PRACTICA 4: ELISA PARA ANTGENO AVIARIO INTRODUCCIN: La tcnica de ELISA (EnzymeLinkedInmunoSorbentAssay) es un procedimiento de ensayoinmunoenzimtico.

Se basa en la deteccin antgeno(Ag) o anticuerpo (Ac), inmovilizado sobre una faseslida y mediante anticuerpos que directa oindirectamente producen una reaccin, la pruebarecurre al empleo de inmungenos, haptenosoanticuerpos marcados con una enzima cuyo productocolorido, puede ser medido espectrofotomtricamente.Este principio consigue,mediante el uso de la fase slida, de una separacinfcil entre la fraccin retenida y la fraccin libre. Fases de realizacin de una ELISA: y Sensibilizacin de la placa. y Bloqueo de espacios vacos. y El Ag o el Ac se fija a una superficie. y Aplicacin del espcimen de prueba. y Controles positivo y negativo y Deteccin y caracterizacin por Ac. 2 marcado. y Incubacin con la muestra. y Incubacin con el sistema de deteccin. y Adicin del sustrato. Los diferentes tipos de ELISA son: Anticuerpos Marcados y y y ELISA Directo ELISA Indirecto ELISA Sandwich Doble (DAS) Heterlogo (HADAS)

Antgenos Marcados y ELISA Competitivo ELISA Directo. Consta de las siguientes etapas: y Fijacin al soporte insoluble ( tapizado ) de antgenos especficos. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados. Adicin de anticuerpos marcados ( conjugados ) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antgenos, el complejo quedar solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no

hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. ELISA Indirecto. Consta de las siguientes etapas: y Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados. Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarn especficamente con los antgenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antgenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. ELISASndwich DAS (Double Antibody Sandwich). Consta de las siguientes etapas: y Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno), reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. ELISA Sndwich HADAS . Consta de las siguientes etapas: y Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno), reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte), los cuales reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionado. Adicin de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior. Lavado para eliminar los anti-

anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. ELISA Competitivo. Consta de las siguientes etapas: y Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. Adicin en concentracin conocida de una mezcla de antgenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados con una enzima y antgenos desconocidos objeto de estudio. Paralelamente, aadir nicamente antgenos del anticuerpo usado en el paso anterior, marcados con una enzima. Lavar para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas son anlogas, el antgeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte. Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el antgeno objeto de estudio, est relacionado serolgicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad ptica, es proporcional a la concentracin del antgeno problema en la muestra. Todos los tipos de ELISAs se pueden resumir en dos grandes grupos: ELISAs para detectar antgenos: ELISAs sndwich. ELISAs para detectar anticuerpos: ELISAs indirectos.

OBJETIVOS: y y y Conocer el fundamento y las fases en la realizacin de la tcnica de ELISA, y cules son las variantes de este mtodo. Detectar la presencia de anticuerpos no precipitantes. Identificar la presencia de un contenido de antgenoy la dilucin del conjugado del Anticuerpo para sta tcnica.

PROCEDIMIENTO: Preparacin del antgeno. Cuando la concentracin del suero de paloma es de 30mg/ml Suero de paloma (30mg/ml) 10Ql (suero de paloma) + 1ml de buffer CO320.5 ml de dilucin anterior + 7 ml CO321.0 ml de dilucin anterior + 7 ml CO32Se plaquean 50 Ql de la ltima dilucin en cada uno de los pozos y se deja la placa en refrigeracin a 4oC durante toda la noche. Soluciones Buffer Fosfatos Salino (PBS) Solucin A NaCl 80g KCl 2g CaCl2 1g MgCl26H2O 1g H2O cbp 1lt Solucin B Na2HPO4 12 H2O o Na2HPO4 KH2PO4 H2O cbp 28.98 g 11.5 g 2.0 g 1lt

