Artigo Original QSAR de dibenzoilmetanos a-substitudos Artigo submetido em 31/1/06; aceito para publicao em 2/5/06

Estudo da relao estrutura-atividade quantitativa de dibenzoilmetanos -substitudos quanto atividade anticncer da mama (linhagem celular MCF7)
A study of quantitative structure-activity relationship in -substituted dibenzoylmethane derivatives as anti-breast cancer agents (MCF7 cell line)

Quirino A. da Lima Neto1, Marisa A. Nogueira2, Ralpho R. dos Reis2, Eduardo B. de Melo2

Resumo O objetivo deste trabalho foi estudar, de forma quantitativa, as relaes entre a estrutura qumica de nove derivados de dibenzoilmetanos e a atividade anticncer da mama descrita para estes compostos. Foram utilizados 45 descritores fsico-qumicos. Foi necessrio otimizar as estruturas por meio de modelagem molecular, obtendo assim as conformaes de menor energia. Aps esta etapa, construiu-se uma matriz contendo as variveis independentes (descritores) e a varivel dependente - logaritmo da porcentagem de inibio total (Log %IT). O prximo passo consistiu em realizar a seleo dos descritores mais correlacionados com Log %IT para serem utilizados na construo dos modelos. Foram construdos cinco modelos com um descritor e trs com dois descritores, pois estes apresentaram R2 > 0,7. A validao externa ficou abaixo do esperado, mas os melhores modelos puderam ser utilizados para a etapa de interpretao fsico-qumica. Verificou-se uma forte influncia negativa da hidrofobicidade (Log P) na atividade biolgica. Constatou-se tambm a importncia de propriedades estricas (RM, RM3 e AR1) e eletrnicas (Dz) para a atividade descrita, tambm de forma negativa. Porm, a contribuio destas bem menor, se comparada ao Log P. Palavras-chave: Neoplasias Mamarias; Linhagem MCF7; Dibenzoilmetanos; Modelagem molecular; Relao estrutura-atividade quantitativa.

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Ex-graduando, Curso de Farmcia, Universidade Estadual do Oeste do Paran (UNIOESTE). Professor, Curso de Farmcia, Universidade Estadual do Oeste do Paran (UNIOESTE). Trabalho realizado para obteno do grau de Farmacutico por Q.A.L.N. Enviar correspondncia para E.B.M. E-mail: ebmelo@unioeste.br

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Abstract This study focused on the quantitative structure-activity relationships between nine dibenzoylmethane derivatives and the anti-breast cancer activity described for them. Forty-five physical-chemical descriptors were used. It was necessary to optimize the structures by molecular modeling, thus obtaining lower-energy structures. Following this stage, a matrix was constructed containing the descriptors and the dependent variable (Log %IT). The next step was to select the descriptors most closely correlated with Log %IT to be used in constructing the models. Five models with one descriptor and three with two descriptors were constructed, since they presented R2 > 0,7. External validation was lower than expected, but the best models were used for the physical-chemical interpretation phase. A strong and negative influence of hydrophobicity (Log P) on biological activity was observed. The importance of steric (RM, RM3, and AR1) and electronic (Dz) properties was evident for the described activity, also in negative form. However, their impact was small as compared to Log P. Key words: Breast cancer; MCF7 cell lines; Dibenzoylmethanes; Molecular modeling; Structure-activity relationships.

INTRODUO
O cncer caracterizado pela multiplicao descontrolada e propagao de formas anormais de clulas do prprio corpo do indivduo. Trata-se de uma das principais causas de morte nos pases desenvolvidos. Segundo estimativas, uma em cada cinco mortes na Europa e E.U.A. causada por um dos diversos tipos de cncer.1 Em virtude de ser uma das mais importantes causas de morte em mulheres, o cncer da mama uma das neoplasias mais extensivamente estudadas. Ocorre em ambos os sexos, mas com uma prevalncia 100 vezes maior nas mulheres.2 No Brasil, o cncer que mais causa mortes entre as mulheres. Em 2002, ocorreram 10,15 mortes por 100.000 mulheres. Em 2003, foram registrados 41.610 novos casos e 9.335 bitos. De acordo com as Estimativas de Incidncia de Cncer no Brasil para 2006, o cncer da mama ser o segundo mais incidente, com 48.930 novos casos.3,4 Atualmente, alm da cirurgia e da quimioterapia,5,6 esto disponveis alguns frmacos para a quimioterapia do cncer da mama: mostardas nitrogenadas, ciclofosfamida, ifosfamida, tiotepa, metotrexato, fluouracil, vimblastina, taxol, docetaxel, etoposida, teniposida, caproato de hidroxiprogesterona, dietilestilbestrol, propionato de testosterona e tamoxifeno compem este arsenal teraputico.5-8 Dentre estes, o tamoxifeno ({2-[4-(1,2-difenil-but-1-enil)fenxi]-etil}-dimetil-amina, TMX, figura 1) o mais amplamente utilizado na prtica clnica. Vrios estudos comprovam seus efeitos benficos. Pertence ao grupo dos compostos trifeniletilnicos e derivado do mesmo ncleo estilbeno que o dietilestilbestrol. Os compostos desse grupo possuem vrias atividades estrognicas e antiestrognicas.9
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Figura 1. Estrutura e informaes bsicas do tamoxifeno (TMX)10,11

