Associao Bandeira Azul da Europa / FEE Portugal

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24 de Agosto de 2010

Programa Bandeira Azul | Documentao | Actividades | Projectos

Monitorizao da Qualidade Microbiolgica das Areias

Pesquisa de agentes patognicos em amostras de gua e areia de praias litorais e interiores da Costa Portuguesa
1. Preparao do Projecto a. Competncias 2. Introduo a. Enquadramento b. Historial c. Agentes patognicos 3. Metodologia a. Procedimento de colheita de areia b. Procedimento de colheita de gua c. Metodologia analtica 4. Calendarizao 5. Oramento do Projecto

Downloads (relatrio)
Monitorizao da qualidade das areias em zonas balneares (Nov 08)

Informao
> Lista de praias abrangidas no projecto > Declarao de inteno de participao > Valores do projecto de monitorizao da qualidade microbiolgica das areias > Monitorizao da qualidade das areias em zonas balneares > Folheto de instrues para as colheitas de areias > Video de demonstrao para as colheitas de areias

Preparao do Projecto Competncias

Aps aprovao do contedo do projecto por todas as entidades participantes elaborar-se- um protocolo a celebrar com as diferentes instituies, onde sero definidas as respectivas competncias, obrigaes e participaes descritas em seguida: Associao Bandeira Azul da Europa (ABAE) Entidade promotora e coordenadora do projecto. Apoiar, em termos logsticos e de funcionamento a boa execuo do projecto; Recorrer aos servios dos Laboratrios do INSA e da APA, no sentido da execuo da componente cientfica dos trabalhos a desenvolver ao abrigo deste projecto; Colaborar na elaborao e divulgao de um relatrio final sobres os resultados dos trabalhos desenvolvidos no mbito do projecto; Mediar e agendar a divulgao pblica dos trabalhos e dos seus resultados. Instituto Nacional de Sade Dr. Ricardo Jorge (INSA) Realizar as anlises bacteriolgicas e micolgicas das amostras sob a sua responsabilidade; Adaptao de tcnicas moleculares de deteco de agentes patognicos, s analises de qualidade microbiolgica, em areias e guas. Participar na elaborao do relatrio final. Agncia Portuguesa do Ambiente (APA) Realizar as anlises bacteriolgicas e micolgicas das amostras sob a sua responsabilidade; Participar na elaborao do relatrio final.

Coordenao

Execuo do Projecto

Introduo
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Enquadramento
A qualidade ambiental das praias tem vindo a adquirir uma importncia crescente entre os critrios de escolha de destino turstico. Apesar de nos ltimos anos a legislao ter evoludo no sentido do ordenamento da zona costeira e do tratamento de guas residuais, o nico indicador da qualidade relacionado com a sade publica que pode permitir aos utentes uma escolha orientada, a qualidade da gua balnear. Justifica-se o estudo da qualidade microbiolgica da areia, tendo em considerao que a actual directiva 2006/7/EC defende toda uma estrutura de proteco de qualidade da gua balnear e zona envolvente bem como a sade dos seus utilizadores. Tambm a Organizao Mundial de Sade no guia Guidelines for safe recreational waters Volume 1 - Coastal and fresh waters (publicado em 2003) exprime a preocupao com a qualidade das areias da praia por estas poderem constituir um reservatrio de agentes de infeco, sobretudo em zonas balneares onde a utilizao da areia apresenta maior relevncia. Perante esta motivao, a Associao Bandeira Azul da Europa, o Instituto do Nacional de Sade Dr. Ricardo Jorge e a Agncia Portuguesa do Ambiente reuniram esforos no sentido de validar a metodologia desenvolvida em estudos anteriores e alargar a sua aplicao ao territrio insular. Tendo conscincia de que a pesquisa de indicadores nem sempre fornece informao sobre agentes patognicos especficos e/ou de importao, e na sequncia de colaboraes anteriores com grande sucesso, decidiram a ABAE, o INSA e a APA desenvolver esforos no sentido de aprofundar o conhecimento sobre a presena e deteco de agentes do tipo referido em zonas balneares do territrio nacional.

