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DepartamentodeBiologia

BIOTECNOLOGIA
ENGENHARIAGENTICA
U

Manualprticoe
Protocolosexperimentais

20102011

CarlosSinogas

www.ensino.uevora.pt/biotec

NDICE

PROCEDIMENTOSDESEGURANA.................................................................................................................................................................3
Vesturioecomportamentos........................................................................................................................................................................3
Riscosfsicos........................................................................................................................................................................................................4
Riscosqumicos..................................................................................................................................................................................................4
Riscosbiolgicos................................................................................................................................................................................................5
Planeamento........................................................................................................................................................................................................5
Procedimentosgerais.......................................................................................................................................................................................5
REGISTOSERELATRIOS...................................................................................................................................................................................6
PreparaodoTrabalhoInventivo(Poster)................................................................................................................................................7
TcnicasLaboratoriaisBsicasemMicrobiologia....................................................................................................................................8
Meiosdecultura.................................................................................................................................................................................................8
Esterilizao.........................................................................................................................................................................................................8
TubosdeculturaePlacasdePetri..............................................................................................................................................................9
Instrumentosparatransfernciadeculturas........................................................................................................................................9
Cmarasdecultura.........................................................................................................................................................................................10
Frigorfico...........................................................................................................................................................................................................10
MtodosdeEsterilizao..................................................................................................................................................................................11
Esterilizaopelocalor.................................................................................................................................................................................11
Esterilizaoporgases.................................................................................................................................................................................12
Radiaes............................................................................................................................................................................................................12
Filtraoestril................................................................................................................................................................................................13
Desinfectanteseantispticos...................................................................................................................................................................13
PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS....................................................................................................................................................................14
PIPETAGENS,DILUIESESOLUES......................................................................................................................................................15
CULTURADEBACTRIAS(E.coli).................................................................................................................................................................20
PREPARAODEDNAPLASMDICO(LiseAlcalina)............................................................................................................................21
MINIPREPARAODEDNAPLASMDICO(MiniPrep).........................................................................................................................23
DIGESTOCOMENZIMASDERESTRIO................................................................................................................................................24
ANLISEDEDNASEMGELDEAGAROSE.................................................................................................................................................25
PREPARAODEBACTRIASCOMPETENTES.......................................................................................................................................26
TRANSFORMAO...............................................................................................................................................................................................27
Anlisedeprotenarecombinante................................................................................................................................................................28
ELECTROFORESEDEPROTENAS(PAGE)................................................................................................................................................29
PreparaodasAmostras............................................................................................................................................................................30
Preparaodogel...........................................................................................................................................................................................30
UElectroforese..................................................................................................................................................................................................30
Electroforese.....................................................................................................................................................................................................31
Coloraodasprotenas...............................................................................................................................................................................31
ANEXOSPlasmdios..........................................................................................................................................................................................32
pCS11...................................................................................................................................................................................................................32
UpCS62................................................................................................................................................................................................................32
pCS62...................................................................................................................................................................................................................33
pCS71...................................................................................................................................................................................................................34
pCS84...................................................................................................................................................................................................................35
pSK+......................................................................................................................................................................................................................36
ANEXOSEnzimas..............................................................................................................................................................................................37
BamHI.................................................................................................................................................................................................................37
EcoRI...................................................................................................................................................................................................................37
SalI........................................................................................................................................................................................................................37
UANEXOSTabelaPeridica..........................................................................................................................................................................38
TrabalhoAutnomopararelatriofinal....................................................................................................................................................39

Biotecnologia/EngenhariaGentica2010/11

PROCEDIMENTOSDESEGURANA
(AdaptadodeBiotechnologyExplorations,ASMPress)
EnsinareaprendernolaboratriodeBiotecnologiaenvolvesempreumcertonvelderiscoparaooperadore
companheiros.Novosequipamentos,reagentesemateriaisbiolgicossoparteintegrantedostrabalhos
experimentaisqueenvolvemcidosnucleicoseprotenas.Osestudantesestoaaprendernovastcnicas,usando
reagentesemateriaisbiolgicosenovosequipamentosqueapresentamalgumrisconocontextodasuautilizao
laboratorial.Nosendopossvelfazeraexperimentaosemusarosequipamentos,osreagenteseomaterial
biolgico,esperasedosestudantesqueadoptemasatitudesadequadasparaminimizaodosriscosassociados.
Alertapermanente,umconceitoimportadodospilotosdeavio,criaoenquadramentoparaamanutenoda
seguranaapropriadafaceaosriscosinerentes.Talcomoopilotodeveestaralertaparaasuaenvolvente,com
constantevigilnciaparaasuaseguranaeadosoutros,assimosestudantesdebiotecnologiadevemfazerno
laboratrio.Opilototemsempredesaberondeest,paraondevaiecomolchegar.Traduzidoparaoambiente
laboratorial,osestudantesdevemestarconcentradosnastarefasquedesenvolvem,compreenderoequipamento,
osreagenteseosmateriaisbiolgicosqueusam,devendoseguirospassosadequadosconduodaexperincia.
Aomesmotempocadaestudantedeveconheceroqueosseuscolegasfazemeosprotocolosqueseguem.
Nesteenquadramentosoquatroasprincipaisquestesdeseguranaquesecolocam:
Vesturioecomportamentos
Riscosfsicos
Riscosqumicos
RiscosBiolgicos

VESTURIO E COMPORTAMENTOS

Reduziraomnimoospertencespessoaiseoutrosmateriaisnabancadadetrabalho.Casacos,sacoseoutros
pertencesdeveroserdepositadosnobengaleiroentradadolaboratrio.

Usodebataobrigatrio(Sempre),paraevitarsujaroucontaminararoupa.

Cabelo,quandocomprido,devidamenteapanhadoparaevitarasuaignionachamaouacontaminao
qumicaoubiolgica.

Sapatosfechadossorecomendados,poisosabertosnoprotegemdeeventuaisrespingosquepossamcair.

ProtecodosolhosepelenuaaquandodautilizaodeUV

Luvasdescartveissoexigveisquandosemanipulamcertosreagentesoumicrorganismos.

desaconselhadoousodejias,emespecialanisepulseirasqueimpedemoadequadousodasluvas.

Comer,beber,mascarpastilhaselsticas,aplicarcosmticosproibidonolaboratrio,paraqueeventuais
contaminaesnosejamdirigidasparazonasnoprotegidas.Roerasunhas,lpis,canetasededosnaboca
igualmenteproibido,pelasmesmasrazes.

Osestudantesdevemconhecerecompreenderbemotrabalhoafazer.Umaboaprogramaomeiocaminho
paraumaboaexecuo.Odocentedeverserquestionadosemprequesurjamdvidassobreos
procedimentosaseguir.

Asmosdevemsersemprelavadasantesdeiniciarotrabalhoedepoisdeconcludaaexperimentao,para
quecontaminantesnosejamintroduzidosnemtransportadosparaforadolaboratrio.

Asbancadasdetrabalhodevemsersemprelimpasesanitarizadascomlcoolantesdoinciodotrabalhoe
depoisdesteconcludo.Noseconheceoqueoutrosestudantespossamterdeixadonolaboratrio,nemse
pretendedeixarcontaminaesparaquemvieraseguir.

Biotecnologia/EngenhariaGentica2010/11

RISCOS FSICOS
Fogo

Identificaralocalizaodochuveiro,dosextintoresedosbaldesdeareia.

