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BREVE RELATÓRIO
ResumoA glicoproteína uromodulina (UMOD) é a proteína mais abundante na urina humana e forma
homopolímeros filamentosos que encapsulam e agregam uropatógenos, promovendo a eliminação do
patógeno pela excreção urinária. Apesar de seu papel crítico na resposta imune inata contra infecções do
trato urinário, a base estrutural e o mecanismo de polimerização do UMOD permanecem desconhecidos.
Aqui, apresentamos a estrutura cryo-EM do núcleo de filamento UMOD com resolução de 3,5 Å, composta
pelo módulo bipartido da zona pelúcida (ZP) em um arranjo helicoidal com elevação de ~ 65 Å e torção de
~ 180˚. Os subdomínios ZPN e ZPC do tipo imunoglobulina de cada monômero são separados por um
ligante longo que interage com o ZPC anterior e subdomínios ZPN seguintes porb-complementação de
* Para correspondência: folha. A arquitetura única do filamento sugere um mecanismo de montagem no qual a incorporação da
rudi@mol.biol.ethz.ch subunidade pode ser sincronizada com a clivagem proteolítica do pró-peptídeo C-terminal que ancora os
†Estes autores contribuíram
precursores UMOD incompetentes para montagem à membrana.
igualmente para este trabalho
Interesses competitivos:Os
A proteína mais abundante na urina humana, a glicoproteína uromodulina (UMOD; também proteína
autores declaram que não
Tamm-Horsfall, THP), é conservada em todos os mamíferos e produzida principalmente nas células
existem interesses concorrentes.
epiteliais que revestem o ramo ascendente espesso (TAL) da alça de Henle no rim. Lá, o UMOD é
Financiamento:Veja a página 10 importante para manter a camada impermeável à água, regular o transporte de sal e a concentração
Recebido:22 de junho de 2020 urinária (Devuyst et al., 2017). Mais adiante no trato urinário, o UMOD demonstrou atuar como um
Aceitaram:19 de agosto de 2020 antagonista de adesão solúvel contraE. coli (UPEC) (Pak et al., 2001;Weiss e outros, 2020).
Publicados:20 de agosto de 2020 Os precursores de UMOD trafegam através da via secretora na forma pró-UMOD incompetente de
montagem, onde se tornam glicosilados em oito locais potenciais de N-glicosilação e, eventualmente,
Editor de revisão:Sjors HW
ligados à superfície da membrana apical por meio de seu pró-peptídeo C-terminal ancorado em
Scheres, Laboratório MRC de
glicosilfosfatidilinositol (GPI) ( CTP) (Rindler e outros, 1990;van Rooijen e outros, 1999;Weiss e outros, 2020).
Biologia Molecular, Reino
Unido A protease hepsina então cliva o CTP e o UMOD se reúne em filamentos homopoliméricos com um
comprimento médio de 2,5mm na urina (Brunati et al., 2015;Porter e Tamm, 1955).
Copyright Stanisich e outros.
Recentemente, a arquitetura geral dos filamentos UMOD intrinsecamente flexíveis foi descoberta por
Este artigo é distribuído nos
meio de tomografia crioeletrônica (Weiss e outros, 2020). Os resultados, juntamente com dados anteriores,
termos doLicença de Atribuição
Creative Commons,que permite
mostraram que o UMOD se monta em um polímero linear em forma de zigue-zague, onde o núcleo do
uso irrestrito e redistribuição filamento é formado por seu módulo bipartido de zona pelúcida (ZP) com os subdomínios ZPN e ZPC. Os
desde que o autor original e a domínios N-terminais, tipo fator de crescimento epidérmico (EGF) I--III e o seguinte domínio D8C rico em
fonte sejam creditados. cisteína, projetam-se como braços alternados de lados opostos do filamento, e o domínio EGF IV conecta os
braços ao núcleo do filamento (Figura 1A;Jovine e outros, 2002;Schaeffer e outros, 2009;Weiss e outros,
Figura 1.Estrutura Cryo-EM do núcleo de filamento UMOD humano. (A)Arquitetura de domínio do monômero pró-UMOD ancorado à membrana, composto por 4 domínios
semelhantes a EGF (I-IV, cinza), o domínio D8C rico em cisteína (verde) e o módulo ZP bipartido (ZPN e ZPC, azul). A dobra do subdomínio ZPC C-terminal é estendida pelo pró-
peptídeo C-terminal ancorado a GPI (CTP, vermelho) que é clivado pela hepsina como um pré-requisito da polimerização UMOD. O local de clivagem da hepsina (ligação
peptídica 587--588) é indicado por uma tesoura. O segmento UMOD previamente cristalizado rEGF-ZP-CTP é Figura 1 continua na próxima página
Figura 1 continuação
também indicado. As posições dos oito sítios de N-glicosilação verificados em filamentos UMOD maduros são indicadas acima dos respectivos domínios como hexágonos
(hexágonos preenchidos: N-glicano do tipo complexo; hexágono aberto: N-glicano do tipo alto teor de manose). Numeração de aminoácidos de acordo com pré-pro-UMOD
incluindo sequência de sinal. (B)Micrografia crioeletrônica representativa mostrando as duas principais visualizações dos filamentos UMOD: vista frontal (1) e vista lateral (2).
