Modelagem da Extenso de uma nica Hifa Area de um Fungo Filamentoso

Juliana Hey Coradin1, Graciele Viccini2 e David Alexander Mitchell2

1 Universidade Federal do Paran - Departamento de Engenharia Qumica Caixa Postal 19011 81531-980 Curitiba - PR E-mail: juliana.coradin@gmail.com 2 Universidade Federal do Paran Departamento de Bioqumica e Biologia Molecular Caixa Postal 19046 81531-980 Curitiba PR E-mail: davidmitchell@ufpr.br

RESUMO Os fungos filamentosos crescem atravs de estruturas microscpicas tubulares: as hifas. A extenso da ponta da hifa sustentada por fenmenos de transporte e metabolismo de nutrientes. Neste trabalho, um modelo foi desenvolvido para simular o crescimento de uma nica hifa area a partir de uma fonte isolada e inesgotvel de glucose, sendo a hifa tratada como um conjunto de tanques em srie. No modelo, a glucose era transportada a partir da fonte at a ponta por dois mecanismos: a difuso intracelular de glucose e o fluxo convectivo gerado pela evaporao de gua pela ponta da hifa. As simulaes feitas com o modelo sugeriram que o mecanismo de difuso no seria capaz, sozinho, de sustentar o crescimento at alturas maiores do que 1 mm em 40 h. Por outro lado, com a evaporao de gua pela ponta, a velocidade de translocao de nutrientes aumentava e alturas maiores puderam ser atingidas. Palavras-chave: Fungos Filamentosos. Tanques em Srie. Translocao de Nutrientes. INTRODUO Os fungos so microrganismos que chamam ateno pela vasta gama de ambientes em que aparecem, desde o solo at o corpo humano. Eles crescem atravs de estruturas microscpicas semelhantes a tubos: as chamadas hifas. A hifa a unidade fsica microscpica formada em microrganismos filamentosos devido conexo de clulas vegetativas. uma estrutura cilndrica com raio entre 1 e 10 m (Tindemans; Kern; Mulder, 2006). Ela emerge do crescimento de um nico esporo. Aps a germinao, o esporo d origem a um tubo que estende seu comprimento atravs do crescimento na ponta e, ao mesmo tempo, forma ramificaes, constituindo novas hifas. As hifas areas desempenham um papel importante em processos de fermentao no estado slido (FES) que envolvem fungos filamentosos. Por exemplo, foi estimado que as hifas areas so responsveis por at 75% da taxa global de consumo de O 2 em processos de FES envolvendo o fungo Aspergillus niger (Rahardjo et al., 2002). Durante o perodo de operao esttica de biorreatores, elas podem tambm formar redes de miclio que se ligam a partculas de substratos, formando ento aglomerados. Esses aglomerados so indesejveis porque eles no s restringem o transporte de O2 at a superfcie das partculas, como tambm favorecem a formao de canais preferenciais no leito do substrato (Schutyser et al., 2003).

Um entendimento dos fenmenos de microescala que governam o crescimento de hifas areas necessrio para compreender como elas influenciam a performance de processos de FES. Dentro da estrutura fsica dessas hifas existe um conjunto de processos fisiolgicos que contribuem para a absoro, armazenamento e distribuio de nutrientes atravs da rede de hifas, de uma maneira aparentemente bem coordenada (Cairney, 2005). Em nvel microscpico, acredita-se que o transporte de nutrientes em hifas individuais mediado por uma combinao de difuso, fluxo de massa devido a correntes citoplasmticas generalizadas e transporte vesicular especfico (Cairney, 2005). Apesar da importncia desses processos, pouco se sabe sobre a anatomia celular e subcelular dos caminhos, sobre o mecanismo de transporte e suas foras motoras e sobre a natureza da informao biolgica que deve ser transmitida no interior da hifa para que ocorram respostas globais coordenadas em funo de estmulos nutricionais locais. Dentro deste contexto, o objetivo deste trabalho foi estudar como a translocao de nutrientes por difuso e fluxo convectivo no interior da hifa contribui para o fornecimento de nutrientes at a ponta. Para isso, um modelo que trata a hifa como um conjunto de tanques (reatores) em srie foi desenvolvido. DESENVOLVIMENTO DO MODELO A hifa foi modelada como uma entidade crescente que se estende no espao areo a partir de um meio nutritivo atravs do aumento da estrutura na ponta. Essa hifa pode ser tratada como um conjunto de compartimentos semelhantes a tanques adjacentes bem misturados, de maneira anloga a um conjunto de reatores em srie. O esquema do modelo mostrado na Figura 1.
Manuteno Cfonte
Glucose F + gua