A cada dia, novos compostos naturais ou sintticos farmacologicamente ativos contra os diversos tipos de tumores so descritos. Mesmo que a grande maioria no se torne um frmaco (composto capaz de ser utilizado na prtica clnica), praticamente todos podem ser considerados prottipos de novas entidades moleculares (N.E.M) terapeuticamente teis. Sendo assim, utilizando estes compostos como ponto de partida, e por meio de modificaes moleculares em suas estruturas qumicas, podese chegar a novos agentes antitumorais passveis de utilizao na quimioterapia ou quimiopreveno do cncer.12,13 Entre as diversas classes de compostos descritas na literatura que apresentam atividade antitumoral, in vitro e in vivo, encontram-se os dibenzoilmetanos. O dibenzoilmetano (1,3-difenil-propano-1,3-diona, DBM, figura 2) uma -dicetona muito estudada.14-18 Este composto e seus derivados formam um grupo raro de pequenas -dicetonas que apresentam diversas propriedades farmacolgicas, como fotoproteo, atividades antiinflamatria, antitumoral, antiviral e outras. Esto presentes em um grande nmero de famlias de plantas (Annonaceas, Astraceas, Menispermaceae, Rosaceae, Salicaceae e, especialmente, Leguminoseae),19 principalmente carregando isoprenides e furano ligado aos anis aromticos, e, mais raramente, um radical alil

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ou outro ligado ao carbono central da cadeia aliftica.20 Na natureza, os representantes dos dibenzoilmetanos so a curcumina [1,7-bis-(4-hidroxi-3-metxi-fenil)hepta-1,6-dieno-3,5-diona, CCM, figura 2], o pongamol [1-(4-metxi-benzofuran-5-il)-3-fenil-propano-1,3-diona, PGM, figura 2] e seus derivados. A CCM foi isolada das razes da Curcumina longa, que utilizada como tempero na cozinha oriental (curry). O PGM foi a primiera -dicetona de ocorrncia natural descrita, e foi isolada da casca da raiz da Tephrosia lenceolata, uma planta indiana.21 Este composto foi descrito em diversas outras espcies, como a Pongamia glabra,22 T. purpurea, T. hamiltoni,23 Dahlstedtia pinnata, D. pentaphyla24 e Millettia peguensis Ali.25

classe de compostos.27 O estudo de QSAR, como conhecido hoje, prope que a ao de uma droga pode ser dividida em dois estgios: o transporte para seu stio de ao e a ligao ao mesmo. Assim, a atividade biolgica est associada s mudanas de energia livre que ocorrem nos processos de absoro, distribuio e biotransformao ou prpria interao droga-receptor, sendo esse o paradigma que fundamenta o estudo de QSAR.27 Este fenmeno poderia ser explicado por modelos matemticos simples ou multiparamtricos, em que a atividade biolgica pode ser determinada por parmetros que medem a influncia de cada uma das propriedades, como demonstrado abaixo na equao 1: AB = + + cEs + d (1)

Figura 2. Estruturas do DBM, PGM, CCM, Parsol e Eusolex

Dois derivados de DBM so utilizados comumente na indstria cosmtica devido a suas propriedades fotoprotetoras: o Eusolex [1-(4-isopropil-fenil)-3-fenilpropano-1,3-diona] e o Parsol [1-(4-tert-butil-fenil)-3(4-metxi-fenil)-propano-1,3-diona] (figura 2).26 A cincia envolvida com o desenho, com a descoberta e o desenvolvimento de novos frmacos a qumica ou medicinal ou farmacutica. Nesta rea, os estudos de relaes estrutura-atividade (SAR: Structure-Activity Relationships) so utilizados para definir os parmetros importantes para a ao de uma classe de compostos anlogos contra certa patologia, pois parte da premissa geral de que uma droga age em um stio de ao especfico localizado em uma enzima ou receptor, sendo que compostos com estruturas semelhantes tendem ento a possuir a mesma atividade farmacolgica e/ou toxicolgica, ou seja, interagem nesse mesmo stio.27 O sucesso da abordagem SAR no desenho de frmacos depende no somente do conhecimento e da experincia da equipe de desenho, mas tambm de uma boa dose de sorte. O estudo de relaes estruturaatividade quantitativas (QSAR: Quantitative StructureActivity Relationships) procura remover o elemento sorte ao estabelecer uma relao matemtica, sob a forma de uma equao, entre a atividade biolgica e os parmetros (ou propriedades) fsico-qumicos mensurveis que possuam influncia sobre a atividade teraputica de uma

