Cultivo de embriones bovinos:
Esterilización y control de calidad
y toxicidad en los laboratorios de
producción de embriones.
Parte (I)
A.T. Palasz y J. de La Fuente
Dept. de Reproducción Animal y Conservación de Recursos Zoogenéticos. INIA, Madrid
Julio de la Fuente
Introducción
Aunque los procedimientos para el cultivo de em-
briones han sido establecidos hace mas de 100 años (He-
ape, 1891), el desarrollo de técnicas in vitro para producir
embriones ha ido tomando relevancia durante el paso del
tiempo. Sin embargo la aplicación, desde un punto de
vista comercial, de los embriones producidos por fecunda-
ción in vitro (FIV) es aun muy limitada debido fundamen-
Una rutina talmente a la baja eficiencia y repetibilidad de los sistemas
diaria de de cultivo in vitro.
limpieza y Es por tanto de gran importancia disponer de es-
control de la trictas medidas de control de la calidad en el laboratorio
asepsia en las de FIV, así como tratar de evitar la toxicidad que sobre
el semen y los embriones pueden llegar a producir los
superficies en materiales utilizados para su manipulación.
contacto con
los envases de
los embriones Medidas de Control de Calidad
prevendrán
una posible En el Laboratorio
contaminación El laboratorio debe estar separado de los locales para
de los cultivos el alojamiento y la obtención de embriones y gametos de
en el incubador los animales y solo deberán tener acceso a él las personas
directamente relacionadas con la manipulación in vitro de
los embriones. El suelo y las paredes deberán limpiarse
de forma rutinaria con desinfectantes, de probada acción
no toxica para los embriones, al igual que las zonas de
trabajo como son las mesadas y en particular la mesa de
flujo laminar, que ha de ser limpiada frecuentemente con
una solución de alcohol al 70%. En condiciones de granja
se ha de hacer un esfuerzo adicional usando papel limpio,
a ser posible estéril, para las superficies de manipulación
de los embriones. Deberá estar prohibido, fumar, comer
o beber en todas aquellas zonas donde se manipulen los
embriones y la higiene personal (usando batas limpias, cu-
bre zapatos y guantes de plástico), así como procurar una
desinfección metódica (con alcohol) antes de manipular a
los embriones.
Equipamiento
Solo el equipamiento estrictamente necesario; Mi-
croscopio, lupa y micromanipuladores, platina calen-
tadora, estufa de cultivo, congelador y Biocongelador,
osmómetro y pH-metro, deben estar dentro del labo-
ratorio. Ha de tenerse un cuidado especial para man-
tener limpias las superficies externas de los equipos,
limpiándolas al menos semanalmente. Deben ponerse
coberturas a los microscopios y micromanipuladores,
limpiar las superficies donde se depositen las placas con
las muestras con una solución de alcohol al 70%, con
tiempo suficiente para permitir que el alcohol se eva-
pore antes de empezar a trabajar con los embriones. Ha
de ponerse una atención especial al incubador, ya que
la elevada temperatura y la alta humedad ambiental
hacen un caldo de cultivo perfecto para el crecimiento
de cualquier bacteria, hongo o virus. Una rutina diaria
de limpieza y control de la asepsia en las superficies
en contacto con los envases de los embriones preven-
drán una posible contaminación de los cultivos en el
incubador, el cual además ha de situarse en una zona
de tráfico ligero del personal y de mínimo movimiento
 Efectos del tipo de conservante añadido al ensilado de trigo sobre la producción y composición
Cultivo de embriones bovinos: Esterilización y control de calidad y toxicidad en los laboratorios de producción de embriones
química de la leche
de aire. El contenedor del agua del incubador ha de
limpiarse mensualmente y rellenarse con agua destila-
da, añadiendo 10-12 gotas de solución de limpieza de
baños maría de Sigma (Sigma #S-5525) por cada 5 li-
tros. Debe instalarse un filtro de 200 nm de poro en los
tubos de entrada de gases al incubador. Mientras que
algunos técnicos piensan que se ha de limpiar men-
sualmente el incubador, otros tienen la estrategia con-
traria, esto es, la de no tocar los incubadores mientras