Barra de escala: 50 nm. As representações esquemáticas da organização do subdomínio dessas duas visualizações são mostradas à direita. (C)Mapa de potencial de Coulomb
segmentado do módulo ZP maduro no filamento, mostrado sobre a reconstrução filtrada passa-baixa (com resolução de ~ 9 Å, cinza). O vinculador estendido conectando ZPN e
ZPC do módulo ZP azul complementa as dobras de ZPN do seguinte e ZPC dos módulos ZP anteriores (ZPN+1e ZPC-1; ameixa e ouro, respectivamente) porb-complementação de
folha. As características do mapa mostram uma elevação helicoidal de 65 Å e uma torção de 180˚. As localizações dos domínios EGF IV e D8C dos braços do filamento também
são indicadas. As características do mapa N-glicano resolvidas (cinza escuro) são indicadas com setas. (D)Vista frontal e lateral do modelo refinado do núcleo do filamento
dentro do mapa crio-EM de alta resolução obtido. Unidades de monossacarídeos resolvidas de N-glicanos são mostradas como modelos de bastão cinza. (E)Visão detalhada das
características do mapa em regiões selecionadas em ZPN (azul) e ZPC (ouro), ilustrando a qualidade do modelo cryo-EM final. (F)Mapa de potencial de Coulomb contíguo (malha)
em torno do segmento de linker estendido que abriga ob-fios Lb1--Lb3. eub1e eub2complementam a dobra ZPC da subunidade UMOD anterior, e Lb3complementa ZPN da
seguinte subunidade UMOD. (G)Mapa de potencial de Coulomb em torno do pentassacarídeo central do tipo complexo N-glicano ligado a N396 em ZPN. Quadrados azuis: N-
acetilglucosamina; círculos verdes: manose. A versão online deste artigo inclui o(s) seguinte(s) suplemento(s) de vídeo e figura para a figura 1:
2020). Os filamentos UMOD encapsulam uropatogênicos pilosos por meio de ligação multivalente por meio de seus
N-glicanos às lectinas nas pontas dos pili bacterianos. Este mecanismo não só impede a adesão do patógeno aos
glicanos alvo nas células epiteliais do hospedeiro, mas também facilita a agregação do patógeno e a eliminação
pela excreção de urina.Weiss e outros, 2020).
Apesar dessas percepções, a organização estrutural exata dos filamentos UMOD permaneceu desconhecida. Nós nos
propusemos a resolver a estrutura do filamento UMOD por crio-EM de partícula única. Filamentos UMOD nativos isolados
de um indivíduo saudável apareceram na grade em duas visualizações principais: uma visualização 'frontal' semelhante a
uma espinha de peixe com braços salientes alternadamente e uma visualização 'lateral' em zigue-zague (Figura 1B).
Variações conformacionais marcadas tanto no núcleo do filamento quanto nos ângulos entre os braços periféricos e o
núcleo eram visíveis. Além disso, N-glicanos flexíveis que revestem o núcleo do filamento já podem ser vistos em médias de
classe 2D (Figura 1 - suplemento de figura 1). Essa flexibilidade intrínseca e exibição de glicano é um pré-requisito do
encapsulamento de patógenos por filamentos UMOD, no entanto, eles complicaram consideravelmente a determinação da
estrutura por crio-EM de partícula única, restringindo a análise de alta resolução ao núcleo do filamento.
Ab initioA reconstrução 3D de 723.000 partículas foi seguida por uma extensa classificação e refinamento
focado, juntamente com a estratégia de refinamento não uniforme em cryoSPARC, a fim de obter uma
reconstrução do núcleo UMOD em 3,5 Å (Figura 1—vídeo 1). Este mapa não simétrico de alta resolução foi
usado para ajustar o corpo rígido aos subdomínios UMOD ZP individuais, ZPN e ZPC, a partir da estrutura
cristalina publicada anteriormente de um fragmento pró-UMOD recombinante e incompetente de
montagem (consistindo no domínio EGF IV, módulo ZP, e CTP (denominado rEGF-ZP-CTP);Bokhove e outros,
2016; PDB: 4WRN). A resolução do mapa cryoSPARC no núcleo do filamento permitiu a construção direta do
modelo das dobras do subdomínio ZP tipo imunoglobulina (IG). A unidade assimétrica ZPN/ZPC foi então
estendida por ajuste de corpo rígido dentro de um mapa de resolução mais baixa (4,7 Å), refinado no
cisTEM, que continha mais repetições. Este ajuste mostrou uma arquitetura helicoidal do filamento com um
aumento de ~ 65 Å e torção de ~ 180˚, o que é consistente com os parâmetros obtidos pela média do
subtomograma (Weiss e outros, 2020). A partir daqui, fomos capazes de verificar uma conformação
estendida inesperada dos monômeros ZP no núcleo do filamento, em que um ligante longo de 28 resíduos
(resíduos UMOD L429--F456) entre os subdomínios ZPN e ZPC de cada monômero ZP abrangeu o ZPC do
módulo anterior (ZPC-1) e o ZPN do módulo subsequente (ZPN+1) (Figura 1C-D). A região central, incluindo o
vinculador, é bem resolvida, mostrando recursos claros do mapa da cadeia lateral (Figura 1E-F). O linker
entre ZPN e ZPC dos monômeros abrange ~103 Å e interage fortemente com os dois subdomínios ZP
intervenientes (Figura 1D--F,Figura 1 - suplemento de figura 2). Além disso,
Potenciais de Coulomb para N-glicanos proeminentes em N396 e N513 foram observados e permitiram a
visualização do pentassacarídeo e dissacarídeo central, respectivamente (Figura 1C,D,G).