AB a atividade biolgica; , e Es so constantes de substituintes referentes distribuio eletrnica e hidrofobicidade (razo entre o quanto a molcula solvel em meio apolar e meio polar, o que influencia diretamente na absoro e distribuio da molcula no organismo), bem como s caractersticas estricas (propriedades relacionadas forma e tamanho da molcula), respectivamente; a, b, c expressam a contribuio de cada propriedade para a atividade biolgica; d uma constante.27 Cada uma dessas propriedades contribui com maior ou menor intensidade para o estabelecimento da resposta biolgica e pode ser representada por descritores estruturais que expressam a sua influncia na bioatividade de compostos qumicos.28-31 Atualmente, o desenvolvimento de uma nova droga ou frmaco, clinicamente til, pode chegar a 15 anos, devido aos custos e tempo necessrios. Os estudos de QSAR so uma das mais importantes contribuies na rea de qumica medicinal, visto que eles visam identificao de compostos prottipos e do embasamento fsico-qumico para o planejamento de anlogos mais especficos, com maior atividade intrnseca ou com melhor perfil farmacolgico, aumentando, desta forma, as chances de sucesso de insero de novos frmacos no arsenal teraputico.27 Estes estudos so, mais comumente, realizados utilizando programas de computadores que calculam as propriedades fsico-qumicas mensurveis de substncias qumicas (quando os clculos so realizados com as estruturas tridimensionais dos compostos que esto sendo estudados, tem-se o processo denominado modelagem molecular29) e que avaliam a relao destas com a atividade biolgica, gerando equaes de regresso ou modelos de previso. Estes estudos integram, dentro da qumica medicinal e junto a outras abordagens, a rea conhecida como planejamento de frmacos auxiliado por
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computador (CADD: Computer Aided Drug-Design).28,29 Considerando o exposto, este trabalho teve como objetivo realizar um estudo QSAR baseado em nove dibenzoilmetanos substitudos (figura 3) sintetizados e testados por Nogueira et al.32 quanto inibio da linhagem celular de tumores da mama MCF7. Assim, atravs dos parmetros fsico-qumicos mais importantes para o efeito descrito, poder ser obtida uma equao (ou equaes) que auxilie(m) no planejamento da(s) sntese(s) de novos derivados.

uma tenso estrica entre o substituinte em R3 e os radicais fenila, que se encontrariam no mesmo plano quando na forma ceto-enlica. Assim, o equilbrio favorece o tautmero -dicetona (figura 4).45 Considerando estes dados, esta forma foi a escolhida para o processo de modelagem molecular dos compostos 1 a 9. Como o ensaio biolgico32 foi realizado com a mistura racmica dos compostos 4 a 12, a configurao tridimensional absoluta utilizada, de forma padro, foi a (R) para todos os carbonos assimtricos.

Figura 3. Prottipos utilizados para o presente estudo. Compostos 1 a 9 foram utilizados para a montagem dos modelos QSAR, enquanto 10 a 12 para a validao dos modelos

MATERIAL E MTODOS
As seguintes etapas foram realizadas: (I) modelagem molecular dos compostos pertencentes ao grupo de estudo (1-9) e do grupo a ser utilizado para o processo conhecido como validao externa (10-12); 33 (II) obteno dos descritores fsico-qumicos; e (III) montagem e validao dos modelos de previso. Para as etapas I e II, foi utilizado o programa de modelagem molecular HyperChem 7.1.34 Para a etapa III, o programa de anlise de Hansch BuildQSAR35 e a planilha de clculos do OppenOffice 1.1.5.36 Uma explanao da forma e a importncia destes procedimentos sero apresentadas nos prximos itens, mas incentivamos os interessados em maiores informaes sobre este tema a consultar diversos artigos publicados na revista Qumica Nova (www.scielo.br/qn).28-30, 37-42

Figura 4. Equilbrio tautomrico dos dibenzoilmetanos. Se R3 = H, o equilbrio deslocado para direita. Se for diferente, deslocado para a esquerda

MODELAGEM MOLECULAR
Os dibenzoilmetanos, quando apresentam hidrognio em R3 (carbono ), existem exclusivamente na forma de um tautmero ceto-enlico, apresentando um deslocamento do equilbrio para a forma enlica graas formao de uma ponte de hidrognio intramolecular.43,44 Isto no ocorre nos compostos aqui estudados, devido a
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Os 12 compostos estudados tiveram suas conformaes tridimensionais termodinamicamente mais estveis calculadas no programa HyperChem 7.1.34 Em qumica medicinal, considera-se que dentre as conformaes mais estveis (ou de menores energias) da molcula isolada deve estar a bioativa (aquela que se liga ao stio de ao), assim como as conformaes da mesma quando em soluo e em sua forma cristalina. Porm, no ser necessariamente a mais estvel. Assim, quando no h algum dado experimental que indique qual realmente a conformao bioativa, utilizada, de forma padro, a mais estvel obtida pelo processo conhecido como otimizao da geometria por modelagem molecular.46 Os descritores que no so baseados na estrutura tridimensional dos compostos so obtidos por simples contagem ou por clculos convencionais. Caso contrrio, h a exigncia de que se faa a otimizao da geometria de cada um dos compostos, pois, como a conformao mais estvel aquela considerada bioativa, as propriedades desta sero as importantes para o estudo de QSAR.46 Aps o desenho de cada molcula, foram realizados

