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Cultivo de embriones bovinos:

Efecto de los medios de cultivo y


de los requerimientos fisiólogicos
sobre la calidad de los embriones
producidos in vitro. Parte (II)

A.T. Palasz y J. de La Fuente


Dept. de Reproducción Animal y Conservación de Recursos Zoogenéticos. INIA, Madrid
Dr. Palasz Dr. de la Fuente

Introducción fabricados suelen tener un coste superior ya que se requieren


medidas de asepsia estrictas y la mejor calidad posible de
En la producción in vitro de embriones bovinos los agua y de componentes, que a su vez han de haber sido
elementos constitutivos son de importancia capital, así el testados para evitar una posible toxicidad sobre los embrio-
uso de suero sanguíneo y de células somáticas resultan nes. Después de pesar todos los componentes del medio, la
ser las principales fuentes de la inconsistencia de los re- preparación final debe ser realizada bajo una mesa de flujo
sultados obtenidos (datos científicos no concluyentes) y laminar y las soluciones finales almacenadas en recipientes
aun más relevante, una fuente potencial de contamina- estériles, bien de plástico o de cristal. Normalmente los me-
ción con agentes víricos infecciosos. Por estas razones se dios complejos, por ejemplo el Ham´s F-10, deben ser utiliza-
Una rutina han llevado a cabo numerosos intentos para desarrollar dos antes de las 2 semanas de su preparación y guardados a
diaria de un sistema de cultivo más definido y eficiente, sin ningún
tipo de producto biológico, para la producción in vitro por
4º C antes de su uso. Por el contrario el PBS o las soluciones
salinas pueden ser almacenadas por más de 6 meses a 4ºC.
limpieza y FIV de embriones bovinos. De igual manera, los requeri- Los cambios en el pH y la exposición a la luz de los medios
control de la mientos fisiológicos para el mantenimiento y desarrollo de almacenados son los factores responsables del deterioro de
asepsia en las los embriones resultan fundamentales y sus márgenes de
variación reducidos.
alguno de sus componentes. El piruvato, los antibióticos y
L-glutamina se degradan espontáneamente durante el alma-
superficies en cenaje y por lo tanto deben ser adicionados inmediatamente
contacto con En el presente artículo se pretende revisar los princi- antes de su utilización. Otros componentes del medio, como
los envases de pios básicos y las medidas de control de calidad para los
sistemas de FIV bovina.
son los factores de crecimiento y el suero deberán haber
sido alicuotados y congelados a –70ºC, ya que esta tem-
los embriones peratura previene el deterioro y la desnaturalización de las
prevendrán proteínas,que producen su indisolubilidad al precipitar los
una posible Cultivo: Constituyentes del
componentes del medio. Nosotros hemos encontrado que la
repetición de sucesivas congelaciones no afecta a la eficacia
contaminación Medio y Condiciones de Cultivo del suero para su utilización normal en los medios de cultivo
de los cultivos ni en las transferencias de los embriones (Palasz et al, 1995).
en el incubador Medio de Cultivo
No se recomienda el almacenar el agua por un prolongado
periodo de tiempo, ya que los metales pesados pueden llegar
a diluirse desde los envases de plástico y de vidrio.
En numerosos laboratorios los medios de cultivo suelen
ser comprados al fabricante y solo en algunos casos fabri- Todas las soluciones deben ser testadas para medir
cados en el propio laboratorio, dependiendo generalmente su pH (la adición de rojo fenol al medio permite la visua-
de la complejidad del medio en sí mismo. Los medios auto lización de una posible desviación del pH) y osmolaridad
Efectos del tipo de conservante añadido Cultivoaldeensilado
embrionesde trigo sobre la producción y composición
bovinos:
Efecto de los medios de cultivo y de los requerimientos
química fisiológicos sobre la calidad de los embriones producidos in vitro
de la leche
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Nut rición

antes de proceder a su esterilización mediante filtración Embriones PIV de 4-8 células


con un filtro de presión positiva con un tamaño de poro
de 0.22 µm, inmediatamente antes de su uso. Todas las
preparaciones de nuevos medios deben ser testadas por
una posible contaminación y para demostrar su habilidad
a facilitar el desarrollo de embriones en cultivo. Un en-
sayo muy preciso y conveniente es el cultivo de estadíos
tempranos (2 células) de embriones de ratón. A pesar de
que los embriones de ratón son menos sensibles que los
de otras especies, este bio-ensayo da información como
control de calidad y de una posible toxicidad.

