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BREVE RELATÓRIO

A estrutura crio-EM do núcleo do filamento de


uromodulina humana revela um mecanismo de
montagem único
Jessica J Stanisich1†, Dawid S Zyla1†, Pavel Afanasyev2, Jingwei Xu1, Anne Kipp3, Eric
Olinger4, Olivier Devuyst3,5, Martin Pilhofer1, Daniel Boehringer2, Rudi Glockshuber1*

1Instituto de Biologia Molecular e Biofísica, ETH Zurich, Zurique, Suíça;2Cryo-EM


Knowledge Hub (CEMK), ETH Zurique, Zurique, Suíça;3Instituto de Fisiologia,
Universidade de Zurique, Zurique, Suíça;4Instituto de Pesquisa Clínica e Translacional,
Faculdade de Ciências Médicas, Universidade de Newcastle, Central Parkway,
Newcastle upon Tyne, Reino Unido;5Divisão de Nefrologia, UCLouvain Medical School,
Bruxelas, Bélgica

ResumoA glicoproteína uromodulina (UMOD) é a proteína mais abundante na urina humana e forma
homopolímeros filamentosos que encapsulam e agregam uropatógenos, promovendo a eliminação do
patógeno pela excreção urinária. Apesar de seu papel crítico na resposta imune inata contra infecções do
trato urinário, a base estrutural e o mecanismo de polimerização do UMOD permanecem desconhecidos.
Aqui, apresentamos a estrutura cryo-EM do núcleo de filamento UMOD com resolução de 3,5 Å, composta
pelo módulo bipartido da zona pelúcida (ZP) em um arranjo helicoidal com elevação de ~ 65 Å e torção de
~ 180˚. Os subdomínios ZPN e ZPC do tipo imunoglobulina de cada monômero são separados por um
ligante longo que interage com o ZPC anterior e subdomínios ZPN seguintes porb-complementação de
* Para correspondência: folha. A arquitetura única do filamento sugere um mecanismo de montagem no qual a incorporação da
rudi@mol.biol.ethz.ch subunidade pode ser sincronizada com a clivagem proteolítica do pró-peptídeo C-terminal que ancora os
†Estes autores contribuíram
precursores UMOD incompetentes para montagem à membrana.
igualmente para este trabalho

Interesses competitivos:Os
A proteína mais abundante na urina humana, a glicoproteína uromodulina (UMOD; também proteína
autores declaram que não
Tamm-Horsfall, THP), é conservada em todos os mamíferos e produzida principalmente nas células
existem interesses concorrentes.
epiteliais que revestem o ramo ascendente espesso (TAL) da alça de Henle no rim. Lá, o UMOD é
Financiamento:Veja a página 10 importante para manter a camada impermeável à água, regular o transporte de sal e a concentração
Recebido:22 de junho de 2020 urinária (Devuyst et al., 2017). Mais adiante no trato urinário, o UMOD demonstrou atuar como um
Aceitaram:19 de agosto de 2020 antagonista de adesão solúvel contraE. coli (UPEC) (Pak et al., 2001;Weiss e outros, 2020).
Publicados:20 de agosto de 2020 Os precursores de UMOD trafegam através da via secretora na forma pró-UMOD incompetente de
montagem, onde se tornam glicosilados em oito locais potenciais de N-glicosilação e, eventualmente,
Editor de revisão:Sjors HW
ligados à superfície da membrana apical por meio de seu pró-peptídeo C-terminal ancorado em
Scheres, Laboratório MRC de
glicosilfosfatidilinositol (GPI) ( CTP) (Rindler e outros, 1990;van Rooijen e outros, 1999;Weiss e outros, 2020).
Biologia Molecular, Reino
Unido A protease hepsina então cliva o CTP e o UMOD se reúne em filamentos homopoliméricos com um
comprimento médio de 2,5mm na urina (Brunati et al., 2015;Porter e Tamm, 1955).
Copyright Stanisich e outros.
Recentemente, a arquitetura geral dos filamentos UMOD intrinsecamente flexíveis foi descoberta por
Este artigo é distribuído nos
meio de tomografia crioeletrônica (Weiss e outros, 2020). Os resultados, juntamente com dados anteriores,
termos doLicença de Atribuição
Creative Commons,que permite
mostraram que o UMOD se monta em um polímero linear em forma de zigue-zague, onde o núcleo do
uso irrestrito e redistribuição filamento é formado por seu módulo bipartido de zona pelúcida (ZP) com os subdomínios ZPN e ZPC. Os
desde que o autor original e a domínios N-terminais, tipo fator de crescimento epidérmico (EGF) I--III e o seguinte domínio D8C rico em
fonte sejam creditados. cisteína, projetam-se como braços alternados de lados opostos do filamento, e o domínio EGF IV conecta os
braços ao núcleo do filamento (Figura 1A;Jovine e outros, 2002;Schaeffer e outros, 2009;Weiss e outros,

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breve relatório Biologia Estrutural e Biofísica Molecular

Figura 1.Estrutura Cryo-EM do núcleo de filamento UMOD humano. (A)Arquitetura de domínio do monômero pró-UMOD ancorado à membrana, composto por 4 domínios
semelhantes a EGF (I-IV, cinza), o domínio D8C rico em cisteína (verde) e o módulo ZP bipartido (ZPN e ZPC, azul). A dobra do subdomínio ZPC C-terminal é estendida pelo pró-
peptídeo C-terminal ancorado a GPI (CTP, vermelho) que é clivado pela hepsina como um pré-requisito da polimerização UMOD. O local de clivagem da hepsina (ligação
peptídica 587--588) é indicado por uma tesoura. O segmento UMOD previamente cristalizado rEGF-ZP-CTP é Figura 1 continua na próxima página

