina 1ml/kg.
26
Métodos
__________________________________________________________________________________
4.3 Delineamento experimental
4.3.1 Experimento 1: Construção de Curva Dose-Resposta com base na resposta

comportamental
Para o primeiro experimento, que estabeleceu as doses de cocaína e

clonazepam utilizadas no Experimento 2, foram usados 35 animais. Distribuídos em 7
grupos, de 5 ratos cada, os animais receberam diariamente, às 9:00, durante 16 dias,
doses de cocaína e clonazepam, por via intraperitoneal (Figura 1). Os ratos foram
distribuídos nos grupos a seguir:
 Grupos COC: administração diária de cocaína nas doses de 7 mg/kg (COC 1),
15 mg/kg (COC 2), ou 30 mg/kg (COC 3).
 Grupos CLN: administração diária de clonazepam nas doses de 0,25 mg/kg
(CLN 1), 0,75 mg/kg de clonazepam (CLN 2), ou de 1,25 mg/kg (CLN 3).
 Grupo CTRL: administração diária de 0,5 ml de salina.
As doses de cocaína selecionadas tiveram como base estudos prévios
realizados por nosso grupo (Andersen et al., 2000). As doses de clonazepam levaram
em consideração a bibliografia consultada (Chen et al., 2009; Sudai et al., 2011; Nin
et al., 2014) para estabelecimento da dose mínima, que promoveria alterações
comportamentais ansiolíticas e da dose máxima, que levaria a um impacto na
neurogênese.
Figura 1: Esquematização do Experimento 1. Entre os dias 2 e 17 os animais receberam diariamente doses de cocaína,
clonazepam ou salina, de acordo com o grupo ao qual foram designados.
Imediatamente antes do início do tratamento com salina, clonazepam ou

cocaína, e no dia seguinte após o término do tratamento, os animais foram submetidos
aos testes comportamentais. Os ratos foram expostos a 2 aparatos, o labirinto em cruz
elevado e o campo aberto. Foram avaliados parâmetros comportamentais que indicam
27
Métodos
__________________________________________________________________________________
comportamento tipo-ansioso. Os animais foram expostos por 5 minutos a cada

aparato. Uma hora após a realização dos testes comportamentais, foi feita eutanásia
por injeção de tiopental (100mg/kg) (Cristália®). O teste comportamental feito antes
do início do tratamento tinha o intuito de observar o nível basal de comportamento
tipo-ansioso dos animais utilizados (Figura 1).
Doses que provocaram respostas comportamentais adequadas foram
selecionadas para uso no Experimento 2. As doses selecionadas foram aquelas que
estivessem abaixo daquela que causou o efeito-teto para cada droga.
Figuras 2 e 3: Aparatos utilizados para avaliação comportamental dos animais, o campo aberto e o labirinto em cruz elevado.
Tabela 1: lista de variáveis analisadas no campo aberto
Variável analisada no campo Descrição

aberto
Tempo de Imobilidade (TI) Tempo gasto pelo animal em imobilidade
(movimentando apenas as vibrissas)
Quadrantes Centrais (QC) Número de quadrantes centrais percorridos
Quadrantes Periféricos (QP) Número de quadrantes periféricos percorridos
Tempo em Quadrantes Tempo gasto nos quadrantes centrais
Centrais
Tempo em Quadrantes Tempo gasto nos quadrantes periféricos
Periféricos
Latência para Início da Latência para deixar o quadrante central do campo
Locomoção aberto, no início do teste
28
Métodos
__________________________________________________________________________________
Episódios de Rearing Número de episódios no qual o animal se ergue nas

(Levantamento) patas anteriores e perscruta o ambiente
Razão de Locomoção Razão entre o número de quadrantes centrais
percorridos/número total de quadrantes percorridos
Tabela 2: Lista de variáveis analisadas no labirinto em cruz elevado
Variável analisada no Descrição

labirinto em cruz elevado
Tempo de Imobilidade (TI) Tempo gasto pelo animal em imobilidade
(movimentando apenas as vibrissas)
Entradas em Braços Número de entradas dos animais em braços abertos
Abertos (EntradaBA) do labirinto
Entradas em Braços Número de entradas dos animais em braços
Fechados (EntradaBF) fechados do labirinto
Tempo em Braços Tempo de permanência nos braços abertos do
Abertos (PermaBA) labirinto
Tempo em Braços Tempo de permanência nos braços fechados do
Fechados (PermaBF) labirinto
Tempo no Quadrante Tempo de permanência no centro do labirinto, após
Central (QC) início do teste
Episódios de Rearing Número de episódios no qual o animal se ergue nas
(Levantamento) patas anteriores e perscruta o ambiente
Episódios de Risk Número de episódios no qual o animal coloca a
Assessing (Avaliação de cabeça para fora dos braços fechados e perscruta o
Risco) ambiente, sem sair do braço fechado
Episódios de Head Número de episódios no qual o animal mergulha a
Dipping (Mergulho de cabeça para fora do labirinto, pelos braços abertos,
Cabeça) observando o ambiente em volta do labirinto
Número de Cruzamentos Número de cruzamentos que o animal realiza nos
em Braços Fechados braços fechados
(NCF)
29
Métodos
__________________________________________________________________________________
Número de Cruzamentos Número de cruzamentos que o animal realiza nos

em Braços Abertos (NCA) braços abertos
Latência para Início da Latência para deixar o quadrante central do labirinto,
Locomoção no início do teste
4.3.2 Experimento 2: Efeitos do Tratamento Conjunto com Clonazepam e Cocaína no

Comportamento, Sono e Neurogênese
Figura 4: delineamento experimental do experimento 2. Após período de adaptação, os animais foram submetidos à cirurgia
estereotáxica para implante de eletrodos para registro de sono. Entre os dias 1 e 16 os animais receberam tratamentos diários
com as doses de cocaína e/ou clonazepam selecionadas no experimento 1, por injeção intraperitoneal. No primeiro dia de
tratamento, os animais foram submetidos a registro de sono por 24 horas. Após a realização dos testes comportamentais, no dia
seguinte ao término do tratamento, os animais foram submetidos à eutanásia e seus cérebros foram coletados para realização
da análise imunohistoquímica.
Para essa etapa, os animais foram distribuídos em 4 grupos experimentais:

 Grupo controle (CTRL) (n=10): animais que receberam salina (1,0 ml/kg)
intraperitonealmente durante 16 dias de tratamento;
 Grupo clonazepam (CLN) (n=10): animais que receberam doses de
clonazepam (1,25 mg/kg) intraperitonealmente durante 16 dias de tratamento;
 Grupo cocaína (COC) (n=10): animais que receberam doses de cocaína (15
mg/kg) intraperitonealmente durante 16 dias de tratamento;
 Grupo clonazepam + cocaína (COCCLN) (n=10): animais que receberam
cocaína (15 mg/kg) e, após 1 hora, clonazepam intraperitonealmente (1,25
mg/kg) durante 16 dias de tratamento.
30
Métodos
__________________________________________________________________________________
O período de tratamento foi baseado em parâmetros observados na literatura.

Yamaguchi e colaboradores (2004) relataram comportamento tipo-ansioso causado
por administração de cocaína em ratos durante 15 dias. As doses correspondentes de
cocaína e clonazepam foram ministradas por meio de injeção intraperitoneal diluída
em 1 mL de solução e determinadas de acordo com os resultados do experimento 1.
O tratamento foi sempre realizado às 9:00 horas. O grupo COCCLN recebeu a dose
de clonazepam às 10:00 horas, 1 hora após a injeção de cocaína. O intervalo de 1
hora entre as injeções de cocaína e clonazepam foi selecionado levando-se em conta
a meia-vida da cocaína no organismo do rato e os seus efeitos sobre a concentração
de dopamina, que atinge um pico após 30 minutos do tratamento e então rapidamente
começa a decair (Hedaya e Pan, 1997). Objetivou-se, dessa forma, criar um protocolo
que se aproximasse o máximo possível da prática realizada em humanos com o
consumo do clonazepam no momento de redução dos efeitos da cocaína.
Após 2 semanas de adaptação às condições ambientais do laboratório, os ratos
passaram pela cirurgia para implantação de eletrodos para o registro de sono. Em
seguida foi realizado o registro de sono agudo dos animais e então, iniciado o
tratamento com clonazepam e/ou cocaína por 16 dias (Figura 4). O teste
comportamental foi feito 1 dia após o fim do tratamento. Em seguida, os animais foram
eutanasiados.
4.3.2.1 Avaliação comportamental
No Experimento 2, os animais só foram expostos ao labirinto em cruz elevado

