Alysson Pereira

Bruno de Farias
Elisa Silveira Teixeira
Isabele Schulz Mackedanz
Júlio Antônio de Matos Gemiaqui
Marina Arias da Silva
Victor Barcelos Corrêa

DETERMINAÇÃO DA QUANTIDADE DE PROTEÍNAS SOLÚVEIS EM AMOSTRA

DE PROTEÍNAS

Pelotas, 06 de abril de 2022

 1. INTRODUÇÃO

O método de biureto é utilizado para determinar a concentração de proteínas

totais em diversos meios, sendo eles: soro ou plasma sangüíneo, líquido cérebro
espinhal (líqüor), urina, alimentos, saliva, fibrinogênio e tecido animal. O método de
biureto tem sido também, utilizado em análise por injeção em fluxo para análise de
plasma sanguíneo, assim como em alguns métodos cinéticos (ZAIA, Dimas et al,
1998).
A fundamentação desse método se da devido às ligações peptídicas das
proteínas (-HN-CO-) que reagem com íons cúpricos em meio alcalino (Reagente do
Biureto) formando um complexo de coloração violeta, cuja absorbância medida em
540 nm é diretamente proporcional à concentração de proteínas na amostra (Golden
Analisa, 2018).
É um método rápido que utiliza reagentes de baixo custo e não apresenta
grande variação da absortividade específica para diferentes proteínas. Porém este
método não é muito sensível (Beckman Coulter, inc. 2013), o que o coloca em
desvantagem, e por isso outros métodos mais sensíveis tem tido a preferência ao
longo dos anos devido a essa desvantagem. Contudo o método de biureto ainda é
recomendado para a determinação da concentração de proteínas totais em plasma
sangüíneo pela Associação Americana de Análises Clínicas, assim como para
determinação de proteínas totais em saliva (Jenzano, J. W, et al, 1986) e leite
(Verheul, F. E. A. M et al, 2003), quando comparado com outros métodos.

2. METODOLOGIA

Foram utilizadas três amostras de extrato de soja, trazidas/realizadas pelo

professor Ricardo Toralles, no Instituto Federal Sul-rio-grandense, localizado na ci-
dade de Pelotas, RS. Com o objetivo de determinar o teor de proteína destas amos-
tras e construir uma curva-padrão BSA-Biureto.

As amostras foram pesadas em 5g, trituradas e colocadas em três beckers

com um deles contendo um glicerol 50%, o outro água destilada e o ultimo contendo
tampão fosfato pH 7,0, usando uma relação soluto/solvente de 1/10. Todos foram
agitados por 5 minutos vagarosamente e armazenados na geladeira por 24 horas,
cobertos por papel alumínio.
 Ao iniciar-se a prática, foram separados 7 tubos de ensaio e demarcados de
acordo com a concentração da solução mãe que seria transferido para cada um de-
les, como pode-se observar na tabela adiante. O sétimo tubo de ensaio foi demarca-
do como “amostra”, pois a análise também seria feita na análise.

Simultaneamente ao início da análise, foi, portanto, feita a diluição da soluçã o

mãe, afim de realizar o preparo dos padrões.

→ Solução Mãe = 10 mg/mL = 100mg/10mL

Concentração H2O Solução mãe Total

(mg/mL)

0 5 0 5

2 4 1 5

4 3 2 5

6 2 3 5

8 1 4 5

10 0 5 5

Em todos os tubos de ensaio foram colocados 1ml de água e 3ml de biureto. No

tubo 1, foi adicionado a solução padrão ‘’0’’, no segundo, 1ml de solução padrão ‘’2’’,
já no terceiro, 1ml de solução padrão ‘’4’’. O quarto foi contemplado com a solução
padrão ‘’6’’, o quinto com a solução padrão ‘’8’’ e o sexto com a solução padrão
‘’10’’. Após adicionar suas respectivas diluições nos tubos, os mesmo foram analisa-
dos através de um espectrofotômetro. Nele, colocou-se cada tubo separadamente,
logo foi possível analisar a quantidade de luz absorvida e, consequentemente, calcu-
lar a concentração da amostra analisada.