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Figura 1 continuação

também indicado. As posições dos oito sítios de N-glicosilação verificados em filamentos UMOD maduros são indicadas acima dos respectivos domínios como hexágonos
(hexágonos preenchidos: N-glicano do tipo complexo; hexágono aberto: N-glicano do tipo alto teor de manose). Numeração de aminoácidos de acordo com pré-pro-UMOD
incluindo sequência de sinal. (B)Micrografia crioeletrônica representativa mostrando as duas principais visualizações dos filamentos UMOD: vista frontal (1) e vista lateral (2).
Barra de escala: 50 nm. As representações esquemáticas da organização do subdomínio dessas duas visualizações são mostradas à direita. (C)Mapa de potencial de Coulomb
segmentado do módulo ZP maduro no filamento, mostrado sobre a reconstrução filtrada passa-baixa (com resolução de ~ 9 Å, cinza). O vinculador estendido conectando ZPN e
ZPC do módulo ZP azul complementa as dobras de ZPN do seguinte e ZPC dos módulos ZP anteriores (ZPN+1e ZPC-1; ameixa e ouro, respectivamente) porb-complementação de
folha. As características do mapa mostram uma elevação helicoidal de 65 Å e uma torção de 180˚. As localizações dos domínios EGF IV e D8C dos braços do filamento também
são indicadas. As características do mapa N-glicano resolvidas (cinza escuro) são indicadas com setas. (D)Vista frontal e lateral do modelo refinado do núcleo do filamento
dentro do mapa crio-EM de alta resolução obtido. Unidades de monossacarídeos resolvidas de N-glicanos são mostradas como modelos de bastão cinza. (E)Visão detalhada das
características do mapa em regiões selecionadas em ZPN (azul) e ZPC (ouro), ilustrando a qualidade do modelo cryo-EM final. (F)Mapa de potencial de Coulomb contíguo (malha)
em torno do segmento de linker estendido que abriga ob-fios Lb1--Lb3. eub1e eub2complementam a dobra ZPC da subunidade UMOD anterior, e Lb3complementa ZPN da
seguinte subunidade UMOD. (G)Mapa de potencial de Coulomb em torno do pentassacarídeo central do tipo complexo N-glicano ligado a N396 em ZPN. Quadrados azuis: N-
acetilglucosamina; círculos verdes: manose. A versão online deste artigo inclui o(s) seguinte(s) suplemento(s) de vídeo e figura para a figura 1:

Suplemento de figura 1.Avaliação de dados Cryo-EM para filamentos UMOD.


Suplemento de figura 2.Imagem representativa do mapa de potencial cryoSPARC Coulomb de alta resolução equipado com o modelo UMOD de unidade assimétrica (AU).

Suplemento de figura 3.Análise de flexibilidade de filamentos UMOD nativos.


Figura 1—vídeo 1.Mapa Cryo-EM de um filamento UMOD nativo. https://
elifesciences.org/articles/60265#fig1video1 Figura 1—vídeo 2.Análise de
variabilidade 3D de filamentos UMOD. https://elifesciences.org/articles/
60265#fig1video2

2020). Os filamentos UMOD encapsulam uropatogênicos pilosos por meio de ligação multivalente por meio de seus
N-glicanos às lectinas nas pontas dos pili bacterianos. Este mecanismo não só impede a adesão do patógeno aos
glicanos alvo nas células epiteliais do hospedeiro, mas também facilita a agregação do patógeno e a eliminação
pela excreção de urina.Weiss e outros, 2020).
Apesar dessas percepções, a organização estrutural exata dos filamentos UMOD permaneceu desconhecida. Nós nos
propusemos a resolver a estrutura do filamento UMOD por crio-EM de partícula única. Filamentos UMOD nativos isolados
de um indivíduo saudável apareceram na grade em duas visualizações principais: uma visualização 'frontal' semelhante a
uma espinha de peixe com braços salientes alternadamente e uma visualização 'lateral' em zigue-zague (Figura 1B).
Variações conformacionais marcadas tanto no núcleo do filamento quanto nos ângulos entre os braços periféricos e o
núcleo eram visíveis. Além disso, N-glicanos flexíveis que revestem o núcleo do filamento já podem ser vistos em médias de
classe 2D (Figura 1 - suplemento de figura 1). Essa flexibilidade intrínseca e exibição de glicano é um pré-requisito do
encapsulamento de patógenos por filamentos UMOD, no entanto, eles complicaram consideravelmente a determinação da
estrutura por crio-EM de partícula única, restringindo a análise de alta resolução ao núcleo do filamento.

Ab initioA reconstrução 3D de 723.000 partículas foi seguida por uma extensa classificação e refinamento
focado, juntamente com a estratégia de refinamento não uniforme em cryoSPARC, a fim de obter uma
reconstrução do núcleo UMOD em 3,5 Å (Figura 1—vídeo 1). Este mapa não simétrico de alta resolução foi
usado para ajustar o corpo rígido aos subdomínios UMOD ZP individuais, ZPN e ZPC, a partir da estrutura
cristalina publicada anteriormente de um fragmento pró-UMOD recombinante e incompetente de
montagem (consistindo no domínio EGF IV, módulo ZP, e CTP (denominado rEGF-ZP-CTP);Bokhove e outros,
2016; PDB: 4WRN). A resolução do mapa cryoSPARC no núcleo do filamento permitiu a construção direta do
modelo das dobras do subdomínio ZP tipo imunoglobulina (IG). A unidade assimétrica ZPN/ZPC foi então
estendida por ajuste de corpo rígido dentro de um mapa de resolução mais baixa (4,7 Å), refinado no
cisTEM, que continha mais repetições. Este ajuste mostrou uma arquitetura helicoidal do filamento com um
aumento de ~ 65 Å e torção de ~ 180˚, o que é consistente com os parâmetros obtidos pela média do
subtomograma (Weiss e outros, 2020). A partir daqui, fomos capazes de verificar uma conformação
estendida inesperada dos monômeros ZP no núcleo do filamento, em que um ligante longo de 28 resíduos
(resíduos UMOD L429--F456) entre os subdomínios ZPN e ZPC de cada monômero ZP abrangeu o ZPC do
módulo anterior (ZPC-1) e o ZPN do módulo subsequente (ZPN+1) (Figura 1C-D). A região central, incluindo o
vinculador, é bem resolvida, mostrando recursos claros do mapa da cadeia lateral (Figura 1E-F). O linker
entre ZPN e ZPC dos monômeros abrange ~103 Å e interage fortemente com os dois subdomínios ZP
intervenientes (Figura 1D--F,Figura 1 - suplemento de figura 2). Além disso,