Agua
Ovarios de matadero
Es conveniente recordar que el mayor componen-
te de los medios de cultivo es el agua (>98%) y que su
calidad tiene un profundo efecto sobre el desarrollo de
los embriones en cultivo (Whittingham, 1971). El restante
1-2% son iones inorgánicos, amino ácidos, carbohidratos,
vitaminas, antioxidantes, hormonas y factores de creci-
miento, cuya pureza química tampoco debe ser ignorada.

En la actualidad se han desarrollado sistemas muy


sofisticados de purificación del agua, Agua de Grado y
Tipo I, la cual puede ser suministrada de forma comercial
(Millipore Ltd; Barnstead/Thermolyne Corporation). Aun-
que una gran cantidad de contaminantes encontrados en Aspiración de ovocitos
el agua hacen necesario la realización de múltiples test, el para FIV
indicador de pureza mas común es la resistividad (resisten-
cia ofrecida por el agua al paso de una corriente eléctrica).
Así, a mayor resistividad mayor el grado de pureza del
agua. La mayor resistividad es de 18.3 megaohms (Tipo
I-RGW) a 25ºC. Solo este tipo de agua debe ser usada en
los medios de cultivo de embriones. No está recomendado
el almacenamiento del agua pura, ya que con el paso del
tiempo puede llegar a deteriorarse, mayormente debido a
la disolución de metales pesados procedentes de los reci-
pientes, bien sean de cristal como de plástico. Ha quedado
demostrado que el desarrollo de los embriones hasta el
estadío de blastocisto es mayor en los medios preparados
Grupo de ovarios para PIV
con agua fresca Milli-Q que en aquellos preparados con del medio de cultivo, y
agua guardada durante 1 ó 2 semanas (35%, 18% y 18%, que el calcio y el pota-
respectivamente; Nagao et al., 1995). sio son esenciales para
el desarrollo embriona-
No obstante, y a pesar de contar con una composición rio, son muy efectivos
óptima del agua, el medio de cultivo es muy dependiente y se en un rango muy am-
puede ver muy afectado por parámetros físicos como son la plio que va desde 0.4 a
temperatura, pH, osmolaridad, composición del gas utilizado 10 mM. La ausencia de
durante el periodo de cultivo in vitro, luz y la cantidad de em- calcio en el medio de
briones en un determinado volumen de medio de cultivo. cultivo resulta en una
reducción de las di-
Iones inorgánicos visiones embrionarias
y en una incapacidad
Las funciones de los iones inorgánicos son catalíti- para la compactación
cas y fisiológicas. La composición iónica de la mayoría de de las mórulas. Catio-
los medios de cultivo se basa en el análisis bioquímico de nes como el Ca++ y Mg++, así como las glicoproteinas,
la sangre o del liquido oviductal, así es como ejemplo el juegan un papel importante en el proceso de adhesión
medio de Fluido Oviductal Sintético (SOF; Tervit, 1972). celular. El fosfato parece ser efectivo solo a una muy de-
Sin embargo, no hay que olvidar que el fluido oviductal terminada concentración de 0.35 mM en los medios de
no resulta ser un simple filtrado de plasma (Leese, 1988). cultivo para embriones bovinos (Kim et al., 1993).
La composición iónica, el pH, la osmolaridad y el con-
tenido de macromoléculas contenidas en el líquido ovi- Substratos energéticos
ductal difieren enormemente de los del plasma sanguíneo
(Gandolfi et al, 1989). Está generalmente aceptado que Las fuentes de energía más comunes en el medio de
el cloruro sódico es necesario para regular la osmolaridad cultivo son el lactato, el piruvato y la glucosa. Todos es-
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Aminoácidos y vitaminas

Los medios de cultivo más frecuentemente utilizados,


como son el Ham´s F-10 o el TCM-199, contienen del orden
de 20 aminoácidos, sin embargo, aún están poco definidas
sus funciones en los medios de cultivo. Normalmente los
20 aminoácidos están implicados en la síntesis proteica. Si
a los medios de cultivo solamente se les enriquece con una
gran cantidad de aminoácidos esenciales, una porción de
ellos se degradarán para proveer de una fuente de nitróge-
no que sirva para la síntesis de aminoácidos no esenciales.