Identificaralocalizaodosquadroselctricosedatorneirageraldogs.

Aquecerprodutosaaltastemperaturaspodeprovocarqueimaduras.

Assoluesaquecidasnomicroondas,emespecialasagaroses,podemficarsobreaquecidaseentrarem
ebulioexplosivaapsagitao,provocandoqueimadurasgraves.

Bicosdegselamparinas

Conhecercomosedeveacenderobicodegs.

Nuncaabandonarumbicooulamparinaacesa.Evitarmovimentlosquandoacesos.

Flamejarosinstrumentoseostuboscomcuidadoparaevitarformaodeaerossis.

Nousarmaterialfacilmenteinflamvelnasproximidadesdachama(atenoaolcool).

Autoclave

Evitarexposioaosvaporesdaautoclaveaquandodasuaabertura.Podemprovocarqueimaduras.

Usarluvasisolantespararemovermateriaisdaautoclave

Vidrospartidosematerialcortante

Osvidrospartidosdeveroserremovidoscomauxliodepinaouluvas,nuncacomasmosdesprotegidas.

Nocolocarvidrospartidosnolixocomum.

Seapropriadorecolherparadescontaminao.

Usarlminascortantescomauxliodepinasouluvas.

Equipamentoelctricoedeelectroforese

Verificaroscaboselctricosdosequipamentosenuncausarcabosdefeituosos.

Evitarousodematerialelctricoprximodegua.

Desligaroequipamento(botoOFF)antesdeoligarcorrente.Nuncaligaroudesligarumaparelhode
electroforesesemantescortaracorrente(botoOFF).

Nuncaabrirumatinadeelectroforesesemantesdesligaracorrenteelctrica.

TransiluminadordeUV

AousarotransiluminadordeUV,nuncaoligueantesdebaixaratampaprotectora.

Desliguealuzantesdelevantaratampaeremoverogel.

RISCOS QUMICOS

Prestaratenosnotasdosprotocolossobreosriscosassociadosaalgunsreagenteseseguirasinstrues
dodocente.

Nuncapipetarboca.Usarpipetadoresmecnicos.

Osrestosdeprodutosqumicosnodevemserrejeitadosparaoesgoto.

Localizarochuveiroeosistemadelavagemdeolhos.

Biotecnologia/EngenhariaGentica2010/11

Aroupaatingidaporreagentesqumicosdeverserdeimediatoremovidaeapeleemcontactoser
abundantementelavada.

Noremoverprodutosqumicosdolaboratrio.

Algunsreagentesqumicosausarnasexperinciastmassociadosriscosparticulares.Ousodereagentesem
soluoouprmisturadosreduzonveldeexposioeotempodasuautilizao.Aquantidademanipulada
tambmimportante.Algunsreagentescomriscosespecficosautilizarnassesseslaboratoriais:

AcrilamidaebisacrilamidaMutagnico,carcinognicoeneurotxicoqunadoinaladoouingerido.Usar
apenassoluespreviamentepreparadasecomluvas.

PersulfatodeamnioOxidantepotente.Manterafastadodemateriaiscombustveisedefontesdecalor.

Clorofrmio

DTT(Ditiotreitol)Provocairritaonosolhos,pele,membranasdasmucosasetratorespiratrio.

EtanolInflamvel.

Brometodeetdio(solues)Mutagnico.Usarluvas.

SDS(laurilsulfatodesdio)Irritantedosolhosedapele.

cidosebasesconcentradosCorrosivos.Provocamqueimadurasaocontacto.

RISCOS BIOLGICOS

Desinfectarareadetrabalhoantesedepoisdemanipularmicrorganismos.

Usarlixviadiluda(10%dehipocloritodesdio)paradescontaminarreaseinstrumentoseventualmente
contaminados.

Evitarasmosnabocaounosolhos.

Flamejarcuidadosamenteinstrumentosetubosparaevitaraformaodeaerossis.

Noremovermicrorganismosdolaboratrio.

TratartodasasamostrasdeDNA,plasmdiosebactriascomomaterialcontaminado.

Rejeitarasculturaseoutromaterialcontaminadonotabuleiroparaautoclavar.

Nojuntarmaterialnocontaminadonotabuleiroparaautoclavar.

Norejeitarnolixocomumoquequerquesejaquetenhacontactadobactrias.

Sebemqueosmicrorganismosausarnaexperimentao(E.coli)nocoloquemriscosbiolgicosparticulares
devetersesempreemmentequesocriadascondiesdecrescimentodosmesmos.Orisconaturalmente
aumentacomaquantidadedebactriaseoutrosmicrorganismos,eventualmentepatognicos,podemcontaminar
asculturaseseramplificados.

PLANEAMENTO
Noiniciarqualquerexperinciasemoconvenienteplaneamento.Oconhecimentoecompreensoprviosdos
procedimentosexperimentais,grelhasadequadaspararegistodosresultadoseaefectivadisponibilidadedetodos
osrecursosmateriaisnecessriosconstituemelementosimportantesparaosucessodasexperincias.Otempo
"perdido"numplaneamentoiniciallargamentecompensadopelonveldaaprendizagemconseguidoepela
prevenodanecessidadederepetiodeexperinciaseventualmentebloqueadas.

PROCEDIMENTOS GERAIS
Todososprocedimentosdeveroserefectuadostendoemmenteaminimizaodosriscosassociados
manipulao,numaperspectivadeprotecodoprpriooperadoredeterceiros.Maisimportantequeum
conjuntoderegrasaobedecerautilizaodobomsensodooperadornostrabalhosarealizar.
muitoimportanteusaracabeaantesdasmos.

Biotecnologia/EngenhariaGentica2010/11

REGISTOSERELATRIOS
convenienteusarumblocooucadernopararegistodetodasasocorrnciasedosresultadosdaexperimentao.
Sugereseousodecadernodelaboratrio,deprefernciacomfolhasnoamovveis,paraquenosejam
eliminadasnotasouregistosconsideradosirrelevantesnaaltura,comosucedecomfrequnciaquandosepassam
osapontamentos"alimpo",masdegrandeutilidadeparaconsultafuturanaelaboraodorelatriofinalouparaa
eventualrepetiodaexperincia.Origorepormenordosregistosefectuadosduranteaexecuodotrabalho
experimentalfacilitaroaaprendizagemeainterpretaodosresultadosobtidos,emespecialquandoestesso
inesperados.
Umqualquerrelatriodeumaexperincialaboratorialdeverdocumentardeformatocompletaquantopossvel
oprocedimentoexecutadoeosresultadosobtidos.Paraalmdissodeversertambmobjectivodorelatorredigir
umdocumentocompreensvelparaoleitoresusceptveldeapoiaraeventualrepetiodamesmaexperinciaem
idnticascondies.Paraaelaboraodosrelatriossugeremse,comoorientao,asseguintesseces:

Ttulo

Identificadordocontedodorelatrio

Resumo

Pequenotextodequeconstemosobjectivosalmejadoseasconclusesobtidas

Objectivo

Razodeserdotrabalhorealizado

Introduo

Dadosconhecidosquejustificamarealizaodaexperinciarelatada

Palavraschave

Termosdirectamenterelacionadoscomotrabalho

Materialereagentes

Listagemexaustivadoequipamento,reagenteseoutromaterialusado

Protocoloexperimental

Marchageraldosprocedimentosaplicados.Deveroserrelatadosos
procedimentosconcretosexecutados,comrefernciaaeventuaisdesvios
relativamenteaoprocedimentorecomendado/descrito