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Potenciais de Coulomb para N-glicanos proeminentes em N396 e N513 foram observados e permitiram a
visualização do pentassacarídeo e dissacarídeo central, respectivamente (Figura 1C,D,G).
A flexibilidade intrínseca das fibras UMOD pode ser observada diretamente nas micrografias coletadas
na faixa de suas curvaturas (Figura 1B). Pequenos desvios na ascensão helicoidal ao longo da cadeia e na
flexibilidade intrínseca dificultaram a classificação e o alinhamento das partículas e limitaram a resolução
das reconstruções. Para analisar essa flexibilidade, medimos os ângulos relativos entre os subdomínios após
o encaixe do corpo rígido em várias médias de classes 3D heterogêneas (Figura 1 - suplemento de figura 3).
Mudanças angulares máximas semelhantes de ~7 graus foram obtidas em ambas as interfaces únicas entre
os subdomínios ZP, indicando que ambas as interfaces dão igualmente origem à flexibilidade dos
filamentos. Adicionalmente, utilizamos a análise de variabilidade 3D do cryoSPARC (com base na análise de
componentes principais (PCA);Punjani e Frota, 2020), que mostrou um grau semelhante de flexão do
filamento (componente 1) e um alongamento do filamento ao longo do eixo z (componente 2) com base em
uma rotação relativa dos módulos ZP nas interfaces do subdomínio (Figura 1—vídeo 2).
O ligante ZP alongado estabelece um andaime intrincado e extensivamente encadeado para o acúmulo
de filamentos a partir de monômeros UMOD maduros. Reminiscente da complementação da fita doadora
em interações de subunidades de pili montadas por meio da via chaperone-usher (Waksman, 2017) ou o
mais recentemente descoberto tipo V pili (Shibata e outros, 2020), a formação do filamento UMOD envolve
umab-mecanismo de complementação de folhas que se estende por módulos ZP encadeados (Figura 2A).
Especificamente, o ligante estendido entre ZPN e ZPC em cada monômero é composto por três b-fios: Lb1,
EUb2, e eub3(resíduos 430--435, 438--441 e 446--452, respectivamente), onde Lb1e eub2da subunidade n
complementam a dobra da ZPC da subunidade n--1 (ZPC-1), e eub3estende a dobra IG de ZPN da subunidade
n+1 (ZPN+1) (Figura 2B). O sítio de complementação (CS) entre Lb1, EUb2e ZPC-1(denotado CSUMA) é formada
pela inserção antiparalela de Lb1em relação ao ZPCbFvertente, e a complementação paralela mais curta do
ZPCbUMA'fio pelo Lb2fio (Figura 2C). eub3, o mais longob-cadeia no segmento de ligação, liga-se
paralelamente ao longo do ZPN+1bGfita no sítio de complementação B (CSB) (Figura 2D).

A interface intermolecular entre o subdomínio ZPN da subunidade n e o domínio ZPC da subunidade


anterior (ZPC-1) (interface A, IUMA), é formado principalmente por resíduos hidrofóbicos de ambas as
subunidades (Figura 2E), criando uma área de superfície enterrada de ~2000 Å2(servidor PISA,Krissinel e
Henrick, 2007). Especificamente, os resíduos Y402, Y427 e L429 de ZPN em IUMAcobrir uma mancha
hidrofóbica proeminente na superfície do ZPC-1, composto por L491, F499, F456 e L570 (Figura 2 -
suplemento de figura 1). A segunda interface intermolecular única (IB) ao longo do monômero UMOD
alongado é formado entre ZPC-1e ZPN+1, e é estendido pelo vinculador (Figura 2F). A carga de superfície
complementar entre os dois subdomínios ZP fornece a base para IB, destacada pela inserção do R415 na
ZPN+1em um bolso carregado negativamente em ZPC-1abrigando D532. EUBé ainda mais estabilizado por
interações hidrofóbicas entre ZPC-1(F555, F553) ZPN+1(I413, I414) e o vinculador (P441, V443) (Figura 2 -
suplemento de figura 1).
Utilizamos o banco de dados de agregação de genoma (gnomAD) para analisar variantes sem sentido no
módulo UMOD ZP detectado em ~ 125.000 exome e ~ 15.000 sequências de genoma completo de indivíduos
saudáveis não relacionados de vários estudos populacionais (Karczewski et al., 2020). Dada a pressão seletiva para
altos níveis de filamentos UMOD funcionais na urina (Ghirotto et al., 2016), raciocinamos que os resíduos ou regiões
de UMOD que são necessários para a montagem de filamentos devem mostrar menos variação genética em
indivíduos saudáveis. Aqui, descobrimos que tanto o segmento do ligante quanto os resíduos importantes para a
criação de IUMAe euBsão empobrecidos em variantes genéticas, em relação ao resto do módulo ZP (Figura 2 -
suplemento de figura 2;Arquivo suplementar 1A).
A estrutura relatada anteriormente do fragmento pró-UMOD rEGF-ZP-CTP, que cristalizou como
um homodímero no qual apenas os subdomínios ZPN interagem (Bokhove e outros, 2016), fornece a
comparação mais próxima para a transição de pró-UMOD (CTP intacto) para UMOD maduro no
filamento.Figura 3mostra as principais diferenças conformacionais entre rEGF-ZP-CTP e o módulo ZP
no filamento maduro. A diferença mais proeminente é a separação de ZPN e ZPC no filamento
maduro, onde o indivíduo Cumaátomos (por exemplo, resíduo ZPN S364) mudam sua posição relativa
em até 95 Å (Figura 3A). Além disso, a formação do segmento de ligação de 103 Å no UMOD maduro
envolve i) a excisão da fitabUMAda ZPC, que se torna a cadeia de ligação Lb3no módulo ZP maduro, e ii)
o desenrolar e extensão douma-segmento helicoidal conectando ZPN e ZPC em pró-UMOD que forma
cadeias de ligação Lb1e eub2no módulo ZP maduro (Figura 3B;Figura 3 - suplemento de figura 1). As
dobras gerais dos subdomínios ZPN e ZPC, no entanto, permanecem as mesmas (com