e campo aberto uma única vez (Figuras 5 e 6), 1 dia após o término do tratamento
(período claro). A exposição prévia dos animais aos aparatos utilizados poderia
influenciar o comportamento a ser analisado, comprometendo a interpretação dos
dados (Chacur et al., 1999).
Para o teste de labirinto em cruz elevado foi utilizado um aparato composto por
2 braços abertos e 2 braços fechados com mesma dimensão. Os animais foram
colocados ao centro do aparato. Foram quantificados: tempo de permanência nos
braços abertos e fechados; número de entradas em cada um dos braços durante 5
minutos; número de episódios de rearing (comportamento exploratório, no qual o
animal permanece sobre as 2 patas traseiras) (Pellow et al., 1985; Carobrez e
31
Métodos
__________________________________________________________________________________
Bertoglio, 2005); número de cruzamentos entre os 2 braços fechados e entre os 2

braços abertos e latência para locomoção. No labirinto em cruz elevado, ansiogênese
é indicada por maior tempo de permanência e frequência nos braços fechados.
Redução na ansiedade está vinculada a esses mesmos eventos, mas nos braços
abertos (Pellow et al., 1985; Walf e Frye, 2007) (Figuras 3 e 4).
Para o teste de campo aberto, foi utilizada uma estrutura cilíndrica, com
superfície dividida em 12 quadrantes centrais e 7 periféricos. Os animais foram
colocados ao centro do aparato por 5 minutos e foram contabilizados: número de
entradas nos quadrantes centrais e periféricos, episódios de rearing (levantamentos),
latência para início da locomoção, tempo de imobilidade, número de bolos fecais e a
razão da atividade locomotora. Essa razão foi calculada a partir da soma dos tempos
totais de permanência do animal nos quadrantes centrais e periféricos dividida pelo
tempo total de permanência do animal nos quadrantes centrais. Imobilidade do animal,
defecação e aumento na locomoção periférica são comportamentos associados à
presença de comportamento tipo-ansioso nos animais (Belzung, 1999; Frussa-Filho
et al., 2010).
Figuras 5 e 6: Ilustração de ratos inseridos, durante teste comportamental, no labirinto em cruz elevado (A) e no campo aberto
(B).
32
Métodos
__________________________________________________________________________________
4.3.2.2 Registro de sono
Para implantação de eletrodos para registro de sono, os animais receberam 1

dose de 6 mg/kg de xilazina para 60 mg/kg de cetamina intraperitoneal. Após a
constatação da anestesia profunda dos animais, os procedimentos cirúrgicos foram
iniciados.
Os animais, após serem posicionados no aparelho estereotáxico e serem
tricotomizados no local da incisão, tiveram 4 incisões apropriadas para registro de
eletrocorticograma feitas no periósteo exposto. Parafusos philips 1,40 com arruela nº
207 AR foram dispostos nessas incisões e o conjunto composto pelo soquete que foi
acoplado à cabeça do animal e eletrodos ligados a fios de níquel e cromo foi então
fixado utilizando-se massa acrílica e polimerizador (Andersen et al., 2001). A
temperatura corporal dos animais foi regulada por meio de mantas térmicas durante o
procedimento. Ao término da cirurgia foram administradas doses de 0,5 mL/kg de uma
suspensão poli-antibiótica (Pentabiótico®, Brasil) via intramuscular e de cetoprofeno,
via intraperitoneal (7,5 mg/kg) (Biofarm®, Brasil). Durante os próximos 5 dias, os
animais receberam uma dose diária de 7,5 mg/kg de cetoprofeno por via
intraperitoneal. Seu acompanhamento pós-cirúrgico durou 11 dias, e foi seguido por 3
dias de adaptação aos cabos do polígrafo, usado no registro de sono.
Tabela 3: Lista de variáveis avaliadas durante o registro de sono agudo
Variável analisada no registro de sono Descrição

Tempo de Sono Total (TTS) Tempo total, no registro, no qual o animal
encontrava-se em alguma fase de sono
Tempo de Sono Intermediário ou Pré- Tempo de sono no qual o animal
Paradoxal (TSI) encontra-se na fase intermediária entre o
sono de ondas lentas (NREM) e sono
REM, com aparição de fusos somados a
ondas theta.
Tempo de Sono REM (TREM) Tempo de sono no qual o animal
encontra-se em sono REM ou paradoxal.
33
Métodos
__________________________________________________________________________________
Latência para Sono REM (LREM) Tempo decorrido até o primeiro episódio
de sono REM ocorrer, a partir do início
do registro.
A avaliação do sono dos animais foi feita no momento do início do tratamento

dos animais, durando 24 horas. O objetivo foi registrar o efeito agudo do tratamento
no sono dos animais. Foram analisadas as frequências e tempo total dos estágios de
sono dos animais no período claro e escuro.
A avaliação foi realizada utilizando-se os critérios estabelecidos por Andersen
e colaboradores (2001), e utilizando-se épocas de 10 segundos. Em ratos, o ciclo
vigília-sono pode ser dividido em vigília atenta, vigília relaxada, sono de ondas lentas,
ou sincronizado, e sono paradoxal ou dessincronizado, análogos ao sono NREM e
REM presente em seres humanos. O sono de ondas lentas pode ser subdividido em
3 níveis distintos, com graus crescentes de sincronização das ondas e crescente
presença de ondas delta. Há, ainda, a presença da chamada fase de sono
intermediária ou pré-paradoxal, na qual há componentes semelhantes aos presentes
no sono sincronizado e no sono dessincronizado. A fase de sono intermediária
precede o início do sono paradoxal ou dessincronizado. O ciclo vigília-sono em ratos
é invertido em relação a seres humanos, com os episódios de sono sendo
predominantes durante o dia (fase de claridade do biotério) e a fase de atividade
ocupando predominantemente a noite (fase de escuridão do biotério). O animal tende
a dormir mais no início da fase de claridade e estar mais ativo no início da fase de
escuridão. No início dos episódios de sono, o ciclo vigília-sono tende a apresentar-se
de forma irregular, muitas vezes não atingindo o sono paradoxal nos primeiros ciclos.
Posteriormente, os ciclos se tornam completos (Andersen et al., 2001).
4.3.2.3 Perfusão transcardíaca e eutanásia
O processo de eutanásia teve como finalidade a extração dos cérebros dos

animais para realização da análise imunohistoquímica. Todos os cuidados foram
tomados para reduzir o sofrimento do animal.
Os ratos passaram por perfusão transcardíaca. A anestesia foi realizada com 8
mg/kg de xilazina e 80 mg/kg de cetamina intraperitoneal. A analgesia foi feita com
34
Métodos
__________________________________________________________________________________
injeção intraperitoneal de cetoprofeno (7,5 mg/kg). Após a anestesia ser confirmada,

uma incisão vertical na linha média da região torácica foi realizada. Foi realizada
perfusão por gravidade, com injeção de PBS (phosphate-buffered saline) por 30
segundos, removendo o excedente de sangue. Os animais receberam uma dose de
0,1ml/100g de heparina diluída no PBS utilizado nos animais para promover
anticoagulação. Em seguida, foi bombeada uma solução de paraformaldeído 4% 0,1M
pH 7,4 (10mL/min), seguido por uma injeção de formalina a 4%, fixando o tecido
cerebral.
4.3.2.4 Análises histológicas
Após a eutanásia, os cérebros dos animais foram removidos e imediatamente

imersos em paraformaldeído a 4% durante uma noite. Eles foram então transferidos
para uma solução de paraformaldeído 1% na qual foram mantidos previamente à
realização dos cortes histológicos.
Figuras 7 e 8: Ilustração da extremidade do giro denteado do hipocampo de um rato corado com diaminobenzidina. Nesta região
foi determinada a área de contagem de células, realizada manualmente.
Duas horas antes da realização da eutanásia, os animais receberam o