Se toman 100 ml de A+100 ml de B y se le aaden 5.0 ml de Tween 20, se ajusta el pH a 7.4 y se afora a 1lt. Buffer de carbonatos 0.01 M Carbonato de Sodio 2.1 g en 100 ml (Sol A) Bicarbonato de Sodio 1.7 en 100 ml de (Sol B)

Se prepara aadiendo 1 ml de solucin A + 4ml de solucin B, se ajusta el pH a 9.6 y se afora a 100 ml. Buffer de citratos cido Ctrico (anhidro) 1.921g en 100 ml (sol A) Citrato de Sodio 2H2O 2.941g en 100 ml (sol B) Se prepara aadiendo 28 ml de Sol A +22 ml de Sol B, se ajusta el pH a 4.5 y se afora a 100ml. Solucin de cido Sulfrico 1N H2SO4 (c) H2O cbp 5.64 ml 100 ml

PBS albmina (PBSA) A 100 ml de PBS se le agregan 0.5 g de albmina (SIGMA A 7030) y se ajusta el pH a 7.4. Preparacin Sueros. A 0.5 Ql de PBSA se lo aaden 5 Ql del suero a probar (Dil 1:100), de esta dilucin se toman 50 ml y se aaden a 700 Ql de PBSA (Dil 1:500). a) La placa se lava 3 veces durante 2 min. Con PBS-tween b) La placa se bloquea con 200 ml de PBSA, durante 1 h en reposo. La placa se lava nuevamente como en el paso 1 se seca. c) Se colocan 50 ml por pozo del suero diluido por triplicado y se incuba durante 1 h con agitacin continua. Al trmino de la incubacin se lava 3 veces como en el paso 1. d) Durante el ltimo lavado se prepara el conjugado (E-IgG humana hecho en cabra, especifico de cadenaK); 5ml de conjugado en 5ml de PBSA (Dil 1:1000), de esta dilucin se toma 1ml + 9ml de PBSA (Dil 1:10). e) Se seca la placa y se colocan 50ml de conjugado a cada uno de los pozos y se incuba durante 1 h con agitacin. Se lava nuevamente como en el paso 1. f) Durante el ltimo lavado se pesan 10 mg de ortofenilenediamina para 10 ml de buffer de Citratos y se le aaden 4 ml de H2O2 al 30%, se seca bien la placa y se colocan 50 ml de esta solucin y se deja incubar durante 10 min. g) La reaccin se para con 200 ml de H2SO4 1N

RESULTADOS: Las pruebas fueron positivas en los pozos:

ANALISIS DE RESULTADOS: ste tipo de estudios se realizan paraestandarizar un mtodo de ELISA para un antgenodeseado. Cuando se agreg el conjugado, comienza la unin a los complejos inmunes formados paradesencadenar una reaccin, posteriormente se agreg un sustrato que inicia la reaccin de color y por ltimo esta reaccin se detuvo con una solucin de frenado. La densidad pticaobtenida es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpos presentes en la muestra, que en este caso la reaccin de color puede ser observada a simple vista. La lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimtricamente, en este caso visualmente, a simple vista se ley el resultado del ensayo, ya que no se requiri la cuantificacin del antgeno de paloma contenido en el suero. En sta prctica se realiz de manerademostrativa como se realiza la tcnica de ELISAdesde el pegado de antgeno a la placa, las diluciones del mismo y la dilucin del anticuerpo. En sta prctica se conocieron los fundamentos y larealizacin de la tcnica de ELISA, as mismo losfactores que afectaron durante el experimento, en stecaso las diluciones y tiempo de incubacin. BIBLIOGRAFIA: y y y ROITT I, et al. Inmunologa. 5 edicin. Espaa: Harcourt. ANBAL MARGNI R. Inmunologa e inmunoqumica fundamentos. Argentina: Ed. Panamericana. ABBAS, A.K., LICHTMAN, A.H., POBER, J.S: Inmunologa celular y molecular. Madrid: Ed. Interamericana-McGraw Hill