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Figura 2.intermolecularb-a complementação de folha nos subdomínios ZP resulta em extensas interações entre subunidades vizinhas no filamento UMOD. (A)
Representação em desenho animado do módulo ZP da subunidade n (azul) em complexo com o subdomínio ZPN+1(ameixa) e o subdomínio ZPC-1(ouro) como
representações de superfície. O comprimento total da estrutura polipeptídica do ligante estendido de 28 resíduos entre ZPN e ZPC (representação em bastão) é de
aproximadamente 103 Å. ob-sites de complementação de folha CSUMA, entre as cadeias de ligação Lb1/EUb2e ZPC--1, e CSB, entre a cadeia de ligação Lb3e ZPN+1, bem
como as interfaces entre os subdomínios ZPN e ZPC-1(interface euUMA) e ZPN+1e ZPC (interface IB) são indicados. (B)Modelo de topologia indicando elementos de
estrutura secundária de filamentos UMOD maduros com base na estrutura crio-EM resolvida. (C)Local de complementação A (CSUMA): as cadeias de ligação Lb1e eub
2complementam a dobra incompleta de ZPC-1interagindo com seu fiobFebUMA', respectivamente. (D)Local de complementação B (CSB): a cadeia de ligação Lb3
complementando a dobra de ZPN+1pela interação com seu fiobG.(E)Interface A (euUMA) entre ZPNn(azul) e ZPC--1(ouro) mostrando extensas interações hidrofóbicas
intermoleculares entre os subdomínios. Os resíduos que formam a interface são mostrados como bastões e rotulados com os números de resíduos
correspondentes (mesmo código de cores de A). (F)Interface B (euB) entre ZPC--1(ouro), ZPN+1(ameixa) e o peptídeo ligante (azul) é estabilizado por interações
eletrostáticas e hidrofóbicas. Os loops dos subdomínios ZP se encontram como um acoplador com o linker que se estende.
A versão online deste artigo inclui o(s) seguinte(s) suplemento(s) de figura para a figura 2:
Suplemento de figura 1.As interfaces do módulo UMOD ZP são estabilizadas por empacotamento hidrofóbico.
Suplemento de figura 2.resíduos de variância zero gnomaAD da região ligante de fibra UMOD madura.

CumaValores de RMSD de 2,0 e 1,2 Å, respectivamente). Notavelmente, cadeia de ligação Lb2ocupa a


mesma posição na ZPC--1Enquanto ob-segmento de fita (559--605) do CTP em rEGF-ZP-CTP. No
filamento maduro, os resíduos que constituem a héliceumaEF de rEGF-ZP-CTP são estendidos e os
resíduos aromáticos envolvidos sofrem um rearranjo que permite a ligação de Lb2(Figura 3 -
suplemento de figura 2). Além disso, a inserção da fita ligante Lb1em ZPC-1só se torna possível após a
excisão de sua vertentebUMA, que bloqueia Lb1ligação em rEGF-ZP-CTP (Figura 3C-E). No geral, o bolso
de encadernação para o CTPb-cadeia em ZPC de rEGF-ZP-CTP é mais curta do que acomodando Lb1e
eub2no subdomínio ZPC maduro, causando uma torção no peptídeo CTP ao longo do subdomínio ZPC
(Figura 3E). A diferença observada na comparação dos domínios da ZPN é menos dramática; aqui, a
mesma superfície complementada pela vertente rEGF-ZP-CTPbGda ZPN oposta na estrutura cristalina,
o homodímero é preenchido no filamento pelo Lb3fita da subunidade n--1 (Figura 3F,G).
A estrutura cryo-EM do núcleo do filamento UMOD levanta a intrigante questão de como os filamentos
UMOD se montam a partir de subunidades pró-UMOD ligadas à superfície da célula.Figura 4mostra o

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Figura 3.Comparação da estrutura do módulo ZP no filamento nativo com a estrutura cristalina do rEGF-ZP-CTP. (A)Sobreposição da estrutura do módulo ZP no
homodímero rEGF-ZP-CTP (cinza, PDB: 4WRN) com a estrutura crio-EM resolvida do módulo ZP maduro no filamento (azul). Ambas as estruturas foram alinhadas
através dos subdomínios ZPC. No filamento, o subdomínio ZPN está afastado do subdomínio ZPC da mesma subunidade em ~60 Å. (B)Rearranjo de elementos de
estrutura secundária em ZPN e ZPC formando o ligante estendido na polimerização UMOD em comparação com rEGF-ZP-CTP. O modelo cryo-EM do núcleo UMOD
maduro é mostrado em azul e a estrutura de raios X de rEGF-ZP-CTP (PDB: 4WRN) em cinza. O CTP (ausente no filamento maduro) está destacado em vermelho.
Deixou ouma-segmento helicoidal no terminal C de ZPN em pró-UMOD forma as cadeias de ligação Lb1
e eub2no filamento maduro. Direita: O N-terminal ZPCb-fio (bUMA) em pró-UMOD forma a fita Lb3no ligante estendido do filamento maduro. O CTP (vermelho),
fornecendo o último ZPCb-fio (bG) em pró-UMOD. O local de clivagem da hepsina no pró-UMOD está circulado. (C)Representação da superfície do subdomínio ZPC
(ouro) com as duas fitas complementares Lb1e eub2da subunidade seguinte. Resíduos rotulados indicam o início e o fim de Lb1-2. (D)Superposição do pró-peptídeo
C-terminal formando a fita pró-UMOD ZPCbG(vermelho) com as cadeias de ligação Lb1e eub2(azul) que ocupam o mesmo sulco hidrofóbico no polímero ZPC.
Hidrofóbico semelhante ou idênticob-as cadeias laterais da fita estão ligadas aos bolsos hidrofóbicos das cadeias laterais em ZPC (cinza) em ambas as estruturas. (E)
Ranhura de encadernação do pró-UMOD CTP (vermelho, bastões) na ZPC (superfície cinza). A fita ZPC N-terminalbUMA
(contorno amarelo) limita o tamanho do bolso de encadernação. obUMAfita é invertida após a mudança conformacional de UMOD pró-UMOD maduro
(então Lb3). (F)Estrutura do homodímero ZPN cristalizado de pró-UMOD (PDB: 4WRN). A fita N-terminalbUMAde cada subdomínio ZPN interage com o C-
terminalbGfita da ZPN oposta. (G)No polímero UMOD, ZPNbGinterage com a cadeia de ligação Lb3(azul), em vez disso, que ocupa a mesma posição que
o fiobUMA(preto) da subunidade oposta no dímero.
A versão online deste artigo inclui o(s) seguinte(s) suplemento(s) de figura para a figura 3:
Suplemento de figura 1.Diagramas regulares de topologia de estrutura secundária para os módulos ZP.
Suplemento de figura 2.Rearranjo de resíduos aromáticos na interface IB.

