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FIXAO BIOLGICA E ASSIMILAO DE NITROGNIO

Patrcia G. Morgante - pgleydes@ib.usp.br

I- INTRODUO II- CICLO DO NITROGNIO III- ORGANISMOS FIXADORES DE NITROGNIO IV- Frankia E AS PLANTAS ACTINORRIZAS V- CIANOBACTRIAS E SUAS ASSOCIAES VI- A SIMBIOSE COM AS GRAMNEAS VII- FIXAO SIMBITICA DE NITROGNIO EM LEGUMINOSAS VIII- A NITROGENASE E A REAO DE FIXAO DE NITROGNIO IX- GENES ENVOLVIDOS NA FIXAO BIOLGICA DO NITROGNIO X-ASSIMILAO DO NITROGNIO XI- BIBLIOGRAFIA BSICA XII- BIBLIOGRAFIA ESPECFICA

I- INTRODUO
O nitrognio o quarto elemento mais abundante nas plantas, sendo superado apenas pelo carbono, pelo oxignio e pelo hidrognio. constituinte essencial de aminocidos, protenas, bases nitrogenadas, cidos nuclicos, hormnios e clorofila, entre outras molculas. A maioria das plantas obtm o nitrognio do solo sob a forma de on nitrato (NO3-), havendo algumas que o absorvem sob a forma de on amnio (NH4+). O nitrognio pode ser um nutriente crtico para as plantas porque seu suprimento no solo limitado e, alm disso, ele tambm utilizado pelos microrganismos que habitam esse solo. O ar atmosfrico tambm possui nitrognio. Cerca de 78% da constituio gasosa da atmosfera formada por nitrognio molecular ou dinitrognio (N2). No entanto, os organismos eucariontes so incapazes de absorver o N2 e convert-lo a uma forma assimilvel. Assim, o N2 move-se para dentro da planta atravs dos estmatos, saindo logo em seguida, sem que possa ser utilizado. Os tomos encontram-se unidos de uma maneira muito estvel na molcula de nitrognio e por esse motivo para que o N2 possa ser convertido a uma forma assimilvel necessrio o fornecimento de temperatura e presso muito elevadas (fixao industrial) ou a presena de um sistema enzimtico apropriado (fixao biolgica) .

A fixao industrial do N2, chamada de processo de Haber-Bosch, utiliza temperaturas em torno de 400-600 oC e presses em torno de 100-200 atm, sendo dispendiosa do ponto de vista energtico. Reao: N2 + 3 H2 ---> 2 NH3 A fixao biolgica do N2 ocorre graas a uma enzima, denominada nitrogenase, presente apenas em alguns organismos procariontes. Do ponto de vista energtico, ela tambm dispendiosa para o organismo que a realiza . No entanto, devido a presena de um sistema enzimtico, a reao pode ocorrer temperatura ambiente e presso atmosfrica. Reao: N2 + 16 ATP + 8 e- + 8H+ ---> 2 NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi. (onde e- simboliza eltron e Pi simboliza o fosfato inorgnico).

II- CICLO DO NITROGNIO


Cerca de 10% do nitrognio atmosfrico que trazido para o solo, sob a forma de NO3ou NH4+, foi convertido a tais formas inicas atravs de trs processos diferentes (Fig.1).

Os resduos da combusto industrial, a atividade vulcnica e a queima de florestas liberam compostos gasosos na atmosfera. Dentre eles est a amnia, que em contato com a gua da chuva convertida em on NH4+ e acaba por atingir o solo. Pode ocorrer a oxidao do N2, tanto pelo O2 como pelo O3, na presena de energia de raios ou radiao ultravioleta. Assim, alguns xidos de nitrognio so formados e originam o NO3- quando em contato com a chuva, sendo transportados para o solo. Os oceanos lanam aerossis no ar. Quando a gua desses aerossis evapora, os sais permanecem em suspenso e so levados ao sabor dos ventos. Com as chuvas, alguns desses sais podem ser depositados na terra como ocorre com o NO3-. Esses processo recebe o nome de "sais cclicos" porque, normalmente, os sais so depositados em terras da faixa costeira, retornando sua origem, o mar.

