2. Tcnicas bsicas em microbiologia 2.1 Segurana no laboratrio Em microbiologia, trabalhar bem significa trabalhar com segurana.

Algumas regras importantes no exerccio do trabalho em laboratrio de biotecnologia como: - Ao entrar no laboratrio colocar, livros, casaco e outros objetos de uso pessoal em local apropriado, nunca sobre a bancada de trabalho. - Lavar as mos com sabo ou detergente, antes e depois de executar o trabalho. - Prender os cabelos, quando longos, para evitar o contato com a chama do bico de gs. - Manter sempre a ateno no trabalho que esta sendo executado, a fim de evitar acidentes.

2.2 Preparo de meios de cultura Chamamos de meio de cultura o conjunto de nutrientes necessrios para que ocorra a multiplicao ou manuteno dos microrganismos. Um meio de cultura pode ser utilizado para o crescimento, manuteno ou transporte de microrganismos. Para o crescimento, devem conter todos os nutrientes necessrios, para que sejam sintetizadas as novas estruturas celulares. Inculo: pequena quantidade de material contendo clulas vivas. Inoculaao: a adio do inculo ao meio estril, chamamos de inoculao.

2.3 Tcnicas de assepsia As tcnicas de assepsia impedem a contaminao de instrumentos e meios de cultura antes e durante o seu manuseio. Para evitar a contaminao de um material, a borda do tubo deve ser rapidamente passada na chama do bico de Bunsen imediatamente aps a sua abertura e antes de ser fechado.

2.5 Metodos de inoculao Procedimento para inoculao com lquidos contendo microrganismos

2.5.1 Inculos lquidos em meios lquidos A partir de uma suspenso contendo microrganismos, podemos inocular meios lquidos, mergulhando nestes uma alada contendo os microrganismos. 2.5.2 Inculos slidos em meios lquidos A ala e o fio de platina podem ser usados para retirar pequenas quantidades de material slido, por exemplo, microrganismos provenientes de uma colnia em meio de cultura slido. 2.5.3 Liquidos ou slidos em meios slidos 2.5.3.1 Semeadura para obteno de colnias isoladas ou semeadura em estrias Essa tcnica usada quando o inculo (liquido ou solido) contem diferentes microrganismos ou muitos microrganismos de uma mesma espcie e desejamos obter colnias bem separadas. 2.5.3.2 Semeadura em profundidade e superfcie Esse mtodo usado quando queremos crescer microrganismos simultaneamente, em condies de semi-anaerobiose e em aerobiose. 2.5.3.3 Semeadura com espalhamento em superfcie Esta tcnica consiste no espalhamento de um inculo contido em um pequeno volume sobre a superfcie de um meio de cultura slido em placa. 2.5.3.4 Semeadura em camada Essa tcnica tem como objetivo a obteno de um crescimento abundante em toda a superfcie do meio de cultura solido contido em placa, erlenmeyer ou outro frasco. 2.5.3.5 Semeadura por derramamento Com os mesmos objetivos da tcnica descrita no item 2.5.3.2 esta tcnica usada para obteno de crescimento em condies de aerobiose e anaerobiose em meio de cultura slido contido em placa de Petri.

2.7 Meios de cultura e condies de incubao para anaerbios Para que ocorra a multiplicao dos microrganismos anaerbios os meios inoculados devem ser incubados em condies apropriadas 2.7.1 Incubao anaerbia em jarras

Microrganismos anaerbios devem ser mantidos em ausncia de oxignio. Essa condio pode ser alcanada com o uso de jarras de anaerobiose. 2.7.2 Meios de cultura para anaerbios Alguns microrganismos anaerbios podem crescer em meios de culturas apropriados, como o caso do meio de Robertson. O meio esterilizado por autoclavao e mantido em frascos com tampa de rosca. 2.7.3 Cmaras para o trabalho com anaerbios A utilizao de cmaras para o trabalho com microrganismos anaerbios permite que amostras de culturas sejam retiradas em condies controladas de ausncia de oxignio, temperatura, umidade e CO2.