modelo concebível mais simples de montagem de filamento UMOD. A montagem requer a liberação de
monômeros UMOD maduros da membrana por remoção proteolítica do CTP ancorado a GPI pela hepsina,
tornando assim um módulo ZPC competente para ligar o Lb3cadeia de outro UMOD. A montagem começa
pela ligação de um módulo pró-UMOD ZPN aos fios Lb1e eub2em um pró-UMOD vizinho (etapa 1). A
clivagem da hepsina pode então ocorrer no filamento em alongamento (etapa 2). Cada etapa subsequente
de incorporação de UMOD (etapas 3, 4, etc.) seria então caracterizada pela intercalação do ZPN

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Figura 4.Modelo proposto de polimerização UMOD após clivagem hepsina de pró-UMOD. Os braços UMOD com os domínios EGF I-III, D8C e EGF IV são mostrados
transparentes para indicar suas posições em relação aos domínios ZP. (Etapa 1) Ligação de ZPN de um monômero pró-UMOD (azul) ao Lb3segmento de um vizinho
estendido pro-UMOD (ouro) pode iniciar a montagem. (Etapa 2) No dímero pró-UMOD assimétrico resultante, a hepsina (tesoura vermelha) cliva o CTP ancorado
em GPI (vermelho) do subdomínio ZPC. O subdomínio ZPC liberado então se liga a Lb1e eub2do pró-UMOD entrante. (Etapa 3) ZPN de um terceiro pró-UMOD
(ameixa) se liga ao Lb3segmento entre os dois segmentos ZPC do filamento em crescimento. (Etapa 4) Novamente, a hepsina cliva o CTP do pró-UMOD no qual o
ZPC é complexado com o ZPN. As etapas 3 e 4 são repetidas consistentemente até que a montagem do filamento seja concluída.

A versão online deste artigo inclui o(s) seguinte(s) suplemento(s) de figura para a figura 4:
Suplemento de figura 1.Análise MALDI-MS/MS de peptídeos trípticos de filamentos UMOD humanos maduros. Suplemento de
figura 2.Alinhamento da sequência de aminoácidos de proteínas humanas ancoradas em GPI contendo ZP.

de um pró-UMOD de entrada entre os dois módulos ZPC do filamento, levando a uma ligação mais estável do ZPN
de entrada em comparação com a etapa 1. Como etapa final de clivagem para liberar os filamentos montados da
membrana, uma hidrolase ainda não identificada pode atuar sobre UMOD, pois pequenas quantidades de CTP
ainda podem ser detectadas em espectros de MS/MS após a digestão com tripsina de filamentos maduros (Figura 4
- suplemento de figura 1). Este modelo de montagem UMOD é análogo ao mecanismo de montagem recentemente
proposto de pili filamentoso tipo V, no qual a montagem está ligada à liberação proteolítica de subunidades de
pilus da membrana bacteriana externa.Shibata e outros, 2020). Durante a preparação deste manuscrito, foi
publicado um artigo de pré-impressão relacionado sobre a estrutura cryo-EM do núcleo de filamento UMOD (
Stsiapanava et al., 2020). No referido estudo, foi proposto um modelo alternativo de montagem UMOD, com base
na suposição de que a montagem começa a partir de homodímeros pró-UMOD ligados à membrana.

o acorrentadob-O mecanismo de complementação de folha observado no núcleo do filamento UMOD também


pode ser válido para outras proteínas contendo módulos ZP ancorados à membrana e em formação de filamentos.
Por exemplo, outra proteína ZP humana, alfa-tectorina (TECTA), forma filamentos criando a base para a matriz
extracelular apical (ECM) nas células de suporte coclear e compartilha características importantes com UMOD: uma
região de ligação altamente semelhante e um C conservado, C local de clivagem da protease terminal (Figura 4 -
suplemento de figura 2). Recentemente, Kim e seus colegas propuseram o 'modelo de impressão 3D' para a
organização de ECM mediada por TECTA conectada à superfície (Kim e outros, 2019), o que está de acordo com
nosso modelo proposto de polimerização UMOD na superfície das células TAL no túbulo renal. Assim, a estrutura
crio-EM do núcleo do filamento UMOD pode ser representativa para a estrutura do núcleo de múltiplas proteínas
com um módulo ZP C-terminal que se torna funcional após a polimerização.

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materiais e métodos
Purificação de UMOD humano
Fibras UMOD humanas foram purificadas de um doador saudável conforme descrito emWeiss e outros, 2020.
Resumidamente, a urina foi purificada usando um filtro de terra de diatomáceas, concentrada e dialisada durante a noite
contra 0,5 mM EDTA-NaOH, pH 8,2 (limite de 300 kDa, laboratórios Spectrum). As alíquotas foram congeladas rapidamente
em nitrogênio líquido e armazenadas a -20˚C até uso posterior. Apenas a segunda micção da manhã foi utilizada para coleta
de urina. As concentrações de proteína foram determinadas conforme descrito anteriormente (Weiss e outros, 2020).