Extenso

x
C1 Ci
Difuso Fluxo de Massa Consumo

Evaporao de gua

Meio Nutritivo

Espao Areo

N-tanques em srie

Figura 1: Desenho esquemtico da hifa modelada como um conjunto de tanques em srie Cada um dos tanques que compem a hifa cbico, e possui um comprimento x (m) e uma rea transversal A= x2 (m2). Essa rea transversal de um tanque equivalente rea transversal da hifa fngica modelo escolhida, que foi a de Rhizopus oligosporus crescendo sobre PDA, conforme o sistema experimental utilizado por Nopharatana (1999). Dentro de cada um desses tanques, perfeitamente misturados, ocorrem reaes para sustentar o crescimento e manuteno da hifa. Os tanques que compem a hifa so construdos por biomassa fngica de maneira tal que o total de biomassa necessria para construir um tanque funo do volume do mesmo e da densidade do material que compe o tanque. A densidade do lquido que flui dentro da hifa e da biomassa mida que forma um

tanque, por simplificao, prxima densidade de gua (Nopharatana, 1999). Cada tanque contm 100 mg-biomassa-seca cm-3 (Nopharatana, 1999), valor este denotado por hifa. O modelo considera o crescimento a partir da superfcie de um meio nutritivo que contm glucose, em uma concentrao Cfonte (mg cm-3), concentrao esta que se mantm constante durante o cultivo. A glucose difunde a partir desta fonte para dentro do primeiro tanque, com uma difusividade D (m2 s-1). Alm do transporte por difuso, mais material pode entrar neste tanque por conveco atravs de uma corrente de alimentao de entrada, chamada aqui de corrente F (m3 s-1). No h mais entrada de material para dentro da hifa alm do que entra neste primeiro tanque. A concentrao nesta corrente igual da fonte. Do primeiro ao segundo tanque, existe uma corrente que os liga, sendo que a vazo tambm F. Lquido flui do segundo ao terceiro tanque, tambm com vazo F, e assim sucessivamente. Portanto, o volume de lquido em cada tanque no muda. Na sada de cada tanque, a concentrao dos componentes idntica concentrao no interior daquele tanque, devido condio de mistura perfeita. A glucose consumida numa velocidade r (s-1) no ltimo tanque para formar biomassa necessria construo de um novo tanque (essa reao ser descrita adiante). Nos demais tanques, a glucose consumida apenas pela reao de manuteno de biomassa, caracterizada pelo coeficiente de manuteno m (mg-glucose mg-biomassa-seca-1 s-1). Considerando um tanque genrico qualquer do meio da hifa, denominado tanque i, cujos vizinhos so o tanque i-1 (mais prximo do meio nutritivo) e o tanque i+1 (mais distante), o balano de massa geral para a glucose, j simplificado, dado pela equao 1: (1) onde Ci refere-se concentrao de glucose no tanque i e os demais smbolos foram explicados anteriormente. Nesta equao, o primeiro termo do lado direito o termo convectivo (entrada sada), o segundo o termo difusivo e o terceiro est relacionado com o consumo de glucose para manuteno. De maneira anloga, foi feito o balano para o primeiro tanque (o tanque mais prximo fonte), considerando que o termo difusivo de entrada no do tipo centro-centro, mas sim contorno-centro. Alm disso, foi utilizada a condio de contorno fixa (Cfonte constante e inesgotvel): (2) Para o ltimo tanque (chamado de N-simo tanque), no h o termo de difuso de soluto para fora da hifa. Do mesmo modo, em relao ao fluxo convectivo, foi considerado que h o bombeamento de gua para fora da hifa, mas no do soluto glucose (e, portanto, tambm no h sada de glucose por meio do fluxo convectivo). Esse bombeamento busca incorporar o efeito que a evaporao de gua pode provocar sobre a translocao de nutrientes (Jennings, 1995). Alm disto, no ltimo tanque que ocorre gasto de glucose para formar biomassa em reserva, a uma velocidade de reao r. Juntando essas informaes, o balano de massa para o ltimo tanque dado pela equao 3: (3) Como tanto o fluxo F como a rea transversal A so constantes, o termo F/A pode ser re-escrito como a velocidade superficial do lquido no interior da hifa (vs, m s-1).