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clculos de mecnica molecular (MM), base matemtica que trata as molculas como uma coleo de tomos unidos por foras harmnicas ou elsticas (foras newtonianas). Essas foras podem ser descritas como funes de energia potencial de caractersticas estruturais, como comprimentos de ligao, ngulos de ligao, interaes no-ligantes e outras. Devido a isto, estes so conhecidos como clculos de campo de fora. A rapidez, a economia de tempo de computao e a facilidade de compreenso so algumas das vantagens da mecnica molecular.47 No programa HyperChem 7.1, foi usado o campo de fora MM+, de N. L. Allinger. Nesse, a partir de um conjunto de dados de entrada, uma geometria inicial especificada e sua energia calculada. Todos os parmetros que definem a geometria do sistema so modificados em incrementos pequenos e, pelo uso de mtodos de abaixamento de gradiente, a geometria otimizada. No entanto, esse mtodo de otimizao depende da geometria de partida, o que faz com que a minimizao geralmente leve ao mnimo local (uma conformao estvel, porm no a de menor energia) mais prximo e no ao mnimo global (a conformao mais estvel entre todas aquelas que uma molcula pode adotar) (figura 5).47 Um mtodo capaz de ultrapassar pequenas barreiras, portanto, mais eficiente do que a otimizao simples na localizao de um mnimo local mais profundo, so os clculos de dinmica molecular (DM). Eles simulam o movimento baseado em clculos de energia potencial, utilizando o campo de fora e as equaes de Newton para movimento, considerando cada tomo uma partcula, assim como na mecnica molecular. O mtodo consiste em simular a colocao da molcula em um banho de temperatura e viscosidade definidas. dado um intervalo de tempo em que ocorre a transferncia de calor entre o banho e a molcula e outro intervalo de tempo em que a molcula equilibra a sua energia. O processo repetido o nmero de vezes especificado pelo usurio.47 A partir do resultado da DM, onde obtida uma conformao de energia um pouco maior do que o mnimo local, pode-se chegar, por repetio da MM, a um mnimo local de energia ainda menor, ou, finalmente, ao mnimo global (figura 5).

Figura 5. Representao da superfcie de energia potencial obtida na otimizao da geometria de uma molcula. As circunferncias representam as conformaes adotadas em cada etapa. Esquema baseado na referncia 41

Os clculos de dinmica molecular foram simulados em um banho de 300 K, cuja transferncia de calor se deu durante 1 ps (picosegundo). Assim, os clculos MM e DM foram realizados alternadamente, conforme o esquema apresentado na figura 5, at que se obtivesse a conformao de menor energia. No entanto, apesar da MM ser uma boa tcnica de otimizao da geometria para molculas pequenas, ela no oferece informaes quanto s caractersticas eletrnicas dos compostos. Portanto, h a necessidade de se usar clculos de mecnica quntica para um estudo mais completo das estruturas.48 Uma molcula cuja geometria foi otimizada por MM pode ser utilizada como ponto de partida para clculos de orbitais moleculares por meio de mecnica quntica,47 como foi realizado neste estudo. Por muito tempo, os fsicos acreditaram que a mecnica clssica (a base dos clculos MM) no descrevia corretamente o comportamento de partculas muito pequenas, como os eltrons e os ncleos dos tomos e molculas. Assim, diversos pesquisadores comearam a desenvolver uma nova rea do conhecimento denominada posteriormente de mecnica quntica.47 Para descrever o estado de um sistema, em mecnica quntica, foi postulada a existncia de uma funo de coordenadas, chamada funo de onda (). A funo de onda contm todas as informaes sobre a molcula, e a partir dela podem ser calculadas todas as suas propriedades eletrnicas.47 Os clculos de mecnica quntica no so exatos, pois so feitas algumas aproximaes baseadas em dados empricos, e podem ser subdivididos em dois mtodos: ab initio e semi-emprico. O primeiro pode ser aplicado apenas a molculas pequenas e, apesar de mais preciso e no precisar de dados armazenados, requer grande capacidade de memria e tempo de clculo do computador.41,48 O segundo, uma alternativa ao ab initio, mais simplificado e apresenta valores aproximados que vm armazenados no programa, sendo estes dois fatores determinantes na reduo do tempo gasto no clculo computacional.48 Um grande nmero de mtodos semi-empricos com aplicaes diversas foi desenvolvido nas ltimas duas dcadas. Para as estruturas em estudo, o mtodo selecionado foi o AM1 (Austin Model 1). Uma das vantagens desse mtodo a disponibilidade de parmetros para uma grande variedade de tomos e resultados mais exatos para clculos de carga, momento de dipolo e energia de orbitais moleculares, 49-52 descritores utilizados neste estudo. A metodologia aqui adotada foi a mesma utilizada nos clculos por MM, ou seja, otimizao por AM1 alternado com DM, at a