Coleta de dados Cryo-EM


Amostras de proteína (3,5mL de 2,5mM UMOD) foram aplicados a grades de carbono lacey descarregadas por
brilho com um revestimento de carbono ultrafino (Electron Microscopy Sciences) automaticamente apagado do
lado de trás da grade por 13,5 s (100% de umidade, 9˚C) e mergulho congelado em etano líquido -propano usando
um Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific). As micrografias foram adquiridas em um microscópio Titan Krios
(Thermo Fisher Scientific) operado a 300 kV com um detector direto de elétrons Gatan K2 Summit usando uma
largura de fenda de 20 eV em um filtro de energia GIF-Quantum. Um total de 4.679 e 4.864 filmes foram gravados
em duas coletas de dados de duas grades separadas e posteriormente mescladas. As imagens foram registradas
com o software EPU (Thermo Fisher Scientific) com ampliação nominal de 130.000 x no modo de contagem com um
tamanho de pixel calibrado de 1,084 Å. Os intervalos alvo de desfocagem foram1.2mm para3.3mm e 0,8mm para
2.0mm para a primeira e segunda coleta de dados, respectivamente. Cada micrografia foi fracionada em dose para
40 quadros sob uma taxa de dose de 7,5 e-/ Å / s, com tempo de exposição de 6 s, resultando em uma dose total de
aproximadamente 45 e-/ UMA2.

Processamento de imagem Cryo-EM


Os filmes coletados foram corrigidos com MotionCor2 (Zheng et al., 2017). Os parâmetros CTF das micrografias
foram estimados usando Gctf 1,06 (Zhang, 2016). As etapas seguintes de processamento de imagem foram feitas
no cryoSPARC v2.15 (Punjani e outros, 2017) e com os scripts python escritos internamente para administração e
interpretação de dados (https://github.com/dzyla/umod_processing_scripts). Aproximadamente 600 partículas
foram selecionadas manualmente de uma seleção aleatória de micrografias e usadas para treinar um modelo de
seleção de rede neural convolucional para TOPAZ (Bepler e outros, 2019). Um total de 1,3 milhão de partículas
foram coletadas via TOPAZ de todas as micrografias. Para as primeiras etapas do processamento, as partículas
foram extraídas com tamanho de caixa de 320 px e agrupadas em 2,71 Å/px. Após várias rodadas de classificação
2D, 723.000 partículas, correspondentes a classes claras e bem resolvidas, foram selecionadas para processamento
posterior. Trêsab initiomodelos iniciais foram gerados e um único melhor foi usado como referência 3D para o
refinamento 3D heterogêneo. O refinamento heterogêneo 3D com 10 classes resultou em várias médias de classe
3D distintas, mostrando a flexibilidade intrínseca do espécime. A média de classe 3D mais populosa de 145.000
partículas foi escolhida para refinamentos adicionais. As partículas da classe selecionada foram então reextraídas
no tamanho de pixel original e submetidas a um refinamento 3D homogêneo. Uma máscara foi criada em UCSF
Chimera (Pettersen e outros, 2004) para os segmentos centrais da reconstrução 3D e usado para várias rodadas de
refinamento local usando uma estratégia de refinamento não uniforme. Este pipeline produziu reconstrução 3D de
alta resolução da unidade assimétrica central (AU; ZPN, ZPC e o linker inserido) em 3,5 Å. Fluxos de trabalho
detalhados são mostrados emFigura 1 - suplemento de figura 1,Arquivo suplementar 1B,C.

Para obter um mapa focado em várias unidades repetidas, uma abordagem alternativa foi aplicada usando cis-
TEM para refinamento e classificação: todas as micrografias foram selecionadas manualmente, resultando em um
total de 8543 filmes que também foram corrigidos por movimento usando MotionCor2, valores CFT estimados
usando Gctf e 485.000 partículas foram selecionadas manualmente como hélices de uma seleção aleatória de 3.600
micrografias no RELION v3.0.8 (Zivanov e outros, 2018) e extraídos no tamanho do pixel original. A pilha de
partículas foi então submetida à classificação 2D em cisTEM (Grant e outros, 2018). 402.000 boas partículas foram
selecionadas e várias rodadas de classificação focada foram realizadas com a melhor média importada da classe
cryoSPARC 3D como referência (descrita acima) e uma máscara esférica (raio de 120 Å). Duas das médias de classe
3D resultantes foram mescladas e outra rodada de classificação 3D com a mesma máscara esférica foi realizada,
resultando em um mapa resolvido para 4,7 Å de 330.000 partículas. O mapa foi filtrado para 4,7 Å e aprimorado
usando as configurações padrão do cisTEM (fator B pré-corte

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90,0, corte de resolução 4,7 Å). Os parâmetros helicoidais relatados foram estimados no espaço real a partir do
mapa cisTEM usandorelion_helix_toolbox (Ele e Scheres, 2017) com faixas de pesquisa para ascensão (60--67 Å) e
torção (175–185˚). Fluxos de trabalho esquemáticos e detalhes são mostrados emFigura 1 - suplemento de figura 1,
Arquivo suplementar 1B,D. Para fins comparativos, as curvas FSC do mapa cisTEM e os mapas de resolução local
foram calculados no cryoSPARC para todos os semi-mapas gerados.

Construção de modelo e refinamento de estrutura


Os subdomínios ZP individuais da estrutura cristalina UMOD (PDB: 4WRN;Bokhove e outros, 2016) foram
usados como modelos iniciais (ZPN: aa 428–528, ZPC: aa 541–710, de acordo com a numeração 4WRN).
Primeiro, os domínios individuais foram ajustados de corpo rígido ao mapa obtido em cryoSPARC usando
UCSF Chimera, seguido de construção manual em Coot 0.9 e ISOLDE (Croll, 2018;Emsley e outros, 2010). A
unidade assimétrica (AU, definida como um único ZPN e ZPC e o linker inserido) de UMOD foi refinada
usandophenix.real_space_refineprograma (Adams e outros, 2010) com as configurações padrão, que
aplicam restrições de Ramachandran. Para reduzir os conflitos entre as interfaces das subunidades, o
modelo AU foi usado para criar um modelo com quatro subdomínios ZP consecutivos e foi refinado contra o
mapa cis-TEM. A estrutura do módulo UMOD ZP foi então aplicada ao refinamento RosettaCM com a
simetria derivada do mapa cisTEM (Song e outros, 2013), com a estratégia 'auto' aplicada no refinamento. O
módulo ZPN/ZPC central na estrutura refinada foi ajustado manualmente para o mapa cryoSPARC de alta
resolução no COOT e foi subsequentemente usado para gerar o modelo UMOD final. Esse modelo
atualizado foi submetido à próxima rodada de refinamento do RosettaCM, com uma restrição de modelo
RMS mais alta aplicada (rms = 0,2). No geral, três rodadas de manual interativo e refinamentos RosettaCM
foram realizados e o parâmetro de geometria da estrutura do modelo AU final foi melhorado usando
phenix.real_space_refinecom restrições de referência rígidas (sigma = 0,025). Os resíduos de cadeia lateral
462-473 no modelo AU não puderam ser construídos com confiança e foram omitidos do modelo final.