Alm disso, o N2 pode ser fixado pela indstria (processo de Haber-Bosch) ou por organismos procariontes (fixao biolgica) como visto anteriormente (Fig.1). O processo industrial contribui com cerca de 15% do nitrognio atmosfrico colocado no solo, enquanto que o processo biolgico se encarrega de obter os 75% restantes. Portanto, a fixao biolgica de suma importncia para a nutrio nitrogenada dos solos. A matria orgnica tambm fonte de nitrognio para o solo. Nela, o nitrognio est insolvel, mas graas a atuao de organismos decompositores (fungos e bactrias) ele convertido em NH4+ , no processo conhecido como amonificao (Fig.1).

FIGURA 1: Ciclo do nitrognio (adaptado de Salisbury & Ross, 1992).


Ainda considerando o ciclo do nitrognio, importante lembrar que o NH4+ presente nos solos , freqentemente, convertido a NO3- (Fig.1). O processo, conhecido pelo nome de nitrificao, ocorre em duas etapas e conta com a atuao de bactrias nitrificantes. Inicialmente, o NH4+ convertido a NO2- (nitrito) pela ao de bactrias do gnero Nitrosomonas. Em seguida, o NO2- convertido a NO3- a graas a bactrias Nitrobacter. Fechando o ciclo do nitrognio, observamos que o nutriente pode ser perdido do solo (Fig.1). Perdas so devidas lixiviao ou desnitrificao.

III- ORGANISMOS FIXADORES DE NITROGNIO


A fixao biolgica do nitrognio realizada por determinados procariontes, denominados organismos fixadores de nitrognio, que possuem a enzima nitrogenase. Os organismos fixadores podem ser de vida livre (Tab.1) ou viver em associaes (Tab. 2).

TABELA 1: Exemplos de organismos de vida livre fixadores de nitrognio.

Bactrias Autotrficas - Thiobacillus ferrooxidans - Rhodospirillum rubrum - Gloeothece, Oscillatoria, Plectonema, Anabaena, Nostoc Bactrias Heterotrficas - Clostridium pasteurianum - Klebsiella pneumoniae - Azotobacter vinelandii Fonte: adaptado de Smith & Gallon, 1993. A fixao de nitrognio efetuada pelos organismos de vida livre est estimada em menos de 5 kg/ha/ano. Nesse grupo encontram-se bactrias autotrficas e heterotrficas, as quais distinguem-se quanto eficincia do processo de fixao. Destacam-se as cianobactrias ou cianofceas (Gloeothece, Oscillatoria, Plectonema, Anabaena, Nostoc) que realizam a fotossntese de uma maneira muito semelhante aos vegetais superiores, havendo a liberao de O2 e, a bactria Klebsiella pneumoniae, na qual foram identificados e estudados os primeiros genes nif. TABELA 2: Exemplos de organismos fixadores de nitrognio que formam associaes.

Procarionte Fixador Eucarionte Associado


Rhizobiaceae Azorhizobium, Bradyrhizobium, Rhizobium Actinomycetales Frankia Cianobactrias Anabaena, Nostoc Leguminosas Papilionoideae, Caesalpinioideae, Parasponia (Ulmaceae) Plantas Actinorrizas Elaeagnus, Myrica, Alnus, Casuarina Angiospermas (Gunnera), Gimnospermas (Macrozamia), Pteridfitas (Azolla), Brifitas (Sphagnum), Diatomceas (Rhizosolenia), Fungos (liquens) e Esponjas (Siphonochalina) Mimosoideae e

Azospirillum Beijirinckia Gramneas Bacillus Azotobacter

Fonte: adaptado de Gibson, 1990 e de Smith & Gallon, 1993). As associaes entre organismos fixadores e eucariontes sero estudadas a seguir. A relao Rhizobiaceae-leguminosas a mais conhecida e talvez a mais importante das associaes. Por esse motivo, ser analisada ao final e mais minuciosamente.

