UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA

FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA

Departamento de Química

Técnicas de Laboratório

Cromatografia
 

LICENCIATURA EM BIOQUÍMICA

  

Ano Letivo 2020-2021

Débora Pombo / nº 59996

 TRABALHO Nº 6

Cromatografia

1. Resumo
Nesta atividade laboratorial realizou-se a separação da trimiristina duma mistura de noz-moscada e
n-hexano/diclorometano (1:1) em cinco frações diferentes, a partir da cromatografia em coluna.

Após a separação, as frações foram eluídas numa placa cromatográfica na câmara de eluição. A
visualização da cromatografia foi possível devido à análise da placa de ccd à luz UV sendo posteriormente
colocada em câmara de iodo para a revelação.

Perante o que se observou no placa depois de retirada da câmara de iodo, selecionou-se as frações
mais puras (aquelas cuja marca de eluição é mais idêntica à marca de eluição do padrão de trimiristina, na
placa) e colocou-se num balão de fundo redondo. Seguidamente, o conteúdo do balão foi evaporado no
evaporador rotativo e, após a evaporação, foi pesada a massa de trimiristina obtido. Por fim, o rendimento
experimental obtido foi de 50%.

2. Introdução [1]
Esta atividade experimental tem como objetivo a separação da trimiristina duma mistura de noz-
moscada e n-hexano:CH₂Cl₂ (1:1), a partir da cromatografia em coluna.

A cromatografia é um método de separação de componentes de uma mistura, baseado na migração

diferencial desses componentes devido a diferentes graus de interação entre duas fases imiscíveis: fase
móvel e fase estacionária.

A fase móvel pode ser líquida ou gasosa. O gás/líquido move-se através da placa/coluna carregando
solutos. A fase estacionária pode ser sólida ou líquida. O sólido/líquido está impregnado num sólido que
permanece fixo na placa/coluna.

Dependendo das quantidades de analitos a separar e da matriz a analisar, a cromatografia pode ser
preparativa ou analítica. No sistema cromatográfico, os analitos separados eluem de maneira distinta, em
função da sua interação com as duas fases, como também da temperatura, humidade, condições de eluição,
etc. A grandeza que caracteriza esta diferença denomina-se por fator de retenção – R f .

Distância percorrida pela mancha de analito (cm)

Rf=
Distância percorrida pela frente do eluente (cm)

Na cromatografia de absorção, a fase estacionária é um sólido poroso que retém tanto soluto como
solvente, neste caso, o sólido utilizado foi a sílica (SiO₂). Este processo pode ser realizado em placa (ccd –
cromatografia em camada delgada) ou em coluna. Depois de se aplicar a mistura a separar, a fase
estacionária será percorrida por um líquido – o sistema eluente – por capilaridade. A capacidade de
deslocação do soluto através da fase estacionária depende da polaridade do sistema eluente: quando mais
polar for o sistema de eluentes, maior será a distância percorrida pelo soluto. Podemos agrupar os eluentes
 conforme a sua capacidade de eluição para um determinado absorvente, em séries eluotrópicas, começando
pelos menos polares e acabando nos mais polares.

Para visualizar/revelar a cromatina, é necessário tratar a placa

cromatográfica de forma a que se observe os componentes após a
separação. O processo mais frequente é a análise das placas de ccd à luz de
UV e posterior revelação com um revelador universal ou específico, neste
caso, utilizou-se a câmara de iodo. O absorvente está colocado sobre uma
superfície plana de vidro, alumínio ou plástico de dimensões 7x2,5.

Figura 1 - Placa cromatográfica (ccd) [1].