Para o modelo final do filamento UMOD, uma estrutura foi gerada com 3 cópias do modelo AU final
aplicando a simetria derivada do mapa cisTEM. A subunidade central ZPN/ZPC da parte central das
estruturas foi submetida a um refinamento de espaço real com restrições de referência rígidas (sigma =
0,025) usando o mapa cryoSPARC. A subunidade central ZPN/ZPC no modelo refinado foi então usada para
gerar a nova estrutura de filamento UMOD. Os confrontos na interface da subunidade foram reduzidos
ainda mais ao realizar outra rodada dephenix.real_space_refinecom restrições de referência mais rígidas
(sigma = 0,02).
As validações do modelo foram realizadas usando a ferramenta Comprehensive Validation no PHENIX. As
estatísticas do modelo final foram geradas usando a ferramenta MolProbity via PHENIX (Chen e outros, 2010). As
figuras da estrutura foram preparadas com PyMol v2.4 (The PyMOL Molecular Graphics System, versão 2.4
Schrödinger, LLC) e as figuras do mapa EM foram geradas com UCSF ChimeraX 0.93 (Goddard e outros, 2018).

Análise de flexibilidade 3D do modelo Cryo-EM


As reconstruções bem resolvidas das etapas de classificação 3D realizadas independentemente em cryo-
SPARC e cisTEM foram de corpo rígido ajustadas com subdomínios ZP derivados do modelo final. Cada
subdomínio foi primeiro colocado na posição correta e então ajustado peloAjustar no mapaferramenta em
Chimera 1.13.1. No total, 6 subdomínios ZP foram encaixados em nove mapas onde o potencial de Coulomb
do subdomínio foi bem definido (quatro classes do cryoSPARC e cinco classes do cisTEM) e salvos com
posições fixas entre si como um 'filamento'. Em seguida, usando o PyMOLalinharcomando, todas as nove
estruturas de filamentos foram alinhadas ao subdomínio ZPN central. Em Quimera, odefinir eixocomando
foi usado para dar a cada subunidade um centróide e um eixo central. Para subunidades nas posições ZPC-1
e ZPC, o ângulo máximo foi determinado com oângulocomando.

Análise de variabilidade 3D de UMOD


A análise de variabilidade 3D (3DVA) foi realizada em cryoSPARC usando ~ 723.000 partículas extraídas no tamanho
de pixel de 4,34 Å, 10 modos e resolução de filtro de 9,2 Å. O trabalho de exibição 3DVA foi executado no modo de
saída simples com 20 quadros intermediários. De 10 componentes gerados, os dois primeiros exibiram o mesmo
movimento de guinada/pitch (Figura 1—vídeo 2), o terceiro mostrava um artefato no

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borda da caixa, e a quarta mostrava o alongamento ao longo do eixo do filamento (Figura 1—vídeo 2). Os
componentes superiores mostraram vários movimentos nos braços (não mostrados).

Avaliando a variação genética usando o gnomAD


Banco de dados de agregação de genoma (GnomAD) v2.1.1 (https://gnomad.broadinstitute.org/) está alinhado com
a construção do genoma GRCh37 e foi lançado em março de 2019. O conjunto de dados compreende 125.748
exomas e 15.708 genomas sequenciados como parte de vários estudos genéticos de população e específicos de
doenças, totalizando 141.456 indivíduos não relacionados de oito populações principais (Karczewski et al., 2020).
Resultados paraUMODforam filtrados para variantes missense e verificados quanto à consistência com o UMOD
transcrição ENST00000302509.8. As variantes sem sentido correspondentes a uma transcrição não canônica foram
removidas manualmente.
As variantes UMOD foram analisadas usando um script Python interno (https://github.com/dzyla/
umod_processing_scripts) e plotados na estrutura. Resíduos sem mutações foram fixados em 1,0 e para todas as
variantes diferentes de zero os valores foram normalizados entre 0 e 1, com base na matriz PAM250. A estrutura foi
visualizada por coloração de espectro em PyMOL 2.4. ParaArquivo suplementar 1A, todos os resíduos do ligante são
mostrados e as interfaces são definidas por átomos que estão dentro de 8 Å um do outro, conforme definido pelo
COCOMAPS (Vangone e outros, 2011).

Reconhecimentos
Os autores agradecem a M Peterek pelo suporte técnico durante a coleta de dados EM e a plataforma
ScopeM para acesso a instrumentos na ETH Zurich. Agradecemos também ao Functional Genomics
Center Zurich, especificamente P Hunziker, pela análise MS/MS. Gostaríamos de agradecer a R
Zdanowicz pelo suporte inicial para triagem de grades cryo-EM. RG foi financiado pela Swiss National
Science Foundation (310030B_176403/1 e 31003A_156304) e financiamento básico pela ETH Zurich. O
MP foi financiado pela Swiss National Science Foundation (31003A_179255), pelo European Research
Council (679209) e pela fundação NOMIS. OD e AK são apoiados pelo programa Swiss National Centre
of Competence in Research Kidney Control of Homeostasis (NCCR Kidney.CH) e pela Swiss National
Science Foundation (310030_189044).

Informações adicionais
Financiamento

Financiador Número de referência da concessão Autor


Schweizerischer Nationalfonds 310030B_176403/1 Rudi Glockshuber
zur Förderung der Wis-
senschaftlichen Forschung

Schweizerischer Nationalfonds 31003A_156304 Rudi Glockshuber


zur Förderung der Wis-
senschaftlichen Forschung

Schweizerischer Nationalfonds 31003A_179255 Martin Pilhofer


zur Förderung der Wis-
senschaftlichen Forschung

H2020 Conselho Europeu de 679209 Martin Pilhofer


Pesquisa

NOMIS Stiftung Martin Pilhofer

Schweizerischer Nationalfonds 310030_189044 Olivier Devuyst


zur Förderung der Wis-
senschaftlichen Forschung

Centro Nacional Suíço de Olivier Devuyst


Competência em Pesquisa do
Controle Renal da Homeostase

Schweizerischer Nationalfonds P2ZHP3_195181 Eric Olinger


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senschaftlichen Forschung

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Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, na coleta e interpretação dos dados ou
na decisão de enviar o trabalho para publicação.