IV- Frankia E AS PLANTAS ACTINORRIZAS


A bactria filamentosa do gnero Frankia associa-se com plantas de 20 gneros diferentes, pertencentes a 9 famlias vegetais. Em conseqncia, durante muito tempo acreditou-se que essa bactria fosse a mais promscua dentre os organismos fixadores que realizam associaes . Essa viso tende a ser modificada, uma vez que estudos filogenticos recentes tm mostrado a existncia de uma grande proximidade entre as 9 famlias em questo. As plantas hospedeiras so chamadas de actinorrizas e os exemplos mais comuns so as arbreas, no leguminosas, como o pinheiro australiano (Casuarina) e membros da famlia Rosaceae. A bactria habita o solo, vivendo saprofiticamente enquanto em liberdade. Ao encontrar uma planta hospedeira, ela penetra suas razes para formar os ndulos, no interior dos quais passar a fixar o nitrognio atmosfrico. Nessa simbiose, as plantas fornecem os produtos da fotossntese, enquanto as bactrias fornecem o nitrognio fixado (sob a forma de NH4+). Os ndulos radiculares so constitudos de hifas vegetativas alongadas e vesculas septadas fixadoras de nitrognio. As vesculas esto envolvidas por um envelope lipdico que tem a funo de proteger contra a inibio causada pelo O2 .

V- CIANOBACTRIAS E SUAS ASSOCIAES


Embora muitos gneros de cianobactrias sejam organismos fixadores de vida livre, os gneros Anabaena e Nostoc podem ser encontrados em associaes com eucariontes pertencentes a diferentes Reinos. Uma unio bastante conhecida a da Anabaena com a pteridfita aqutica Azolla. Na sia, o cultivo do arroz costuma ser feito em consrcio com o de Azolla para garantir a nutrio nitrogenada das plantas. Tanto as formas de vida livre como as associadas fixam nitrognio somente quando o ambiente pobre em nutrientes nitrogenados. As cianobactrias que formam associao podem invadir os tecidos do hospedeiro eucarionte ou permanecerem externamente localizadas. Para contornar os efeitos inibitrios do excesso de O2 as cianobactrias adotaram estratgias muito interessantes e eficazes:

as formas unicelulares realizam uma separao temporal da fotossntese (fonte de O2) e da fixao de nitrognio. Assim, a fotossntese ocorre durante o perodo luminoso, acumulando reservas de carbono e, a fixao de nitrognio ocorre durante o perodo escuro. H excees como observado no gnero Gloeothece,

que realiza a fixao de nitrognio mesmo na presena de luz, juntamente com a fotossntese. Nesse caso, necessrio o desenvolvimento de pesquisas que possam elucidar quais mecanismos possibilitam a ocorrncia simultnea de ambos os processos. as formas filamentosas, como Anabaena e Nostoc, realizam uma separao espacial da fotossntese e da fixao do nitrognio. Ao longo do filamento encontram-se clulas vegetativas normais e clulas especializadas na fixao de nitrognio, os heterocistos . As clulas normais possuem a funo de realizar a fotossntese e suprir as necessidades de energia dos heterocistos. Esses, por sua vez, fixam o nitrognio e fornecem os produtos nitrogenados para as demais clulas do filamento.

VI- A SIMBIOSE COM AS GRAMNEAS


Algumas gramneas de interesse econmico, como milho, arroz e trigo, podem estar associadas com bactrias do gnero Azospirillum. Outros exemplos importantes seriam a associao de bactrias do gnero Beijirinckia com cana-de-acar, Azotobacter paspali com a grama batatais (Paspalum notatum) e determinados cultivares de trigo com espcies do gnero Bacillus. Nessa simbiose no ocorre, aparentemente, a invaso dos tecidos vegetais pela bactria e nem a formao de uma estrutura especializada para a fixao do nitrognio (no h formao de ndulos, por exemplo). Os produtos da fotossntese so liberados pela planta, sendo absorvidos pelas bactrias que habitam a rizosfera. As bactrias fixam o nitrognio e transferem o NH4+ para a planta. Trabalhos realizados com trigo em associao com Azospirillum evidenciaram que as bactrias ligam-se superfcie externa da raiz para colonizar a rizosfera. Alm disso, certos estudos realizados com aplicao de 15N2 (nitrognio atmosfrico radioativo) demonstraram que ocorre a passagem de produtos nitrogenados da bactria para a planta. Esses dados confirmam a existncia de uma interao estreita entre planta e bactria fixadora.

