METODOS DE SIEMBRA Y CULTIVO

INTRODUCCION:

Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseado diversos mtodos que permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las tcnicas ms usadas en el laboratorio de microbiologa consiste en transferir una muestra microbiolgica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. A l efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el rea de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que stos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no slo el aspecto nutricional, sino tambin las condiciones ambientales de su hbitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentracin de sales y durante la incubacin condiciones tales como la temperatura, aireac in la luminosidad. La aplicacin de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, as como su aislamiento y la obtencin de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterizacin, aplicacin y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propsito especfico del estudio.
OBJETIVOS: y y y

Aprender los principales mtodos de siembra de microbiologa Aprender los principales mtodos de cultivo existentes Aplicar la tcnica adecuada para preparar el rea de trabajo y evitar contaminaciones. Seleccionar y aplicar las tcnicas de siembra adecuadas para alcanzar propsitos especficos.

FUNDAMENTO TEORICO:

Cultivar un microorganismo significa promover intenci onalmente el desarrollo de ste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La poblacin de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando ste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro oaxnico, cuando contiene ms de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto. Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios.

Un cultivo axnico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola clula. Los cultivos axnicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axnico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axnico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos estn por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que ste pueda ser axnico. El segundo paso para obtener un cultivo axnico es inocular o introducir, una sola clula de un microorganismo en un medio slido o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podr multiplicar en condiciones favorables. Unclon est constituido por una poblacin de clulas descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio slido. Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En esta transferencia se deben considerar dos aspectos bsicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y concentracin o carga microbiana de la muestra (inculo) a sembrar. Para impedir la contaminacin de los cultivos, es necesario tener plena conciencia de la ubicuidad de los microorganismos, lo que determina que el are y todas las superficies estn densamente pobladas por microorganismos, de este modo en la transferencia de una muestra microbiolgica a otro recipiente, se deben tener una serie de cuidados que eliminen los riesgos de contaminacin. Estos incluyen el rea de trabajo, el lavado de las manos, la esterilizacin de todos los utensilios y medios de cultivo a emplear y realizar la transferencia del microorganismo en una zona estril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. Al conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminacin se le llama tcnica asptica; el seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes tales como:
y y

La contaminacin y prdida del cultivo en estudio La salida y dispersin de microorganismos del cultivo, lo que ocasionara la contaminacin de utensilios, productos y del personal. Este ltimo aspecto es particularmente importante cuando se trabaja con cultivos de microorganismos patgenos.

Con relacin a la concentracin del inculo, un error frecuente del p rincipiante consiste en tomar muestras grandes, lo que es innecesario. Una colonia de bacterias del tamao de la cabeza de un alfiler contiene varios millones de microorganismos, es obvio que con una cantidad pequesima (casi invisible) que se adhiera al asa, ser ms que suficiente para efectuar una transferencia exitosa.

Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas: hisopo, pipeta (para uso microbiolgico son terminales y la parte superior o boquilla debe estar protegida con filtro de algodn), pipeta pasteur, cable de Kolle o portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, esptula y/o gancho. En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculacin, hisopos, pipetas o pipetas pasteur que debern esterilizarse previamente. La utilizacin de esto s dispositivos, as como de los diferentes medios de cultivo tienen aplicaciones especficas. Por ejemplo: los medios lquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de algodn o tapones especiales. Un cultivo lquido puede ser transferi do mediante un asa microbiolgica, un hisopo, pipeta o pipeta pasteur; el inculo se deposita dentro del caldo o medio lquido. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en la superficie o a travs de todo el lquido. Una de las ventajas que presenta este tipo de cultivo se refiere a la posibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las poblaciones se encuentran suspendidas y e fcil homogenizarlas, lo que permite estandarizar la concentracin del inculo. La desventaja que presentan, e que en ellos e difcil detectar contaminacin a simple vista. Los medios semislidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o pipeta pasteur; en este ltimo caso es necesario calentar el medio y cuando se encuentra en estado lquido y a una temperatura de aproximadamente 42C se agrega el inculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los microorganismos y para favorecer la separacin de microorganismos con diferentes requerimientos de oxgeno. Los medios slidos e preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las necesidades, despus de esterilizarlos, estos se inclinan o vierten en cajas de petri. La siembra se realiza con el asa, inoculando la superficie del agar con mucha suavidad; en estos medios, los microorganismos al multiplicarse forman agregados que se hacen visibles a simple vista; a estos agregados se les denominan colonias, las que presentan caractersticas que varan con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado. En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que an cuando la mayora de los microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH alcalino o cido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecer el crecimiento del microorganismo de inters y la obtencin del cultivo. Con este mismo propsito durante la i ncubacin se deben proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio. El crecimiento ptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayora de las veces estn relacionadas con la de su hbitat natural. Algunos microorganismos crecen por debajo de 15C, otros requieren temperaturas ms elevadas (30 a 45C) y algunos hasta 80C. Para alcanzar y mantener estas temperaturas se puede usar una incubadora microbiolgica o

