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SERIE 2

COMPORTAMIENTO ACIDO-BASE DE AMINOCIDOS Y PPTIDOS

1. En una solucin de alanina 0,1 M (pH 9,69), indicar a) la concentracin de aminocido que tendra el grupo carboxilo ionizado; b) la concentracin de aminocido que tendra el grupo amino protonado. pKa (-COOH) = 2,34; pKa (NH4+ = 9,69). Sol.: a) 0,1 M; b) 0,05M. 2. Calcular el pH de una solucin de clorhidrato de asprtico 1 mM. pKa (-COOH) = 2,09; pKa (R-COOH) = 3,86; pKa (-NH4+) = 9,82. Sol.: 3,05. 3. Calcular el pH de una solucin de clorhidrato de glicina, a) 0,5 M; b) 0,05 mM; c) 0,1 mM. pKa (-COOH) = 2,34; pKa (-NH4+) = 9,60. Sol.: a) 1,32; b) 1,89; c) 4. 4. Calcular el pH de una solucin de glicinato sdico 0,5 M. Usar los datos del problema 3. Sol.: 11,65. 5. Calcular el pH de una solucin de lisinato sdico 100 mM. pKa (-COOH) = 2,18; pKa (-NH4+) = 8,95; pKa (-NH4+) = 10,53. Sol.: 11,76. 6. Describir la preparacin de 1 litro de tampn histidina 0,2 M (pH 6,5), a partir de dihidrocloruro de histidina slido (PM = 228,0) y una solucin de KOH 1 M. Los valores de pKa de los grupos ionizables de la histidina son 1,82; 6,00 y 9,17. Sol: 45, 60 g del aminocido se disuelven en agua, se aaden 353 ml de KOH 1 M y se completa con agua hasta 1 l. 7. Representar la curva de titulacin de 1 litro de una solucin de clorhidrato de glicina 0,5 M con NaOH 2 M. a) Cantos ml de sosa habra que aadir para neutralizar completamente el aminocido?; b) cal ser el pH de la disolucin tras la adicin de 0,5 moles de sosa?. Usar los datos del problema 3. Sol.: a) 500 ml; b) 5,97. 8. Hallar el punto isoelctrico (pI) de los siguientes aminocidos: a) glicina; b) serina; c) glutmico; d) lisina. Usar los datos de los problemas 3 y 5 para los pKas de la glicina y lisina. pKas (Ser) = 2,21 y 9,15. pKas (Glu) = 2,19; 4,25 y 9,67. Sol.: a) 5,97; b) 5,68; c) 3,22; d) 9,74.

9. Representar la curva de titulacin de 100 ml de una solucin 0,1 M de clorhidrato de histidina con NaOH 2 M. Indicar hacia qu polo emigrara este aminocido en un campo elctrico: a) a pH 5,0; b) a pH 7,6. Usar los datos del problema 6. Sol.: a) Ctodo (-); b) No se mueve (pI = 7,6). 10. Representar la curva de titulacin de la tirosina. Hacia qu polo emigrara este aminocido en una electroforesis?: a) a pH 6,3; b) a pH 9,5. pKa (Tyr) = 2,20; 9,11 y 10,07. Sol.: a) No se mueve; b) Anodo (+). 11. Tenemos una mezcla de Asp, Arg y Leu. a) Cul ser el pH ms conveniente para separar estos aminocidos por electroforesis?. b) Hacia qu polo emigraran estos aminocidos al pH elegido?. Usar los datos del problema 2 para los pKas del aspartato. pKas (Arg) = 2,17; 9,04 y 12,48. pKas (Leu) = 2,36 y 9,60. Sol.: a) pH alrededor de 6; b) Asp hacia el nodo (+); Arg hacia el ctodo (-); Leu no se mueve. 12. Representar la curva de titulacin de 1 mol de clorhidrato de histidil-tirosina. a) Calcular su pI. b) Hacia donde se movera este dipptido en un campo elctrico a pH 6?. Los valores de pKas son 2,20; 6,00; 9,17 y 10,07. Sol.: a) pI = 7,56; b) Ctodo (-). 13. Calcular el pI y representar la curva de titulacin de 1 mol del clorhidrato del siguiente pptido: +H3N-Asp-Arg-Arg-Gly-Arg-Asp-Arg-COOH. Los valores de pKas son: 2,12; 3,86; 9,82 y 12,48. Sol.: pI = 12. 14. Calcular el pI y representar la curva de titulacin de 1 mol del clorhidrato del siguiente pptido: +H3N-Glu-Asp-His-Gly-Asp-Glu-Cys-COOH. Los valores de pKas son: 1,71; 3,86-4,25; 6,00; 8,33 y 9,67. Sol.: pI = 3,5. 15. Calcular el pI del siguiente pptido: +H3N-Gly-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Trp-ValCOOH. 100 ml de una solucin 1 mM de este pptido a pH 4,0 se quieren llevar hasta pH 6,5 mediante la adicin de NaOH 0,1 N. Cuntos ml de esta solucin habr que aadir?. Los valores de pKas son: 2,32; 3,86-4,25; 9,60 y 12,48. Sol.: pI = 4; 1 ml. 16. Calcular el pI del siguiente pptido: +H3N-Glu-His-Asp-Lys-Val-COOH. Hacia donde se movera en un campo elctrico a pH 5. Los valores de pKas son 2,32; 3,82-4,25; 6,00; 9,67 y 10,53. Sol.: pI = 5; no se movera. 17. Una mezcla de los cuatro pptidos siguientes: a) His-Gly-Ala-Glu b)Ser-Gly-Leu-Trp c)Val-Glu-Asp-Ala d)Gly-Lys-Val-Ser se deposit en una columna empaquetada con una resina de intercambio inico. Indicar el qu orden saldrn los pptidos de la columna si se eluyen con un