Historial
Em 2001, no mbito da campanha Areia Limpa, Praia Saudvel promovida pela Associao Bandeira Azul da Europa, realizou-se um estudo que envolveu directamente o Instituto do Ambiente (IA) e o Instituto Nacional de Sade Dr. Ricardo Jorge (INSA), entre outros parceiros, que teve como objectivo seleccionar os indicadores de qualidade que melhor caracterizam a contaminao microbiolgica das areias das praias, propor os respectivos valores de referncia e os mtodos de anlise mais adequados para a determinao dos indicadores seleccionados. Posteriormente ambas as entidades, no mbito de um projecto europeu Improving Costal and Recreational Watwers (ICREW) procederam reviso, validao e desenvolvimento de alguns conceitos. As concluses de ambos os estudos foram as seguintes: 1. Para a monitorizao da qualidade das areias das praias, suficiente a anlise da areia seca. A gua fornece informao que pode dispensar a anlise da areia molhada pois foi demonstrada uma correlao positiva entre estes dois parmetros. 2. Os parmetros qumicos ensaiados evidenciam pouca sensibilidade na avaliao do teor de matrias oxidveis presentes na amostra. 3. Os indicadores com melhor desempenho foram os coliformes totais, a Escherichia coli e os enterococos intestinais em Bacteriologia e os fungos leveduriformes, fungos potencialmente patognicos e alergognicos e dermatfitos, em Micologia. (Tabela 1) 4. Os mtodos escolhidos foram: o mtodo de sementeira por espalhamento baseado em Bernard, et. al 1989 para os parmetros micolgicos e o mtodo cromognico e/ou fluorognico com determinao do nmero mais provvel (Colilert e Enterolert - Idexx) para as determinaes bacteriolgicas. Os parmetros a pesquisar, (Tabela 1) os valores mximos admissveis (VMA) e recomendados (VMR) usados neste trabalho foram os publicados no relatrio final do projectoQualidade Microbiolgica das Areias das Praias Litorais, realizado em 2002[1] . No entanto, posteriormente foi feita uma reviso de congruncia dos VMR micolgicos com os VMR dos parmetros bacteriolgicos, representado actualmente pelos Novos Valores Mximos Recomendados (NVMR) ver Tabela 2 Parmetros Micolgicos: Foram considerados fungos com forte associao ao Homem e animais homeotrmicos e potencialmente patognicos, por contacto, inalao e ingesto. Estes distribuem-se em 3 parmetros: (Fungos leveduriformes, Fungos filamentosos potencialmente patognicos e/ou alergognicos e Dermatfitos - Tabela 1)
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Parmetros Bacteriolgicos: Como parmetros bacteriolgicos indicadores da qualidade das areias, foram escolhidos os usados na classificao da qualidade de guas balneares (Bactrias coliformes, Escherichia coli, Enterococos intestinais - Tabela 1) Tabela 1: Parmetros microbiolgicos pesquisados. Micologia Fungos filamentosos Bacteriologia Fungos potencialmente patognicos Dermatfitos leveduriformes e/ou alergognicos Candida albicans Aspergillus fumigatus Trichophyton sp Bactrias Candida sp Aspergillus niger Microsporum sp coliformes (Outras) Aspergillus sp (Outros) Epidermophyton sp Escherichia coli Cryptococcus Chrysosporium sp Enterococos neoformans Fusarium sp intestinais Outras leveduras Scytalidium sp Scedosporium sp Scopulariopsis sp Outros [2] Tabela 2: Valores mximos recomendados, novos valores mximos recomendados (resultado de reviso dos valores mximos recomendados aps reviso) e valores mximos admissveis. Parmetros Leveduras Fungos potencialmente patognicos Dermatfitos Coliformes totais Escherichia coli Enterococos intestinais VMR 30 pfc/g 70 pfc/g 1 pfc/g 5 pfc/g 1 pfc/g 1 pfc/g NVMR 3 pfc/g 5 pfc/g 1 pfc/g 5 pfc/g 1 pfc/g 1 pfc/g VMA 60 pfc/g 85 pfc/g 15 pfc/g 100 pfc/g 20 pfc/g 20 pfc/g

Agentes patognicos
A pesquisa dos parmetros indicadores da qualidade microbiolgica das areias no revela necessariamente a presena de agentes patognicos de maior virulncia mas tendncias ou qualidade de uma forma geral. No entanto a pesquisa desse tipo de agentes importante pois revela risco de doenas claramente caracterizadas. Nomeadamente: Tabela 3: Descrio de espcies patognicas de interesse para pesquisa em areias de praias litorais e interiores e guas de recreio. Patologia Habitat no humano gua, solos com teor orgnico, Exophiala spp madeiras em decomposio Solos com teor Sporothrix orgnico, madeiras schenckii em decomposio Solos, plantas e Phialophora spp comida em decomposio Espcies [3] Coccidioides spp Solos secos Animais de sangue Paracoccidiodes quente, solos ricos brasiliensis em protenas e hmidos Histoplasma capsulatum
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Regio endmica