VII- FIXAO SIMBITICA DE NITROGNIO EM LEGUMINOSAS


Os efeitos benficos promovidos pelo crescimento de plantas leguminosas no solo tm sido observados por sculos. Teofrasto, que viveu no terceiro sculo a.C., escreveu que os gregos usavam a fava (Vicia faba) para enriquecer os solos. J no sculo passado, em 1818, Sir Humphrey Davy escreveu no "Agricultural Chemistry" que ervilhas e feijes pareciam preparar a terra para o plantio do trigo e, que o nitrognio (chamado azoto) existente na matria das duas leguminosas parecia derivar da atmosfera. De fato, em locais no quais plantas leguminosas crescem, algum nitrognio extra pode ser liberado no solo, tornando-se disponvel para outros vegetais. Na agricultura moderna, prtica comum fazer a rotao de uma planta cultivada no leguminosa, como o milho, com uma leguminosa, como a alfafa. Por vezes utiliza-se a rotao milho, soja e ento trigo. Quando as leguminosas so colhidas, suas razes ricas em nitrognio permanecem no solo, enriquecendo-o.

O papel dos microrganismos na fixao biolgica do nitrognio atmosfrico, responsvel por essas antigas e freqentes observaes, foi descoberto por H. Helbuegel e H. Wilfarth em 1888. Alguns exemplos conhecidos de associaes entre bactrias Rhizobiaceae e plantas leguminosas so: o gnero Azorhizobium com o gnero Sesbania, Bradyrhizobium japonicum com Glycine max (soja), Rhizobium meliloti com Medicago sativa (alfafa), Rhizobium leguminosarum biovar viciae com Vicia faba e com Pisum sativum (ervilha) e, Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli com Phaseolus vulgaris (feijo). As bactrias vivem saprofiticamente no solo quando em liberdade. A presena de uma planta hospedeira percebida por sinais qumicos, principalmente pelos flavonides liberados pelas razes. Devido ao dos flavonides, as bactrias so atradas em direo s razes, por um quimiotactismo positivo e, produzem um composto denominado Fator NOD (fator de nodulao). O Fator NOD responsvel, entre outras coisas, pelo reconhecimento entre bactria e planta hospedeira e pela induo de uma intensa diviso celular na crtex da raiz. As bactrias colonizam a rizosfera, multiplicando-se ao redor dos tricomas (plos) radiculares. Os tricomas enrolam-se, envolvendo grupos de bactrias (Fig. 2 e 3). Em seguida, as bactrias degradam uma poro da parede celular do tricoma e a plasmalema comea a se invaginar. As bactrias invadem o tricoma, utilizando o canal formado pela invaginao da plasmalema, originando o cordo de infeco. O cordo de infeco cresce em direo s clulas em diviso na crtex da raiz. No interior do cordo, as bactrias continuam se multiplicando (Fig. 2 e 3).

FIGURA 2: Incio da formao de ndulo radicular em uma planta leguminosa.


A regio da crtex da raiz, com intensa diviso celular, recebe o nome de ndulo primrio. Ao chegar nas proximidades do ndulo primrio, o cordo de infeco se ramifica para invadir as clulas vegetais (Fig. 2 e 3). Pequenos grupos de bactrias, contidas no interior de vesculas membranosas, so liberados dentro do citoplasma das clulas vegetais do ndulo primrio. Dessa maneira, o citoplasma da clula invadida

conter vrios grupos de bactrias, individualizados por uma membrana derivada da membrana do cordo de infeco. A partir desse incio de estabelecimento do ndulo radicular, as bactrias, que se encontram dentro das clulas radiculares hospedeiras, param de se multiplicar, aumentam de tamanho e sofrem vrias alteraes bioqumicas para se transformarem em bactrias especializadas na fixao de nitrognio, os bacteriides.

FIGURA 3: Desenvolvimento de ndulo radicular em alfafa.

Para diferenciar as duas fases da vida desses microrganismos, convencionou-se que o nome bactria seria utilizado enquanto no ocorressem as transformaes bioqumicas que iniciam o processo de fixao de nitrognio. Portanto, quando os microrganismos passam a fixar nitrognio so chamados de bacteriides. Os ndulos radiculares desenvolvidos possuem uma organizao prpria de tecidos (Fig. 3). Eles apresentam um meristema responsvel pela formao das clulas da regio