disolvente cuyo pH va cambiando continuamente de 10 a 2. De qu tipo de resina se trata?. Usar los siguientes valores aproximados de pKas: 2; 4; 6; 9 y 11. Justifica estos valores y predecir cmo seran en una protena. Sol: d-b-a-c; intercambio aninico; 3,1-3,9-6,3-8-10. 18. Una mezcla de hemoglobina (Hg, pI = 6,8) y de quimitripsingeno (Qt, pI = 9,5) se someti a una electroforesis a) a pH 6,8 y b) a pH 8,0. Indicar la movilidad de estas protenas en cada caso. Sol.: a) Hg no se movera y Qt emigra al ctodo (-); b) Hb emigra al nodo (+) y Qt emigra al ctodo (-). 19. Qu pH sera ms eficaz para separar por electroforesis una mezcla de -globulina (pI = 6,6), mioglobina (pI 7,0) y hemoglobina (pI = 6,8. Sol.: pH = 6,8. 20. Un polipptido tiene los siguientes grupos ionizables, con sus correspondientes valores de pKas: 1 -COOH (2), 1 -NH3+ (9), 9 R-COOH (4), 3 Imidazol (6), 3 NH4+ (11) y 3 Guanidinio (12). a) Calcular el pI. b) Hacia donde emigrara en un campo elctrico a pH 7. c) Si tenemos una solucin 1 M de dicho polipptido a pH 1, cuntos equivalentes de NaOH necesitaramos para neutralizarla?. Sol.: a) pI = 5; b) Anodo (+); c) 20 eq. 21. Aplicar los datos del problema anterior para el caso de que el polipptido tenga 15 residuos de Asp y 3 de residuos de His. Sol.: pI = 3,4; b) Anodo (+); c) 20 eq. 22. Determinar el pH al cual el siguiente poliptido no se movera en una electroforesis: + H3N-Gly-Arg-His-Asp-Gly-Asp-Leu-Arg-Asp-Arg-Arg-Asp-COOH. Considerar los siguientes valores de pKas para los grupos ionizables: 2, 4, 6, 9 y 12. Cuntos moles de KOH se necesitan para llevar 0,1 mol del triclorhidrato del polipptido hasta pH 12?. Qu pH existe al disolver dicho triclorhidrato?. Dibujar la correspondiente curva de titulacin. Sol.: pI = 4,6; 0,75 moles de KOH; pH = 3,4. 23. Calcular el pI del siguiente polipptido: +N3H-Gly-Arg-Gly-His-Asp-Asp-Arg-LeuAsp-Arg-Asp-Asp-Ala-COOH. Utilizar los datos del problema 22. Hacia qu polo se movera este poliptido en una electroforesis a pH 8. Cuntos moles de NaOH se necesitan para llevar 0,2 moles del monoclorhidrato del polipptido hasta pH 10?. Dibujar la correspondiente curva de titulacin. Sol.: pI = 4,6; Anodo (+); 0,8 moles de NaOH 24. Calcular el pH necesario para eluir de una columna empaquetada con una resina de intercambio aninico el 90 % del glutamato retenido en la misma. Los pKas del glutamato son 2,19; 4,25 y 9,67. Sol.: pH = 3,3. 25. Calcular el pI del glutation (-glutamil-cisteinil-glicina). Considerar los siguientes valores de pKas para los grupos ionizables: 2, 8 y 9. Sol.: pI = 2.