Resultados

Registodasobservaesefectuadasedosdadosrecolhidos

Discusso

Comentriocrticoaosresultadosobtidos

Concluso

Descriodocumprimentoouincumprimentodoobjectivo,decorrentedos
resultadosobtidos

Notacrtica

Comentrioglobalidadedaexperincia,comrecomendaesparaasua
repetioououtrasconsideradasadequadas

Bibliografia

Refernciasconsultadasouutilizadasparaarealizaodotrabalho

Dependentedotipodotrabalhoexecutado,daformadorelatrioedasensibilidadedorelator,algumasdas
secesdescritaspoderoserfundidas,como"Resultadosediscusso"ou"Discussoeconcluses",por
exemplo

Biotecnologia/EngenhariaGentica2010/11

PreparaodoTrabalhoInventivo(Poster)
Umacomunicaoemposter,emprincpio,aapresentaodeumtrabalhointermdioemcursosdeexecuo.
Comasuaapresentaopretendese,emgeral,comunicarumamensagemaosvisitanteseesperasedestesuma
interacoquepermitamelhorarotrabalhoemcurso.
Amensagemapassardeverserimediata(primeiravista),defcilleituraederpidaapreensodistnciade,
pelomenos,ummetro.Tantoquantopossveldeverserminimizadootextoaincluirevalorizadososesquemase
grficos.
ParaalmdaIDENTIFICAOdo(s)autor(es)edaInstituioondeotrabalhofoirealizado,umposterdever
incluirumaprimeiraseco,quesedesignausualmenteporINTRODUO,emquecolocadooproblemaa
abordarpelotrabalhoquesecomunicafaceaostateoftheartactualequeconduzdirectamenteaosOBJECTIVOS
almejados.DeverdepoisexistirumaoutrasecoemquesedescrevaaMETODOLOGIAutilizada(ouautilizarno
casodepropostasdetrabalhofuturo)aantecederosRESULTADOSobtidos(ouesperados)quedeverodepoisser
contextualizadosnumaDISCUSSOdequeresultaaCONCLUSO.PorfimdeverserindicadaaBIBLIOGRAFIAem
queoautorsebaseouparaarealizaodotrabalho.

Biotecnologia/EngenhariaGentica2010/11

TcnicasLaboratoriaisBsicasemMicrobiologia
AodesenvolvimentodostrabalhosemBiotecnologiafundamentalrecorrerstcnicasprpriasdaMicrobiologia
paraamanipulao,crescimentoemanutenodebactriaseoutroshospedeirosdeDNAsrecombinantes.
Osmicrorganismossoubquos.Podemencontrarsenosolo,noar,nagua,nacomida,nosesgotosenas
superfciescorporais,entreoutroslocais.Ouseja,existemportodooladonossavolta,onossoambienteest
repletodemicrorganismos.Paraestudarqualquertipodemicrorganismonecessriosepararestaspopulaes
mistas,deformaamanipularnolaboratrioaschamadasculturaspuras,culturasdeumanicaestirpe.Apesardo
fornecimentodeestirpesbacterianaspurasparaarealizaodostrabalhos,asculturaspodemviraser
contaminadas.
Paraisolareestudarosmicrorganismosemculturapura,oexperimentadornecessitadealgunsequipamentos
laboratoriaisbsicosedaaplicaodetcnicasespecficasusandomateriaisparticulares.Nasprticasque
aplicaremosnodecursodestadisciplina,tersederecorrerstcnicasbasedemicrobiologia/bacteriologiacom
utilizaodosequipamentosemateriaisespecficosqueseindicam:

Equipamento

Materiais

Autoclaveedispositivosdefiltraoestril
Ansaseagulhas.Pipetasemicropipetas
Banhosdeguaeestufas
Frigorfico
Fluxolaminar(conveniente)
guadestiladadequalidade
Meiosdecultura(bactrias)
Lquido
Semislido
Slido
Tubosparacultura
PlacasdePetri

MEIOS DE CULTURA
Asobrevivnciaeosuportedevidadosmicrorganismosdependemdofornecimentoadequadodenutrientese
convenientescondiesparaoseucrescimento.Quantoaosnutrientes,grandepartedosmicrorganismosapenas
necessitamdesubstnciasolveisdebaixopesomolecular,usualmenteoriginadaspeladegradaoenzimticade
outrosnutrientesmaiscomplexos.Umasoluocontendoestesnutrientesdesignadacomomeiodecultura.Em
geral,osmeiosdeculturasolquidos,semislidosouslidos.Ummeiolquidosemagentesolidificante
designadoporcaldonutritivo.Umcaldonutritivosuplementadocomumagentesolidificante,usualmenteoagar,
originaummeioslidoousemislido.Oagarumextractodealgasmarinhas,umcarbohidratocomplexoque
contemmaioritariamentegalactoseepossuimuitopoucovalornutritivo.Oagarmuitoadequadocomoagente
solidificanteporqueseliquefazacercade100Cesolidificaa40C.Devidoaestaspropriedades,os
microrganismos,emespecialospatognicos,podemsercultivadosatemperaturasdaordemdos37Csemreceios
deliquefacodomeiosolidificado.Ummeiodeculturabemsolidificadoexigeumaconcentraodeagarda
ordemdos1,5a1,8%.Umaconcentraoinferiora1%resultanummeiosemislido.
Paraalmdasnecessidadesnutritivas,vriosoutrosfactoresambientaisprecisamdesercontroladosparao
sucessodaculturadosmicrorganismos,comosejamopH,atemperatura,oambientegasosoouapresso
osmtica.

ESTERILIZAO
Aesterilizaoumdospontoschaveparaosucessodotrabalhoemmicrobiologia.Paratrabalharemcondies
deesterilidadefundamentalousodematerialestrileaaplicaodetcnicasadequadas.Aesterilizao
processopeloqualsoeliminadastodasasformasdevidadequalquermeiooumaterial.Asprincipaistcnicas
paraaesterilizaoderotinaemlaboratriosoasseguintes:

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Calor

Filtrao

Produtosqumicos

Calorseco(arquente)
160Ca180Cdurante1/2horaa3horas
Materialdevidroemvazio
Calorhmido(vapor)
Circulaodevapora100C.Esterilizaointermitente(soluestermolbeis)
Autoclave.Vaporsobpresso,temperaturasacimados100C(meiosdecultura,
soluestermoestveis)
Membranasfiltrantescomporosde0,05ma0.8m
Remoodemicrorganismosdesoluestermolbeisporfiltrao
xidodeetileno
Materialdeplstico
Betapropiolactona
Tecidosvivos,materiaisbiolgicos

TUBOS DE CULTURA E PLACAS DE PETRI


TubosdeensaioemvidroeplacasdePetriemvidroeplsticoconstituemosprincipaissuportesparao
desenvolvimentodasculturasdemicrorganismos.Ummeionutritivoadequadonaformadecaldonutritivooude
agarusadoemtubosdeensaio,enquantonasplacasdePetriapenasseusameioslido.Umambienteestril
preservadonostubosdeculturaporvriostiposdetampas.Historicamenteorolhodealgodohidrfobo,
desenvolvidoporSchroederevonDuschnosculodezanove.Hojeemdia,amaiorpartedoslaboratriosusam
tampasemformademanga,emmetalouplsticoresistenteaocalor.Avantagemdestastampasresidenofactode
noexigiremtantotrabalhonasuapreparaoeseremmaisfacilmenteremovidasereintroduzidasnostubos
duranteamanipulao.
AsplacasdePetridisponibilizamumamaiorsuperfcieparaculturaecrescimentodosmicrorganismos.So
compostasporumabasecircularinferior,ondecolocadoomeioeporumatampadomesmoformatoe
ligeiramentemaiorqueseencaixanabase.ExistemplacasdePetridevriasdimensesparadiferentesexigncias
laboratoriais.Narotinasousadasplacasdecercade10cmdedimetro.Omeionutritivoestril,contendoagar,
numvolumede15a20mlvertidonasplacasquandoaindaquenteapsfusodoagaredeixadoarrefecera
temperaturainferiora40C.Depoisdeinoculadascomosmicrorganismosasplacassoincubadasemposio
invertidaparaevitarqueasgotasdecondensao,formadasnatampaduranteoarrefecimentodoagar,tombem
sobreasuperfciedoagar.