Uma vez que o modelo somente reconhece nmeros inteiros de tanques, no N-simo tanque foi considerado que a glucose consumida de maneira irreversvel para formar biomassa em reserva, que foi denotada por X (mg-biomassa-seca cm-3). A converso de glucose em biomassa segue uma reao de primeira ordem, com constante de velocidade k1 (s-1). A reao mostrada na equao 4 e a expresso da velocidade de reao na equao 5: (4) (5) Considerando um rendimento de biomassa seca em relao glucose de YX/G (mg-biomassa-seca mg-glucose-1), a equao que descreve a formao de biomassa em reserva a partir da glucose dada pela equao 6: (6) O alongamento de uma hifa ocorre por meio da adio de um novo tanque ponta e, com isto, N aumenta em uma unidade. Isto ocorre quando a quantidade de biomassa formada a partir da glucose acumulada no ltimo tanque for suficiente para a construo de um novo tanque, ou seja: (7) Condies iniciais: foi assumido que no tempo zero a hifa j contm trs tanques - o tanque 1, prximo fonte; o tanque 2, intermedirio; e o tanque 3, um tanque da ponta. Para estes trs tanques foi assumido que a concentrao inicial de glucose igual a zero (C1 = C2 = C3 = 0). Alm da condio inicial de zero de glucose, foi assumido tambm que a concentrao de biomassa em reserva no ltimo tanque tambm igual a zero (X = 0). O modelo foi calibrado para uma hifa area de Rhizopus oligosporus crescendo sobre PDA, conforme o sistema de Nopharatana (1999). Como muitos parmetros no esto disponveis para o fungo em questo, parmetros de outros fungos foram utilizados. O parmetro k1 foi fixado nas simulaes. Na Tabela 1 todos os parmetros so descritos, juntamente com seus valores. Tabela 1: Parmetros utilizados para a resoluo do modelo
Parmetro D m YX/G hifa Cfonte x F/A = vs k1 Valor 6,9x102 5x10-6 0,45 100 20 10 0 ou 1,5 0,01 Unidade m2 s-1 mg-glucose mg-biomassa-seca-1 s-1 mg-biomassa seca mg-glucose-1 mg-biomassa-seca cm-3 mg-glucose cm-3 m m s-1 s-1 Fonte Hayduk e Laudie (1974) Bull e Trinci (1977) Nopharatana (1999) Nopharatana (1999) Atlas (2006) Coradin et al. (2011) Variado Fixado

MATERIAL E MTODOS O conjunto de equaes diferenciais ordinrias (EDOs) do modelo foi resolvido utilizando o mtodo de Runge-Kutta de quarta ordem programado na sub-rotina DRKGS em linguagem FORTRAN 90 e compilado atravs do software Compaq Visual Fortran Professional Edition 6.5.0.