marcador BrdU (5-bromo-2’-deoxiuridina), que se liga ao DNA de células que estão
passando por replicação celular, colorindo-as de modo a permitir sua quantificação
(Figuras 7 e 8). A identificação de células passando por divisão celular com uso de
marcação por BrdU é um dos métodos mais validados e difundidos para análise de
neurogênese. As secções foram submetidas a um protocolo de análise
imunohistoquímica específica para BrdU. A neurogênese foi determinada utilizando-
se o programa ImageJ® e o microscópio Olympus DP71. As lentes utilizadas foram
35
Métodos
__________________________________________________________________________________
as de aumento 10x (UPlanSP N) e 40x (UPlanSApo) com o qual foi possível avaliar a
densidade de células passando por replicação na zona sub-granular do hipocampo.
4.3.3 Análises Estatísticas
Para realização de todas as análises comportamentais, de registro de sono e

de densidade de células em neurogênese, foi utilizado o programa IBM® SPSS®
Statistics 20. Os conjuntos de dados tiveram sua normalidade verificada antes da
realização das análises.
Os dados comportamentais obtidos no Experimento 1 foram analisados por
meio de Modelo Linear Geral (General Linear Model – GLM) de Medidas Repetidas,
com uso de Posthoc de LSD (Least Significant Difference).
Para os dados comportamentais, foi realizado teste utilizando o Modelo Linear
Generalizado (Generalized Linear Model - GLzM). A distribuição adotada no modelo
foi adaptada especificamente para cada variável, de acordo com a natureza dos dados
analisados e a presença de normalidade ou não na variável investigada. Desta forma,
foi utilizado modelo de distribuição linear, para dados com distribuição normal, gama
para dados de distribuição não-normal que correspondiam a razões e taxas (como por
exemplo, razão de locomoção), e Poisson, para dados de distribuição não-normal que
correspondiam a contagens numéricas (como por exemplo, número de eventos de
rearing ou levantamento).
De forma semelhante, para as análises de registro de sono, os dados foram
analisados se utilizando do GLzM, adotando-se um modelo de distribuição linear ou
gama de acordo com a natureza do conjunto de dados de cada variável. As análises
foram realizadas separadamente para a fase de claridade e escuridão na sala de
registro de sono, de modo a se relacionar as possíveis alterações no sono dos animais
de acordo com a fase do ciclo vigília-sono na qual eles se encontravam.
Para avaliação da neurogênese na região do giro denteado do hipocampo,
foram realizados testes utilizando Modelo Linear Geral (GLM), com utilização de post-
hoc de LSD. Testes adicionais foram realizados utilizando-se Modelo Linear
Generalizado, adotando-se distribuição gama. Foram utilizadas as médias de cada
animal, construídas a partir da totalidade de cortes histológicos avaliados de cada um.
Uma segunda análise foi realizada, dessa vez excluindo animais que não
36
Métodos
__________________________________________________________________________________
apresentavam ao menos um corte histológico hipocampal completo, ou seja, um corte

histológico com os 2 hemisférios hipocampais. Essa segunda análise teve por
finalidade garantir a consistência da amostra, analisando apenas hipocampos
completos. Com a redução no número de amostras, utilizando-se desse critério, foi
utilizado, além do GLzM com distribuição linear e post-hoc de LSD, o Teste Não-
Paramétrico de Kruskall-Wallis.
Para todas as análises realizadas foi adotado como nível de significância
p≤0,05.
37
Resultados
Resultados
__________________________________________________________________________________
5 Resultados
5.1 Experimento 1
De acordo com os resultados do Experimento 1, que teve como finalidade

finalidade observar as doses de cocaína e clonazepam que provocariam maior
alteração comportamental abaixo do efeito-teto, a dose intermediária de cocaína
(Grupo COC 2 - 15mg/kg) e a dose mais elevada de clonazepam (Grupo CLN 3 - 1,25
mg/kg) foram selecionadas para o Experimento 2. Conforme mostrado abaixo (Figura
9), os valores obtidos para esses grupos apresentaram em média as maiores
alterações. Os testes estatísticos, no entanto, não detectaram significância nessas
diferenças, de forma que a escolha da dose foi feita considerando-se a maior diferença
observada entre o momento basal e final dos parâmetros observados.
R a z ã o d e lo c o m o ç ã o e m c a m p o a b e r t o
150
R a z ã o ( q u a d r a n t e s t o t a is /
CTRL
q u a d r a n t e s c e n t r a is )
CLN 1
100 CLN 2
CLN 3
50
0
B asal F in a l
M o m e n t o d o te s te
T e m p o d e im o b ilid a d e ( la b ir in t o e m c r u z e le v a d o )
80
CTRL
T e m p o m é d io ( s )
CLN 1
60
CLN 2
40 CLN 3
20
0
B asal F in a l
39
Resultados
__________________________________________________________________________________
N ú m e ro d e e n tra d a s e m b ra ç o s a b e rto s
8
CTRL
N ú m e ro d e e n tra d a s
COC 1
6
COC 2
4 COC 3
0
B asal F in a l
T e m p o d e im o b ilid a d e ( c a m p o a b e r t o )
80
CTRL
T e m p o m é d io ( s )
COC 1
60
COC 2
40 COC 3
20
0
B asal F in a l
Figura 9a-9d: Gráficos representando a variação, entre o teste comportamental basal e final, dos resultados encontrados para
os grupos experimentais avaliados no Experimento 1.
5.2 Experimento 2
5.2.1 Teste em campo aberto
40
Resultados
__________________________________________________________________________________
Figura 10a-10d: Resultados obtidos para o número de quadrantes centrais (A), quadrantes periféricos (B) percorridos, tempo de
imobilidade (C) e número de bolos fecais produzidos (D) em campo aberto, no experimento 2. *=diferença significativa em relação
ao grupo CTRL; #=diferença significativa em relação ao grupo COC; §=diferença significativa em relação ao grupo CLN.
Para o teste de campo aberto, não foi encontrada diferença significativa entre
os grupos considerando-se a latência para início da locomoção, tempo gasto nos
quadrantes centrais ou periféricos, ou número de episódios de rearing (levantamento)
(Figura 10). Houve, no entanto, uma diferença significativa quanto ao número de
quadrantes periféricos percorridos, entre os Grupos COC, que percorreu um número
maior de quadrantes periféricos, e CLN (Exp(B)= -0,34; IC 95%= 0,52 – 0,97; p= 0,03).
Foram observadas diferenças também quanto ao tempo de imobilidade, entre os
Grupos COC e CLN (Exp(B)= -0,17; IC 95%= 0,77-0,94; p= 0,001), COC e COCCLN
(Exp(B)= -2,54; IC 95%= 0,70-0,86; p= 0,001) e COC e CTRL (Exp(B)= -0,03; IC 95%=
0,80-0,97; p= 0,01). O Grupo COC apresentou o menor tempo de imobilidade dentre
todos os grupos. Em relação ao número de bolos fecais produzidos, houve diferença
significativa entre os Grupos CTRL e COC (Exp(B)= -0,86; IC 95%= 0,18-0,96; p=
0,03).
41
Resultados
__________________________________________________________________________________
5.2.2. Teste em labirinto em cruz elevado
Figura 11a-11c: Resultados obtidos para o tempo de permanência em braços abertos (A), número de episódios de avaliação de
risco (B) e tempo de imobilidade (C) no labirinto em cruz elevado no experimento 2. *=diferença significativa em relação ao grupo
CTRL; #=diferença significativa em relação ao grupo COC; §=diferença significativa em relação ao grupo CLN.
Nos testes no labirinto em cruz elevado, foram observadas diferenças

significativas quanto ao tempo gasto nos braços abertos (Figura 11), entre os Grupos
CTRL e COC (Exp(B)= 1,38; IC 95%= 1,21-1,58; p= 0,001); CTRL e CLN (Exp(B)=
1,27; IC 95%= 1,11-1,44; p= 0,001) e CTRL e COCCLN (Exp(B)= 1,30; IC 95%= 1,14-
1,48; p= 0,001). Também foram encontradas diferenças significativas para o número
de episódios de avaliação de risco entre os Grupos CTRL e COCCLN (Exp(B)= 0,51;
IC 95%= 0,34-0,77; p= 0,001), CTRL e COC (Exp(B)= 0,63; IC 95%= 0,43-0,92; p=
0,001) e CLN e COCCLN (Exp(B)= 0,42; IC 95%= 1,00-2,29; p= 0,05). Considerando-
se o tempo de imobilidade, foram encontradas diferenças entre os Grupos COC e
COCCLN (Exp(B)=1,94; IC 95%=1,26-2,97; p= 0,001), CTRL e COC (Exp(B)= 0,49;
42
Resultados
__________________________________________________________________________________
IC 95%= 0,32-0,75; p= 0,001), CTRL e CLN (Exp(B)= 0,49; IC 95%= 0,32-0,74; p=