3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
A partir de medições realizadas por 3 grupos no espectrofotômetro foram
obtidos os seguintes valores de absorbância para as diluições:

DILUIÇÃO 1 2 3 MÉDIA DE ABS.

 0 0,053 0,065 0,065 0,061

2 0,161 0,159 0,172 0,164

4 0,248 0,252 0,265 0,255

6 0,35 0,341 0,369 0,353

8 0,445 0,416 0,467 0,443

10 0,53 0,499 0,502 0,51

AMOSTRA 0,524 0,132 0,359

A partir das médias aritméticas das absorvâncias obtidas, construiu-se a

seguinte curva-padrão de absorvância x concentração (de proteína), onde:

Eixo X = concentração de proteína nas diluições da solução padrão de albumina

bovina (BSA).

Eixo Y = absorbância em nm.

Curva-padrão sem a diferença do branco (0,061).

Considerando-se que a água teria uma absorbância igual a 0, foi-se

descontado o valor de 0,061 (equivalente ao branco) para cada um dos pontos da
reta. Obtendo-se assim a seguinte curva-padrão:
 A equação expressa pela curva-padrão representada acima é:
Y = 0,045428571428572x + 0,00952380952381

Utilizando-se da fórmula obtida a partir da curva-padrão, foi possível encontrar

um valor aproximado da concentração de proteína em cada uma das amostras.
Sendo eles 9,9822 mg/mL para a amostra extraída com solução tampão; 6,3501
mg/mL para a amostra extraída com água destilada; 1,3532 mg/mL para a amostra
extraída com glicerol 50%.
Pode-se perceber através dos valores encontrados, que a solução mais eficaz
para a extração de proteínas solúveis da soja foi o tampão fosfato pH 7. Essa
eficiência pode ser explicada pelo efeito conhecido como salting-in, onde uma
concentração salina média aumenta a solubilidade das proteínas ao enfraquecer as
ligações eletrostáticas entre elas.
Já o meio menos eficiente para a extração foi a solução de glicerol 50%. Isso
ocorre pois as proteínas, sendo formadas por aminoácidos, têm mais afinidade com
moléculas polares.
Utilizando a concentração da amostra de solução tampão como referência,
encontramos que para cada 100 gramas de grão de soja existem aproximadamente
9,9822 gramas de proteína solúvel.
 4. CONCLUSÕES

Foi analisado o teor de proteína de soja em 3 soluções diferentes, são elas:

água destilada, solução tampão fosfato pH 7 e glicerol 50%. Após a análise de cada
uma delas as expectativas sobre seus resultados foram comprovadas. A mais eficaz
é a solução tampão fosfato pH 7, que extrai na proporção 9,9822 mg/mL, valor que é
cerca de 1,6 vezes maior que a da água destilada e cerca de 7,4 vezes maior que a
solução de glicerol 50%.

Referências:

ZAIA, Dimas AM; ZAIA, Cássia Thaïs BV; LICHTIG, Jaim. Determinação de
proteínas totais via espectrofometria: vantagens e desvantagens dos métodos
existentes. Química nova, v. 21, n. 6, p. 787-793, 1998.
Golden Analisa. Proteínas Totais: Kit para determinação das proteínas totais
por metodologia colorimétrica. Brazil, 2018. Disponível em:
http://www.goldanalisa.com.br/arquivos/%7BB9568130-0164-4EF2-BC10-
13875DD3469C%7D_Prote%C3%ADnas%20Totais_REF_418.pdf. Acesso em: 21
Mar. 2022.
Beckman Coulter, inc. URINARY/CSF PROTEIN. USA, 2013. Disponível em:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/techdocs?docname=/cis/BAOSR6x70/%2
5%25. Acesso em: 21 Mar. 2022.
Jenzano, J. W.; Hogan, S. L.; Noyes, C. M.; Featherstone, G. L.; Lundblad, R. L.;
Anal. Biochem. 1986, 159, 370
Verheul, F. E. A. M.; Cornelissen, P. J. H. C.; Clin. Chem. 1986, 32, 2003.
Gornall, A. G.; Bardawill, C. J.; David, M. M.; J. Biol. Chem. 1949, 177, 751.