un bao de agua a temperatura constante, en tanto qu e para lo microorganismos que presentan su crecimiento ptimo a temperaturas entre 20 y 25C se pueden incubar en la gaveta o cajn del laboratorio, a temperatura ambiente. En general las incubadoras microbiolgicas satisfacen las necesidades en cuanto a los rangos de temperatura requeridas por los microorganismos. La desventaja que tienen es que estos aparatos funcionan con are seco, lo que determina la deshidratacin de los medios de cultivo. Por lo tanto, el crecimiento de cualquier cultivo experimental que se realice en incubadora no debe prolongare por ms de nueve das. Con relacin a las necesidades gaseosas, no todos los microorganismo crecen en presencia de oxgeno atmosfrico; los que slo crecen en presencia de are se llaman aerobios obligados; los que slo crecen en ausencia de oxgeno se denominan anaerobios obligados o estrictos, un tercer grupo se adapta a las dos condiciones y se le conoce como facultativos. Existe una cuarta categora que comprende bacterias que requieren oxgeno, pero sl o lo utilizan cuando ste existe en concentraciones reducidas; a estos se les llama microaeroflicos. El desarrollo de estos diferentes grupos e favorece mediante la agitacin de los cultivos o mediante la exclusin de oxgeno para lo que se emplean sustan cias reductoras o equipos especiales. Las bacterias son organismos procariticos, se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitan en el agua, el suelo, en la superficie o en el interior de plantas y animales incluyendo al hombre. Pueden v ivir en forma libre o en simbiosis con otros organismos, ya sea como parsitos, comensales o mutualistas. Fisiolgicamente este grupo presenta caractersticas muy variables, hay bacterias mviles e inmviles fotosintticas y quimiotrficas, auttrofas y hetertrofas; se desarrollan en un rango muy amplio de temperatura, pH y condiciones gaseosas. En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen: tamao, morfologa celular, forma de agrupacin, reaccin a la tincin de Gram, formacin de esporas, movilidad, presencia de inclusiones de reserva y caractersticas culturales en medios lquidos y slidos en los que presentan patrones de desarrollo en cuanto a la forma, tamao, elevacin y color de las colonias.
Tcnicas de siembra: El mtodo de siembra por estra en placa:

Es el mtodo ms fcil y el ms usado para obtener cultivos axnicos. Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la poblacin mixta y a continuacin se hacen estras sobre la superficie de un medio slido preparado en una placa Petri (a las placas Petri tambin se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estras en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorgani smos. A continuacin, se flamea el asa, se toca en la regin donde se han realizado las ltimas estras y se contina la siembra con la misma tcnica, en la superficie

de medio sin sembrar an. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar clulas individuales. A continuacin, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las clulas aisladas experimenten un nmero suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de un a sola clula, no podemos asegurarlo. Quizs, dos clulas quedaron depositadas tan juntas que han originado una nica colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axnico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, sern, casi con toda seguridad, cultivos axnicos.
Los mtodos de vertido en placa y extensin en placa

En estos mtodos, las suspensiones de clulas microbianas se di luyenantes de su siembra en placa. Se siguen estas tcnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la dilucin no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensin con mil millones de clulas por mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener una suspensin con un centenar de clulas por mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien. Para realizar diluciones de diez en diez, se aade 1 ml de la suspensin bacteriana a 9 ml (le medio estril o solucin salina, igualmente estril. Se agita vigorosamente para diluir las clulas y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuacin, se puede proceder de dos maneras diferentes. En el mtodo de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarn embebidas en el agar y otras crecern en la superficie. Las colonias superficiales se extendern y sern ms grandes. En el segundo mtodo (extensin en placa), las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar, extendindolas con avuda de un asa de Diralsky de cristal estril. La suspensin se absorbe en el agar, dejando las clulas microbianas sobre la superficie. En ambas tcnicas las placas se incuban hasta la aparicin de las colonias. Como en el mtodo de siembra por estra, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensin o en el agar solidificado sembrado por el mtodo del vertido en placas sean cultivos axnicos hasta que se repita el proceso. Las dos tcnicas de siembra por dilucin presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor nmero de colonias aisladas que el mtodo de siembra por es tra, por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos.