INSTRUMENTOS PARA TRANSFERNCIA DE CULTURAS


Existeanecessidadedetransferirosmicrorganismosdeummeiodeculturaparaoutros,desdeculturasde
armazenamentoamanutenoparaculturasdeanlise.oprocessodesubculturaquetemdenecessariamente
serefectuadocomtcnicaestrilparaevitarpotenciaiscontaminaesdassubculturas.
Asansaseagulhas,usualmentefabricadascommetaisinertescomoaplatinaeinseridasemcabosprpriosparaa
manipulao,soinstrumentosmuitodurveisdefcilutilizao.Sofacilmenteesterilizveisnomomentodasua
utilizaoporincineraochama,numaposioquaseverticalatometalficaraorubro.Importardepois
deixararrefecerentre10a20segundos,foradachama,masnasuaproximidade,ondeacargademicrorganismos
ambientaisviveisinferior.Depoisdearrefecidos,paranoinactivarosmicrorganismosatransferir,podemser
usadaspara"picar"umaculturaslidaoulquidaeinocularoutromeio.Umavezesterilizada,aansadeverserde
imediatoutilizadaantesdeserdenovocolocadanabancada.
Aspipetassooutrosdosinstrumentosdetransfernciadeculturasdeusomuitogeneralizado.Socalibradase
permitematransfernciadequantidadesdeculturaslquidaspreestabelecidas.Sodevidroouplstico,comuma
extremidadeafiladaeoutraparaaaspiraoeexpulsodolquidoquecontenham.Podemseresterilizadaspor
calorsecoouhmido,conformeotipodematerialdequesoconstitudas.Apesardetradicionalmenteserem
instrumentospara"pipetarboca"proibidousarabocaparaaspirarmicrorganismos.Existemauxiliares
mecnicosdisponveisparaoefeito,comoperasdeborrachaoucorposdeseringaqueseadaptamnaextremidade
largadapipeta.
AspipetasPasteur,tubosdevidronograduadoscomumadasextremidadesafiladassotambmdeusomuito
frequenteemtrabalhosdemicrobiologia,tambmpelasuafacilidadedeesterilizaoextempornea.

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CMARAS DE CULTURA
Dascondiesparacrescimentodosmicrorganismos,umadasmaisrelevantesasuatemperaturaptimade
crescimento.Asestufassousadasparaamanutenodatemperaturaptimadosmicrorganismosem
crescimentoduranteoperododecultura.Socmarasemqueatemperaturaambienteinteriorcontroladapor
termstato,paraqueamesmasejamantidadentrodelimitesapropriadosparaocrescimentocelular.Usamem
geralumsistemadecirculaodearaquecidoe,paraevitaradesidrataodosmeiosemincubao,devero
contertambmumafontedevapordegua(umrecipientecomguanoseuinterior,quandonovenham
preparadasparaoefeitodeorigem).
Osbanhosdegua(banhomaria)comguaatemperaturacontroladaportermstatoconstituemoutrodos
instrumentosfrequentementeempreguesparaacriaodascondiesdetemperaturaptimadecrescimentodos
microrganismos.Ontimocontactodaguaatemperaturacontroladacomorecipienteondecrescemos
microrganismosapresentaavantagemdepermitirumamaisrpidaeeficaztransfernciadocalor.Almdisso,os
banhoscomagitaofacilitamtambmoarejamentodasculturas,degrandeimportnciaparaocrescimentodos
microrganismosaerbios.Adesvantagemdobanhodeguaresidenofactodespoderserusadoparaasculturas
emmeiolquido,aocontrriodasestufasdear,queservemtantoparaculturasemmeiolquidocomoemmeio
slido.

FRIGORFICO
Ofrigorficooutradaspeasfundamentaisemlaboratriodemicrobiologia.Oambientedebaixatemperatura
quedisponibilizadamaiorrelevnciaparaamanutenoearmazenamentodasculturascelularesemfasede
nocrescimentoentreosperodosdesubculturaeparaaconservaodosmeiosesterilizadoseoutrosreagentes.
Tambmassoluesecompostostermolbeistmperodosdeconservaomaisalargadosquandoarmazenados
abaixastemperaturas.

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MtodosdeEsterilizao
Esterilizaoumprocessoqueeliminatodososorganismosvivosqueseencontremsuperfcieounointerior
deummaterial,podendoseralcanadopelaexposiodomaterialaagentesletaisfsicosouqumicosou,nocaso
doslquidos,pelaseparaomecnicadosorganismosatravsdefiltraes.Existemmuitasformasdeesterilizar
materiaisemeios,easuaescolhadependedanaturezadosmateriaisaseremesterilizadosbemcomoda
disponibilidadedemeiosdetrabalho.
Anoodeesterilidade(estril=infecundo)encontrasefrequentementeassociadaaduasoutras:adeassepsia
(ausnciadesepsis=putrefaco)eadedesinfeco(livrardainfeco).Estessignificadosliteraiscorrespondem,
defacto,snoestcnicasdestasterminologias.Emmicrobiologiareferimonosaesterilizaoquandose
pretendeimpedirapropagaodemicrorganismos;aassepsiaquandosepretendetrabalharemambiente
desprovidodemicrorganismoseadesinfecoquandoseaplicamtcnicasdestinadasaeliminarmicrorganismos
potencialmentepatognicosparaooperador.
Destasnoes,aaprofundarnoexercciodaexperimentaoquesedesenvolvernadisciplina,importa
consideraremparticularastcnicasqueseutilizamemmicrobiologiaparaaeliminaodemicrorganismos
viveis:aesterilizao.

ESTERILIZAO PELO CALOR


A.CalorHmido
Oaparelhomaisusadoparaesterilizarmateriaisemeiosdeculturaaautoclave.Asautoclavestrabalham
semelhanadepanelasdepressodomsticas.Asautoclavesdelaboratriooperamnormalmentesobuma
pressode1,02Baraumatemperaturade121C.Aautoclaveesterilizaamaioriadosmateriaisem1530
minutos,sendoavariaodotempodeesterilizaodevidarelaosuperfcie/volumedosmateriaisaserem
esterilizados.

Aspectosdaesterilizaoporvaporpresso
Temperatura
Osendoesporosdasbactriassoasformasdevidamaisresistentesaocalor,easuadestruiopodeser
conseguidaseforaplicadovaporsobrepresso.Umatemperaturade121Cofereceumaboamargemde
seguranaseformantidaduranteumespaodetempoapropriado.