no exista contaminación. Diariamente debe controlarse
la temperatura, CO2 y la humedad y ajustarse si fuera
necesario.
La toxicidad potencial de los
diferentes tipos de jeringas
Se conoce desde hace bastante tiempo que al-
gunos materiales resultan ser tóxicos para los diferentes
tipos celulares, en especial después de determinados mé-
todos de esterilización. Así pues, está siendo una practica
habitual el testar la posible existencia de toxicidad en los
materiales que van a estar en contacto directo con los
gametos y embriones. El lubricante del émbolo de ciertos
tipos de jeringas de plástico ha sido determinante para
la generación de problemas tóxicos, tanto en el esperma
como en los embriones.
Espermatozoides
Fueron realizados dos experimentos para de-
terminar hasta que punto podían resultar espermicidas
los émbolos de las jeringas de plástico (Broussard et al.,
1993). Los émbolos de goma o de plástico fueron culti-
vados por separado junto al diluyente espermático duran-
te 24 horas a 40C. Después de la incubación el diluyente
fue conservado a -200C hasta el momento de la colecta
del semen. Como control se utilizó diluyente incubado a
40C durante 24 horas. Los tratamientos consistieron en
lo siguiente: Grupo A; Semen equino mas diluyente con-
trol, Grupo B; Semen equino mas diluyente incubado con
émbolos de goma, Grupo C; Semen equino mas diluyen-
Desarrollo de embriones de dos células de ratón hasta el estadio de blastocisto después de ser expuestos a varios tipos de recipientes plásticos a temperatura
ambiente durante 1 hora (Boone y Shapiro 1990)
Tipo de recipiente plástico
Placa multi pocillos
Jeringas (embolo de goma)
Jeringas (embolo plástico)
Jeringas (embolo plástico)
ab
Porcentajes con diferentes superíndices son diferentes (P< 0.05)
te incubado con émbolos de plástico, Grupo D; Semen
equino mas diluyente control incubado con émbolos de
goma y Grupo E; Semen equino mas diluyente control
incubado con émbolos de plástico. Cada grupo contenía
5 ml de diluyente y semen a una concentración de 1.0 x
106 sperm./ml. En un segundo experimento, las incuba-
ciones con semen fueron durante 45 minutos, y luego el
diluyente fue retirado y reemplazado por diluyente fresco.
nº 8
Diferentes tipos de jerin-
gas y filtros.
El numero de espermas vivos, los porcentajes de movilidad
y de movilidad progresiva, fueron determinados después
de la colecta cada 15 minutos durante 1 hora. En el pri-
mer experimento, el numero de espermas vivos no se vio
afectado por el tratamiento. Sin embargo, se apreció un
descenso (P < 0.01) de la movilidad progresiva y de los
porcentajes de movilidad a los 30, 45 y 60 minutos en el
Grupo B (diluyente incubado con émbolos de goma) al ser
comparado con los otros cuatro grupos, no se apreciaron
diferencias en el semen mantenido en jeringas con émbo-
los de goma o de plástico. En el segundo experimento, los
porcentajes de progresión espermática se incrementaron
después de la adición de diluyente fresco.
Embriones
La toxicidad potencial de diferentes jeringas produ-
cidas por diferentes fabricantes fue estudiada mediante
el cultivo de embriones de ratón (Boone y Shapiro 1990).
El medio de cultivo fue expuesto a diversos útiles de
plástico durante 16 horas y después colocado en placas
multi pocillos en las que fueron incubados embriones
de ratón de dos células, durante 72 horas en 5% CO2 en
aire y a 37ºC. Se encontraron (Tabla 1) diferencias sig-
nificativas en la frecuencia de desarrollo hasta el estadio
de blastocisto.
Tabla 1.
Nombre comercial Blastocistos n/n (%)
Falcon 294/327 (89.9)a
Becton Dickinson 3/88 (3.4)b
Fortune 83/93 (89.3)a
Monoject 52/56 (92.9)a
En otro estudio, realizado con embriones de ratón
de dos células (Scott Fitzgerald et al., 1993; n=50) fue-
ron cultivados en medio expuesto a émbolos de jeringa
negros de goma (Becton Dickinson); los embriones se
desarrollaron y realizaron 3-4 divisiones (69% embrio-
nes de 8-células) pero todos los embriones termina-
ron haciéndose atrésicos (P<0.001 comparados con los
controles). Los efectos tóxicos de los émbolos de goma