3. Parte experimental
Trimiristina Sílica n-hexano Diclorometano

Fórmula
C₄₅H₈₆O₆ SiO₂ C₆H₁₄ CH₂Cl₂
Molecular

Massa
723,16 60,08 86,18 84,93
Molecular

Ponto de
57°C 1710°C -94,3°C -95°C
Fusão

Ponto de
311°C 2230°C 69°C 40°C
Ebulição

Densidade
0,885 (20°C) 2,65 (20°C) 0,66 (20°C) 1,33 (20°C)
(g/cm3)

Solubilidade
Insolúvel 0,012 0,0095 20
(g/L)

Fórmula de
Estrutura

Tabela 1 - Propriedades dos reagentes [2][3][4][5].

Segurança dos reagentes:

n-hexano [4]:

 Prejudicial; inflamável; irritante; pode ser mortal por ingestão/inalação; tóxico para reprodução;
perigoso para o meio ambiente.
Diclorometano [5]:

 Prejudicial; cancerígena; provoca irritação cutânea e ocular grave; causa sonolência ou tonturas.

Iodo [6]:

 Prejudicial; provoca irritação cutânea e ocular grave e irritação respiratória; causa danos aos órgãos
através de exposição prolongada ou repetida se engolido; muito tóxico para a vida aquática.

Material, reagentes e equipamento utilizado [1]:

 Sílica (1,0 g);  Funil;

 Tubo de amostra com 100 mg de extrato  Tubos de ensaio com suporte;
da noz-moscada;  Placa cromatográfica;
 n-hexano:CH₂Cl₂;  Capilar;
 Algodão;  Câmara de eluição;
 Areia;  Lâmpada de UV;
 Proveta;  Câmara de iodo;
 Pipeta Pasteur;  Balão de fundo redondo;
 Espátula;  Evaporador rotativo;
 Pinça/noz;  Balança técnica (incerteza de 0,01 g).
 Gobelé;

Procedimento Experimental [1]:

Preparação da coluna:

1. Começou-se por introduzir um pouco de algodão na extremidade inferior duma pipeta Pasteur e
adicionou-se uma camada de areia com cerca de 0,5 cm de altura.
2. Num gobelé, pesou-se 1 g de sílica para cromatografia flash e verteu-se na coluna usando um funil.
3. Por fim, adicionou-se uma camada de areia com cerca de 0,5 cm de altura e posteriormente o
eluente até o absorvente (sílica) estar completamente embebido.

Separação da trimiristina:

4. Pesou-se para um tubo de amostra 0,10 g do extrato de noz-moscada da aula anterior e dissolveu-se
em 1 mL de n-hexano:CH₂Cl₂ (1:1), depois aplicou-se no topo da coluna de sílica e deixa-se correr o
eluente até que o extrato seja absorvido.
5. Uma vez iniciada, sem interrupções, a eluição da coluna usando o n-hexano:CH₂Cl₂ (1:1) como
eluente, recolheu-se cindo frações para tubos de ensaio diferentes (numerados de 1 a 5)
adicionando sempre eluente de forma a que a coluna nunca seque.
 6. Após recolhermos as cinco frações aplicámos, com um capilar, cerca de 10 gotas de cada fração e um
padrão de trimiristina numa placa cromatográfica em camada delgada.
7. De seguida, eluiu-se a placa numa câmara de eluição com eluente n-hexano:CH₂Cl₂ (1:1). Terminada
a eluição, retirou-se a placa da câmara e deixou-se secar.
8. Visualizou-se a placa sob a lâmpada UV com posterior revelação da mesma em câmara de iodo.
9. Para cada fração, calculou-se a o R f da trimiristina e avaliou-se o grau de pureza.
10. Evaporaram-se as frações mais puras (neste caso, as frações 2 e 3) para um balão de fundo redondo
e levou-se à secura num evaporador rotativo.
11. Por fim, pesou-se o balão após o solvente ser evaporado e registou-se o peso de trimiristina obtido.