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estabilizao da menor energia. A geometria obtida no final da etapa foi considerada a conformao mais estvel.51

OBTENO DOS DESCRITORES FSICO-QUMICOS

A partir das geometrias otimizadas pelo mtodo AM1 implementado no programa HyperChem 7.1, foram obtidas 40 variveis, ou descritores fsico-qumicos, dos compostos 1 a 9 (tabela 1). Estas variveis foram obtidas com a utilizao do mdulo QSAR Properties, que fornece uma srie de descritores empricos (eletrnicos, estricos e hidrofbicos) baseados em estudos de diversos autores,53 e pelas opes Properties e Orbitlals do menu Compute, e pela opo Charges, do menu Display Labels, que forneceram as variveis de distribuio eletrnica calculadas por AM1.

MONTAGEM DOS MODELOS DE PREVISO

Para a montagem dos modelos de previso quantitativos, necessria uma varivel dependente experimental. Neste caso, o logaritmo da porcentagem de inibio total (Log %IT) in vitro da linhagem celular MCF7 foi determinado a partir dos estudos experimentais realizados por Nogueira et al.32 A %IT foi obtida a partir da soma das porcentagens de inibio do crescimento e da citotoxicidade dos compostos testados (%IT = %IC + %CC, tabela 2), e fornece uma idia da potncia total de cada composto. A seleo das melhores combinaes de variveis42 foi realizada utilizando algoritmo gentico 42 implementado no BuildQSAR. Com a determinao das combinaes de variveis mais promissoras, construram-se modelos, os quais foram avaliados para verificar se a sua especificao adapta-se convenientemente aos dados observados. Essa avaliao foi dividida em trs partes: avaliao do grau de ajuste, do grau de significncia e do grau de previsibilidade.38 O primeiro medido em termos de sua capacidade de reproduzir o valor observado dos objetos. A avaliao do grau de ajuste feita atravs do clculo do coeficiente de correlao R e do desvio-padro s para cada modelo, alm da anlise dos resduos, calculado a partir da diferena do Log %IT observado experimentalmente (Log %ITObs) e do Log %IT previsto pelo modelo (Log %ITPrev). O que se espera de um modelo em relao ao grau de ajuste que ele apresente R o mais prximo possvel de 1 (ou -1, no caso de uma regresso inversa), que o valor de s seja o mais prximo possvel de zero e que os resduos apresentem distribuio normal em torno de zero. Tambm relacionado ao grau de ajuste do modelo, tem-se o quadrado do coeficiente de correlao R2, o qual corresponde frao da variabilidade total

que explicada pelo modelo. Por exemplo, um modelo de QSAR em que R2= 0,9 dito capaz de explicar 90% da variabilidade total dos valores observados da atividade biolgica, em torno de sua mdia.38 Determinou-se que seriam avaliados os graus de significncia e previsibilidade apenas dos modelos que apresentassem um valor de R 2 acima de 0,7 para correlao com Log %ITObs e, no caso daqueles que apresentavam duas variveis, um valor de R2 menor do que 0,7 para a correlao entre as variveis presentes no modelo, pois, do contrrio, estaria se perdendo tempo com modelos inapropriados para o estudo.42 A literatura3742 geralmente recomenda R > 0,7 (ou seja, R2 > 0,5) como o limite mnimo aceitvel, mas este grupo optou por aumentar os critrios de exigncia, aplicando este valor numrico a R2, visando a chegar a modelos com alta capacidade preditiva e alto nvel de confiana. O grau de significncia medido atravs da execuo de testes de validao (teste estatstico de hiptese). Para testar a significncia estatstica do R2, aplica-se um teste de hiptese conhecido como teste F. Esse verifica o quanto da variabilidade da atividade observada experimentalmente, Log %ITObs, pode ser explicada pelas variveis X1, X2, ..., Xk. Para validar R2 atravs do teste F, preciso comparar o valor de F obtido no modelo com o valor de referncia. Esse, em geral, se refere ao nvel de confiana de 95% e pode ser obtido em tabelas apropriadas.38,56 O grau de previsibilidade do modelo testado atravs da validao cruzada. Um modelo, com elevado grau de previsibilidade, para objetos no includos no mesmo, apresentar Q2 (quadrado do coeficiente de correlao da validao cruzada) prximo de 1 e SPRESS (desvio padro da validao cruzada) prximo de zero.38 Muitos autores consideram valores acima de 0,5 para o Q2 como um bom indicador, ou mesmo a prova final de que o modelo altamente preditivo.33 As equaes utilizadas para o clculo destes parmetros so apresentadas na figura 6. A simples obteno de um modelo QSAR pode significar muito pouco no que diz respeito sua validade e significado. Mesmo aps a obteno de bons resultados nas etapas anteriores, necessria a realizao da validao externa para introduzir maior confiana no modelo. 37 A validao externa (VE) foi feita neste trabalho com os compostos 10, 11 e 12 (figura 3), que tambm foram sintetizados e testados por Nogueira et al.32 A mesma metodologia de modelagem molecular aplicada a 1-9 foi utilizada, obtendo assim os parmetros necessrios resoluo dos modelos propostos, chegando por fim a valores de Log %ITVE para os compostos 10, 11 e 12. Essas atividades previstas foram ento correlacionadas com os valores de Log %ITObs, obtendo-