A flexibilidade intrínseca das fibras UMOD pode ser observada diretamente nas micrografias coletadas
na faixa de suas curvaturas (Figura 1B). Pequenos desvios na ascensão helicoidal ao longo da cadeia e na
flexibilidade intrínseca dificultaram a classificação e o alinhamento das partículas e limitaram a resolução
das reconstruções. Para analisar essa flexibilidade, medimos os ângulos relativos entre os subdomínios após
o encaixe do corpo rígido em várias médias de classes 3D heterogêneas (Figura 1 - suplemento de figura 3).
Mudanças angulares máximas semelhantes de ~7 graus foram obtidas em ambas as interfaces únicas entre
os subdomínios ZP, indicando que ambas as interfaces dão igualmente origem à flexibilidade dos
filamentos. Adicionalmente, utilizamos a análise de variabilidade 3D do cryoSPARC (com base na análise de
componentes principais (PCA);Punjani e Frota, 2020), que mostrou um grau semelhante de flexão do
filamento (componente 1) e um alongamento do filamento ao longo do eixo z (componente 2) com base em
uma rotação relativa dos módulos ZP nas interfaces do subdomínio (Figura 1—vídeo 2).
O ligante ZP alongado estabelece um andaime intrincado e extensivamente encadeado para o acúmulo
de filamentos a partir de monômeros UMOD maduros. Reminiscente da complementação da fita doadora
em interações de subunidades de pili montadas por meio da via chaperone-usher (Waksman, 2017) ou o
mais recentemente descoberto tipo V pili (Shibata e outros, 2020), a formação do filamento UMOD envolve
umab-mecanismo de complementação de folhas que se estende por módulos ZP encadeados (Figura 2A).
Especificamente, o ligante estendido entre ZPN e ZPC em cada monômero é composto por três b-fios: Lb1,
EUb2, e eub3(resíduos 430--435, 438--441 e 446--452, respectivamente), onde Lb1e eub2da subunidade n
complementam a dobra da ZPC da subunidade n--1 (ZPC-1), e eub3estende a dobra IG de ZPN da subunidade
n+1 (ZPN+1) (Figura 2B). O sítio de complementação (CS) entre Lb1, EUb2e ZPC-1(denotado CSUMA) é formada
pela inserção antiparalela de Lb1em relação ao ZPCbFvertente, e a complementação paralela mais curta do
ZPCbUMA'fio pelo Lb2fio (Figura 2C). eub3, o mais longob-cadeia no segmento de ligação, liga-se
paralelamente ao longo do ZPN+1bGfita no sítio de complementação B (CSB) (Figura 2D).
Figura 2.intermolecularb-a complementação de folha nos subdomínios ZP resulta em extensas interações entre subunidades vizinhas no filamento UMOD. (A)
Representação em desenho animado do módulo ZP da subunidade n (azul) em complexo com o subdomínio ZPN+1(ameixa) e o subdomínio ZPC-1(ouro) como
representações de superfície. O comprimento total da estrutura polipeptídica do ligante estendido de 28 resíduos entre ZPN e ZPC (representação em bastão) é de
aproximadamente 103 Å. ob-sites de complementação de folha CSUMA, entre as cadeias de ligação Lb1/EUb2e ZPC--1, e CSB, entre a cadeia de ligação Lb3e ZPN+1, bem
como as interfaces entre os subdomínios ZPN e ZPC-1(interface euUMA) e ZPN+1e ZPC (interface IB) são indicados. (B)Modelo de topologia indicando elementos de
estrutura secundária de filamentos UMOD maduros com base na estrutura crio-EM resolvida. (C)Local de complementação A (CSUMA): as cadeias de ligação Lb1e eub
2complementam a dobra incompleta de ZPC-1interagindo com seu fiobFebUMA', respectivamente. (D)Local de complementação B (CSB): a cadeia de ligação Lb3
complementando a dobra de ZPN+1pela interação com seu fiobG.(E)Interface A (euUMA) entre ZPNn(azul) e ZPC--1(ouro) mostrando extensas interações hidrofóbicas
intermoleculares entre os subdomínios. Os resíduos que formam a interface são mostrados como bastões e rotulados com os números de resíduos
correspondentes (mesmo código de cores de A). (F)Interface B (euB) entre ZPC--1(ouro), ZPN+1(ameixa) e o peptídeo ligante (azul) é estabilizado por interações
eletrostáticas e hidrofóbicas. Os loops dos subdomínios ZP se encontram como um acoplador com o linker que se estende.
A versão online deste artigo inclui o(s) seguinte(s) suplemento(s) de figura para a figura 2:
Suplemento de figura 1.As interfaces do módulo UMOD ZP são estabilizadas por empacotamento hidrofóbico.
Suplemento de figura 2.resíduos de variância zero gnomaAD da região ligante de fibra UMOD madura.
Figura 3.Comparação da estrutura do módulo ZP no filamento nativo com a estrutura cristalina do rEGF-ZP-CTP. (A)Sobreposição da estrutura do módulo ZP no
homodímero rEGF-ZP-CTP (cinza, PDB: 4WRN) com a estrutura crio-EM resolvida do módulo ZP maduro no filamento (azul). Ambas as estruturas foram alinhadas
através dos subdomínios ZPC. No filamento, o subdomínio ZPN está afastado do subdomínio ZPC da mesma subunidade em ~60 Å. (B)Rearranjo de elementos de
estrutura secundária em ZPN e ZPC formando o ligante estendido na polimerização UMOD em comparação com rEGF-ZP-CTP. O modelo cryo-EM do núcleo UMOD
maduro é mostrado em azul e a estrutura de raios X de rEGF-ZP-CTP (PDB: 4WRN) em cinza. O CTP (ausente no filamento maduro) está destacado em vermelho.