Registo dos resultados/Cálculos:

Distância percorrida pela Distância percorrida pela distância … analito

Rf =
mancha de analito (cm) frente do eluente (cm) distância … eluente

Padrão 3,0 0,59

Fração 1 0 0

Fração 2 2,4 0,47 (mais pura)

5,1
Fração 3 2,3 0,45 (mais pura)

Fração 4 1,0 0,20

Fração 5 0,8 0,16

Tabela 2 - Resultados da placa cromatográfica.

m balão = 37,23 ± 0,01 g

m balão + frações 2 e 3 = 37,28 ± 0,01 g 0,05

η= ×100=50 %
0,10
m tr i miristina pesada = 0,10 ± 0,01 g

m trimiristina obtida = 37,28−37,23 = 0,05 ± 0,01 g

4. Resultados e Discussão
Aquando do passo 7 do procedimento, após a placa cromatográfica ser colocada na câmara de
eluição, o eluente vai subindo pela mesma até embeber toda a placa. À medida que isto acontece, os
compostos presentes na mistura estão a ser separados sendo que, os mais polares progridem mais
lentamente do que os menos polares (cada mancha na placa corresponde a um composto diferente).
 Em algumas cromatografias, as manchas apresentam variadas cores, mas neste caso elas são
incolores devido ao facto dos compostos usados também serem incolores. Uma vez que não é possível
observar as manchas a olho nu, temos de recorrer à luz UV e à câmara de iodo. A luz UV irá nos permitir
visualizar as manchas e o iodo irá revelá-las, tornando-as de incolores para uma cor amarelada/acastanhada.

Após a revelação das manchas, selecionámos as frações mais puras, ou seja, aquelas que continham
mais trimiristina pura. Estas frações são aquelas cuja marca de eluição é mais idêntica à marca de eluição do
padrão de trimiristina, na placa.

Apesar das frações não serem completamente puras, pois para a mesma fração observou-se várias
manchas que equivalem a outros compostos, as frações 2 e 3 demonstraram ser as que continham mais
trimiristina pura pois, comparativamente ao padrão (R f =0,59 ¿, são as que apresentam os valores mais
idênticos (R f 2=0,47)( R f 3=0,45). Pelo cálculo dos R f , podemos concluir que a fração 1 não apresenta
trimiristina na sua composição ( R f 1=0 ) e as frações 4 e 5 contém trimiristina, mas com um valor de pureza
muito baixo ( Rf 4 =0,20 ¿( R f 5=0,16).

No final, verteram-se as frações 2 e 3 para serem evaporadas no evaporador rotativo e a massa de

trimiristina obtida das duas frações foi de 0,05 g como podemos observar nos cálculos realizados
anteriormente. Sendo que a massa pesada inicialmente foi de 0,10 g, o rendimento experimental foi de 50%.
Este valor pode dever-se a erros como, por exemplo, a presença de impurezas nas amostras ou a uma má
separação da trimiristina como consequência de uma má montagem da coluna de cromatografia.

5. Conclusão
Podemos então concluir que, o objetivo da atividade experimental – a separação da trimiristina
duma mistura de noz-moscada e n-hexano:CH₂Cl₂ (1:1) a partir da cromatografia em coluna – foi atingido
com sucesso apesar do rendimento obtido ser de apenas 50% devido maioritariamente às impurezas
presentes nas amostras como foi discutido anteriormente.

6. Bibliografia
1. OLIVEIRA, Elisabete; PEREIRA, Florbela; MARKOVA-PETROVA, Krasimira; BRANCO, Luís; FERREIRA,
Luísa; VENTURA, Márcia; SILVA, Marco; GAGO, Sandra; ROSA, Vitor; “Técnicas de Laboratório” (2020-
2021) – “6ª sessão – Cromatografia”.
2. Trimiristina - Wikipedia, la enciclopedia libre
3. Silicon dioxide CAS 7631-86-9 | 113126 (merckmillipore.com)
4. n-Hexane CAS 110-54-3 | 100795 (merckmillipore.com)
5. Dichloromethane CAS 75-09-2 | 106050 (merckmillipore.com)
6. Iodine CAS 7553-56-2 | 104761 (merckmillipore.com)