Humidade
Acoagulaodoprotoplasmabacterianoemtemperaturasmoderadasrequerhumidadeehmedidaqueesta
removidaatemperaturanecessriaparahavercoagulaoaumentarapidamente.Seovaporforsobreaquecido
ficarmais"seco"oqueocasionaumaumentodatemperaturaedotempodeexposioparaaesterilizao,que
nasituaoextremadeesterilizaoemcalorsecoserde170Cduranteumahora.Emconcluso,vapor
excessivamentequenteperdealgumadasuaeficciacomoagenteletalparaalmdepoderserlesivoparaos
materiaisaseremtratados.

Presso
Apresso,nosvaloresusadosnaautoclave,porsisnoexercequalquerefeitonaesterilizao,sendotilpara
elevaratemperaturadovaporacimados100C.

Tempo
Otemponecessrioparaqueovaportenhaaoportunidadedepenetrareaquecerosmateriaisaserem
esterilizados.Mesmoquandoastemperaturasdeesterilizaosoatingidas,osagentesviraisoumicrobianosno
sotodosmortosdeumavez.Avelocidadedemorteumaconstanteaumadadatemperaturaeporcadaunidade
detempodeexposioaoagenteletal,umaproporoqueconstanteparaumadadapopulao.Normalmente
demora11a12minutosa121C(calorhmido)paramatarosendoesporosdasbactriastermoflicas,osagentes
maisresistentesnasmanipulaesdodiaadia.

Biotecnologia/EngenhariaGentica2010/11

11

Purga
Oarrelativamentefrionacmaradeesterilizaomuitomaispesadoqueovaportemperaturade
esterilizao.Senoforpermitidaasadadoarcriaseumaestratificaonaautoclavequeconduzaumafaltade
uniformizaodastemperaturasdesenvolvidas.Umavezqueoareovaporsolentosamisturaremse,as
diferenasdetemperaturaentrecamadaspodesermuitogrande,porissoanecessidadedesesubstituirtodooar
porvapor(purga).

Naturezadocarregamento
Geralmente,osmateriaismaisvolumososrequeremummaiortempodeesterilizao,sendoprefervelesterilizar
pequenosvolumesdecadavez,porexemploprefervelesterilizar5balesdelitrodecadavezdoqueesterilizar
apenasumbalocomcincolitros.Osfrascosdevemsertapadoscomalgodooupapel.Sefornecessriousar
tampasroscadas,devemirpoucoapertadasparaaautoclavedemodoapermitiremasadadeareentradade
vapor,evitandoseassimorebentamentodefrascosnaautoclave.

B.Calorseco
Ocalorsecousadoparaesterilizarmaterialdevidro,outrosmateriaisslidostermoestveisealguns
componentesdemeiosoualimentosqueficariamimprpriosseexpostosaovapor.Tratasetambmdeumdos
mtodosdeesterilizaomaisusadosedemuitofcilaplicao.Oequipamentoindispensvelapenasuma
estufadealtatemperatura(160200C).Paraalmdeterdesertidaemcontaaresistnciatrmicadosmateriais
aesterilizarporestatcnica,aoutraprecauoaconsiderarprendesecomaminimizaodapossibilidadede
contaminaressesmateriaisdepoisdaesterilizao.

ESTERILIZAO POR GASES


Orecenteincrementodousodematerialdeplsticodeutilizaonicacomoseringas,caixasdePetri,tubosde
cultura,filtros,etc.,levouaodesenvolvimentodeumanovaformadeesterilizaoqueusagasestxicosparaa
eliminaodosmicrorganismosdemateriaistermosensveis.Aaplicaodestatcnicarequerautilizaode
equipamentosprpriosqueforcemacirculaodogstxicoatravsdetodasassuperfciesdosmateriais,oquea
tornadedifcilutilizaoemlaboratriosdetiponoindustrial.
Oxidodeetilenoogsusadocommaiorfrequncianestetipodeesterilizaes.Estegs,aocontrriode
muitosprodutosqumicostxicos,poucocorrosivoenoalteraosmateriaisaseremesterilizados,sendo
facilmenteremovidoporarejamento.Assuasdesvantagensincluemanecessidadedelongosperodosde
exposioparaseobteraesterilizao(vriashoras),areactividadecomcomponentesdosmeiosecertostiposde
plsticoseanecessidadedeequipamentosprpriosedisponibilidadedogs,comosereferiu.

RADIAES
Algunsprocessoscomerciaisusamasradiaesparaaesterilizaoafriodecertosmateriaiscomoprodutos
farmacuticos,porexemplo.Airradiaoousoderadiaesionizantesdealtaenergiaqueincluemraiosgama
produzidosapartirdecobalto60oucsio139ederaioscatdicosproduzidosemgeradoreseaceleradoresde
electres.
Airradiaocomluzultravioletanoumaformamuitosatisfatriadeesterilizaodadaasuafracacapacidade
depenetraonosmateriaiseprodutosaesterilizar.,contudo,deutilizaofrequentenadiminuiodonvelde
contaminaodeespaosconfinados,comosalasestreisoupequenosambientes,sendoparticularmenteteis
tambmparaareduodainfecciosidadeviraldevidosalteraesinduzidasnomaterialgenticodaspartculas
viraisexpostas.

Biotecnologia/EngenhariaGentica2010/11

12

FILTRAO ESTRIL
Oprincipalmtodoparaaesterilizaodelquidosquecontenhamcomponentestermosensveistaiscomo
vitaminas,protenassricaseantibiticos,porexemplo,afiltrao.Tradicionalmenteosmicrobiologistas
esterilizavamestesprodutosrecorrendoafiltrosfeitosapartirdeterradediatomceasefibrasdeasbesto,
previamenteesterilizadosemautoclave.Presentementeestesfiltrosforamsubstitudosporfiltrosdeacetatode
celuloseoupolicarbonatosnosquaisostiposdeporosdesenvolvidospermitemfiltraescomelevadosgrausde
preciso.Existemactualmentedisponveisnomercadofiltrosesterilizantesdevriosporosecapacidades
filtrantes.Osmaisfrequentese,porisso,maisacessveissofiltrosdeporosde0,45mou0,2mdedimetro,
queretmosmicrorganismospresentesnassolues.
Paraesterilizarumasoluoporfiltrao,nohmaisquepassaressasoluoatravsdeumdestesfiltrospela
aplicaodeumapressopositivanolquidoafiltrar(filtrosdeseringa,porexemplo)ounararefacodoarno
contentorquerecebeofiltrado.Emqualquerdoscasosestatcnicarequerarecolhadofiltradoemcondiesde
assepsiaparaimpediracontaminaodolquidoesterilizado.
Salvorarasexcepes,afiltraoestrilnoretmaspartculasvirais.Nopodendoserconsideradocomo
mtodode"esterilizaodevrus".Afiltraoestrilmesmoumatcnicafrequentementeusadaemvirologia
paraapurificaodesuspensesviraispelaeliminaodebactriaspotencialmentecontaminantes.

DESINFECTANTES E ANTI-SPTICOS
Mltiplosreagentesqumicossodiariamenteutilizadosparacontrolodadisseminaodemicrorganismos.Os
produtosusadosna"limpeza"deutensliosdiversos,frequentementedemasiadotxicosparaserusados
directamentenoHomem,sochamadosdedesinfectantes.Osprodutosqueaplicamosnapele,comomesmo
objectivodeeliminareventuaismicrorganismos,soantispticos.
Particularmenteeficazemuitotilnolaboratrio,paraeliminaodevrusemicrorganismosasoluode
hipocloritodesdio(lixvia)comquesetratamosmateriaisdelaboratrioapsexposioaagentesinfecciosos.