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Tabela 1. Classificao e descrio das variveis utilizadas no estudo

se o quadrado do coeficiente de correlao para a validao externa (R2VE). Da mesma forma que o R2, determinou-se que o R 2VE deveria apresentar valor mnimo de 0,7, o que garantiria modelos com alta capacidade de predio para novos derivados. A correlao de Log %ITPrev foi realizada na planilha de clculos do programa OppenOffice 1.1.5.36

RESULTADOS E DISCUSSO
Segundo a metodologia adotada, 8 modelos foram selecionados para a avaliao, 5 formados por um descritor e 3 formados por dois descritores. A equao 2 apresenta o melhor modelo obtido com um descritor.
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Tabela 2. Valores para porcentagem de inibio do crescimento celular (%IC) e de citotoxicidade (%CC) e somatrio desses valores (%IT) quanto linhagem celulari

Ensaios realizados conforme metodologia descrita por Alley et al.41

Log %IT = -0,18496(0,07267) LogP +2,88029(0,363420) (2) n=9; R2=0,831; s=0,083; F=34,444; Q2=0,701; SPRESS=0,110 O modelo de regresso representado pela equao 2 capaz de explicar cerca de 83% da variabilidade observada na atividade (R2x100). Gaudio e Zandonade38 consideram este nvel de ajuste excelente, fato esse confirmado pelo baixo valor do desvio-padro s. Esses valores podem ser objetivamente analisados em termos de dois grficos: Log %ITObs em funo de Log %ITPrev e resduos de regresso em funo de Log %ITObs (figura 7). No grfico do Log %ITObs, em funo de Log %ITPrev (esquerda), importante observar o alinhamento dos pontos em relao reta ajustada, bem como a distribuio dos pontos ao longo do intervalo de valores de atividades estudado. J no grfico de resduos de regresso (direita), deve-se observar a distribuio dos resduos, pois se espera que um modelo adequado aos dados observados tenha seus resduos aleatoriamente dispersos em torno de zero.38 O grau de significncia desse modelo pode ser medido em termos do valor obtido para o teste F, comparando o mesmo ao valor de referncia. Para um nvel de confiana de 95%, o valor de referncia F[k, n-k-1] = F[1, 8] = 5,32.56 Como na equao 2 o valor encontrado foi bem maior, esse modelo apresenta um timo nvel de confiana. Quanto ao grau de previsibilidade desta equao, o mesmo apresenta-se satisfatrio, pois o Q2 de 0,701 e o SPRESS bem prximo a zero. Os demais modelos gerados com um descritor so apresentados a seguir: Log %IT = -0,01188(0,00619) RM +3,13600(0,612723) (3) n=9; R2=0,736; s=0,103; F=19,598; Q2=0,565; SPRESS=0,133 Log %IT = -0,00347(0,00202) MM +3,09006(0,657308) (4) n=9; R2=0,692; s=0,112; F=15,719; Q2=0,483; SPRESS=0,145 Log %IT = -0,01899(0,01151) RM3 +2,33766(0,239807) (5) n=9; R2=0,674; s=0,115; F=14,491; Q2=0,387; SPRESS=0,158

Figura 6. Equaes utilizadas para resoluo do Q2 e SPRESS. Figura baseada em dados apresentados na referncia 38

Figura 7. Log%ITObs em funo de Log %ITPrev e resduos de regresso em funo de Log %IT para a equao 2

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Log %IT = -0,00119(0,00078) VM +3,15340(0,780879) (6) n=9; R2=0,638; s=0,121; F=12,396; Q2=0,391; SPRESS=0,157 A equao 3 demonstra estar de acordo com os pressupostos para aprovao na avaliao do grau de ajuste e significncia, mas apresenta previsibilidade baixa. As equaes 4, 5 e 6, apesar de apresentarem bons resultados para s e F, apresentam R2 abaixo de 0,7 e previsibilidade ruim, pois os valores obtidos para validao cruzada esto abaixo do recomendado. Os grficos da equao 6 so apresentados na figura 8, para que a qualidade do melhor (2) e do pior modelo (6) com um descritor possam ser comparadas visualmente. Para modelos com dois descritores foram obtidas trs equaes: Log %IT = -0,03166(0,02433) Dz -0,20513(0,05248) LogP +3,00042(0,267172) n=9; R2=0,935; s=0,056; F=42,797; Q2=0,841; SPRESS=0,087 (7) Log %IT = +0,00097(0,00112) AR1 -0,22786(0,07945) LogP +3,01130(0,344890) n=9; R2=0,900; s=0,069; F=27,044; Q2=0,761; SPRESS=0,106 (8) Log %IT = -0,00831(0,01002) RM3 -0,13397(0,08792) LogP +2,79031(0,332463) n=9; R2=0,899; s=0,070; F=26,149; Q2=0,761; SPRESS=0,106 (9)

As trs equaes foram timas quanto avaliao do grau de ajuste, significncia e previsibilidade. A equao 7 a melhor entre todas, pois apresenta os melhores resultados para R2, s, F, Q2 e SPRESS (figura 9).