de invaso , uma regio central e conexes vasculares com o xilema do cilindro central da raiz. Envolvendo e delimitando toda essa estrutura est o parnquima do ndulo. As clulas das razes da planta, bem como os prprios bacteriides, precisam de O2 para a respirao celular . As estratgias desenvolvidas para evitar o excesso de O2 nos ndulos radiculares, prevenindo contra a conseqente inibio da nitrogenase, foram duas:

estratgia anatmica: o parnquima do ndulo funciona como uma barreira de difuso do O2. Os espaos intercelulares so pequenos e pouco numerosos, podendo ser preenchidos com gua. Logo, a entrada de O2 no interior do ndulo muito dificultada. estratgia bioqumica: as clulas vegetais da regio central do ndulo produzem a leghemoglobina (hemoglobina das leguminosas). Essa molcula um carregador de O2, que garante que os bacteriides recebam o O2 necessrio para sua respirao, evitando que o gs circule livremente no ndulo.

VIII- A NITROGENASE E A REAO NITROGNIO

DE

FIXAO

DE

A reao de fixao do nitrognio caracteriza-se pela reduo do N2 NH3. Portanto, para que a reao ocorra, necessrio que haja um transporte de eltrons, mediado por molculas aptas a realiz-lo. A enzima nitrogenase formada por duas unidades proticas, a Ferro-protena (Feprotena) e a Molibdnio-Ferro-protena (MoFe-protena), ambas capazes de transportar eltrons. Durante a reao de reduo do N2, a nitrogenase auxiliada por uma terceira molcula transportadora de eltrons, a ferridoxina (Fig. 4).

FIGURA 4: Modelo da reao de fixao do nitrognio, mediada pela enzima nitrogenase.

O modelo proposto para a evoluo da reao pode ser entendido do seguinte modo:

a ferridoxina, na sua forma reduzida , transfere um eltron para a unidade Feprotena da nitrogenase. a Fe-protena, ento reduzida, doa o eltron recebido para a MoFe-protena. a MoFe-protena acumula os eltrons. Aps 8 transferncias, essa unidade ter acumulado 8 eltrons e, ento, far a reduo do N2 NH3. para cada eltron transferido da Fe-protena para a MoFe-protena so consumidos 2 ATPs. Para reduzir uma molcula de N2 so necessrios 8 eltrons e, portanto, 16 ATPs.

Como conseqncia da reao de fixao, para cada molcula de N2 fixada produzida uma molcula de H2. A produo do H2 durante o processo inevitvel e acaba por consumir parte dos eltrons que poderia ser utilizada na fixao de N2. O H2, devido a sua natureza gasosa, perdido para a atmosfera. No entanto, determinados organismos fixadores possuem uma enzima, a hidrogenase, que oxida o H2 antes que ele seja perdido, formando H2O e ATP. O ATP gerado pode ser utilizado para a fixao de nitrognio. Logo, as bactrias portadoras da hidrogenase so menos prejudicadas e, at mesmo, mais eficientes na fixao do nitrognio porque possuem uma fonte adicional de ATP.

IX- GENES ENVOLVIDOS NITROGNIO


Organismos fixadores de vida livre

NA

FIXAO

BIOLGICA

DO

Os primeiros genes envolvidos na fixao do nitrognio foram identificados e estudados utilizando-se a bactria Klebsiella pneumoniae. So conhecidos cerca de 20 genes, denominados genes nif. Eles so responsveis pela produo da nitrogenase e pela produo de molculas que regulam o processo, como a prpria ferridoxina. Organismos fixadores que formam associaes Como base para os estudos da gentica da fixao de nitrognio nas associaes tm sido utilizadas as bactrias da famlia Rhizobiaceae, com destaque para o gnero Rhizobium. Sabe-se que as bactrias fixadoras simbiontes possuem dois grupos distintos de genes: nif e fix. Os genes nif, aparentemente esto envolvidos com a sntese da nitrogenase, enquanto os fix produzem as molculas que regulam o processo de fixao. Por exemplo, sabe-se que o gene fix X codifica a ferridoxina nessas bactrias. No processo da formao de ndulos em plantas leguminosas, induzidos por bactrias Rhizobiaceae, mais dois grupos de genes so considerados: nod e NOD. Os genes nod (nodulao) so encontrados na bactria, sendo responsveis pela produo da protena que recebe o sinal qumico da planta hospedeira (os flavonides) e pela produo das enzimas que sintetizam o fator de nodulao. Os genes NOD so encontrados na planta

leguminosa, sendo responsveis pela sntese de protenas denominadas nodulinas. As nodulinas desempenham papel importante na formao e manuteno do ndulo radicular. O exemplo mais conhecido de nodulina a leghemoglobina, produzida pelas clulas vegetais da regio central do ndulo.