2.8 Mtodos utilizados para quantificar os microrganismos Existem vrios mtodos a serem utilizados quando queremos saber o numero de microrganismos em uma cultura ou suspenso. 2.8.1 Tcnicas de diluio Para reduzir o numero de microrganismos em uma amostra, usamos as tcnicas de diluio. 2.8.2 Contagem do numero total de clulas (vivas e mortas) O numero total de clulas usualmente determinado por contagem em cmaras calibradas observadas com microscpio, ou por contadores, onde os organismos so contados eletronicamente. 2.8.2.1 Cmaras de contagem Para a contagem em cmaras, os organismos patognicos ou moveis devem ser previamente mortos pelo calor ou por ao de uma soluo contendo formalina. 2.8.2.2 Contagem em Coulter Para serem contadas, as partculas devem ser suspensas em um fluido condutor que passa de uma cmara para outra atravs de uma abertura minscula por onde passa tambm uma corrente eltrica. 2.8.1.3 Contagem em esfregaos corados A contagem feita ao microscpio. 2.8.1.4 Mtodo de turbidimetria. Comparao visual com tubos de turvao padro

A amostra deve ser observada em tubos de dimenses iguais ao tubo contendo a suspenso padro. A turvao da amostra comparada visualmente com a de um determinado tubo da srie padro e o calculo da concentrao de clulas na amostra feito a partir de uma tabela que acompanha o conjunto de tubos padres. 2.8.2 Contagem do numero de microrganismos vivos A contagem de viveis mede a concentrao de clulas vivas. 2.8.2.1 Contagem de colnias aps espalhamento do inculo na superfcie do meio de cultura bastante utilizado para a contagem de bactrias e leveduras. 2.8.2.3 Contagem de colnias aps inoculao com gotas. Mtodo miles e misra Nesse mtodo a estimativa do numero de clulas vivas obtida a partir da contagem de colnias originadas pelas clulas contidas nas gotas. 2.8.2.4 Contagem de colnias aps filtrao A contagem do numero de clulas vivas feita a partir das colnias crescidas na membrana e o volume da amostra da amostra filtrada. 2.8.2.5 Determinao do numero de viveis aps inoculao em meio liquido. Metodo do Numero Mais Provavel (N.M.P.) O calculo obtido a partir dos resultados obtidos na pratica recorrendo-se a tabela adequadas. 2.8.2.6 Determinao do numero de viveis aps inoculao em meio de cultura solido. Mtodo do Numero Mais Provavel Alternativo (N.M.P.A.) O calculo obtido a partir dos resultados experimentais, recorrendo-se a tabelas adequadas. 2.8.3 Mtodos utilizados para medir a biomassa microbiana 2.8.3.1 Determinao da massa de material celular As clulas provenientes de uma cultura podem ser quantificadas por pesagem direta. As medidas de massa do contedo celular seco tm sido bastante empregadas para avaliar crescimento de bactrias, leveduras e fungos filamentosos. 2.8.3.2 Turbidimetria com espectrofotmetro O espectrofotmetro um instrumento capaz de medir a quantidade de luz que absorvida ou transmitida quando atravessa uma amostra contida em um recipiente. Em microbiologia, quando utilizamos o espctrofotometro, um feixe de luz atravessa a suspenso que contem os microrganismos. Quanto

maior o numero de microrganismos, maior ser a disperso da luz. O resultado ser que uma menor quantidade de luz atravessara a amostra. 2.8.3.3 Dosagem de componentes celulares A dosagem de qualquer um dos principais componentes celulares pode fornecer uma avaliao da massa microbiana. 2.8.3.4 medidas de compostos resultantes da atividade metablica Quando as clulas esto em crescimento, a massa de material celular seco aumenta, enquanto a quantidade de nutrientes disponveis no meio de cultura diminuir. 2.8.3.5 Volume de material celular aps centrifugao Esse mtodo consiste na centrifugao de uma amostra de suspenso celular em tubo de centrifuga especialmente calibrado. A centrifugao deve ser realizada em condies que promovam o empacotamento dos microrganismos, sem provocar ruptura ou lise celular.

2.9 Colorao de microrganismos 2.9.1 preparao de esfregaos e fixao pelo calor Para que uma amostra seja corada, geralmente as clulas so previamente mortas e fixadas. 2.9.2 Colorao de Gram Essa colorao utilizada para separar as bactrias em dois grandes grupos: bactrias gram-positivas e bactrias gram-negativas.