Se acepta de forma general que los aminoácidos sir-


ven como fuente de energía, tampones intracelulares del
pH, y como “pool” para la síntesis proteica. Se ha demos-
trado que la retirada de ciertos aminoácidos, así como la
inclusión de otros puede llegar a mejorar las condiciones de
cultivo (Keskintepe et al., 1995; Steeves y Gardner 1999).
Muchos de los aminoácidos nutricionales, como la fenila-
lanina, tirosina, lisina, valina y treonina son apenas utili-
Placas de cultivo
zados por las células embrionarias (Eagle, 1959), mientras
que otros, como la glutamina, son activamente metaboli-
zados y muy utilizados como fuente de energía durante el
desarrollo embrionario (Rieger et al., 1992). Sin embargo,
en otros estudios, al suplementar con los 20 aminoácidos
esenciales y con aminoácidos no esenciales, el resultado fue
que se incrementó el desarrollo embrionario (Takahashi y
First, 1992) y se vio que la acción de los aminoácidos sobre
el desarrollo embrionario era dependiente del estadío de
desarrollo (Kim et al., 1993; Lane y Gardner, 1997).

Las vitaminas juegan un importante papel como


coenzimas en el metabolismo de los carbohidratos y de los
aminoácidos (Lehninger, 1975), igualmente está demostra-
do que las vitaminas hidrosolubles son necesarias para la
expansión del blastocisto y la salida de la zona pelucida en
los embriones de hámster y de conejo (Kane et al., 1988).
Pero, por encima de todo, los efectos de las vitaminas so-
bre el crecimiento de los embriones bovinos han resultado
generalmente no concluyentes (Takahashi y First, 1992).
Colina e Inositol, generalmente incluidas como vitaminas,
juegan un papel de substratos mas que de catalizadores. La
Mesa de flujo laminar y colina es un precursor de la fosfatidilcolina y de la esfingo-
estereo-microscopios tos substratos se han encontrado en el líquido oviductal, sus mielina, dos de los mayores fosfolípidos estructurales de la
funciones difieren en los medios de cultivo de las diferentes capa exterior de las membranas embrionarias.
especies animales y en los diferentes estadíos de desarrollo.
En los estadios mas tempranos (embriones de 1-2 células) se Hormonas
utiliza el piruvato y/o el lactato pero no la glucosa. De hecho,
la adición de glucosa a los embriones bovinos fertilizados Existe una clara evidencia de que algunas hormonas,
de una célula cultivados en SOF resulta en un descenso del como es la insulina, tienen un gran efecto sobre el desa-
desarrollo embrionario posterior (Takahashi y First, 1992), rrollo de los embriones. Así, la adición de insulina a los
así como en una desviación en la proporción de sexos de medios de cultivo resulta en un incremento de las tasas
los embriones bovinos producidos in vitro (Gutiérrez Adán et de desarrollo morfológico y del transporte de glucosa al
al., 2001). Otras fuentes de energía, incluyendo la glucosa, blastocisto (Gardner y Kaye, 1991). A la vista de la micros-
son utilizadas a partir del estadio de 8 células. Ha quedado copía electrónica, la supervivencia post descongelación y
claramente demostrado (Rieger et al, 1992) que los embrio- los porcentajes de gestación, la adición de insulina y sele-
nes bovinos utilizan la glucosa como principal fuente de nio a los medios de cultivo de embriones bovinos, resultan
energía desde las 8 células hasta el estadío de blastocisto. en una mayor calidad de los blastocistos (Shamsuddin et
Kobayashi et al, (1994) han reportado que se incrementan al., 1993). La suplementación con hormonas, tales como
los blastocistos bovinos producidos in vitro utilizando ba- LH, FSH y estradiol 17β, de los medios de maduración
jas concentraciones de glucosa en el medio (0.4 mg/ml) en de los ovocitos bovinos, se ha demostrado que ofrecen
combinación con una baja (5%) tensión de oxígeno. El piru- efectos beneficiosos sobre el porcentaje de complejos cú-
vato-glucosa puede llegar a ser sustituido por una mezcla de mulo-ovocito (COC) que son capaces de completar la ma-
piruvato-ribosa e incluso en algunos medios determinados duración meiótica con el consecuente desarrollo in vitro
por galactosa. (Sirard, 1988; Saeki et al., 1991).
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Factores de crecimiento