SEPARACIN DE PROTENAS Y DETERMINACIN DE PARMETROS FSICOQUMICOS

1. En uno de los pasos de purificacin de la fenilalanina hidrolasa de Pseudomonas sp. se concentra la protena por precipitacin con sulfato amnico al 70 % . Se disuelve el precipitado en tampn fosfato potsico 0,01 M (pH 7,5) y se dializa frente a este tampn durante dos horas. a) Para qu se utiliza la dilisis?. b) Por qu tcnica se podra sustituir?. Sol.: a) Para eliminar el sulfato amnico; b) Filtracin en Sephadex G-10, G-15 G-25. 2. Predecir la secuencia en que las protenas siguientes resultarn eludas en una columna de exclusin molecular del tipo Sephadex G-150 (Rango de fraccionamiento: 5.000-400.000): mioglobina (PM = 17.000), catalasa (PM = 240.000), citocromo c (PM = 13.370), miosina (PM = 524.800), quimitripsingeno (PM = 25.000), seroalbmina (PM = 67.000). Sol.: Miosina-catalasa-seroalbmina-quimotripsingeno-mioglobina-citocromo c. 3. En una columna de Sephadex G-150 (Rango de fraccionamiento: 5.000-400.000) se eluyen dos protenas. Los mximos de elucin coinciden con el volumen vacio o de exclusin (Vo) y el volumen total de la columna (Vt). Qu se puede decir del tamao molecular de cada protena?. Sol.: La protena que eluye en el Vo tiene PM 400.000, y la protena que eluye en el Vt tiene PM 5.000. 4. En una columna de Sephadex G-150 (Rango de fraccionamiento: 5.000-400.000), de dimensiones 2,6 x 50 cm y equilibrada con tampn fosfato potsico 10 mM (pH 7,0), se carga una muestra que contiene azul dextrano (PM = 2 x 106) y agua tritiada. Se recogen fracciones de 8 ml y se mide en cada una de ellas la absorbancia a 620 nm (azul dextrano) y la radiactividad (agua tritiada): Ve (ml) A620
nm

8 0,01 56

16 0,01 58

24 0,03 56

32 0,20 55

40 0,40 56

48 0,55 57

56 0,43 58

64 0,23 55

72 0,04 56

80 0,02 57

88 0,01 56

Cpm

Ve (ml) A620
nm

96 0,01 56 184

104 0,01 58 192

112 0,01 56

120 0,01 57 200

128 0,01 56 208

136 0,01 55 216

144 0,01 56 224

152 0,01 56 232

160 0,01 68

168 0,01 58 240

176 0,01 64 248

Cpm V2 (ml)

A620 nm Cpm

0,01 70

0,01 100

0,01 300

0,01 1.500

0,01 3.500

0,01 4.000

0,01 3.200

0,01 600

0,01 60

a) A la vista de los datos obtenidos, determinar el volumen de exclusin o volumen vaco (Vo) y el volumen total lquido (Vl). b) Cmo se podran determinar con ms precisin ambos parmetros? c) Por qu no se corresponde el volumen total lquido (Vl) con el volumen total (Vt) calculado a partir de sus dimensiones? Sol.: a) Vo = 40-48 ml; Vl = 216-224 ml; Vt = Vl + Vgel. 5. Cul ser el peso molecular de una protena desconocida si los volmenes de elucin (Ve) para ella y otras protenas patrones en una filtracin en gel son: 118 ml (citocromo c , PM = 13.370), 58 ml (-lactoglubulina, PM = 37.100), 24 ml (hemoglobina, PM = 64.500), 37 ml (protena desconocida). Suponer que todas las protenas son esfricas y se hallan dentro del rango de fraccionamiento del gel empleado. Sol.: PM = 52.000. 6. En una columna de Sephadex G-25 (Rango de fraccionamiento: 1.000-5.000) equilibrada con tampn fosfato potsico 1 M (pH 7,5), se carga una protena de peso molecular 240.000 disuelta en tampn fosfato potsico 1 M (pH 7,5). a) A qu volumen eluir la protena?. b) A qu molaridad de fosfato potsico se espera obtener la protena?. Sol.: a) Ve = Vo; b) 10 mM. 7. Se ha determinado el volumen de elucin (Ve) de varias protenas de peso molecular conocido en una columna de Sephadex G-150 (Rango de fraccionamiento: 5.000400.000): Proten Citocro Quimotr Ovoalb mo c ipsinge mi-na a no 184 165 Ve (ml) 206 25.000 PM 13.370 43.000 Seroalb Lactope Fibrin mi-na roxidasa Catalasa geno 153 67.000 Tiroglo buli-na