X-ASSIMILAO DO NITROGNIO
Assimilao do NH4+ produzido nos ndulos A fixao do nitrognio atmosfrico d origem amnia (NH3), que em contato com o substrato aquoso do citoplasma dos bacteriides convertida, rapidamente, em on amnio (NH4+). O NH4+ inibe a fixao do nitrognio, no podendo acumular-se no interior dos bacteriides. Assim, logo depois de ser formado, ele retirado dos bacteriides, atingindo o citoplasma da clula vegetal hospedeira, clula da regio central do ndulo radicular (Fig. 5).

FIGURA 5: Assimilao do NH4+ produzido na fixao do N2 nos ndulos radiculares de leguminosas.

Para as clulas vegetais, o NH4+ tambm prejudicial, promovendo a dissociao entre a formao de ATP e o transporte de eltrons na respirao e na fotossntese. Logo, o NH4+ que atinge o citoplasma das clulas vegetais da regio central do ndulo precisa ser assimilado em molculas que no possuem efeito txico.

Duas enzimas, a glutamina sintetase (GS) e a glutamato sintase (GOGAT), so responsveis pela converso do NH4+ em aminocidos. Os aminocidos gerados pela ao dessas enzimas so a glutamina e o glutamato. Sabe-se que leguminosas de origem temperada (ex. ervilha), normalmente, sintetizam um terceiro tipo aminocido, a asparagina, que ser utilizado para a exportao de nitrognio para o restante da planta (atravs das conexes vasculares que unem o ndulo ao xilema do cilindro central da raiz). Da mesma forma, as leguminosas de origem tropical (ex. soja), freqentemente, produzem uredeos para a exportao do nitrognio ao longo do organismo vegetal (Fig. 5). Assimilao do NH4+ absorvido do solo pelas razes As plantas que no encontram-se associadas s bactrias fixadoras de nitrognio precisam absorv-lo a partir do solo. Alguns vegetais adquirem o nitrognio sob a forma de NH4+. Como j mencionado, o NH4+ txico para as plantas. Assim, logo que absorvido pelas razes, esse on assimilado pelas enzimas GS e GOGAT, formando os aminocidos glutamina e glutamato. Nas plantas no leguminosas, principalmente sob a forma de glutamina que o nitrognio exportado para os rgos vegetais, a fim de ser incorporado nas molculas nitrogenadas. Assimilao do NO3- absorvido do solo pelas razes A maioria das plantas que no realizam associao com organismos fixadores, absorvem o nitrognio do solo sob a forma de nitrato (NO3-). A assimilao do NO3- um processo de reduo, que culmina com a formao de NH4+, no qual duas enzimas esto envolvidas: a nitrato redutase (enzima citoplasmtica) e a nitrito redutase (enzima existente nos plastdeos ou cloroplastos ). Inicialmente, o NO3- reduzido a nitrito (NO2- ) pela ao da nitrato redutase e, em seguida, esse reduzido a NH4+ pela ao da nitrito redutase. Uma vez produzido o NH4+, este ser assimilado pelas enzimas GS e GOGAT, como visto para as plantas no leguminosas. O processo de assimilao do NO3- pode ocorrer nas prprias razes que o absorveram ou nas folhas. Aparentemente, um fator importante que controla em que local ser a assimilao o contedo de NO3- no solo. Quando o nutriente est escasso no solo, ele assimilado preferencialmente nas razes; quando est abundante, nas folhas.

XI- BIBLIOGRAFIA BSICA


1. HOPKINS, W. G. Introduction to plant physiology. New York, John Wiley & Sons, 1995. 464 p. 2. RAVEN, P. H.; EVERT, R. F. & EICHHORN, S. E. Biologia Vegetal. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 1996. 728 p. 3. SALISBURY, F. B. & ROSS, C. W. Plant physiology. Belmont, Wadsworth Publ. Co, 1991. 682 p.

XII- BIBLIOGRAFIA ESPECFICA


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