Entre un gran número de factores de crecimiento que tienen un papel importante en la proliferación celular del embrión,
los más importantes parecen ser los relacionados con la insulina (insulin-like growth factors; IGF), los de transformación (trans-
forming growth factors; TGF) y los epidérmicos (epidermal growth factors; EGF). Los péptidos de IGF afectan al transporte de
membrana y a las actividades enzimáticas en las células embrionarias. La IGF-I y la insulina se ha demostrado que incrementan
la producción estrogénica en los embriones de cerdo en cultivo, lo cual es necesario para la transición del estadio de mórula
al de blastocisto (Hofig et al., 1990). La adición de TGF-B al medio de cultivo también estimula las actividades mitóticas en
la masa interna celular del blastocisto (ICM), sobre todo cuando el embrión se encuentra en un estadío inicial de blastocisto
(Marguant-LeGuaienne et al., 1989). La familia de los EGF de los factores de crecimiento se ha visto que causan un incremento
significativo en el desarrollo en los embriones bovinos de 2 a 8 células, así como en el paso de mórula a blastocisto (Yang et al.,
1993). Por otra parte, un estudio realizado por Shamsuddin. et al., (1993) demostró que los EGF no estimularon el desarrollo
embrionario hasta el blastocisto pero que si incrementaron la ruptura zonal de los blastocistos.

Proteínas de origen biológico

Una forma de suplementar proteínas a los embriones in vitro es mediante la adición al medio de suero fetal (FCS) o
de albúmina del suero bovino (BSA), los cuales son usualmente añadidos a la mayoría de los medios de cultivo embrionario.
Estos dos compuestos realizan un papel similar, aunque no del todo conocido y ambos están compuestos de una forma muy
variable, debido a la escasa definición de sus componentes (Barnes y Sato, 1980; Bavister, 1992). El suero fetal y la BSA afectan
al pH del medio y actúan como quelantes de iones metálicos, contienen factores de crecimiento y ciertas cantidades variables
de hormonas que inciden en la proliferación y diferenciación celular (Ball et al., 1985), además sirven como agentes activos
de superficie (Palasz et al., 1995). Las proteínas biológicas que contienen acarrean un peligro potencial de contaminaciones
cruzadas y de esta manera los embriones pueden aparecer infectados con virus y otros patógenos provenientes de las donantes
de las proteínas (Rossi et al., 1980). Debido fundamentalmente a este hecho, la posible contaminación, además de su variable
aportación en cuanto a constituyentes y funciones, los medios con productos biológicos deberían ser sustituidos por medios
definidos que permitieran similares tasas de crecimiento embrionario in vitro.

Sustitutivos del suero y de la tensión superficial

La tensión superficial de los medios de cultivo ha resultado ser un factor importante en el cultivo in vitro de los
embriones de mamíferos (Palasz et al., 2000). Esto ha sido resuelto tradicionalmente por la adición de BSA, pero en la
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Estufa de cultivo para PIV


son procesos biológicos y físico-químicos muy diferen-
tes) sugiere que ambos (suero y BSA) poseen propieda-
des comunes o al menos muy parecidas, más allá de sus
componentes nutricionales. Al mismo tiempo, la polivinil-
pirrolidona (PVP; Saeki et a1, 199l; Leibo y Oda 1993),
el alcohol de polivinilo (PVA; Keskintepe et al., 1995), el
hialuronato de sodio (SH; Joly et al., 1992; Palasz et al.,
1993) y el ET surfactante (Palasz et al., 1995), han sido
utilizados de forma exitosa como reemplazantes del suero
y la BSA en los medios de colecta, cultivo y congelación
de las células germinales de mamíferos. Aunque algunas
de las moléculas citadas pueden recordar o tener similitu-
des con la albúmina, de ninguna manera pueden provocar
las posibles reacciones que realizaría el suero y además
son inertes desde el punto de vista fisiológico (Catálogo
de Merck, 1989).