Contribuições do autor
Jessica J Stanisich, Conceptualização, Curadoria de dados, Análise formal, Validação, Investigação,
Visualização, Metodologia, Redação - rascunho original, Redação - revisão e edição; Dawid S Zyla,
Conceituação, Curadoria de dados, Software, Análise formal, Validação, Investigação, Visualização,
Metodologia, Redação - rascunho original, Redação - revisão e edição; Pavel Afanasyev, Conceituação,
Curadoria de dados, Software, Análise formal, Supervisão, Validação, Investigação, Visualização,
Metodologia, Administração de projetos; Jingwei Xu, Curadoria de Dados, Validação, Metodologia; Anne
Kipp, Conceptualização, Curadoria de dados, Análise formal, Validação, Investigação, Visualização; Eric
Olinger, Conceitualização, Curadoria de dados, Análise formal, Investigação; Olivier Devuyst, Martin Pilhofer,
Conceitualização, Recursos, Supervisão, Captação de financiamento, Redação - rascunho original,
Administração do projeto, Redação - revisão e edição; Daniel Boehringer, Conceituação, Recursos, Análise
formal, Supervisão, Validação, Investigação, Visualização, Metodologia, Redação - rascunho original,
Administração do projeto, Redação - revisão e edição; Rudi Glockshuber, Conceituação, Recursos,
Supervisão, Aquisição de financiamento, Investigação, Redação - rascunho original, Administração do
projeto, Redação - revisão e edição

Autor ORCIDs
Jessica J Stanisich https://orcid.org/0000-0002-2702-8092
Dawid S Zyla https://orcid.org/0000-0001-8471-469X
Pavel Afanasyev https://orcid.org/0000-0002-6353-6895
Eric Olinger http://orcid.org/0000-0003-1178-7980
Olivier Devuyst http://orcid.org/0000-0003-3744-4767
Martin Pilhofer http://orcid.org/0000-0002-3649-3340
Rudi Glockshuber https://orcid.org/0000-0003-3320-3843

Ética
Sujeitos humanos: O uso de amostras de urina humana para purificação UMOD foi aprovado pelo Comitê de Ética
da Escola de Medicina da UCLouvain em Bruxelas, Bélgica (Projeto EUNEFRON, 2011/ 04 de maio/184). Todos os
indivíduos deram consentimento informado por escrito. O "Formulário de consentimento para publicação no eLife"
preenchido foi arquivado em nome do doador.

Carta de decisão e resposta do autor


Carta de decisãohttps://doi.org/10.7554/eLife.60265.sa1
Resposta do autorhttps://doi.org/10.7554/eLife.60265.sa2

Arquivos adicionais
arquivos suplementares
. Arquivo suplementar 1. Stanisich_et_al_2020_supplementary_file_1.pdf. (A) Ligante do módulo ZP e posições de
aminoácidos de interface com variantes conhecidas (gnomAD). (B) Coleta de dados Cryo-EM e estatísticas de
refinamento do modelo. (C) Fluxograma para processamento cryoSPARC cryo-EM. (D) Fluxograma para
processamento crio-EM cis-TEM.

. Formulário de relatório transparente

Disponibilidade de dados

As estruturas e mapas apresentados neste artigo foram depositados no Banco de Dados de Proteínas (PDB)
e na Base de Dados de Microscopia Eletrônica (EMDB) com os seguintes códigos de acesso: 3,5 Å cryoSPARC
map EMD-11388, o UMOD AU modelo PDB ID: 6ZS5, alongado modelo de filamento UMOD derivado do
mapa cryoSPARC PDB ID: 6ZYA, mapa cisTEM de 4,7 Å EMD-11471.

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Os seguintes conjuntos de dados foram gerados:

banco de dados e
Autor(es) Ano Título do conjunto de dados URL do conjunto de dados identificador

Stanisich JJ, Zyla 2020 Estrutura crio-EM de 3,5 Å do mapa do núcleo http://www.ebi.ac.uk/ Microscópio eletrônico
DS, Afanasyev P, Xu J, do filamento de uromodulina humana pdbe/entrada/emdb/EMD- Banco de Dados, EMD-
Pilhofer M, Boehringer 11388 11388
D, Glockshu-
ber R
Stanisich JJ, Zyla 2020 Estrutura crio-EM de 3,5 Å do núcleo de http://www.rcsb.org/ Dados de Proteína RCSB
DS, Afanasyev P, Xu J, filamento de uromodulina humana estrutura/6ZS5 Banco, 6ZS5
Pilhofer M, Boehringer
D, Glockshu-
ber R
Stanisich JJ, Zyla 2020 Núcleo de filamento de uromodulina http://www.rcsb.org/ Dados de Proteína RCSB
DS, Afanasyev P, Xu J, humana estendido com resolução de 3,5 Å estrutura/6ZYA Banco, 6ZYA
Pilhofer M, Boehringer
D, Glockshu-
ber R
Stanisich JJ, Zyla 2020 Mapa crio-EM estendido do núcleo de http://www.ebi.ac.uk/ Microscópio eletrônico
DS, Afanasyev P, Xu J, filamento de uromodulina humana nativa pdbe/entrada/emdb/EMD- Banco de Dados, EMD-
Pilhofer M, Boehringer em 4,7 Å 11471 11471
D, Glockshu-
ber R

O seguinte conjunto de dados publicado anteriormente foi usado:

banco de dados e
Autor(es) Ano Título do conjunto de dados URL do conjunto de dados identificador

Karczewski KJ 2020 Banco de dados de agregação de https:// Agregação do genoma


genoma (GnomAD) gnomad.broadinstitute.org/Banco de dados (GnomAD)
v2.1.1, GRCh37

Referências
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