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A) SIEMBRA E TUBOS: 1. Si m . Si m El t lti t l i l. u u l t l t u t i l l l i i i t l t f t l i li i i ,

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b. Si mbra a un ubo on m dio de ul i o desde una plac a petri La laca t i con l at ial i a coloca f nt a no con t rili a l asa, se abre la placa bajo el la tapa acia arri a. S echero, se toma con el asa n poco e material, se retira el asa, ierda se toma el t bo con el se cierra la placa con la mano i medio de culti o. La siembra se reali a como en los casos anteriores.

2. Siembra en placa petri a. Tcnica de la placa estriada en sectores (en superficie) cuadrantes). La La placa petri con agar se di ide en sectores siembra se reali a con un asa con material se siembra), sobre el agar reali ando movimientos de ig-zag desde un extremo de la placa hacia en centro de ella. Es necesario ue las estras no

toquen los sectores vecinos. Esterilizar el asa al terminar la siembra luego de cerrar la placa colocar la placa con la tapa hacia abajo.

b.

Tcnica de siembra con un extensor (en superficie) on la mano izquierda levantar la tapa de la placa petri bajo mechero, sosteni ndolo con el dedo ndice el pulgar. on una asa o pipeta se vierte el material de siembra a la superficie del agar, con el extensor se cubre toda la superficie con el material haciendo movimientos giratorios. Al final se extrae e l extensor, se se coloca el extensor en una soluci n cierra la placa desinfectante. olocar la placa con la tapa hacia abajo.

c.

Tcnica de aciado en placa por incorporacin otular las placas. olocar el material de siembra con una pipeta en cada placa ml.). Agregar el agar; realizar movimientos de vaivn para distribuir bien el material. olocar las placas con la tapa hacia arriba hasta que enfre el agar. Invertirlas en el momento de llevarlas a incubar.

5.

RE OME

ACIONES:

Antes de utilizar los materiales pipetas, tubos, asas, etc.) stos deben de ser esterilizados correctamente en el laboratorio tomando siempre las precauciones. ada vez que se termina una siembra siempre hay que esterilizar el asa de olle flamendola con el mechero) para obtener los resultados esperados en el experiemnto . En el caso de los tubos de ensayo, flamear la boca de stos antes de colocar el tapn. Marcar los tubos con la identificacin del cultivo, la fecha y el nombre para no confundir las placas.

6.

CONCLUSION:

Se pudo conocer los mtodos de siembra y cultivo ms utilizados en el laboratorio de microbiologa y dndonos ha conocer correctamente el mtodo que hemos utilizado en la practica.

8.

BIBLIOGRAFIA

Libro: y

R. DAS, C. GA AZO, I. LOPEZ GOI microbiologa

anual prctico de

Referencias en WEB: y y y

www.goolge.com http://es.wikipedia.org/wiki/mediosdecultivo www.monografias.com

RECOEMNDACIONES: CONCLUSION:

Por medio de esta prctica se logr utilizar las tcnicas aprendidas durante el transcurso del curso. Se logr aprender a realizar algunos de los mtodos que existen para cultivar bacterias y de esta manera observar sus caractersticas tanto macroscpicas como microscpicas e interpretacin de las mismas, con lo que se observ que para cada bacteria existen caractersticas diferentes que son las que las identifican y diferencian de otras bacterias, por lo que de esta manera se le puede llegar a identificar con su correcta siembra y observacin para anlisis posteriores o simplemente para la identificacin de una bacteria en algn medio u organismo.

BIBLIOGRAFIA: y y y y y

Romero Cabello, R. icrobiologa y Parasitologa Humana: Bases etiolgicas de las enfermedades infecciosas. Editorial Panamericana, xico 2001. 2ed. Pp.257 -429 http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/jolope/GUIONPRACTICAS050 6.doc http://es.wikipedia.org/wiki/ http://www.ucm.es/info/mfar/pdfs/Guia icro2.pdf