0,001) e entre CLN e COCCLN (Exp(B)= 0,51; IC 95%= 0,34-0,78; p= 0,001). Não
foram observadas diferenças significativas entre os grupos para os parâmetros:
latência para início da locomoção, tempo gasto em braços abertos ou fechados, tempo
gasto na área central do labirinto, número de entradas em braços abertos e fechados,
número de cruzamentos entre braços abertos e fechados, número de bolos fecais
produzidos, número de episódios de rearing (levantamento) e de head dipping
(mergulho de cabeça).
5.2.3. Registro de sono agudo - fase clara
B
T e m p o d e s o n o R E M ( f a s e c la r a )
100
80
*
M in u to s
60
40
20
0
L C N N
R O L L
T C C C
C C
O
C
G ru p o
Figura 12a-12c: Resultados obtidos para o tempo de sono total (A), tempo de sono REM (B) e latência para início do primeiro
episódio de sono REM (C) na fase de claridade do registro de sono agudo, no experimento 2. *=diferença significativa em relação
ao grupo CTRL; #=diferença significativa em relação ao grupo COC; §=diferença significativa em relação ao grupo CLN.
Durante a fase de claridade no biotério, observou-se uma diferença significativa

quanto ao tempo total de sono (TTS) entre os Grupos COC e COCCLN (Exp(B)= 1,18;
IC 95%= 1,04-1,34; p= 0,01) e entre os Grupos COC e CLN (Exp(B)= 1,14; IC 95%=
43
Resultados
__________________________________________________________________________________
1,00-1,30; p= 0,05). Não foram observadas diferenças quanto ao tempo de sono

intermediário ou pré-paradoxal entre os grupos. Houve, no entanto, diferenças quanto
ao tempo de sono REM (TREM), entre o Grupo COCCLN e COC (Exp(B)= 1,38; IC
95%= 1,15-1,67; p= 0,001); COCCLN e CLN (Exp(B)= 1,36; IC 95%= 1,14-1,63; p=
0,001); e COCCLN e CTRL (Exp(B)= 1,56; IC 95%= 1,31-1,87; p= 0,001).
Considerando-se a latência para início do sono REM (LREM), foi observada diferença
entre os Grupos CTRL e COC (Exp(B)= 2,30; IC 95%= 1,14-4,63; p= 0,02), CTRL e
COCCLN (Exp(B)= 3,34; IC 95%= 1,68-6,62; p= 0,001) e CLN e COCCLN (Exp(B)=
0,36; IC 95%= 0,18-0,70; p= 0,001) (Figura 12).
5.2.4 Registro de sono agudo - fase escura
A
Tem po de sono REM (fa s e e s c u ra )
80
*
*
60
M in u to s
40
20
0
N
C
N
L
R
L
O
C
T
C
C
C
O
C
G ru p o
Figura 13: Resultados obtidos para o tempo de sono REM (A) na fase de escuridão do registro de sono agudo, no experimento
2. *=diferença significativa em relação ao grupo CTRL; #=diferença significativa em relação ao grupo COC; §=diferença
significativa em relação ao grupo CLN.
Durante a fase escura, 1 animal foi excluído do conjunto de dados analisados

devido ao excesso de interferência em seu registro de sono. Não foram observadas
diferenças significativas em relação ao tempo total de sono (TST) e tempo de sono
intermediário ou pré-paradoxal (TSI). No entanto, uma diferença acentuada foi vista
quanto ao tempo de sono REM (TREM), entre os Grupos CTRL e COCCLN (Exp(B)=
1,43; IC 95%= 1,11-1,83; p= 0,001) e CTRL e COC (Exp(B)= 1,36; IC 95%= 1,05-1,75;
p= 0,02) (Figura 13).
44
Resultados
__________________________________________________________________________________
Tabela 4: Pistas comportamentais avaliadas em campo aberto após 16 dias de

tratamento.
Campo Aberto
Bolos
Grupo LL TempoQC TempoQP QC QP TotalQ Levantamentos Razão TI
Fecais
CTRL 14,40±21,72 17,90±13,96 267,70±21,80 7,30±7,59 72,00±27,72b 79,30±33,45 25,10±8,92 0,06± 0,05 13,00±18,47 1,90±2,47
63,40±15,32a,
COCCLN 5,70±3,33 21,30±15,13 273,00±17,19 8,50±6,45 b 71,90±17,41 22,50±6,55 0,07± 0,05 10,60±7,81c 1,70±2,16
CLN 9,27±17,93 24,00±19,18 266,73±24,47 6,55±6,11b 69,18±28,36b 75,73±31,88 22,55±8,78 0,08± 0,07 13,73±21,19 1,09±1,45
COC 5,70±7,09 23,20±11,79 271,10±14,39 9,20±6,36 81,70±19,41 90,90±19,90 24,70±8,38 0,08± 0,04 5,90±6,28 0,80±1,93a
Valores mostrados como média ± desvio padrão de número de eventos ou tempo em segundos. LL=latência para início da
locomoção; TempoQC=tempo gasto em quadrantes centrais; TempoQP=tempo gasto em quadrantes periféricos; QC=número
de quadrantes centrais percorridos; QP=número de quadrantes periféricos percorridos; TotalQ=número total de quadrantes
percorridos; Levantamentos=número de episódios de levantamento; TI=tempo de imobilidade; Bolos fecais=número de bolos
fecais produzidos.
CTRL=controle (n=10); COC=cocaína (n=10); CLN=clonazepam (n=11); COCCLN=cocaína, seguida por clonazepam 1 hora
depois (n=10); a=diferença significativa em relação ao Grupo controle; b=diferença significativa em relação ao Grupo COC;
c
=diferença significativa em relação ao Grupo CLN.
Tabela 5: Pistas comportamentais avaliadas em labirinto em cruz elevado após 16

dias de tratamento.
Labirinto em Cruz Elevado
Bolos
Grupo LL PermaBA PermaBF PermaC Levantamento MC AR TI
fecais
CTRL 12,00±11,81 37,90±39,74 208,50±50,90 41,60±24,28 19,70±4,97 9,10±5,38 7,00±4,71 6,50±11,15 0,70±1,34
COCCLN 7,80±4,59 49,20±33,83a 188,10±40,38 54,90±23,62 17,50±3,69 9,90±4,01 3,60±1,26a,c 6,20±3,58 0,30±0,67
CLN 9,45±5,79 48,00±38,53a 198,00±47,07 44,55±17,74 17,09±4,30 9,91±6,47 5,45±3,01 3,18±4,29 0,27±0,65
COC 13,80±8,13 52,40±40,99a 185,00±34,96 48,80±26,00 17,80±4,94 11,20±4,26 4,40±2,91a 3,20±3,71 0,30±0,67
Labirinto em Cruz Elevado
Grupo EntradasBA EntradasBF CruzaBA CruzaBF
CTRL 2,10±1,91 2,7±1,77 0,7±1,06 4,5±2,17

COCCLN 2,10±1,60 2,8±1,48 1,00±1,16 4,10±1,79
CLN 2,73 ±1,85 2,91±1,64 1,09±1,45 3.64±1,96
45
Resultados
__________________________________________________________________________________
COC 2,80±2,10 3,50±2,22 0,80±0,92 3,70±2,00
Valores mostrados como média ± desvio padrão de número de eventos ou tempo em segundos. LL=latência para início da
locomoção; PermaBA=tempo gasto em braços abertos; PermaBF=tempo gasto em braços fechados; PermaC=tempo gasto na
área central; EntradasBA=número de entradas em braços abertos; EntradasBF=número de entradas em braços fechados;
Levantamentos=número de episódios de levantamento; MC=número de episódios de mergulho de cabeça; AR=número de
episódios de avaliação de risco; TI=tempo de imobilidade; Bolos fecais=número de bolos fecais produzidos; CruzaBA=número
de cruzamentos entre braços abertos; CruzaBF=número de cruzamentos entre braços fechados.
c
Tabela 6: Arquitetura do sono durante o registro da fase de claridade após o