RESULTADOS E DISCUSSES A Figura 2 mostra a extenso de uma hifa usando os parmetros da Tabela 1, para duas situaes: uma hifa sem fluxo convectivo e uma hifa com uma velocidade superficial de fluxo convectivo de 1,5 m s-1. Para os dois casos, observa-se uma pequena fase de acelerao na velocidade de extenso; em seguida uma fase de crescimento com velocidade constante; e, ento, uma desacelerao do crescimento. Com vs igualado a 1,5 m s-1, o comprimento de 3,5 mm atingido em 40 h aproximadamente igual altura mxima obtida experimentalmente 4,0 -1 por Nopharatana (1999) para o vs = 1,5 m s crescimento de hifas areas de 3,0 Rhizopus oligosporus. Na simulao com vs 2,0 igualado a zero, o nico -1 vs = 0,0 m s mecanismo de translocao 1,0 atuando a difuso; o modelo prev que a difuso no forneceria 0,0 nutrientes ponta em velocidade 0 10 20 30 40 suficiente para atingir uma altura Tempo (h) maior do que 1 mm em 40 h. A concentrao de glucose Figura 2: Comprimento de uma nica hifa em no tanque da ponta da hifa em funo do tempo para dois valores de vs funo do comprimento da hifa pode ser vista na Figura 3. Com 125 vs = 0, a quantidade de glucose acumulada na ponta baixa. Se a -1 100 concentrao baixa, como a reao vs = 1,5 m s de formao de biomassa de 75 primeira ordem (equao 4), a velocidade desta reao tambm 50 baixa e, portanto, comparado ao caso -1 vs = 0,0 m s 25 de vs = 1,5 m s-1, leva mais tempo para acumular o Xmin necessrio para a 0 construo de um novo tanque. Com 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 isso, a altura atingida em um mesmo Comprimento (mm) tempo menor. O modelo foi idealizado a Figura 3: Concentrao de glucose no tanque da partir da sugesto de Jennings (1995), ponta em funo do comprimento para de que a evaporao (transpirao) a as 40 h simuladas partir de uma hifa poderia aumentar a velocidade de translocao dentro dela. Segundo o autor, se a gua pode ser rapidamente perdida de esporforos de basidiomicetos, em certas circunstncias, o fluxo de gua atravs destas estruturas poderia aumentar a velocidade de crescimento, j que ele carregaria nutrientes at as pontas. Na Figura 3, pode-se observar que quando h fluxo convectivo, possvel um acmulo de nutrientes no tanque da ponta equivalente a mais de seis vezes a
[glucose] (mg cm )
-3

Comprimento (mm)

concentrao da fonte. Com uma grande concentrao de glucose na ponta, a equao 5 resulta em uma alta velocidade de formao de biomassa e, assim, a velocidade de extenso alta. Portanto, o comprimento atingido em um dado tempo maior do que na ausncia de fluxo convectivo. Nenhum modelo de crescimento fngico at hoje tinha incorporado a evaporao de gua da hifa. O presente trabalho sugere que, no caso de hifas areas, que crescem para longe da fonte de nutrientes, essa evaporao importante para aumentar a velocidade de translocao de nutrientes at as pontas. CONCLUSES O papel da evaporao de gua como mecanismo de translocao de nutrientes em hifas areas no havia sido investigado por meio de modelos matemticos. O modelo mostrado neste trabalho permite levantar a hiptese de que uma difuso simples no seria capaz de transportar nutrientes at as pontas de hifas areas de Rhizopus oligosporus em uma velocidade suficiente para permitir que elas atingissem as alturas que foram obtidas experimentalmente por Nopharatana (1999). Conclumos que mecanismos de transporte convectivo podem acelerar a translocao de nutrientes no interior da hifa, com aumento de velocidade de crescimento, e no devem ser desprezados. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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