Deixou ouma-segmento helicoidal no terminal C de ZPN em pró-UMOD forma as cadeias de ligação Lb1
e eub2no filamento maduro. Direita: O N-terminal ZPCb-fio (bUMA) em pró-UMOD forma a fita Lb3no ligante estendido do filamento maduro. O CTP (vermelho),
fornecendo o último ZPCb-fio (bG) em pró-UMOD. O local de clivagem da hepsina no pró-UMOD está circulado. (C)Representação da superfície do subdomínio ZPC
(ouro) com as duas fitas complementares Lb1e eub2da subunidade seguinte. Resíduos rotulados indicam o início e o fim de Lb1-2. (D)Superposição do pró-peptídeo
C-terminal formando a fita pró-UMOD ZPCbG(vermelho) com as cadeias de ligação Lb1e eub2(azul) que ocupam o mesmo sulco hidrofóbico no polímero ZPC.
Hidrofóbico semelhante ou idênticob-as cadeias laterais da fita estão ligadas aos bolsos hidrofóbicos das cadeias laterais em ZPC (cinza) em ambas as estruturas. (E)
Ranhura de encadernação do pró-UMOD CTP (vermelho, bastões) na ZPC (superfície cinza). A fita ZPC N-terminalbUMA
(contorno amarelo) limita o tamanho do bolso de encadernação. obUMAfita é invertida após a mudança conformacional de UMOD pró-UMOD maduro
(então Lb3). (F)Estrutura do homodímero ZPN cristalizado de pró-UMOD (PDB: 4WRN). A fita N-terminalbUMAde cada subdomínio ZPN interage com o C-
terminalbGfita da ZPN oposta. (G)No polímero UMOD, ZPNbGinterage com a cadeia de ligação Lb3(azul), em vez disso, que ocupa a mesma posição que
o fiobUMA(preto) da subunidade oposta no dímero.
A versão online deste artigo inclui o(s) seguinte(s) suplemento(s) de figura para a figura 3:
Suplemento de figura 1.Diagramas regulares de topologia de estrutura secundária para os módulos ZP.
Suplemento de figura 2.Rearranjo de resíduos aromáticos na interface IB.
modelo concebível mais simples de montagem de filamento UMOD. A montagem requer a liberação de
monômeros UMOD maduros da membrana por remoção proteolítica do CTP ancorado a GPI pela hepsina,
tornando assim um módulo ZPC competente para ligar o Lb3cadeia de outro UMOD. A montagem começa
pela ligação de um módulo pró-UMOD ZPN aos fios Lb1e eub2em um pró-UMOD vizinho (etapa 1). A
clivagem da hepsina pode então ocorrer no filamento em alongamento (etapa 2). Cada etapa subsequente
de incorporação de UMOD (etapas 3, 4, etc.) seria então caracterizada pela intercalação do ZPN
Figura 4.Modelo proposto de polimerização UMOD após clivagem hepsina de pró-UMOD. Os braços UMOD com os domínios EGF I-III, D8C e EGF IV são mostrados
transparentes para indicar suas posições em relação aos domínios ZP. (Etapa 1) Ligação de ZPN de um monômero pró-UMOD (azul) ao Lb3segmento de um vizinho
estendido pro-UMOD (ouro) pode iniciar a montagem. (Etapa 2) No dímero pró-UMOD assimétrico resultante, a hepsina (tesoura vermelha) cliva o CTP ancorado
em GPI (vermelho) do subdomínio ZPC. O subdomínio ZPC liberado então se liga a Lb1e eub2do pró-UMOD entrante. (Etapa 3) ZPN de um terceiro pró-UMOD
(ameixa) se liga ao Lb3segmento entre os dois segmentos ZPC do filamento em crescimento. (Etapa 4) Novamente, a hepsina cliva o CTP do pró-UMOD no qual o
ZPC é complexado com o ZPN. As etapas 3 e 4 são repetidas consistentemente até que a montagem do filamento seja concluída.
A versão online deste artigo inclui o(s) seguinte(s) suplemento(s) de figura para a figura 4:
Suplemento de figura 1.Análise MALDI-MS/MS de peptídeos trípticos de filamentos UMOD humanos maduros. Suplemento de
figura 2.Alinhamento da sequência de aminoácidos de proteínas humanas ancoradas em GPI contendo ZP.
de um pró-UMOD de entrada entre os dois módulos ZPC do filamento, levando a uma ligação mais estável do ZPN
de entrada em comparação com a etapa 1. Como etapa final de clivagem para liberar os filamentos montados da
membrana, uma hidrolase ainda não identificada pode atuar sobre UMOD, pois pequenas quantidades de CTP
ainda podem ser detectadas em espectros de MS/MS após a digestão com tripsina de filamentos maduros (Figura 4
- suplemento de figura 1). Este modelo de montagem UMOD é análogo ao mecanismo de montagem recentemente
proposto de pili filamentoso tipo V, no qual a montagem está ligada à liberação proteolítica de subunidades de
pilus da membrana bacteriana externa.Shibata e outros, 2020). Durante a preparação deste manuscrito, foi
publicado um artigo de pré-impressão relacionado sobre a estrutura cryo-EM do núcleo de filamento UMOD (
Stsiapanava et al., 2020). No referido estudo, foi proposto um modelo alternativo de montagem UMOD, com base
na suposição de que a montagem começa a partir de homodímeros pró-UMOD ligados à membrana.
materiais e métodos
Purificação de UMOD humano
Fibras UMOD humanas foram purificadas de um doador saudável conforme descrito emWeiss e outros, 2020.