147 115 106 90 82.000 240.000 330.000 670.000

a) Calcular Vo de la columna. b) El peso molecular de una protena (suponindola esfrica) en ausencia y presencia de SDS al 1 %, si los volmenes de elucin obtenidos son 131 y 152 ml, respectivamente. c) Qu se puede sugerir de la composicin subunitaria de la protena nativa?. Sol.: a) Vo = 90 ml; b) PM (protena nativa) = 140.000, PM (subunidad) = 72.000; c) La protena nativa tiene dos subunidades iguales. 8. Una mezcla de tres protenas se aplica a una columna de Sephadex G-150 (Rango de fraccionamiento: 5.000-400.000). En la elucin se obtienen solamente dos picos, uno correspondiente al volumen vacio y el otro antes del volumen total. a) Por qu salen solamente dos picos?. b) Qu tcnica se puede usar para determinar la pureza de cada pico?. c) Cmo se podran separar las protenas?.

Sol.: a) Dos protenas tienen PM 400.000 y la otra tiene PM ms pequeo, una protena tiene PM 400.000 y otras dos tienen igual PM inferior; b) Electroforesis; c) Si el primer pico es de dos protenas de PM 400.000 se puede utilizar un Sephadex G-200 (Rango de fraccionamiento: 5.000-800.000), pero si el segundo pico corresponde a dos protenas de igual PM se puede utilizar la cromatografa de intercambio inico. 9. En el aislamiento y purificacin de una protena los dializados de la precipitacin con sulfato amnico se aplican a una columna de DEAE-celulosa, obtenindose en la elucin un solo pico con un gradiente de tampn fosfato potsico 0,01-1 M (pH 7,5). Las fracciones correspondientes se concentran y se aplican en una columna de Sephadex G-200, apareciendo dos picos en el perfil de elucin. Puede tratarse de una protena que se disocie?. Comentar los resultados. Sol.: Podra tratarse de una protena que se disocie, dos protenas con la misma carga y distinto tamao. 10. Una de las ltimas etapas del aislamiento de protenas es la filtracin en gel, que puede servir tambin como criterio de pureza. Al eluir en una columna de Sephadex G-150 las fracciones con actividad enzimtica de una etapa anterior en la purificacin aparece un solo pico. Las fracciones correspondientes a este pico se aplican en una columna de intercambio inico, y al eluir con un gradiente de NaCl aparecen dos picos. Comentar los resultados. Sirve realmente la filtracin en gel como criterio de pureza positivo?. Sol.: Se trata de dos protenas de igual tamao y distinta carga. La filtracin en gel nos permite asegurar si una protena est impura, pero no se puede asegurar que est pura. 11. La electroforesis en gel de poliacrilamida a diferentes concentraciones de acrilamida para la albmina de suero bovino dio los siguientes resultados: % Acrilamida 5 6 7 8 9 10 11 12 Rf Banda I 1,12 0,85 0,70 0,60 0,52 0,44 0,38 0,33 Rf Banda II 0,74 0,62 0.49 0,38 0,28 0,22 0,18 0,14 Rf Banda III 0,57 0,43 0,32 0,23 0,13 0,11 0,08 0,06