Feohifomicoses

Mundial

Coccidiomicose

Continente Americano Continente Americano

Paracocciodiomicose

Mundial mas mais Solos contaminados frequente em zonas com excrementos de tropicais e sul de aves e/ou morcegos EUA
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Histoplasmose

Dermatofitias (tinhas onicomicoses)

EUA Solos contaminados Histoplasma com excrementos de Africa sub-saariana duboisii aves e/ou morcegos Epidermophyton Animais de sangue floccosum quente Solo e animais de Trichophyton spp Mundial sangue quente Solo e animais de Microsporum spp sangue quente Cryptococcus spp Fonsec spp Solos contaminados Mundial com fezes de aves

aves e/ou morcegos

Criptococose (meningite/infeco respiratria/infeco sistmica)

Cromoblastomicose

Solos e madeiras em decomposio Madurella spp Solos Cladophialophora Solos e madeiras spp em decomposio

Regies tropicais hmidas

Tambm as praias interiores mostram uma flora bastante diferente das costeiras, devido baixa salinidade, elevado teor de matria orgnica (incluindo madeiras em decomposio) e menor ndice de exposio solar. A importao de espcies no nativas do nosso pas tem-se verificado devido a vrios factores, dos quais se destaca a deslocao de no-autctones em frias ou imigrantes e a importao de areias para reposio de costa. Esta ltima actividade comea a tornar-se bastante frequente em todo o mundo e, curiosamente, as areias de reposio so quase sempre importadas de zonas no prximas. Frequentemente so mesmo importadas de outros pases, cuja flora microbiolgica difere da nativa da praia onde sero depositadas. Esta preocupao leva ao interesse de pesquisar no s indicadores de qualidade microbiolgica comuns mas tambm de avaliar a presena e frequncia de agentes patognicos como referidos na tabela anterior.

Metodologia Procedimentos de Colheita de Areia

Na zona de areia seca, onde normalmente h maior concentrao de banhistas e visitantes, considera-se um transepto paralelo linha de costa que se subdividiu em 3 ou mais pontos, equidistantes (os pontos devem distar 20 a 50 m aproximadamente, dependendo das dimenses da praia, onde se procede colheita de uma pequena poro de areia, que depois de homogeneizada, constitui uma amostra composta, representativa da rea em estudo (ilustrao 2). A colheita realiza-se em cada ponto a uma profundidade entre 5 e 15 cm, utilizando para o efeito, luvas e sacos esterilizados. Identificam-se os sacos com o nome da praia e data da recolha (ilustrao 3). Transportam-se para o laboratrio em malas trmicas refrigeradas de forma a chegarem de manh e dentro de um perodo de 24 horas desde a hora da colheita.

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Ilustrao 2: Esquema dos pontos de colheita da amostra composta

Ilustrao 3: Colheita de uma amostra de areia

Procedimento de Colheita de gua

A colheita de gua efectuada em cada praia, na sua zona central. A amostra colhida para frascos de polietileno estreis, a cerca de 30 cm da superfcie, num ponto com cerca de 80 cm de profundidade. Os frascos so etiquetados com o nome da praia, data da recolha e transportados para o laboratrio em malas trmicas refrigeradas.