Resumidamente, a urina foi purificada usando um filtro de terra de diatomáceas, concentrada e dialisada durante a noite
contra 0,5 mM EDTA-NaOH, pH 8,2 (limite de 300 kDa, laboratórios Spectrum). As alíquotas foram congeladas rapidamente
em nitrogênio líquido e armazenadas a -20˚C até uso posterior. Apenas a segunda micção da manhã foi utilizada para coleta
de urina. As concentrações de proteína foram determinadas conforme descrito anteriormente (Weiss e outros, 2020).
Para obter um mapa focado em várias unidades repetidas, uma abordagem alternativa foi aplicada usando cis-
TEM para refinamento e classificação: todas as micrografias foram selecionadas manualmente, resultando em um
total de 8543 filmes que também foram corrigidos por movimento usando MotionCor2, valores CFT estimados
usando Gctf e 485.000 partículas foram selecionadas manualmente como hélices de uma seleção aleatória de 3.600
micrografias no RELION v3.0.8 (Zivanov e outros, 2018) e extraídos no tamanho do pixel original. A pilha de
partículas foi então submetida à classificação 2D em cisTEM (Grant e outros, 2018). 402.000 boas partículas foram
selecionadas e várias rodadas de classificação focada foram realizadas com a melhor média importada da classe
cryoSPARC 3D como referência (descrita acima) e uma máscara esférica (raio de 120 Å). Duas das médias de classe
3D resultantes foram mescladas e outra rodada de classificação 3D com a mesma máscara esférica foi realizada,
resultando em um mapa resolvido para 4,7 Å de 330.000 partículas. O mapa foi filtrado para 4,7 Å e aprimorado
usando as configurações padrão do cisTEM (fator B pré-corte
90,0, corte de resolução 4,7 Å). Os parâmetros helicoidais relatados foram estimados no espaço real a partir do
mapa cisTEM usandorelion_helix_toolbox (Ele e Scheres, 2017) com faixas de pesquisa para ascensão (60--67 Å) e
torção (175–185˚). Fluxos de trabalho esquemáticos e detalhes são mostrados emFigura 1 - suplemento de figura 1,
Arquivo suplementar 1B,D. Para fins comparativos, as curvas FSC do mapa cisTEM e os mapas de resolução local
foram calculados no cryoSPARC para todos os semi-mapas gerados.
Para o modelo final do filamento UMOD, uma estrutura foi gerada com 3 cópias do modelo AU final
aplicando a simetria derivada do mapa cisTEM. A subunidade central ZPN/ZPC da parte central das
estruturas foi submetida a um refinamento de espaço real com restrições de referência rígidas (sigma =
0,025) usando o mapa cryoSPARC. A subunidade central ZPN/ZPC no modelo refinado foi então usada para
gerar a nova estrutura de filamento UMOD. Os confrontos na interface da subunidade foram reduzidos
ainda mais ao realizar outra rodada dephenix.real_space_refinecom restrições de referência mais rígidas
(sigma = 0,02).
As validações do modelo foram realizadas usando a ferramenta Comprehensive Validation no PHENIX. As
estatísticas do modelo final foram geradas usando a ferramenta MolProbity via PHENIX (Chen e outros, 2010). As
figuras da estrutura foram preparadas com PyMol v2.4 (The PyMOL Molecular Graphics System, versão 2.4
Schrödinger, LLC) e as figuras do mapa EM foram geradas com UCSF ChimeraX 0.93 (Goddard e outros, 2018).
borda da caixa, e a quarta mostrava o alongamento ao longo do eixo do filamento (Figura 1—vídeo 2). Os
componentes superiores mostraram vários movimentos nos braços (não mostrados).
Reconhecimentos
Os autores agradecem a M Peterek pelo suporte técnico durante a coleta de dados EM e a plataforma
ScopeM para acesso a instrumentos na ETH Zurich. Agradecemos também ao Functional Genomics
Center Zurich, especificamente P Hunziker, pela análise MS/MS. Gostaríamos de agradecer a R
Zdanowicz pelo suporte inicial para triagem de grades cryo-EM. RG foi financiado pela Swiss National
Science Foundation (310030B_176403/1 e 31003A_156304) e financiamento básico pela ETH Zurich. O
MP foi financiado pela Swiss National Science Foundation (31003A_179255), pelo European Research
Council (679209) e pela fundação NOMIS. OD e AK são apoiados pelo programa Swiss National Centre
of Competence in Research Kidney Control of Homeostasis (NCCR Kidney.CH) e pela Swiss National
Science Foundation (310030_189044).
Informações adicionais
Financiamento
Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, na coleta e interpretação dos dados ou
na decisão de enviar o trabalho para publicação.