Indquese si estas bandas de albmina corresponden a ismeros de carga o de tamao. Sol.: Ismeros de tamao. 12. Para calcular el peso molecular de la enzima dehidropterina reductasa de hgado de oveja se ha utilizado la electroforesis en gel de poliacrilamida. Utilizando el mtodo de Hedrick y Smith (1968) se han realizado electroforesis de protenas de pesos moleculares conocidos a distintas reticulaciones de los geles, obtenindose las pendientes de las rectas que unen los puntos de la representacin logRf versus concentracin de acrilamida (%): 0,48 (mioglobina, PM = 17.000); 0,55 (prolactina,

PM = 24.000); 0,66 (ovoalbmina, PM = 43.000); 0,79 (seroalbmina, PM = 67.000); 0,64 (dihidropterina reductasa). Calcular el peso molecular de la citada enzima. Sol.: PM = 42.000. 13. Shapiro, Viuela y Maizel (1967) descrubrieron la electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia del detergente aninico dodecilsulfato sdico (SDS), capaz de disociar las protenas en sus subunidades, estableciendo que en este medio la separacin de protenas es dependiente del peso molecular. Se ha determinado la movilidad relativa (Rf) en electroforesis en gel de poliacrilamida al 7,5 %, en presencia de SDS, de varias protenas de peso molecular conocido: 0,18 (seroalbmina, PM = 67.000); 0,22 (catalasa, PM = 59.000); 0,29 (glutamato deshidrogenasa, PM = 53.000); 0,40 (gliceraldehdo-3-fosfato-deshidrogenasa, PM = 36.000); 0,60 (tripsina, PM = 23.500); 0,74 (mioglobina, PM = 17.000). Calcular el peso molecular de la enzima lctico deshidrogenasa de un insecto si su Rf = 0,45, en las mismas condiciones. Sol.: PM = 34.300. 14. La electroforesis de una enzima a la que previamente se ha tratado con SDS en gel de poliacrialmida en presencia de SDS, da dos bandas con Rf = 0,51 yy 0,56. El peso molecular de la enzima nativa obtenido mediante filtracin en Sephadex G-200 y ultracentrifugacin en gradiente de sacarosa es 120.000. Calcular el peso molecular y el nmero de subunidades de la enzima. Las movilidades relativas de las protenas patrn, en las mismas condiciones, son: 0,75 (mioglobina, PM = 17.000); 0,6 (tripsina, PM = 23.500); 0,40 (gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa, PM = 36.000); 0,16 (ovoalbmina, PM = 43.000). Sol.: 2 subunidades de 30.000 y 3 de 20.000. 15. La NADH-nitrato reductasa de Ankistrodesmus braunii se ha purificado hasta homegeneidad electrofortica mediante un procedimiento que implicaba como principal etapa la cromatografa de afinidad en Cibacrn-Sepharose. El Cibacrn es un grupo cromforo cuya conformacin simula la orientacin espacial de los anillos aromticos y grupos inicos de los nucletidos, por lo que covalentemente unido a Sepharose presenta afinidad por el sitio de unin para el NAD+ y ATP de muchas enzimas. Tras aplicar 7 ml de la solucin enzimtica a la columna de afinidad y el posterior lavado de la misma con 3 ml del tampn adecuado, la nitrato reductasa se elua por adicin de NADH al tampn de lavado (Ve de 1 a 15 ml). Posteriormente se aplicaba KCL 3 M para eluir las protenas an adsorbidas a la columna (Ve de 16 a 20 ml). Para las distintas fracciones recogidas se determin la absorbancia a 280 nm (protena) y a 540 nm (actividad enzimtica): Ve (ml) A280 A540 Ve (ml) A280 A540 1 0,450 11 0,045 1,234 2 1,110 0,015 12 0,050 0,676 3 1,250 13 0,038 0,466 4 0,440 0,023 14 0,031 0,207 5 0,202 15 0,022 0,031 6 0,090 0,032 16 0,110 0,128 7 0,085 17 8 0,060 0,032 18 9 10

0,040 0,040 0,009 19 20

0,421 0,438 0,509 0,201

0,115 0,090 0,070 0.035

Representar el perfil de elucin para protena y actividad enzimtica. Por qu se eluye la nitrato reductasa de manera especfica con NADH. Explicar la elucin con KCl y discutir si es una elucin especfica para la enzima. Sol.: El NADH se une a la protena y la despega del Cibacrn que ocupa el sitio especfico de unin; El KCl es fuerza inica que debilita todas las interacciones protena-soporte y libera inespecficamente todas las protenas.

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