Figura 9. Log%ITObs em funo de Log %ITPrev e resduos de regresso em funo de Log %IT para a equao 7

A validao externa foi realizada conforme est descrito na metodologia, resultando assim em valores do quadrado do coeficiente de correlao da validao externa (R2VE) para os 8 modelos (tabela 3).

Tabela 3. Coeficientes de correlao obtidos pelo processo de validao externa (R2 VE)

Figura 8. Log%ITObs em funo de Log %ITPrev e resduos de regresso em funo de Log %IT para a equao 6

Pde-se notar que todas as equaes obtiveram valores abaixo do preconizado (R2VE > 0,7), exceto a equao 5. De forma interessante, possvel notar que
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a equao 7, que apresentou os melhores valores para R2, s, F e Q2, no apresentou o maior R2VE, e sim o terceiro melhor. Isto auxilia a comprovar a importncia desta etapa, pois mostra que modelos de maior previsibilidade no sero necessariamente aqueles mais indicados para serem utilizados no planejamento da sntese de um novo derivado.33 A validao externa uma etapa importante em estudos de QSAR,33 pois visa a enriquecer o modelo no sentido de comprovar a sua previsibilidade atravs da aplicao do mesmo a compostos da mesma classe e no utilizados na sua gerao. Dessa forma, uma reprovao nesta etapa, em um caso como este, em que os outros modelos apresentaram-se eficazes, coloca as equaes, principalmente 4 e 6, em uma posio de menor enfoque, j que as duas tambm no obtiveram resultados to satisfatrios na avaliao do grau de previsibilidade. Quanto equao 5, apesar do altssimo valor encontrado para a validao externa, esta no possvel de utilizao devido a seus valores de R2 e Q2, indicando a existncia de algum fator de variabilidade intrnseco e fora do controle. Desta forma, aps a avaliao dos graus de ajuste, significncia e previsibilidade, os modelos 2, 7, 8 e 9 demonstraram ser os melhores modelos encontrados. Apesar de seus valores para R2VE terem ficado abaixo de 0,7, este processo indica que os modelos em questo podem, teoricamente, prever corretamente o ndice de inibio total da linhagem celular MCF7 de cerca de 49%, 50%, 59% e 67% dos novos compostos, cujas atividades possam ser previstas por estas equaes. Esses melhores modelos foram ento utilizados para a interpretao fsico-qumica dos resultados. De acordo com Montanari, Montanari e Gaudio,37 alm de dizer se um certo parmetro aumenta ou diminui a atividade biolgica, a avaliao do coeficiente angular (constante pela qual multiplicada a varivel) fornece uma medida da influncia do descritor frente atividade biolgica e sobre os demais descritores. Por exemplo, uma varivel X1 com um coeficiente de 0,3 apresenta menor influncia sobre a atividade biolgica do que uma X2 com coeficiente de 1,0. Desta forma, necessrio avaliar cada parmetro e comparar seus coeficientes, para observar qual tem maior contribuio na atividade. Na anlise das equaes selecionadas, observou-se uma grande contribuio da hidrofobicidade, e, em menor escala, de descritores eletrnicos e estricos na atividade dos compostos estudados. Atravs das equaes 2, 7, 8 e 9, pode-se notar que um aumento do Log P leva a uma diminuio na atividade biolgica em todas essas equaes, pois o ndice do coeficiente angular negativo. Alm do mais, a gerao de modelos com dois

descritores no causou um grande impacto na qualidade dos mesmos. Assim, a hidrofobicidade parece estar influenciando na inibio da linhagem MCF7 mais do que as outras propriedades. A hidrofobicidade de um composto um fator importante no planejamento de novos frmacos. Quando encontrada em um modelo, a mesma demonstra exercer forte influncia em processos, tais como: absoro, ligao ao receptor e, se for o caso, transporte pela barreira hematoenceflica. Parmetros hidrofbicos tambm podem refletir uma combinao de propriedades estricas e interaes eletrostticas dos compostos, dependentes principalmente de um distrbio causado na estrutura da gua. Essas caractersticas so correlacionadas com o tamanho e a rea de superfcie das molculas, tendo uma relao direta com a gua atravs da formao de pontes de hidrognio.57 Considerando a contribuio negativa do descritor Log P nos modelos, isto nos leva a crer que os dibenzoilmetanos provavelmente tenham seu stio de ao na superfcie da clula, o que indicaria que, se estes compostos se difundirem facilmente pela bicamada lipdica da membrana celular, ou seja, forem facilmente absorvidos, a atividade diminuiria. Com relao aos demais descritores presentes nos modelos (Dz, RM, RM3 e AR1), tambm possvel verificar uma contribuio negativa de propriedades estricas e eletrnicas. O coeficiente angular destas variveis em todas as seis equaes selecionadas demonstra uma fraca contribuio quando comparado com o Log P. Por exemplo: a equao 7 capaz de prever 94% da variabilidade. Todavia, ao se verificar a equao 2, possvel ver que o Log P responde sozinho por 83% da variabilidade. Assim, apenas 11% explicada por Dz. O mesmo ocorre na equao 9, onde apenas 7% da variabilidade explicada por RM3. O momento de dipolo (D) uma caracterstica vetorial, e pode ser definido como a medida da magnitude da carga deslocada quando tomos de eletronegatividades diferentes so interligados. A direo do momento de dipolo de uma molcula baseada nas eletronegatividades relativas dos tomos componentes e o valor obtido pelo vetor resultante dos momentos de dipolo de cada eixo de ligao (x, y e z) da molcula.57 A presena da varivel Dz no modelo, cujo sinal de seu coeficiente angular negativo, indica como a polarizao na regio da molcula, por onde passa o eixo z, influencia a atividade biolgica dos compostos estudados. O sinal negativo pode indicar que esta regio da molcula, quando da interao droga/receptor, estaria "tocando" um local de polarizao de mesmo sinal (ou seja, polarizao negativa com negativa ou positiva com