Contribuições do autor
Jessica J Stanisich, Conceptualização, Curadoria de dados, Análise formal, Validação, Investigação,
Visualização, Metodologia, Redação - rascunho original, Redação - revisão e edição; Dawid S Zyla,
Conceituação, Curadoria de dados, Software, Análise formal, Validação, Investigação, Visualização,
Metodologia, Redação - rascunho original, Redação - revisão e edição; Pavel Afanasyev, Conceituação,
Curadoria de dados, Software, Análise formal, Supervisão, Validação, Investigação, Visualização,
Metodologia, Administração de projetos; Jingwei Xu, Curadoria de Dados, Validação, Metodologia; Anne
Kipp, Conceptualização, Curadoria de dados, Análise formal, Validação, Investigação, Visualização; Eric
Olinger, Conceitualização, Curadoria de dados, Análise formal, Investigação; Olivier Devuyst, Martin Pilhofer,
Conceitualização, Recursos, Supervisão, Captação de financiamento, Redação - rascunho original,
Administração do projeto, Redação - revisão e edição; Daniel Boehringer, Conceituação, Recursos, Análise
formal, Supervisão, Validação, Investigação, Visualização, Metodologia, Redação - rascunho original,
Administração do projeto, Redação - revisão e edição; Rudi Glockshuber, Conceituação, Recursos,
Supervisão, Aquisição de financiamento, Investigação, Redação - rascunho original, Administração do
projeto, Redação - revisão e edição
Autor ORCIDs
Jessica J Stanisich https://orcid.org/0000-0002-2702-8092
Dawid S Zyla https://orcid.org/0000-0001-8471-469X
Pavel Afanasyev https://orcid.org/0000-0002-6353-6895
Eric Olinger http://orcid.org/0000-0003-1178-7980
Olivier Devuyst http://orcid.org/0000-0003-3744-4767
Martin Pilhofer http://orcid.org/0000-0002-3649-3340
Rudi Glockshuber https://orcid.org/0000-0003-3320-3843
Ética
Sujeitos humanos: O uso de amostras de urina humana para purificação UMOD foi aprovado pelo Comitê de Ética
da Escola de Medicina da UCLouvain em Bruxelas, Bélgica (Projeto EUNEFRON, 2011/ 04 de maio/184). Todos os
indivíduos deram consentimento informado por escrito. O "Formulário de consentimento para publicação no eLife"
preenchido foi arquivado em nome do doador.
Arquivos adicionais
arquivos suplementares
. Arquivo suplementar 1. Stanisich_et_al_2020_supplementary_file_1.pdf. (A) Ligante do módulo ZP e posições de
aminoácidos de interface com variantes conhecidas (gnomAD). (B) Coleta de dados Cryo-EM e estatísticas de
refinamento do modelo. (C) Fluxograma para processamento cryoSPARC cryo-EM. (D) Fluxograma para
processamento crio-EM cis-TEM.
Disponibilidade de dados
As estruturas e mapas apresentados neste artigo foram depositados no Banco de Dados de Proteínas (PDB)
e na Base de Dados de Microscopia Eletrônica (EMDB) com os seguintes códigos de acesso: 3,5 Å cryoSPARC
map EMD-11388, o UMOD AU modelo PDB ID: 6ZS5, alongado modelo de filamento UMOD derivado do
mapa cryoSPARC PDB ID: 6ZYA, mapa cisTEM de 4,7 Å EMD-11471.
banco de dados e
Autor(es) Ano Título do conjunto de dados URL do conjunto de dados identificador
Stanisich JJ, Zyla 2020 Estrutura crio-EM de 3,5 Å do mapa do núcleo http://www.ebi.ac.uk/ Microscópio eletrônico
DS, Afanasyev P, Xu J, do filamento de uromodulina humana pdbe/entrada/emdb/EMD- Banco de Dados, EMD-
Pilhofer M, Boehringer 11388 11388
D, Glockshu-
ber R
Stanisich JJ, Zyla 2020 Estrutura crio-EM de 3,5 Å do núcleo de http://www.rcsb.org/ Dados de Proteína RCSB
DS, Afanasyev P, Xu J, filamento de uromodulina humana estrutura/6ZS5 Banco, 6ZS5
Pilhofer M, Boehringer
D, Glockshu-
ber R
Stanisich JJ, Zyla 2020 Núcleo de filamento de uromodulina http://www.rcsb.org/ Dados de Proteína RCSB
DS, Afanasyev P, Xu J, humana estendido com resolução de 3,5 Å estrutura/6ZYA Banco, 6ZYA
Pilhofer M, Boehringer
D, Glockshu-
ber R
Stanisich JJ, Zyla 2020 Mapa crio-EM estendido do núcleo de http://www.ebi.ac.uk/ Microscópio eletrônico
DS, Afanasyev P, Xu J, filamento de uromodulina humana nativa pdbe/entrada/emdb/EMD- Banco de Dados, EMD-
Pilhofer M, Boehringer em 4,7 Å 11471 11471
D, Glockshu-
ber R
banco de dados e
Autor(es) Ano Título do conjunto de dados URL do conjunto de dados identificador
Referências
Polícia de Adams, Afonine PV, Bunkóczi G, Chen VB, Davis IW, Echols N, Headd JJ, Hung LW, Kapral GJ, Grosse-
Kunstleve RW, McCoy AJ, Moriarty NW, Oeffner R, Read RJ, Richardson DC, Richardson JS, Terwilliger TC, Zwart
PH. 2010. PHENIX: um sistema abrangente baseado em Python para solução de estrutura macromolecular.