Biotecnologia/EngenhariaGentica2010/11

13

PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS

(NBDeumamaneirageralosprotocolosconstantesdestemanualforamadaptadosduraodeumasesso
prticadeduashoras,noconstituindo,nasuageneralidade,asmelhoresopestcnicasparaosobjectivos
pretendidos).

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14

PIPETAGENS,DILUIESESOLUES
Introduo
Origornasdiluiesaefectuarcomalgunsmateriaisbiolgicosereagentes,nocontextodevriosdostrabalhos
experimentaisqueaquiseincluem,crticoefundamentalparaosucessoeparaafiabilidadedosresultados.
Porqueseobservacomfrequnciaalgumainabilidadedosestudantesparaamanipulaoadequadadas
micropipetaseparaumraciocniooperacionaltantodasdiluiesexpressascomopotnciasde10comonaforma
deprepararsoluestituladas,introduzseestetrabalhopreliminar.

Materialereagentes

Soluoconcentradadeazuldemetileno
Sorofisiolgico(salino)
guadestilada
Micropipetasdiversas
Microtuboseppendorf
Espectrofotmetro

Procedimentoindividual
Pipetagem
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Marcarquatromicrotuboseppendorf(de1a4)
Paratubo2pipetar5Ldeguadestilada,portrsvezes(total15L)
Paratubo2pipetar90Ldeguadestilada,portrsvezes(total270L)
Paratubo3pipetar160Ldeguadestilada,portrsvezes(total480L)
Pesarindividualmentecadaumdosquatrotubos.
Registaraspesagens
Avaliarosresultados

Procedimento(porgrupo)
Diluiesdecimais
1.

Marque6tubosdeensaio(de1a6)

2.

Apartirdasoluoconcentradadeazuldemetilenoproceda,sseguintesdiluiessequenciais:
Tubo

Solvente(ml)

4,5

4,5

4,5

4,5

4,5

Corante(ml)

5,0

0,5

Soluoprecedente(ml)

0,5

0,5

0,5

0,5

Diluio(10 x )

3.

Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiesemcadatubo.

4.

Registeasintensidadesdecorobservveisnosdiferentestubos

5.

Determineaabsorvnciadassoluesa600660nm(lerdamaisdiludaparaamaisconcentrada).

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15

Diluiesdetrsemtrs
1.

Marque6tubosdeensaio(de1a6)

2.

Apartirdasoluoconcentradadeazuldemetilenoproceda,sseguintesdiluiessequenciais:
Tubo

Solvente(ml)

Corante(ml)

5,0

2,5

Soluoprecedente(ml)

2,5

2,5

2,5

2,5

Diluio(10 x )

3.

Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiesemcadatubo.

4.
5.

Registeasintensidadesdecorobservveisnosdiferentestubos
Determineaabsorvnciadassoluesdostuboscomnmeropara600660nm

TPC
Diluionica
1.

Apartirdasoluoconcentradadeazuldemetilenocomoprocederiaparaapreparaode5mlde
cadaumadasseguintessolues:
i. Diluiode5x10 2
P

ii. Diluiode5x10 2
P

Preparaodesolues
Pretendendoseobter100mldecadaumadassoluesqueselistam,indiqueasquantidadesdeprodutosa
misturarparaasuapreparaonolaboratrio:
1. NaOH0,1N
2.

SO 4 H 2 0,1N

3.

NaCl0,1M

4.

NaCl100mM

5.

Glicerol10%(frmulaC 3 H 8 O 3 )

6.
7.

Glucose10%(frmulaC 6 H 12 O 6 )
Etanol70%(frmulaC 2 H 6 O 2 )

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16

RegistodeobservaeseResultados
PIPETAGENSEDILUIES

Operador:

Data: ____/____/____

Pipetagens

Tubo

Volume
total

Peso

Diferena

Observaes

270L

480L

Tubo

Amostra

DO 600nm /ml

Concentrao
calculada

Observaes

Tubo

Amostra

DO 600nm /ml

Concentrao
calculada

Observaes

Diluiesdecimais

Diluiesdetrsemtrs

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17

Grfico

Notas:

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18

SOLUES

Operador:

Data: ____/____/____

Diluio

Componentes

5X10 2
P

Diluio

NaOH0,1N

5X10 2
P

Peso/volume

(100ml)

SO 4 H 2 0,1N

(100ml)

NaCl0,1M
(100ml)

NaCl100mM
(100ml)

Glicerol10%

(100ml)

Glucose10%

(100ml)
Etanol70%

(100ml)

Notas:

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19

CULTURADEBACTRIAS(E.COLI)

MaterialeReagentes
Bactriarecombinante

LB10X:
o Bactotriptona
100g
o Extractodelevedura
50g
o NaCl
100g
o H2Odestiladaat
1000ml
pH7,5.
Autoclavar.Conservarestrila4C.
Diluirextemporneaeesterilmentea1:10comguaestril.

Ampicilina1000X
o 50mg/mlemgua.
Esterilizarporfiltrao,conservara20C

ProtocoloExperimental
1.
2.
3.

Preparar50mldemeioLB1X,contendoampicilina(50g/ml).
Inocularcombactriacontendooplasmdioapreparar.
Incubar37Cduranteumanoitesobagitao.

Biotecnologia/EngenhariaGentica2010/11

20

PREPARAODEDNAPLASMDICO
(LISEALCALINA)
(NBlongadurao)

MaterialeReagentes
Bactriarecombinante

LB1Xcomampicilina.
Lisozima(p)
Isopropanol
5MNaCl
Etanolpuroe70%
TEpH8,0
o 10mMTrisHClpH8,0
o 1mMEDTA)
Pronase20mg/mlemgua
o autodigeridadurante2horasa37C.Conservara20C
PronaseMix:
o Pronase
50l
o 10%SDS
86l
o H2O
860l
RNAseA10mg/mlem:
o 10mMTrisHClpH7,5
o 15mMNaCl
o incubadapor15minutosa100Cearrefecimentolento.Conservara20C
RNAsemix:
o RNAseA
40l
o TEpH8,0
10ml
SoluoI:
o 25mMTrisHClpH8,0
o 50mMGlucose
o 10mMEDTA
SoluoII:
o 0,2NNaOH
o 1%SDS
SoluoIII:
o 5MKOAc
60ml
o Ac.acticoglacial
11,5ml
o H2Odestilada
28,5ml
pH4,8
Fenol:clorofrmio:
o Fenoldestilado
50ml
o Clorofrmio
50ml
o Alcoolisoamlico
1ml
o 8hidroxiquinolena
0,1g
o TEpH8,0
15ml
(usarapenasafaseorgnica,decoramarela,noagitar)

Biotecnologia/EngenhariaGentica2010/11

21

ProtocoloExperimental
1.

2.
3.
4.
5.
6.
7.

8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.