tratamento agudo em ratos.
Registro da Fase Clara
Grupo TTS TSI TREM LREM
CTRL 324,41±53,43 62,64±51,88 64,63±11,08 31,77±24,81
114,86±78,49a,
COCCLN 349,10±61,98b 50,92±59,42 41,31±9,68a c
CLN 360,91±40,80b 65,26±51,22 56,38±10,83 40,83±45,34
COC 306,09±52,01 49,17±34,71 57,09±16,39 79,03±82,91a
Latência é considerada a partir do início do registro. Valores mostrados como média ± desvio padrão de tempo em minutos.
TTS=tempo de sono total; TSI=tempo de sono intermediário ou pré-paradoxal; TREM=tempo de sono REM ou paradoxal;
LREM=latência para o primeiro episódio de sono REM.
c
Tabela 7: Arquitetura do sono durante o registro da fase de escuridão após o

tratamento agudo em ratos.
Registro da Fase Escura
Grupo TTS TSI TREM
CTRL 281,32±70,16 48,88±45,34 33,15±10,34
COCCLN 327,18±59,54 64,47±77,48 47,37a±13,20
CLN 301,61±44,03 42,44±50,01 38,65±12,37
COC 311,90±80,37 56,08±42,01 44,93a±12,93
Latência é considerada a partir do início do registro. Valores mostrados como média ± desvio padrão de tempo em minutos.
TTS=tempo de sono total; TSI=tempo de sono intermediário ou pré-paradoxal; TREM=tempo de sono REM ou paradoxal.
c=diferença significativa em relação ao Grupo CLN.
46
Resultados
__________________________________________________________________________________
5.2.5 Avaliação da Neurogênese no Giro Denteado
Figura 14: Resultados obtidos para a densidade de células por mm2. Foram considerados, neste gráfico, as médias de todos
os animais utilizados no experimento.
Tabela 8: Densidade média de células em proliferação neuronal no giro denteado do

hipocampo em ratos.
Densidade de células em proliferação

neuronal
Grupo Densidade/mm3
CTRL 11124,65 ± 491,75
COCCLN 11123,43 ± 751,84
CLN 11183,72 ± 759,97

COC 10924,80 ± 430,23
Valores mostrados como média ± desvio padrão da densidade de células em proliferação neuronal/mm3.
Tabela 9: Densidade média de células em proliferação neuronal no giro denteado do

hipocampo em ratos, incluindo apenas hipocampos completos.
Densidade de células em proliferação

neuronal
Grupo Densidade média/mm3

CTRL 11025,12 ± 457,00
COCCLN 11092,03 ± 485,04
CLN 11150,90 ± 673,38

COC 10858,56 ± 537,81
Valores mostrados como média ± desvio padrão da densidade de células em proliferação neuronal/mm3.
Para a avaliação da neurogênese, não foi encontrado efeito estatístico

significativo para os diferentes grupos analisados, em nenhum dos testes observados.
47
Resultados
__________________________________________________________________________________
Na segunda análise (N=29), na qual 8 ratos foram excluídos devido à ausência

de ao menos uma secção histológica hipocampal completa, também não foi
encontrada nenhuma diferença significativa entre os grupos, para nenhum dos 2
testes estatísticos adotados (GLzM ou Kruskall-Wallis). Os valores de beta nesta
análise também indicam diferentes tendências de efeito para cada grupo de
tratamento.
48
Discussão
Discussão
__________________________________________________________________________________
6 Discussão
6.1 Experimento 1
Para o experimento piloto, a escolha das doses utilizadas teve como critério a
observação de uma maior alteração nos parâmetros comportamentais avaliados em
testes no campo aberto e labirinto em cruz elevado. Embora as diferenças tenham
sido visualmente localizadas, os resultados estatísticos não detectaram diferenças
significativas entre os grupos. Portanto, o critério visual foi utilizado para seleção da
dose para realização do experimento principal. Além disso, o N amostral (5 animais
por grupo) pode ter influenciado na falta de resultados significativos, nos testes
estatísticos. O uso de critério visual para escolha das doses das substâncias e o N
amostral diminuto podem constituir duas limitações do presente estudo, portanto.
Para o Grupo Cocaína (COC), foi observada a presença de uma resposta
comportamental mais acentuada para a dose intermediária, de 15 mg/kg, o que
corresponde a resultados obtidos em estudos prévios na literatura para outros
estimulantes (Berro et al., 2016) assim como para os demais experimentos
envolvendo diferentes doses de cocaína (Nader e Reboussin, 1994). A presença de
uma curva em forma de “U” invertido para dose-resposta de determinada substância
recebe o nome de hormese e é caracterizada pelas doses mais baixa e mais alta de
uma substância se assemelharem em seus efeitos, enquanto que a dose intermediária
da mesma substância se destaca das outras 2. A presença de uma curva em “U”
invertido pode estar relacionada a 2 hipóteses diferentes: em um dos cenários
possíveis, a dose mais elevada se torna demasiado tóxica, comprometendo a
resposta comportamental; em outro possível cenário, a dose mais elevada de uma
substância iria provocar uma ativação diferencial de receptores no sistema nervoso
central do animal, o que alteraria suas respostas comportamentais (Calabrese e
Baldwin, 2001).
Para os Grupos Clonazepam (CLN), foi escolhida a dose mais elevada, de 1,25
mg/kg. Novamente, diante da ausência de diferenças estatisticamente significantes, a
escolha da dose ficou a critério visual. Houve diferença discreta entre as doses de
0,75 e 1,25 mg/kg, e frequentemente as duas doses desencadeavam,
quantitativamente, respostas idênticas.
50
Discussão
__________________________________________________________________________________
É possível, dada a falta de efeitos significantes, que as doses menores (7 mg/kg

de cocaína e 025 mg/kg de clonazepam) pudessem ser desconsideradas. No entanto,
com os presentes resultados, foi possível estabelecer uma curva dose-resposta para
as duas substâncias estudadas e a confirmação de um efeito comportamental mais
acentuado decorrente de doses mais elevadas. Ainda, deve-se considerar que as
doses utilizadas foram analisadas à luz de parâmetros relacionados ao
comportamento tipo ansioso, e que portanto, em protocolos avaliando outros aspectos
do comportamento do animal, a curva dose-resposta utilizando-se essas doses
poderia ser diferente.
6.2 Experimento 2
6.2.1 Testes comportamentais
Para o teste comportamental em campo aberto, o tratamento do Grupo

Cocaína-Clonazepam (COCCLN) parece ter resultado em um “efeito intermediário”,
em relação aos grupos que receberam apenas cocaína ou apenas clonazepam
(Grupos COC e CLN, respectivamente). Estes resultados foram observados no tempo
de imobilidade e número de quadrantes centrais percorridos. Em um primeiro
momento, pode-se sugerir que o resultado implica em um efeito intermediário causado
pela combinação das duas substâncias, uma vez que o Grupo COC percorreu um
número maior de quadrantes centrais e permaneceu por menos tempo imóvel, com o
Grupo CLN apresentando resultados inversos. Em contrapartida, o grupo COCCLN
também percorreu significativamente menos quadrantes periféricos em comparação
ao Grupo Controle (CTRL) e ao Grupo COC.
Para os testes comportamentais em labirinto em cruz elevado, houve aumento
no tempo de permanência em braços abertos para todos os grupos experimentais, em
relação ao Grupo CTRL. Além disso, houve redução no número de episódios de
avaliação de risco para os Grupos COC e COCCLN, e redução no tempo de
imobilidade para os Grupos COC e CLN, em relação aos animais controle. Esses
efeitos sugerem redução e não aumento da ansiedade, contrariando as previsões de
resultados de um tratamento crônico (File et al., 1987; Yang et al., 1992; Alves et al.,
2017).
51
Discussão
__________________________________________________________________________________
Na literatura, observam-se evidências de como a interação entre