Acta Crystallographica Seção D Cristalografia Biológica66:213–221.DOI: https://doi.org/10.1107/
S0907444909052925,PMID: 20124702
Bepler T, Morin A, Rapp M, Brasch J, Shapiro L, Noble AJ, Berger B. 2019. Convolucional positiva sem rótulo
redes neurais para coleta de partículas em micrografias crioeletrônicas.Métodos da Natureza16:1153–1160.DOI: https://
doi.org/10.1038/s41592-019-0575-8,PMID: 31591578
Bokhove M, Nishimura K, Brunati M, Han L, de Sanctis D, Rampoldi L, Jovine L. 2016. Um interdomínio estruturado
O ligante dirige a autopolimerização da uromodulina humana.PNAS113:1552–1557.DOI: https://doi.org/10.1073/
pnas.1519803113,PMID: 26811476
Brunati M, Perucca S, Han L, Cattaneo A, Consolato F, Andolfo A, Schaeffer C, Olinger E, Peng J, Santambrogio
S, Perrier R, Li S, Bokhove M, Bachi A, Hummler E, Devuyst O, Wu Q, Jovine L, Rampoldi L. 2015. A serina protease
hepsina medeia a secreção urinária e a polimerização da proteína uromodulina do domínio da zona pelúcida. eLife4:
e08887.DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.08887,PMID: 26673890
Chen VB, Arendall WB, Headd JJ, Keedy DA, Immormino RM, Kapral GJ, Murray LW, Richardson JS, Richardson
DC. 2010. MolProbity: validação da estrutura de todos os átomos para cristalografia macromolecular.Acta
Crystallographica Seção D Cristalografia Biológica66:12–21.DOI: https://doi.org/10.1107/S0907444909042073, PMID:
20057044
Croll TI. 2018.ISOLADO:um ambiente fisicamente realista para construção de modelos em densidade eletrônica de baixa resolução
mapas .Acta Crystallographica Seção D Biologia Estrutural74:519–530.DOI: https://doi.org/10.1107/
S2059798318002425
Devuyst O, Olinger E, Rampoldi L. 2017. Uromodulina: da fisiologia aos distúrbios renais raros e complexos.
Nature Reviews Nefrologia13:525–544.DOI: https://doi.org/10.1038/nrneph.2017.101
Emsley P, Lohkamp B, Scott WG, Cowtan K. 2010. Recursos e desenvolvimento de galeirão.Acta Crystallographica.
Seção D, Cristalografia Biológica66:486–501.DOI: https://doi.org/10.1107/S0907444910007493, PMID:
20383002
Ghirotto S, Tassi F, Barbujani G, Pattini L, Hayward C, Vollenweider P, Bochud M, Rampoldi L, Devuyst O. 2016.
O locus do gene da uromodulina mostra evidências de adaptação do patógeno através da evolução humana.Jornal da
Sociedade Americana de Nefrologia27:2983–2996.DOI: https://doi.org/10.1681/ASN.2015070830,PMID: 26 966016
Goddard TD, Huang CC, Meng EC, Pettersen EF, Couch GS, Morris JH, Ferrin TE. 2018. UCSF ChimeraX:
enfrentando desafios modernos em visualização e análise.Ciência da Proteína27:14–25.DOI: https://doi.org/10. 1002/
pro.3235,PMID: 28710774
Conceder T, Rohou A, Grigorieff N. 2018.cisTEM, software de fácil utilização para processamento de imagem de partícula única.eLife
7:e35383.DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.35383,PMID: 29513216
Hase K, Kawano K, Nochi T, Pontes GS, Fukuda S, Ebisawa M, Kadokura K, Tobe T, Fujimura Y, Kawano S,
Yabashi A, Waguri S, Nakato G, Kimura S, Murakami T, Iimura M, Hamura K, Fukuoka S, Lowe AW, Itoh K, et al. 2009. A
absorção através da glicoproteína 2 da bactéria FimH(+) pelas células M inicia a resposta imune da mucosa.Natureza 462:
226–230.DOI: https://doi.org/10.1038/nature08529,PMID: 19907495
Ter um JR, Slot JW, Strous GJ. 1985. Descolamento da membrana e liberação da principal glicoproteína da membrana
de grânulos de secreção em células exócrinas pancreáticas de ratos.Jornal Europeu de Biologia Celular39:70-76.PMID: 40
85502
ele S, Scheres SHW. 2017. Reconstrução helicoidal em RELION.Jornal de Biologia Estrutural198:163–176.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.jsb.2017.02.003,PMID: 28193500
Jovina L, Qi H, Williams Z, Litscher E, Wassarman PM. 2002. O domínio ZP é um módulo conservado para
polimerização de proteínas extracelulares.Natureza Biologia Celular4:457–461.DOI: https://doi.org/10.1038/ncb802,
PMID: 12021773
Karczewski KJ, Francioli LC, Tiao G, Cummings BB, Alföldi J, Wang Q, Collins RL, Laricchia KM, Ganna A,
Birnbaum DP, Gauthier LD, Brand H, Solomonson M, Watts NA, Rhodes D, Singer-Berk M, England EM, Seaby EG,
Kosmicki JA, Walters RK, et al. 2020. O espectro de restrição mutacional quantificado a partir da variação em 141.456
humanos.Natureza581:434–443.DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-020-2308-7,PMID: 32461654 Kim DK, Kim JA, Park J,
Niazi A, Almishaal A, Park S. 2019. O lançamento de ancorado na superfícieuma-tectorina, um apical
proteína da matriz extracelular, medeia a organização da membrana tectória.Avanços da ciência5:eaay6300.
DOI: https://doi.org/10.1126/sciadv.aay6300,PMID: 31807709
Krissinel E, Henrick K. 2007. Inferência de conjuntos macromoleculares a partir do estado cristalino.Journal of Molecular
Biologia372:774-797.DOI: https://doi.org/10.1016/j.jmb.2007.05.022,PMID: 17681537
Pak J, Pu Y, Zhang ZT, Hasty DL, Wu XR. 2001. A proteína Tamm-Horsfall liga-se ao tipo 1 fimbriadoEscherichia coli
e previneE. colida ligação aos receptores de uroplaquina Ia e ib.Jornal de Química Biológica276:9924– 9930.
DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.M008610200,PMID: 11134021
Pettersen EF, Goddard TD, Huang CC, Couch GS, Greenblatt DM, Meng EC, Ferrin TE. 2004. UCSF quimera–a
sistema de visualização para pesquisa exploratória e análise.Jornal de Química Computacional25:1605–1612.
DOI: https://doi.org/10.1002/jcc.20084,PMID: 15264254
Porteiro KR, Tamm I. 1955. Visualização direta de um componente mucoproteína da urina.O jornal da biologia
Química212:135–175.PMID: 13233216
Punjani A, Rubinstein JL, Fleet DJ, Brubaker MA. 2017. cryoSPARC: algoritmos para cryo-EM não supervisionado rápido
determinação da estrutura.Métodos da Natureza14:290–296.DOI: https://doi.org/10.1038/nmeth.4169,PMID: 2
8165473
Punjani A, Frota DJ. 2020. Análise de variabilidade 3D: resolução direta de flexibilidade contínua e discreta
heterogeneidade de imagens crio-EM de partícula única.bioRxiv.DOI: https://doi.org/10.1101/2020.04.08.032466 Rindler
MJ, Naik SS, Li N, Hoops TC, Peraldi MN. 1990. Uromodulina (Tamm-Horsfall glicoproteína/uromucoide) é
uma proteína de membrana ligada a fosfatidilionositol.O Jornal de Química Biológica265:20784–20789.
PMID: 2249987
Saito T, Bokhove M, Croci R, Zamora-Caballero S, Han L, Letarte M, de Sanctis D, Jovine L. 2017. Base estrutural
da interação humana Endoglin-BMP9: percepções sobre a sinalização de BMP e HHT1.Relatórios de Células19:1917–
1928. DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.05.011,PMID: 28564608
Schaeffer C, Santambrogio S, Perucca S, Casari G, Rampoldi L. 2009. Análise da polimerização da uromodulina
fornece novos insights sobre os mecanismos que regulam a montagem de proteínas mediada pelo domínio ZP.
Biologia molecular da célula20:589–599.DOI: https://doi.org/10.1091/mbc.e08-08-0876,PMID: 19005207 Shibata S,
Shoji M, Okada K, Matsunami H, Matthews MM, Imada K, Nakayama K, Wolf M. 2020. Estrutura de
pilina tipo V polimerizada revela mecanismo de montagem envolvendo troca de cadeia mediada por protease.
Natureza Microbiologia5:830–837.DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-020-0705-1,PMID: 32284566 Música Y, DiMaio
F, Wang RY, Kim D, Miles C, Brunette T, Thompson J, Baker D. 2013. Alta resolução
modelagem comparativa com RosettaCM.Estrutura21:1735–1742.DOI: https://doi.org/10.1016/j.str.2013.08.
005,PMID: 24035711
Stsiapanava A, Xu C, Brunati M, Zamora-Caballero S, Schaeffer C, Han L, Carroni M, Yasumasu S, Rampoldi L,
Wu B, Jovine L. 2020. Estrutura Cryo-EM de uromodulina humana nativa, um polímero de módulo de zona
pelúcida. bioRxiv .DOI: https://doi.org/10.1101/2020.05.28.119206
van Rooijen JJ, Voskamp AF, Kamerling JP, Vliegenthart JF. 1999. Sítios de glicosilação e sítios específicos
glicosilação na glicoproteína Tamm-Horsfall humana.Glicobiologia9:21–30.DOI: https://doi.org/10.1093/
glicob/9.1.21,PMID: 9884403
Vangone A, Spinelli R, Scarano V, Cavallo L, Oliva R. 2011. COCOMAPS: uma aplicação web para analisar e
visualizar contatos na interface de complexos biomoleculares.Bioinformática27:2915–2916.DOI: https://doi.
org/10.1093/bioinformatics/btr484,PMID: 21873642
Waksman G. 2017. Biologia estrutural e molecular de uma nanomáquina de polimerização de proteínas para biogênese de Pilus.
Jornal de Biologia Molecular429:2654–2666.DOI: https://doi.org/10.1016/j.jmb.2017.05.016,PMID: 28551336
Weiss GL, Stanisich JJ, Sauer MM, Lin CW, Eras J, Zyla DS, Trück J, Devuyst O, Aebi M, Pilhofer M, Glockshuber
R. 2020. Arquitetura e função dos filamentos de uromodulina humana em infecções do trato urinário.Ciência114:
eaaz9866.DOI: https://doi.org/10.1126/science.aaz9866
Zhang K. 2016. Gctf: determinação e correção de CTF em tempo real.Jornal de Biologia Estrutural193:1–12.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.jsb.2015.11.003,PMID: 26592709
Praça Zheng, Palovcak E, Armache JP, Verba KA, Cheng Y, Agard DA. 2017. MotionCor2: correção anisotrópica de
movimento induzido por feixe para microscopia crioeletrônica aprimorada.Métodos da Natureza14:331–332.DOI: https://doi.
org/10.1038/nmeth.4193,PMID: 28250466
Zivanov J, Nakane T, Forsberg BO, Kimanius D, Hagen WJ, Lindahl E, Scheres SH. 2018. Novas ferramentas para
determinação automatizada de estrutura crio-EM de alta resolução em RELION-3.eLife7:e42166.DOI: https://doi.org/
10.7554/eLife.42166,PMID: 30412051