 Palasz A. T. y de La Fuente J.
Mórula PIV.
Blastocisto PIV.
Hay numerosos
métodos de
esterilización
mediante calor,
gas, radiación
y productos
químicos, pero Eclosión de blastocisto PIV.
la saturación
de vapor es el
método más de las jeringas pueden ser evitados mediante el lavado
completo y con jabón y enjuagando con agua destilada (Boone y
Shapiro 1990).
efectivo
Lavado y esterilización de los equipos
Todo el vidrio y el resto de material reutilizable utili-
zado para la producción y manipulación de los embriones
debe ser enjuagado con agua destilada y mantenido du-
rante 24 horas en una solución al 1% de un detergente
no toxico (p.ej., Alconox; Alconox Inc. 9E 40th St, New
York), posteriormente lavado al menos 5 veces en agua
destilada, secado y preparado para su esterilización. La
esterilización es el proceso mediante el cual destruiremos
los microorganismos (bacterias, hongos y virus) mediante
calor o por reacción química.
Hay numerosos métodos de esterilización mediante
calor, gas, radiación y productos químicos, pero la satu-
ración de vapor es el método más completo y efectivo.
La saturación de vapor bajo presión se utiliza para des-
truir la vida microbiana en una gran variedad de mate-
riales, tales como el cristal, utensilios de laboratorio y
medios de cultivo. El calor seco se utiliza para esterilizar
materiales que son sensibles en su mezcla y no pueden
ser atravesados por el vapor. La esterilización con gas
de óxido de etileno es un proceso lento, utilizado para
diversos materiales, que puede provocar daños por calor
y requiere de una muy larga aireación en evitación de
su toxicidad. Las radiaciones son un método muy rápi-
do, usado principalmente para esterilizar equipamientos
sensibles al calor, pero requiere unas instalaciones espe-
ciales y operadores muy cualificados. Los líquidos quí-
micos son efectivos en el tratamiento de paredes, sue-
los y muebles, pero tampoco ningún producto químico
determinado es efectivo para todo tipo de patógenos y
además los productos químicos suelen ser muy tóxicos
para los embriones.
Todos los equipos no reutilizables pueden ser esteri-
lizados con una de las siguientes alternativas:
Calor seco
Los útiles han de ser mantenidos a 1600C durante
2 horas.
Saturación de vapor
Los útiles han de ser mantenidos a 1210C y 104 kilo-
pascals de presión durante 30 min. Existen en el mercado
modelos, tipos y marcas de autoclave, que pueden realizar
esta función ajustándose a las necesidades de cada labo-
ratorio.
Vapor de oxido de Etileno (esterilización por gas)
Los útiles han de ser envueltos en un material poroso
al oxido de etileno y después expuestos a un mínimo de
500 mg de oxido de etileno por cada 1000 cm3 durante 30
minutos. Los equipos han de ser desarmados para facilitar
la penetración del gas. El tiempo adecuado de aireación se
sitúa por encima de los 30-40 días ya que el gas residual
puede matar a los embriones.
Filtración de membrana
Solo puede realizarse con soluciones. El medio de
cultivo ha de ser filtrado con filtros de poro de 0.22
µm (p.ej.: Millipore) mediante la utilización de presión
positiva.
Esterilización con Gas
de Oxido de etileno
Cuatrocientos embriones de ratón de 8 células fue-
ron cultivados in vitro en placas plásticas de poli-es-
tireno y en placas de vidrio, para analizar la toxicidad
potencial de la absorción o retención del oxido de eti-
leno. Las placas de cultivo fueron esterizadas con gas
(Amprolene) y aireadas a 21ºC durante varios periodos de
tiempo. Los residuos de gas posteriores a la esterilización
fueron determinados por la medida de la diferencia de
pesos, donde las placas de plástico aumentaron su peso
de forma exponencial. Después de una semana de airea-
ción, se retuvieron 0.625 mg de oxido de etileno por mg
de plástico de la placa de cultivo.
Para determinar el efecto de los residuos del gas
sobre el cultivo in vitro los embriones fueron colec-
 Cultivo de embriones bovinos: Esterilización y control de calidad y toxicidad en los laboratorios de producción de embriones
nº 8
Nut rición