benzodiazepínicos e estimulantes pode falhar em reverter os efeitos provocados por
estimulantes, ou até mesmo causar um agravamento destes efeitos. Já foi relatado
que, em um protocolo de administração conjunta à cafeína, o clonazepam não foi
capaz de exercer função ansiolítica sobre animais previamente tratados com esse
estimulante (Tang et al., 1989). Em outro estudo, o efeito agudo do tratamento com
clonazepam e metanfetamina foi investigado, e diferenças quanto ao padrão de
locomoção dos animais não foram observadas em comparação ao grupo controle ou
ao grupo que recebeu apenas metanfetamina. Esses achados sugerem que a
associação entre o benzodiazepínico e o estimulante não provocou alterações
imediatas no comportamento dos animais (Ito et al., 1997). Por outro lado, observou-
se no mesmo estudo que o tratamento conjunto de clonazepam e metanfetamina por
10 dias preveniu a sensibilização à metanfetamina, quando uma dose dessa
substância foi ministrada 7 dias após o fim do tratamento.
Para o Grupo COC, por sua vez, as alterações comportamentais foram mais
próximas das evidências já descritas na literatura. O aumento de locomoção e de
comportamentos associados à exploração no labirinto em cruz elevado já foi
previamente descrito (Erhardt et al., 2006), bem como o incremento na atividade
locomotora e exploratória em campo aberto (Yeh e Haertzen, 1992; Andersen et al.,
2005). Dessa forma, nossos resultados para o tratamento com cocaína corroboram
estudos previamente realizados.
No entanto, 2 fenômenos essencialmente atrelados ao tratamento a longo-
prazo com substâncias psicotrópicas explicariam de forma sólida os resultados
obtidos, sobretudo os resultados comportamentais que diferem do esperado, a um
primeiro momento, neste estudo. Estes fenômenos são o desenvolvimento de
tolerância, e o surgimento de dependência, associado à síndrome de abstinência, e
são consistentemente embasados pela literatura.
O desenvolvimento de tolerância caracteriza-se pela diminuição dos efeitos
provocados por determinada dose de uma substância, e necessidade de aumento
desta dose para provocar as alterações comportamentais desejadas. Como não
houve reajuste da dose ao longo dos 16 dias de tratamento, há grande possibilidade
de que os animais tenham desenvolvido tolerância aos efeitos das duas substâncias
ao término do protocolo. Galpern e colaboradores (1991) observaram em ratos que,
52
Discussão
__________________________________________________________________________________
após 14 dias seguidos recebendo clonazepam, os resultados comportamentais

obtidos em labirinto em cruz elevado eram estatisticamente idênticos aos do teste
basal, realizado antes do início do tratamento. De forma semelhante, a cocaína pode
gerar tolerância após sucessivos dias de administração (Izenwasser e Cox, 1991;
Emmet-Oglesby e Lane, 1992; Calipari et al., 2014; Siciliano et al., 2016). O
desenvolvimento de tolerância, portanto, explicaria a falta de resultados significativos
em muitas das variáveis exploradas, como por exemplo o suposto “efeito
intermediário” observado no Grupo COCCLN.
Pareado à tolerância, há o desenvolvimento de dependência física, comumente
associado com o uso prolongado de drogas psicotrópicas. Com o estabelecimento da
dependência, a interrupção do tratamento pode levar ao surgimento de sintomas
aversivos, caracterizando uma síndrome de abstinência. Esses sintomas são
descritos em protocolos de administração de cocaína, após períodos de
aproximadamente 2 semanas de tratamento. Carroll e Lac (1987) foram os primeiros
a identificar alterações comportamentais associadas à interrupção da administração
de cocaína. O estudo consistia em um protocolo de autoadministração de 16 dias,
com um período de substituição por salina durante 5 dias. Neste intervalo, o consumo
de alimento dos animais aumentou expressivamente, enquanto o número de
autoinjeções se reduziu, bem como o consumo de glicose com sacarina. Uma das
hipóteses levantadas pelos autores é de que o gosto da solução de glicose foi pareado
com a sensação aversiva provocada pela retirada da cocaína. Posteriormente,
Rogério e Takahashi (1992) identificaram a presença de comportamento tipo-ansioso
em ratos previamente classificados como não-ansiosos após injeção aguda de
cocaína. Adicionalmente, estudos mais recentes também observaram o
desenvolvimento de comportamento tipo-ansioso em ratos tratados com cocaína
durante a adolescência, juntamente a reduções nos níveis de testosterona e dopamina
(Alves et al., 2014). Estes parâmetros foram avaliados após 10 dias de retirada, com
os animais já tendo entrado na fase adulta de seu desenvolvimento. Os resultados
destes estudos, somados à já conhecida associação entre redução na atividade
locomotora/exploratória e surgimento de comportamento tipo-ansioso (Walf e Frye,
2007), corroboram a redução no número de quadrantes periféricos percorridos no
campo aberto pelo Grupo COCCLN. Há exemplos na literatura de protocolos de
tratamento crônico que expuseram animais à cocaína por 7 dias ou menos, com
53
Discussão
__________________________________________________________________________________
alterações comportamentais (Borowsky e Kuhn, 1991) ou moleculares (Zhang et al.,

2001; García-Cabrerizo et al., 2015; Chandra et al., 2017) identificadas. No entanto,
deve-se ter cautela ao afirmar que estas alterações se encontram relacionadas à
formação de dependência, e ao se comparar protocolos de administração distintos.
Algumas questões, porém, permanecem em aberto. Houve aumento na
atividade exploratória para todos os grupos experimentais no labirinto em cruz
elevado, e o Grupo COC consistentemente apresentou resultados relacionados a
locomoção e exploração, nos 2 testes, que sugerem redução da ansiedade. Há
evidências apontando para um caminho inverso durante o desenvolvimento da
síndrome de abstinência, com aumento na mobilidade decorrente da síndrome de
retirada dos animais em aparatos de avaliação comportamental, ao invés de redução.
No estudo de Galpern e colaboradores (1991), os ratos foram testados 4 dias após o
término do tratamento com clonazepam. Foi observado um aumento na atividade
exploratória em campo aberto dos animais em relação ao teste no 14º e último dia de
tratamento. O resultado sugere a instauração de uma síndrome comportamental
associada com upregulation dos receptores GABAérgicos, findado o tratamento, e
seria uma manifestação diferencial dos sintomas de retirada do clonazepam. Para
testes envolvendo cocaína, de forma semelhante, foi descrito aumento na atividade
locomotora dos animais em campo aberto, associada possivelmente a um aumento
nos níveis de monoaminas extracelulares com a exposição prolongada à droga (Citó
et al., 2012). Estes resultados ajudam a explicar o aumento na locomoção no Grupo
COC, e sugerem uma explicação sobre os resultados obtidos no labirinto em cruz
elevado, para os grupos experimentais.
6.2.2. Registro de sono
Para a fase de claridade, observa-se que ratos que receberam cocaína (grupo
COC) apresentaram o menor tempo de sono total dentre todos os grupos. Apesar da
popularização do clonazepam como tratamento para a insônia (Contreras-Gonzalez
et a., 2016), estudos avaliando diretamente seus efeitos sobre parâmetros de sono
são muito escassos, sobretudo comparando-se com suas utilidades nos tratamentos
de diferentes distúrbios de sono (Schenck et al., 2002; Açikel et al., 2916; Sakai et al.,
2017). Um estudo por Kales e colaboradores (1991), no entanto, investigou
54
Discussão
__________________________________________________________________________________
especificamente os efeitos do clonazepam sobre as fases de sono, encontrando