Metodologia Analtica
Anlise Micolgica da areia Para as anlises micolgicas utiliza-se o mtodo de sementeira por espalhamento (baseado em Bernard et al.,1989). Retira-se uma sub-amostra de areia do saco de plstico com uma esptula esterilizada, e procedese pesagem de 40g numa balana de preciso. Em condies de assepsia, introduzem-se as 40g num frasco de vidro Pirex esterilizado e adicionase 40ml de gua destilada estril. Agita-se a 100 rpm durante 30 mins, assegurando que a gua fique em contacto com a totalidade do volume da areia, de modo a garantir uma lavagem eficiente, evitando-se o risco de fragmentao das hifas do miclio. Em condies de assepsia, com o auxlio de uma micropipeta, retiram-se alquotas de 0,2 ml do liquido resultante da lavagem da areia que se semeiam em placas de Petri contendo respectivamente meio de cultura extracto de malte agar (MEA) com cloranfenicol e de agar micobitico (AM). Efectua-se o espalhamento imediatamente com o auxlio de um estilete em forma de L esterilizado (espalhador). Colocam-se as placas de Petri no invertidas na estufa de incubao a temperatura entre 25 e 30C, durante 5 a 7 dias para o meio de cultura extracto de malte agar, e 15 a 17 dias para o meio de cultura agar micobitico. Anlise Micolgica da gua
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Homogeneizar a amostra agitando suavemente e filtrar 100ml atravs de uma membrana de acetato de celulose estril e quadriculada com porosidade de 45 m e dimetro de 4,5 cm. Coloca-se a membrana no meio de cultura apropriado pesquisa dos microorganismos pretendidos e incuba-se temperatura ideal e durante o tempo necessrio ao crescimento dos mesmos. Anlise Bacteriolgica da areia As anlises bacteriolgicas realizam-se pelos mtodos cromognico e/ou fluorognicos com determinao do Nmero Mais Provvel (NMP) Colilert e Enterolert. Retira-se uma sub-amostra de areia do saco de plstico com uma esptula esterilizada, procedendo-se pesagem de 50g numa balana de preciso. Em condies de assepsia, introduzem-se os 50g de areia num frasco de vidro Pirex esterilizado e adicionam-se 500ml de gua destilada estril. Leva-se o frasco a um agitador rotativo com agitao vertical durante 30min, para garantir uma lavagem eficiente da areia. A partir deste lavado de areia, retiram-se, em condies de assepsia, alquotas de 10ml do lquido sobrenadante, que se introduzem em frascos esterilizados e completa-se o volume de lavado para 100ml com gua destilada estril, totalizando dois frascos por amostra, cada um destes para um meio de cultura diferente. Pesquisa e quantificao de coliformes incluindo Escherichia coli Acrescenta-se ao frasco com a soluo de lavado-gua destilada estril o meio de cultura Colilert, homogeneizando-se bem e coloca-se num Quanty-Tray (Colilert - Idexx), incubar-se durante (182) horas a (362) C Aps a incubao, contar as caselas em que a utilizao do substrato ONPG (Orto-nitrofenil--Dgalactopiranosdeo) leva acidificao do meio e respectiva viragem do indicador para amarelo. O nmero total de caselas amarelas permite determinar o NMP de coliformes, presentes em 10 ml de amostra depois de comparada com a tabela. Observado na cmara de UV a um comprimento de onda de 360 nm contam-se as caselas com fluorescncia, o que revela produo de glucoronidase pelo organismo alvo. Aplicando a mesma tabela calculou-se o NMP de E. coli presente em 10ml de amostra. Pesquisa e quantificao de enterococos intestinais Acrescenta-se ao frasco com a soluo de lavado-gua destilada estril o meio de cultura Enterolert, homogeneizando-se e coloca-se num Quanty-Tray (Enterolert - Idexx); incuba-se durante (244) horas a (41,50,5) C. Aps incubao, contam-se as caselas fluorescentes em cmara de UV e ao nmero obtido aplicase a tabela para determinao do NMP de enterococos intestinais em 10ml de amostra. Deteco e identificao moleculares de agentes patognicos Alguns agentes patognicos dificilmente se isolam ou identificam seguindo as metodologias descritas anteriormente. Assim, e com vista a pesquisa dos agentes patognicos descritos na tabela 3 uma parte deste trabalho sustentar-se- em mtodos de diagnstico molecular, segundo tcnicas que sero escolhidas no final de uma pesquisa bibliogrfica da fase inicial do projecto.

Calendarizao
Durao do projecto 36 meses Fases do projecto Tabela 4: Calendarizao do projecto Fase 1 Descrio Pesquisa e seleco de tcnicas de identificao clssica e Durao 6 meses
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molecular de agentes patognicos em areias e guas Amostragem e anlises Finalizao das anlises em curso Construo do relatrio

6 meses 24 meses 3 meses 3 meses

Calendarizao de Eventos: 1/5/2008 Incio do Projecto 1/6/2008 - Divulgao pblica do projecto 2009 Apresentao do projecto em congresso/reunio internacional 2010 - Apresentao do projecto em congresso/reunio internacional 1/6/2011 Divulgao pblica dos resultados do projecto

Oramento do Projecto
Tabela 5: Custos do projecto por instituio Rubrica Recursos Humanos Deslocaes e representaes Materiais e Reagentes Equipamento Tradues Subtotal NSA 15000 35000 20000 70000 APA 5000 25000 ABAE 40000 10000 totais 40000 30000 60000 20000 5000 155000

30000

5000 55000

[1 ]

Estes parmetros reflectem a qualidade microbiolgica da areia de uma forma genrica e no consideram pesquisa

especfica de todos os patognicos ou de outros organismos no bacterianos ou fngicos.

[2 ]

Histoplasma sp., Coccidioides sp., Exophiala sp., Fonsecae sp., Phialophora sp., e/ou outros, que tenham importncia

clnica relevante, quando presentes como espcie predominante em quantidade significativas (> 500 pfc./g).
[3 ]

Mais informao reunida em http://www.doctorfungus.org/thefungi/Description_index.htm

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