En los sistemas biológicos, la actividad superficial


es evidente para los compuestos de bajo peso molecu-
lar como son el glicerol y los aminoácidos, así como los
polímeros macromoleculares como los fosfolípidos y las
proteínas (Encyclopedia of Chemical Technology, 1970).
Todos ellos realizan importantes funciones in vivo en
cuanto al ensamblamiento y funcionamiento de muchas
Equipo de purificación de estructuras biológicas como son las membranas celulares
agua
y los revestimientos surfactantes de los alvéolos pulmo-
nares (Possmayer et al., 1984), así como en los fluidos
uterinos y oviductales (Nichol et al., 1992). Una sustancia
activa a nivel superficial tiene la tendencia de absorber
dentro de la superficie de las membranas celulares y a ser
incorporada dentro de esas membranas. Las mediciones
de la tensión superficial proveen de una indicación muy
efectiva de las propiedades absorbentes y de la capacidad
de interacción de moléculas en una determinada superfi-
cie estática en gas-liquido de los medios de cultivo. Las
concentraciones momentáneas de los agentes activos de
superficie (proteínas) pueden resultar en una significati-
va reducción de la tensión superficial de los medios de
cultivo. La absorción de proteínas al citoplasma celular a
través de la membrana bi-capa permite el mantenimiento
de la integridad y de la forma de la membrana, y por
tanto puede controlar la circulación de metabolitos (hacia
dentro y hacia fuera) en el embrión. Ya que estos agentes
actúan como “intercambiadores”, pueden potencialmente
afectar al trasporte de oxígeno a través de los componen-
tes gas-líquido de el medio de cultivo, lo cual puede tener
un efecto muy profundo sobre el desarrollo embrionario
(Tervit et al., 1972; Berthelot y Terqui, 1996).
actualidad algunos polímeros sintéticos pueden reemplazar
las propiedades de actividad de las membranas, aunque de Keskintepe et al., (1995) han reportado la posibili-
ninguna manera puedan reemplazar las propiedades em- dad de producir un medio de cultivo sintético para los
brio-tróficas de la BSA o del suero en los medios de cultivo. embriones bovinos constituido por medio SOF al que se le
Estas últimas han de ser sustituidas por factores de creci- añadió PVA, agentes quelantes, citrato y aminoácidos no
miento en los medios químicamente definidos. La actividad esenciales, pero sin ser añadida la BSA. El alcohol de poli-
superficial de los fosfolípidos y de los surfactantes quími- vinilo es un polímero coloidal con poca actividad química
camente definidos se expresa por la formación de micelas y su eficacia en los medios de cultivo ha de ser debida
en soluciones acuosas. Los micelas forman una agrupación a sus propiedades como activador de superficie más que
de micelas que atrapa las moléculas en solución (a los nu- a las coloidales. En otro estudio reciente (Palasz et al.,
trientes en los medios de cultivo) y su disponibilidad para 2000), la tensión superficial del PVA fue más aparente que
las células ha desarrollar (de los embriones) está en relación la del PVP, cuando ambos fueron utilizados a los niveles
con los cambios en la tensión superficial de las soluciones. habituales en los medios de cultivo. Esto puede explicar
el porqué el PVA es más frecuentemente utilizado en los
La efectividad del suero y de la BSA en la colecta de medios de cultivo in vitro de los embriones de mamíferos
los embriones, en el corto o largo periodo de cultivo y en (Kane, 1987; Eckert y Niemann, 1995) de lo que es el PVP
los medios de congelación o descongelación (los cuales (Berthelot y Terqui, 1996; Kim et al., 1996).
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Antibióticos

Los medios de cultivo suelen ser complementados de


forma estandarizada por 0.1% de antibióticos para supri-
mir el crecimiento de microorganismos contaminantes y
para prevenir la expansión de patógenos. Aunque no son
necesarias altas concentraciones de antibióticos, 10 veces la
concentración normal de Penicilina G y de Estreptomicina
durante 72 horas se ha visto que no resulta toxica para los
embriones a 37º C (Riddel et al, 1985). De cualquier manera
no está recomendado que se incluyan en los medios antibió-
ticos almacenados durante largos periodos de tiempo, ya que
la vida media de la mayoría de los antibióticos se encuentra
entre los dos días a las dos semanas, dependiendo del tipo de
antibiótico y de la temperatura de almacenamiento.