resultados semelhantes com os descritos em nosso estudo, incluindo redução no sono
REM, pareado a um aumento no tempo total de sono e redução no sono de ondas
lentas. Embora não tenhamos identificado, em nosso estudo com ratos, efeitos do
tratamento agudo sobre o sono intermediário, é possível que exposição prolongada
ao tratamento desencadeie mudanças como por exemplo as relatadas por Kales e
colaboradores (1991).
Em relação aos animais tratados com cocaína, a redução no tempo total de
sono e aumento na latência para primeiro episódio de sono REM corroboram estudos
prévios que demonstraram os mesmos efeitos em ratos (Knapp et al., 2007). Em seres
humanos, sabe-se que há prejuízo do sono de ondas lentas e do sono REM como
consequência do uso de cocaína (Valladares e Irwin, 2007; Schierenbeck et al., 2008),
e que ela se torna mais acentuada com a retirada da droga (Pace-Schott et al., 2005).
A cocaína também provocou rebote de sono REM após uma supressão inicial, algo
também já relatado na literatura (Watson et al., 1992). O rebote provocado neste
grupo, no entanto, não foi tão intenso quanto aquele observado no Grupo COCCLN.
Em relação à quantidade de sono de ondas lentas, que não apresentou diferenças
significativas entre os 4 grupos, é possível que o efeito só se torne aparente após
vários dias de tratamento. O Grupo COCCLN apresentou valores intermediários para
tempo total de sono (TTS), não significativamente maiores que os dos controles, o que
pode implicar em um antagonismo entre cocaína e clonazepam para esse parâmetro,
com valores obtidos sendo intermediários para aqueles tratados com só uma ou outra
droga.
Em relação ao sono paradoxal, ou sono REM, no entanto, o que ocorre entre
as duas drogas parece ser um efeito aditivo. Houve redução acentuada no tempo de
sono REM (TREM) no grupo que recebeu as duas drogas em associação (COCCLN)
em relação aos animais controle. O efeito observado na fase de claridade aparenta
ter repercutido também na fase escura, uma vez que, nesse momento, o Grupo
COCCLN também apresentou o maior TREM, com diferenças significativas em
relação ao Grupo CTRL. É possível que este efeito seja uma compensação à redução
em TREM na fase clara. A latência para o primeiro episódio de sono REM (LREM) foi
também significativamente mais alta nos indivíduos do grupo COCCLN em
55
Discussão
__________________________________________________________________________________
comparação com ratos dos Grupos CLN e CTRL, e marginalmente maior quando
comparados com animais que receberam apenas cocaína (Grupo COC).
Os efeitos dos benzodiazepínicos em geral quando utilizados em associação à
cocaína ou outro estimulante sobre padrões de sono ainda carece de mais
investigações. Dugovic e colaboradores (1992) relataram resultados semelhantes ao
que observamos, ou seja, um antagonismo entre cocaína e clordiazepóxido, um
benzodiazepínico menos potente do que o clonazepam. O tratamento conjunto
também levou a uma redução no sono REM dos animais. Em relação ao sono de
ondas lentas, o estudo de Dugovic (1992) encontrou resultados que sugeririam
antagonismo entre as duas substâncias.
As duas substâncias analisadas afetam de forma diferente o sono REM e a
arquitetura do sono em geral, ativando vias de neurotransmissores distintas. Com
base em uma das teorias mais difundidas acerca dos mecanismos pelos quais
estimulantes afetam o sono, a cocaína reduz o tempo total de sono ao promover uma
inibição da recaptação de dopamina, aumentando os níveis deste neurotransmissor e
de noradrenalina no cérebro, gerando uma estimulação que, por consequência, afeta
o sono REM. No entanto, outra teoria que vem sendo defendida é a de que o sistema
serotonérgico seria o principal responsável pelos efeitos deletérios de estimulantes
sobre o sono (Berro et al., 2017, Perez Diaz et al., 2017). No trabalho de Perez Diaz
e colaboradores, o uso de um antagonista do receptor serotonérgico 5HT2A foi capaz
de reverter efeitos deletérios da metanfetamina sobre o sono. O clonazepam, por sua
vez, é um modulador alostérico do receptor GABA-A, e sua ação sobre esse sítio
desencadeia redução do sono REM e do sono de ondas lentas (Kales et al., 1991). A
redução do sono REM, no entanto, não foi observada nos animais do grupo CLN. Isso
sugere que a interação entre as duas substâncias opera de forma relativamente
complexa, com a redução no sono REM sendo exacerbada devido a ativação de vias
neuronais de forma diferenciada quando as duas drogas se encontram juntas. As vias
afetadas em questão, no entanto, ainda não estão estabelecidas, e para a
possibilidade de identificação desses mecanismos, torna necessária a realização de
mais estudos.
Segundo um estudo de Wiers e colaboradores (2016), a privação de sono
potencializa a transmissão dopaminérgica em usuários de cocaína, o que está
associado a um maior comportamento de risco e busca pela droga. É sabido que
56
Discussão
__________________________________________________________________________________
problemas de sono estão relacionados a uma maior chance abuso de substâncias e

a maiores chances de recaída (Teplin et al., 2006; Angarita et al., 2016). Dessa forma,
deve-se considerar a possibilidade de que, ao aumentar o prejuízo sobre o sono
quando utilizadas em conjunto, a cocaína e o clonazepam podem facilitar o
desenvolvimento de dependência.
6.2.3 Neurogênese hipocampal
Não foi identificada, neste estudo, nenhuma diferença significativa entre os

grupos experimentais e o grupo controle quanto ao número de células marcadas com
BrDU, e que, portanto, estariam passando por evento de proliferação neuronal. Os
resultados vão de encontro ao que se observa na literatura. Há diversos exemplos
demonstrando como a neurogênese hipocampal pode ser prejudicada devido à
administração de cocaína em modelos animais (Andersen et al., 2007; Castilla-Ortega
et al., 2016). De forma semelhante, para o clonazepam, Chen e colaboradores (2009)
observaram uma redução acentuada de 65% nos eventos de neurogênese em
animais jovens tratados com clonazepam.
Outra perspectiva que seria levantada com a análise da neurogênese seria a
participação dos receptores GABAérgicos nos processos neurogênicos, e
subsequentes impactos no desenvolvimento de ansiedade. Esta relação entre
comportamento tipo-ansioso, neurogênese reduzida e déficits nos receptores GABA-
A já foi previamente evidenciada em estudo com camundongos nocaute (Earnheart et
al., 2007). Pode-se hipotetizar que há uma correlação entre a distribuição difusa dos
resultados comportamentais e a falta de diferenças significativas quanto à proliferação
neuronal dos animais.
A falta de resultados significativos para o Grupo CLN pode estar relacionada
com a idade dos animais durante a realização do protocolo. Chen e colaboradores
(2009) identificaram queda acentuada na neurogênese hipocampal em ratos jovens.
Os animais utilizados neste estudo, por sua vez, já haviam chegado à fase adulta,
com processos neuronais já formados e estabelecidos. Outra possível explicação tem
relação com as propriedades serotoninérgicas do clonazepam. O acúmulo de
serotonina pode ser benéfico à proliferação neuronal (revisado por Apple et al., 2016),
e estudos anteriores relatam que o clonazepam, após tratamento por sucessivos dias,
57
Discussão
__________________________________________________________________________________
leva a um aumento nos níveis de serotonina (Lima et al., 1993). Somam-se a isso
possíveis efeitos do receptor GABA-A sobre a neurogênese. Alguns estudos apontam
que a ativação deste receptor específico pode levar ao aumento da diferenciação
celular (Tozuka et al., 2005). Dessa forma, o clonazepam poderia estar levando a uma
intensificação dos processos relacionados à neurogênese devido aos receptores por
ele ativados. No entanto, seria necessária a avaliação dos níveis serotoninérgicos e
GABAérgicos no momento da eutanásia do animal, para uma correlação com os
processos neurogênicos observados. Deve-se considerar se após 1 dia de abstinência
da droga (uma vez que mais de 24 horas haviam se passado desde a última injeção,
quando a eutanásia foi realizada) algum efeito diferenciado sobre a neurogênese
poderia ser encontrado. Há evidências, por sua vez, de que a interrupção de
tratamento com a cocaína pode resultar não apenas em uma retomada do processo
neurogênico, mas também na sua exacerbação, levando a uma proliferação neuronal
ainda mais intensa do que anteriormente ao tratamento com cocaína (Castilla-Ortega
et al., 2016). Adicionalmente, a dopamina está relacionada com a proliferação
neuronal na região subventricular do giro denteado, por meio do estímulo da secreção
de fator de crescimento epidérmico (Craig et al., 1996). Estudos relacionando o efeito
desse neurônio sobre a região subgranular seriam de grande valia para identificar se
algo semelhante não ocorreria nessa região também.
Deve-se considerar também a presença de controvérsias acerca do efeito da
cocaína sobre a neurogênese. Apesar de evidências que mostram a redução da
neurogênese, como previamente mencionado, alguns estudos encontraram ressalvas
a esta afirmação. A cocaína pode reduzir a proliferação neuronal, mas não prejudicar
a maturação ou a sobrevivência dos neurônios gerados, após administração por 24
dias de cocaína em ratos (Domínguez-Escribá et al., 2006). Outro experimento,
utilizando camundongos, separou, para análise, o hipocampo em porção dorsal e
ventral, encontrando, para a porção dorsal, uma maior quantidade de células
marcadas com BrDU, quando comparado com a porção ventral, e em comparação
com animais controle (Lloyd et al., 2010).
Deve-se considerar, no entanto, aspectos metodológicos que podem ter
influenciado nos resultados, como o uso de contagem manual para obtenção do
número de células, ou a utilização de um setor específico do giro denteado para
realização da análise.
58
Discussão
__________________________________________________________________________________
O uso de outros marcadores celulares também auxiliaria em uma melhor