Usar50mldeculturasaturadadebactriarecombinante.
a. Centrifugar4.000XGdurante15minutosa4C.
b. Lavarosedimentodebactriascom5mldeLB.
c. Decantareescorrercompletamenteosobrenadante.
Ressuspenderbemosedimentocom2mldeSoluoI.
Adicionar10mgdelisozima.Misturar.
a. Repousar10minutostemperaturaambiente.
Adicionar4mldeSoluoII.
a. Misturarporinverso.
b. Repousar10minutosnogelo.
Adicionar3mldeSoluoIII.
a. Misturar.
b. Repousar10minutosnogelo.
Centrifugar7.000XGdurante30minutosa4C.
a. Filtrarosobrenadanteporgazehidrfila.
Adicionar0,6volumesdeisopropanol.
a. Repousar10minutostemperaturaambiente.
b. Centrifugar7.000XGdurante30minutos.
c. Decantar.
Lavaroprecipitadocometanola70%.
Lavaroprecipitadocometanola96%.
a. Secaroprecipitado.
Dissolvercom500ldeRNAsemix.
a. Incubara37Cdurante60minutos.
Adicionar100ldePronasemix.
a. Incubara37Cdurante30minutos.
Extrair2vezescomfenol:clorofrmio(igualvolume).
a. Tomarafaseaquosa,seminterfase.
Adicionar0,04v.de5MNaCl(24*l)e2v.deetanolpuro(1,2ml).
a. Precipitarduranteumanoitea20C.
RecuperarDNAplasmdicoporcentrifugao(7.000XGdurante30minutos).
a. Dissolvercom50ldeTEpH8,0.
AvaliaraconcentraodeumaalquotaporleituradaDOa260nm
a. (50g/ml=1UDO)

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22

MINIPREPARAODEDNAPLASMDICO
(MINIPREP)
MaterialeReagentes
(mesmosdaPreparaodeDNAPlasmdico)

ProtocoloExperimental
1.

Inocular5mldeLBcomcadacolniaaanalisar.
a. Incubara37Cduranteumanoitecomagitao.
2. Pipetar1,5a2mldesuspensoparamicrotubo.
a. Centrifugar1minutonamicrocentrfuga.
b. Decantareescorrercompletamenteosobrenadante.
3. Ressuspenderosedimentocom100ldeSoluoI;Misturar.
4. Adicionar200ldeSoluoII;Misturarporinverso.
5. Adicionar150ldeSoluoIII;Misturar.
6. AgitarfortementemoparapartirDNAcromosomal.
7. Centrifugar5minutosnamicrocentrfuga.
8. Pipetar400ldesobrenadantelmpido(seminterfacenemprecipitadosobrenadante).
9. Adicionar250ldeisopropanol.
a. Repousar10minutostemperaturaambiente.
b. Centrifugar20minutosnamicrocentrfuga.
c. Decantar.
10. Lavaroprecipitadocometanolpuro.
a. Centrifugar5minutosnamicrocentrfuga.
b. Decantar,escorreresecar.
11. Dissolvercom50ldeRNAsemix.
a. Incubara37Cdurante30minutos.
12. Usar10lparadigestocomenzimaderestrio.

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23

DIGESTOCOMENZIMASDERESTRIO

MaterialeReagentes
SoluodeDNAaanalisar
Enzimasderestrio:
o BamHI(10U/l)
o EcoRI(20U/l)
o SalI(20U/l)

Fenol:clorofrmio
Tampodeenzima10X(dofabricante)ou
TUS10X(TampoUniversalStratagene)
o 1MKOAc
o 250mMTris/Acetato,pH7,6
o 100mMMgOAc
o 5mMMercaptoetanol
o 100g/mlBSA

ProtocoloExperimental
1.

Emmicrotubo,adicionarsequencialmente:
a. H 2 Oestril
19,25l(ouq.b.p.25lfinal)
b. SoluodeDNA
1l(1g)
c. TUS10X
3,75l(1,5Xfinal)
d. Soluodeenzima
1l(10Unidades)
Misturarnovortex.
Centrifugarbrevementeparalevartudoparaofundodotubo.
Incubara37Cdurante1hora.
Desproteinizarpelofenol:clorofrmio:
a. Adicionar25ldefenol:clorofrmio.
b. Misturarbem.
c. Centrifugar1minutonamicrocentrfuga.
d. Pipetarfaseaquosaparanovotubo.
Tomar10lparaanliseemgel.
B

2.
3.
4.
5.

6.

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24

ANLISEDEDNASEMGELDEAGAROSE

MaterialeReagentes
SoluodeDNAaanalisar
DNAmarcador:
o lambdaXBstEII

TBE10X
o 890mMTris
o 890mMcidobrico
o 20mMEDTA
pH8,0
AgarosemdiaoubaixaEEO(SigmaTipoIIouV)
Brometodeetdio10mg/ml
DyeDNAs(IndicadordeMigrao):
o 25%Ficoll400
o 0,25%OrangeG

ProtocoloExperimental
1.

2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Preparaodogel
a. Prepararomoldeparaogel.
b. Fundiraagarose(0,7%)em95%volumefinaldegua.
c. Arrefeceracercade50C.
d. Adicionar5%deTBE10X(0,5Xfinal).
e. Adicionar0,005%Brometodeetdio(0,5g/mlfinal).
f. Misturareverternomolde.
g. Colocaropenteedeixarsolidificar.
Colocarogelnoaparelho,apenassubmersoemTBE0,5X.
AplicarasamostrasdeDNA,contendo10a20%deDyeDNAs.
AplicarumaamostradeDNAmarcador(0,5a1g)
Procederseparaoelectrofortica(75V),atconvenientemigrao.
VisualizarnotransiluminadorsobluzUV(300a320nm).
a. Observarogel
Registarasbandas(desenhar)
Fotografarogelcomfiltrovermelhodegelatina.

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25

PREPARAODEBACTRIASCOMPETENTES

MaterialeReagentes

E.ColiXL1B

LB10X
Tetraciclina1000X:
o 12,5mg/mlem50%etanol.Conservara20C.
100mMCaCl 2 (filtraoestril)
Glicerol50%(v/v)(filtraoestril)
B

ProtocoloExperimental
1.
2.

Inocular10mldeLB1X(Tetraciclinaopcional)comcolniadeE.coliXL1B.
a. Incubara37Csobforteagitao,duranteumanoite.
Usar4mldaculturaparainocular50mldeLBpraquecidoa37C.
a. Incubara37Csobforteagitaoat0,2UDOa600nm(cercade2X10 7 bactrias/ml)(2a4
horasantesdaaula).
b. Arrefecer15minutosembanhodegelo.
c. Centrifugar3.000XGdurante10minutosa4C.
d. Decantar.
Ressuspenderosedimentodebactriasem20mlde100mMCaCl 2 .
a. Repousar15minutosnogelo.
b. Centrifugar3.000XGdurante10minutosa4C.
c. Decantar.
Ressuspenderosedimentodebactriascom5mlde100mMCaCl 2 .
Adicionar20%deglicerola50%(10%final)
a. Repousardurante30minutosa4C
Repartiralquotasde50la500lpormicrotubos
a. Conservarcongeladoa80C
Testaraeficciadetransformaocom50ldebactriascompetentes
P

3.

4.
5.
6.
7.

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26

TRANSFORMAO

MaterialeReagentes
Bactriascompetentes
SoluodeDNAsplasmdico(pDNA)

LB10X
Ampicilina1000X
PlacasdeAgar/LB/Amp:
BactoAgar
7.5g
LB10X
50ml
H 2 Oat
500ml
Autoclavar,Deixararrefecera50C.Adicionar500ldeAmpicilina1000X.
Repartirdeimediatopelasplacasdepetri.
B

ProtocoloExperimental
1.
2.
3.

4.

5.
6.
7.