Requerimientos fisiológicos

Temperatura, pH, dióxido de carbono y tensión de oxí-


geno, osmolaridad y humedad relativa de los incubadores.
Osmómetro

Osmolaridad y pH

La osmolaridad normal del suero sanguíneo y de la


mayoría de los medios de cultivo es de alrededor de los
308 mOsm. Sin embargo, osmolaridades más bajas (del
orden de 246 mOsm) se han encontrado óptimas para los
medios de cultivo de embriones de rata y medios dentro
del rango de los 275 a 285 mOsm se han usado para
el cultivo de embriones bovinos en muchos laboratorios
(Gordon, 1994). Generalmente se acepta que los embrio-
nes pueden tolerar un amplio rango de osmolaridad si la
relación potasio:calcio se mantiene constante. No obstan-
te, se recomienda la medición de la osmolaridad antes y
después del cultivo in vitro de los embriones.

El pH del medio de cultivo debe estar entre el 7.2 al


7.4, mientras que en los medios de fecundación se reco-
pHmetro
mienda ligeramente superior (7.6-7.8). Debe ser recordado
que la adición de un 10% de suero o un 0.3% de BSA pro- geno en los fluidos corporales es significativamente menor
duce una tendencia a bajar el pH en un 0.1. Como muchos que en el aire. Así, la existencia de altos niveles de oxígeno
medios para cultivos durante largos periodos de tiempo son han sido asociados al bloqueo del desarrollo embrionario, lo
fosfatados (usado mayormente como sustancia tampón) el cual generalmente es contrarrestado con un co-cultivo en
nivel de este bicarbonato controla el pH. Estos medios son BOEC (Ellington, et al., 1990) o con células bovinas del cu-
normalmente equilibrados con el gas en el que se va a rea- mulus o de la granulosa. Sin embargo, cuando los embriones
lizar el cultivo, generalmente 5% de CO2 en aire, lo cual crecen en medios definidos sin la presencia de suero o de
mantiene el pH alrededor del 7.4. Sin embargo, sin CO2 BSA, se aprecian tasas superiores de desarrollo cuando el ni-
y HCO3+, los embriones de ratón no se dividen por enci- vel de O2 ha sido reducido por debajo del 10% (Tervit et al.,
ma de las 2 a 4 células, lo cual sugiere que ambos tienen 1972; Thompson et al., 1990).
funciones adicionales (Whittingham, 1971). El dióxido de
carbono resulta necesario para la regulación del pH intra- La mayoría de los laboratorios de producción de em-
celular (Carney y Bavister, 1986), y la presencia de bicarbo- briones bovinos in vitro utilizan temperaturas de cultivo
nato se ha visto que incrementa el pH intracelular de los de 39ºC, lo cual representa un incremento de 2ºC sobre
espermatozoides bovinos (Vijayaraghavan et al., 1985). las temperaturas que se utilizaban hace una década. La
razón principal para este cambio es que la penetración
espermática y la subsiguiente fecundación fueron supe-
Gas atmosférico y temperatura riores al realizarse a 39ºC (Watson et al., 1991). Hay, no
obstante, algún otro trabajo que reporta mayores tasas
Las condiciones más habituales de cultivo de los em- de división de los embriones bovinos cultivados in vitro
briones de 5% CO2 y 95% de aire, proveen de niveles de a 37ºC (Alfonso y Hunter, 1992). Es de gran importancia
oxígeno en la fase gaseosa del 20%, lo cual es mucho mayor recordar que la temperatura corporal de la vaca es cercana
que los niveles de oxígeno medidos en el oviducto y el útero a los 39ºC, mientras que los 37ºC son mas cercanos a la
del conejo (Bavister y Fisher, 1991). La presión parcial de oxí- temperatura corporal humana.
Palasz A. T. y de La Fuente J.

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