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positiva), o que desfavorece a formao do complexo. Sendo assim, novos derivados devero, preferencialmente, apresentar valores baixos para Dz ou de sinal negativo, o que favorecer um aumento da atividade biolgica. Porm, mesmo que este dado tenha permitido esta interpretao, a contribuio deste descritor para a atividade biolgica baixa. Com relao aos modelos com os descritores estricos RM, RM3 e AR1, ficou caracterizado que o tamanho da molcula inversamente proporcional sua atividade. Esse fato geralmente observado para compostos que se ligam a receptores pouco flexveis e onde o stio de ao relativamente pequeno. A refratividade molar (RM) considerada uma caracterstica mista, pois ao mesmo tempo em que ela diretamente proporcional ao tamanho da molcula, tambm uma medida do quanto facilmente um composto polarizase.28 Desta forma, a equao 9 demonstra que a atividade desses compostos favorecida na presena de substituintes pequenos em R3. Alm disso, o sinal negativo do coeficiente angular tambm pode estar indicando, assim como ocorreu com Dz, que a capacidade da molcula se polarizar outro fator que desfavorece a atividade biolgica. Estas informaes, somadas s da equao 7, sugerem que os dibenzoilmetanos possivelmente realizam interaes eletrostticas fracas com o stio de interao no receptor, onde o grau de polarizao da molcula menor (por exemplo, foras de van der Waals). A linhagem de clulas MCF7 apresenta em seu ncleo receptores estrognicos. As aes desses receptores podem ser mediadas com a ligao do composto diretamente no ncleo da clula, ou via segundos mensageiros liberados quando da ligao a receptores na membrana ou no citoplasma. Em um estudo de QSAR, relacionando 59 derivados de TMX com a afinidade de ligao ao receptor estrognico citoplasmtico presentes em clulas uterinas de ratas, demonstrou-se uma influncia negativa de propriedades hidrofbicas e estricas na interao frmaco/receptor. Desta forma, em virtude da semelhana estrutural entre os tamoxifenos e alguns dos dibenzoilmetanos substitudos (figura 9), especialmente 3, 6, 9, 11 e 12, nota-se um possvel caminho a ser tomado com relao ao estudo do mecanismo de ao dos dibenzoilmetanos.

Figura 10. Comparao da estrutura do TMX e do esqueleto bsico dos dibenzoilmetanos -substitudos com CH 2 -Ph, e sobreposio das estruturas tridimensionais do TMX (esferas brancas) e do composto 12 (esferas pretas). Sobreposio criada no HyperChem 7.1, utilizando as estruturas otimizadas pela metodologia descrita

a elucidao do mecanismo de ao e para o planejamento e sntese de anlogos com perfil farmacolgico otimizado. Os resultados obtidos neste trabalho, apesar do pequeno nmero de compostos utilizados e dos baixos valores encontrados para R2VE, podem direcionar posteriores estudos sobre os dibenzoilmetanos e a atividade antitumoral em linhagem de clulas MCF7. Atravs das equaes, podese chegar compreenso de quais propriedades so importantes para a atividade descrita. Essas informaes, alm de fornecerem importantes pistas quanto ao possvel mecanismo de ao dos mesmos, auxiliam no planejamento de N.E.M. com potencial utilizao como frmacos no tratamento do cncer da mama, ou como prottipos desses novos frmacos.

AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem FUNDEP/UNIOESTE e ao CURSO DE FARMCIA DA UNIOESTE pelo apoio financeiro.

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CONCLUSO
O estudo de QSAR, atravs da abordagem de Hansch, mostrou-se eficaz na avaliao da atividade antitumoral dos dibenzoilmetanos -substitudos. As equaes geradas pelos modelos de regresso, quando bem avaliadas, podem ser usadas como ponto de partida para

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