Pipetarparaummicrotubo5ldesoluodepDNA.
Pipetarparaoutromicrotubo5ldesoluodepDNAdiludaa1:100.
Adicionar50ldebactriascompetentesacadatubo.
a. Homogeneizarnovortex.
b. Repousar10minutosnogelo.
c. Incubara37Cdurante5minutos.
Adicionar1mldemeioLBpraquecido(semantibitico).
a. Incubara37Cdurante1hora.
b. Centrifugar1minutonamicrocentrfuga.
c. Decantar.
Ressuspenderasbactriasem200ldemeioLB.
EspalharsobreplacadeAgar/LB/Ampatsecar.
a. Incubara37Cemestufaduranteumanoite.
Picarcolnias.

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27

ANLISEDEPROTENARECOMBINANTE
NB.Apartirdecolniadebactriatransformada,queexprimaumaprotenarecombinante,extraireanalisarem
geldeelectroforeseosperfisproteicosdabactriainduzidaenoinduzida.

MaterialeReagentes
Bactriarecombinante(pCS938.15)
LB/Amp
IPTG100mM

Protocoloexperimental
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.

RessuscitarculturadebactriarecombinanteemmeiodeculturaLB/Amp/Agar(slido)
Expandirumacolniaem10mLdemeioLB/Amp(lquido)
Incubaro/n37Csobagitao
Adicionar4mLdeLB/AMPpraquecidoa2tubosesterilizados
Inocular1mLdeculturabacterianaemcadatubo
Adicionaraumdostubos(INDUZIDO)50LdeIPTG100mM
Incubarasduasculturasa37Cdurante30minutos,sobagitao
Tomar,decadacultura,para2microtubos,1mldesuspenso(4tubos)
Centrifugar2minutos
Decantarerejeitarsobrenadantes
a. Congelar20Cumtubodebactriainduzidaeoutrodebactrianoinduzida
11. Resuspenderossedimentosdosoutrostuboscom1,5mLdesalino
a. AvaliareregistaraDOa550nm

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28

ELECTROFORESEDEPROTENAS(PAGE)

MaterialeReagentes
Extractosdebactriarecombinante(pCS938.15)comexpressoinduzidaenoinduzida

Acrilamidaa50%(esterilizadaporfiltrao)
Bisacrilamidaa1,25%
Tris1,5MpH8.8
Tris1,5MpH6.8
SDS10%
TEMED10%
Persulfatodeamnio10%(extemporneo)
TampoLaemmli10X:
Tris250mM
Glicina1,92M
SDS1%
pH8.3
Tampodeelctrodos:
T.Laemmli1X
Tampodeamostra(2X):
Tris125mMpH6.8
SDS4%
Glicerol20%
BME10%
Azuldebromofenol0,2%
Soluodecolorao:
AzuldeCoomassie0,2%
Metanol50%
cidoacticoglacial10%
Soluodediferenciao
Metanol10%
cidoacticoglacial10%

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29

ProtocoloExperimental

PREPARAO DAS AMOSTRAS


1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Ressuspender,descongelando,cadasedimentodebactriasrecombinantesinduzidasenoinduzidas
com100ldetampodeamostra
Aqueceremguaferventedurante3minutos
Centrifugar10.000GX3min
Tomarosobrenadanteparanovotubo
Arrefeceremgelo
Conservarcongeladoa20C,senecessrio
Tomarparagel0,15UDOa550nm(calculadocombasenaDOdaculturaanteriormentedeterminada)

PREPARAO DO GEL
1.
2.

Montaromoldeparaogel(dentrodeplstico)
Preparargeldeseparao(emErlenmeyer):
a. Acrilamida40%
7,5mL
b. Bisacrilamida1,25%
3,0mL
c. Tris1,5MpH8.8
7,5mL
d. SDS10%
300L
e. H2O
11,4mL
f. TEMED10%
150l
g. Persulfatodeamnioa10%
150l
3. Homogeneizarsemintroduzirmuitoar
4. Verternomolde
5. Adicionarpequenovolumedeguanasuperfciedogel(semmisturar)
6. Deixarpolimerizar(20a30min)
7. Preparargeldestacking(emErlenmeyer):
a. Acrilamida40%
900L
b. Bisacrilamida1,25%
500l
c. Tris1,5MpH6.8
1,8mL
d. SDS10%
75l
e. H2O
5,1ml
f. TEMED10%
75l
g. Persulfatodeamnioa10%
75l
8. Removeraguasobrenadantedogeldeseparao
9. Colocaropente
10. Verterogeldestacking
11. Deixarpolimerizar(10a20minutos)

Biotecnologia/EngenhariaGentica2010/11

30

ELECTROFORESE
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Montarogelnatinadeelectroforese
Encherascmarasdoselctrodoscomotampodeelectroforese
Aplicar50ldeamostraporpoodogel(0,15UDOa550nm)
Registaralocalizaodecadaamostra
Ligaracorrenteelctrica(70volts)ataoindicadordemigraoseposicionarnofimdogel(5horas)
Desmontarosistemarecuperandoogel

COLORAO DAS PROTENAS


1.
2.
3.
4.
5.
6.

Mergulharogelemabundantesoluodecolorao
a. Corardurante30minutoscomagitao
Passarogelparasoluodediferenciao.
Mergulharemabundantesoluodediferenciao
a. Diferenciarcomagitaoatcontrasteconveniente(mudarsoluoquandonecessrio)
Observaremtransiluminadordovisvel
Registarosresultados(desenharasbandas).
Fotografar

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ANEXOSPLASMDIOS
PCS11

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32

PCS62

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33

PCS71

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34

PCS84

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PSK+

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ANEXOSENZIMAS
BAMH I
Origem:BacillusamyloliquefaciensH

5...G^GATCC...3
3...CCTAG^G...5

ReacoEnzimtica:
150mMNaCl
10mMTrisHCl
10mMMgCl2
1mMdithiothreitol
100g/mlBSA.
pH7.9
Incubaoa37C.
Inactivaopelocalor:No

ECO RI
Origem:E.coliRY13

5...G^AATTC...3
3...CTTAA^G...5

ReacoEnzimtica:
50mMNaCl
100mMTrisHCl
10mMMgCl2
0.025%TritonX100
pH7.5
Incubaoa37C
Inactivaopelocalor:65CX20minutos

SAL I
Origem:StreptomycesalbusG

5...G^TCGAC...3
3...CAGCT^G...5

ReacoEnzimtica:
150mMNaCl
10mMTrisHCl
10mMMgCl2
1mMdithiothreitol
100g/mlBSA
pH7.9
Incubaoa37C.
Inactivaopelocalor:65CX20minutos

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ANEXOSTABELAPERIDICA

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TRABALHOAUTNOMOPARARELATRIOFINAL

CadagruporeceberumDNAplasmdiconoidentificado,emquantidadevestigial

Problema:
Identificaroplasmdio.
Relataraestratgiaadoptada,osprocedimentosutilizadoseosresultadosobtidos

Estratgiasugerida
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Prepararbactriascompetentes
TransformarcomoDNAdesconhecido
PrepararDNAplasmdicoemquantidadeadequada
Digerircomasenzimasderestrio
Analisarfragmentosemgel
Compararcomosperfisobtidoscomosdosplasmdiosincludosnestemanual,paraidentificao.

NOTAS/Registoderesultados

E:\Documents\UEVORA\Disciplinas\EngGenet\201011\Manual.docx

CarlosSinogas

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