caracterização dos processos neurogênicos hipocampais. A doublecortina (DCX), por
exemplo, poderia ser usada para determinar a quantidade de células recém geradas
que maturaram (Dominguez-Escriba et al., 2006) , enquanto que NeuN poderia ser útil
para identificar neurônios recém diferenciados, e teria o benefício de ser uma
marcação específica de tecido neuronal (Gusel’Nikova e Korzhevskiy, 2015). Outras
estratégias para a contagem dos neurônios em proliferação poderiam ser utilizadas,
como o de Domínguez-Escribá e colaboradores (2006), que apenas consideraram
células com coloração diferencial e na extremidade da zona sub-granular para a
análise, ou ainda o uso de técnicas de imunofluorescência, tal como realizado por
Chen e colaboradores (2009). Pode-se dizer que há grande quantidade de estudos
muitas vezes conflitantes investigando o efeito da cocaína ou clonazepam sobre a
neurogênese (Tozuka et al., 2005; Andersen et al., 2007; Chen et al., 2009; Castilla-
Ortega et al., 2016). Estes achados, juntamente aos resultados obtidos neste estudo
podem sugerir a existência de uma rede complexa de mecanismos sendo ativada de
forma específica pela cocaína ou pelo clonazepam, e que, futuramente, poderia
constituir um foco de investigação. Dependendo da forma como é ativada pelas duas
drogas esta rede pode influenciar o efeito sobre a neurogênese observado. Essa
diversidade de resultados, somada à grande variedade de escolhas metodológicas ou
fatores ambientais que podem influenciar nos resultados obtidos, mostra ser
necessária a continuidade de estudos, com diferentes técnicas e protocolos, para
investigar os mecanismos da neurogênese afetados pela cocaína e pelo clonazepam.
59
Conclusões
Conclusões
__________________________________________________________________________________
7 Conclusões
Este estudo teve como objetivo avaliar alterações comportamentais, a

neurogênese e o sono em ratos após um tratamento agudo e crônico com cocaína e
clonazepam, caracterizando um estudo translacional.
Em relação às alterações comportamentais observadas, os resultados obtidos
são diferentes manifestações de síndrome de abstinência induzida pelo tratamento
crônico com cocaína e/ou clonazepam ao longo de 16 dias e interrupção do tratamento
24 horas antes do teste. Assim, podem ter relação com aumento do comportamento
tipo-ansioso dos animais.
Na avaliação do padrão de sono dos animais após tratamento agudo com
cocaína e clonazepam, encontrou-se redução significativa do sono REM, com rebote
observado na fase escura, e aumento significativo da latência para início de sono
REM. Essas alterações foram mais acentuadas no Grupo COCCLN, indicando que a
combinação entre cocaína e clonazepam amplifica os prejuízos causados na
arquitetura do sono.
A análise da neurogênese não encontrou resultados significativos, o que pode
ser um indício de uma rede mais complexa de fatores da neurogênese influenciadas
pela cocaína e pelo clonazepam. Outras técnicas experimentais também poderiam
ajudar a encontrar outras alterações que não foram observadas neste protocolo e a
melhor caracterizar os mecanismos neurogênicos.
7.1 Implicações
Drogas psicotrópicas constituem agentes de natureza complexa, capazes de

afetar diversos aspectos do organismo, mediante um conjunto de condições. A
cocaína e o clonazepam são duas substâncias de histórias de uso e propriedades
farmacológicas diferentes, mas que podem provocar desfechos prejudiciais à saúde
de forma semelhante, afetando, entre outros parâmetros, o surgimento de transtornos
psiquiátricos, o sono e os processos neuronais dos indivíduos.
Em nossa sociedade atual, a combinação de diferentes drogas pelos usuários
tem se tornado uma preocupação crescente e que ocasiona o surgimento de
interações farmacológicas perigosas. A combinação de clonazepam à cocaína, na
61
Conclusões
__________________________________________________________________________________
tentativa de minimizar os efeitos negativos colaterais desta última, levanta questões

quanto ao impacto na saúde dos usuários. Este projeto avaliou alguns dos efeitos que
essa combinação de substâncias pode provocar na saúde. Dessa forma, espera-se
que esse estudo sirva como contribuição para o entendimento dos efeitos de interação
entre cocaína e clonazepam sobre diferentes aspectos do organismo, ajudando na
construção da base para o tratamento de pacientes usuários dessa combinação.
62
Referências
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77
Anexos
Anexos
Anexo 1 Carta de aprovação do projeto na Comissão de Ética no Uso de

Animais na UNIFESP (CEUA n°7097040716)
79
80
Anexo 2 Publicações Científicas
81

2019 DOKKEDAL-SILVA, VINICIUS - Mestrado

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2019 DOKKEDAL-SILVA, VINICIUS - Mestrado

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VINÍCIUS DOKKEDAL SILVA

EFEITOS DO USO ASSOCIADO DA COCAÍNA E CLONAZEPAM NO

Dissertação apresentada à Universidade Federal

EFEITOS DO USO ASSOCIADO DA COCAÍNA E CLONAZEPAM NO

Dissertação desenvolvida durante o curso de Pós-

Dokkedal Silva, Vinícius

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA

Chefe do Departamento de Psicobiologia

Coordenadora do Curso de Pós-graduação

Chefe da Disciplina de Medicina e Biologia do Sono

EFEITOS DO USO ASSOCIADO DA COCAÍNA E

CLONAZEPAM SOBRE O COMPORTAMENTO TIPO

ANSIOSO, SONO E NEUROGÊNESE EM RATOS

Banca Examinadora – Titulares

Banca Examinadora – Suplentes

Biologia do Sono, da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de

Medicina, com o apoio financeiro da Associação Fundo de Incentivo à Pesquisa

(AFIP), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal Nível Superior – Brasil (CAPES)

– Código de Financiamento 001, e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico

e Tecnológico (CNPq) (processo #133397/2017-3).

Aos meus pais, Clidemar Ramos Silva Júnior e Olga

Cristina Dokkedal Silva. Vocês foram a luz que me

guiou por toda a vida e Mestrado adentro, mesmo nos

momentos mais escuros. Eu não sei como agradecer

o suficiente. Amo vocês.

Partindo-se do pressuposto que uma força maior existe e rege os aspectos do

colocou as pessoas abaixo em meu caminho, também vai meu segundo.

À minha namorada, Karla Menezes e Vasconcelos, que também teve uma

seja para o mesmo caminho, a percorrermos juntos.

À Monica Levy Andersen, orientadora e professora que me ensinou a

importância da dedicação ao trabalho e de expandir meus horizontes, e teve um papel

importantíssimo na minha formação como pesquisador.

de admiração e inspiração, e um grande conselheiro durante todo o meu Mestrado.

À minha melhor amiga, Thaís Bianchini Moretti Caprara. Somos irmãos de

coração, e um compartilhou com o outro seus melhores e piores momentos. Sua

Estamos distantes fisicamente, mas vocês estão no meu coração.

Ao Prof. Sergio Tufik, que apoiou o desenvolvimento deste estudo e é uma

nos motivando a continuar em fascínio com a ciência.

Ao grupo Progressão, meu grupo de pesquisa, por todo o apoio e por me

ajudar a crescer como pesquisador ao longo desses 2 anos. Especialmente à Lenise,

enorme cumplicidade durante esse período, e ao Guilherme, pelo companheirismo

durante diversas etapas do projeto.

À Laís Fernanda Berro, que mesmo na outra ponta do continente, me ajudou

Ao Dunga, Ricardinho, Zé, Vinícius, Gilbertinho e Andrea, por terem me

ajudado com os meus experimentos, e durante todo esse processo, terem me

ensinado coisas valiosas sobre o meu trabalho.

passagem pelo Centro durante o projeto, meu muito obrigado.

Aos membros de minha Banca de Qualificação e Defesa por aceitarem o

melhorar este projeto.

demonstração de como a pesquisa com animais é importante para todos nós.

Figura 1 Delineamento experimental do protocolo de análise comportamental em 2

momentos (Experimento 1) ........................................................................................27

Figura 2 Imagem esquemática do campo aberto ......................................................28

Figura 3 Imagem esquemática do labirinto em cruz elevado ....................................28

Figura 4 Delineamento experimental do protocolo para análise do sono,

comportamento e neurogênese em ratos (Experimento 2) ........................................30

Figura 5 Imagem representativa de um rato durante teste comportamental em campo

Figura 6 Imagem representativa de um rato durante teste comportamental em labirinto

em cruz elevado ........................................................................................................32

Figura 7 Imagem representativa da região de interesse para avaliação da

neurogênese do giro denteado do hipocampo (hemisfério esquerdo) .......................35