Estufa de calor seco.

tados de hembras de ratón (C57BL/6N) en un medio
fosfatado salino (PBS) y posteriormente mezclados al
azar en varias placas de cultivo con diferentes perio-
dos de aireación. Los embriones fueron cultivados en
medio de Whitten con 3 mg/ml de albúmina sérica
bovina (BSA), en una humedad saturada y 5% CO2 en
aire atmosférico a 37oC. El desarrollo embrionario fue
medido usando las tablas morfológicas y las medidas
de calidad sistemáticas, junto con una tinción de ace-
tato de fluoresceína. El desarrollo apareció retardado
entre las 8 a 16 células, cuando se utilizaron 12 horas
o menos de aireación de las placas de poli-estireno.
La aireación durante 24 a 36 horas resultó ofrecer un
desarrollo sub-optimo, con menos (P<0.01) blastocis-
tos y mayores grados de degeneración celular a las 48
horas de cultivo in vitro, al comparar con el control
(placas esterilizadas por el fabricante, sin gas de oxido
de etileno),y con los grupos de una semana de airea-
ción (Schiewe et al., 1985).

El efecto de introducir embriones de ratón en una

pajuela de plástico para semen esterilizadas con oxido
de etileno, fue medido al comparar su desarrollo in vi-
tro frente al desarrollo alcanzado por los embriones que
se introdujeron en pajuelas que no fueron expuestas al Autoclave.
gas. Así, se usaron un total de 920 embriones de ratón
de 8 células a mórula para los siguientes experimen-
tos. Las pajuelas fueron esterilizadas con gas de oxido
de etileno y aireadas a temperatura ambiente durante
varios periodos de tiempo por encima de las 24 hasta
las 144 horas. Los embriones fueron aspirados dentro
de las pajuelas con el medio modificado de Brinster y
mantenidos durante 2 horas, para ser luego expulsados
a una placa con el mismo medio y bajo aceite mineral.
El porcentaje de desarrollo in vitro hasta el estadio de
blastocisto después de 24 horas de cultivo fue usado
como mejor criterio para determinar el efecto produ-
cido por el gas.

El desarrollo de los embriones incluidos en las

pajuelas tratadas (esterilización con gas) fueron desde
0% (24 h de aireación) a 33% (144 h de aireación; Ta-
bla 1). Los embriones control llegaron a un desarrollo
del 50 al 95 % con un promedio del 72% de desarrollo
normal. A todos los tiempos de aireación estudiados las
diferencias en porcentajes de desarrollo normal entre
los grupos tratados y el control fueron altamente signi-
ficativas (P <0.01; Tabla 2), según se determinó por el
test de Chi-cuadrado.

Tabla 2.
Porcentajes de crecimiento normal de los embriones expuestos al contacto con Pajuelas de plástico esterilizadas con oxido de etileno
Grupo Tiempo de aireación en Horas a

24 48 72 96 120 144

Tratados (%) 0 20 19 30 32 33

(n) (44) (50) (95) (64) (82) (168)

Control (%) 90 95 65 85 50 57

(n) (25) (55) (69) (95) (43) (160)

a
entre cada tiempo de aireación las diferencias entre grupos son muy significativas (p <0.01).
 Palasz A. T. y de La Fuente J.

Los resultados indican que las pajuelas de semen

esterilizadas con oxido de etileno tienen la posibilidad
de destruir a los embriones alojados en ellas. Bajo estas
condiciones experimentales, fue insuficiente un periodo
de 144 horas de aireación de las pajuelas para que no
resultaran toxicas para los embriones de ratón (Hagele et
al., 1987).

Test de toxicidad de las pajuelas

de congelación de 0.25 ml

Embriones de ratón de 8 a 16 células fueron cul-

tivados en medio de Ham´s F-10 conteniendo 5 mg/ml
BSA y posteriormente introducidos de forma aleatoria en
cuatro tipos de pajuelas de plástico de 0.25 ml (de 8 a 10
embriones por pajuela): 1) Pajuelas amarillas (no estériles),
2) Amarillas (preparadas de forma comercial y ¿estériles?),
3) Transparentes (preparadas de forma comercial y ¿esté-
riles?) y 4) Transparentes (no estériles).

Filtración de membrana.

Tabla 3.
Desarrollo de embriones de ratón de 8 a 16 células hasta el estadio de blastocisto después de su exposición a varias pajuelas de plástico de 0.25 ml a 39ºC por
24 h y posteriormente cultivados en medio Ham´s F-10 durante 24 horas mas (4 replicas)
Tipo de pajuela N Embriones desarrollados a las 24 h (%) Blastocistos
(Grupo) a las 48h (%)
Control (en gotas) 38 37/38 (97.3) 37/38 (97.3)a
Amarilla (no estéril) 41 34/41 (82.8) 31/41 (75.6)b
Amarilla (IMV*) 34 12/34 (35.3) 11/34 (32.3)c
Transparente (IMV*) 35 14/35 (40.0) 6/29 (20.7)c
Transparente (no estéril) 34 29/34 (85.3) 20/34 (58.8)b
abc
Porcentajes con diferentes superíndices son significativamente diferentes
(P< 0.05).

Las pajuelas conteniendo los embriones fueron mante-
nidas en un incubador a 39ºC durante 24 horas y posterior-
mente trasferidos de nuevo a medio fresco de Ham´s F-10
en gotas de cultivo durante otras adicionales 24 horas. Los
resultados sugieren que las pajuelas preparadas de forma co-
mercial contienen algunos factores que actúan reduciendo el
Pajuelas preparadas para desarrollo embrionario (Tabla 3). Por esto podría ser que las
vitrificación. pajuelas comerciales fueran esterilizadas con gas de oxido de
etileno antes de su venta, aunque si que estarían del orden
de 40 días de aireación antes de ser distribuidas.
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Scott Fitzgerald L, Sundaram SG, Smith S. The relevance and use of

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