In vitro micrografting of lucumo (Pouteria lucuma), Sapotaceae

Jeanine Córdova-Risco, Consuelo Rojas-Idrogo, Guillermo E. Delgado-Paredes*

http://eeb.lu.lv/EEB/201712/EEB_XV_Cordova-Risco.pdf
Micrografografia in vitro de lucumo (Pouteria lucuma), Sapotaceae

Efeitos de reguladores de crescimento de plantas [ácido giberélico (GA3) e ácido indol-

3-butírico (IBA)], segurando enxertos (papel alumínio e fio de cobre), pré-tratamento
[imersão em 1,5 mg L – 1 6-benzilaminopurina (BAP) ] de descendentes e a
combinação de genótipos (porta-enxerto × enxerto) foram investigadas na
micropropagação de porta-enxertos e enxertos e na microenxertia de lucumo (Pouteria
lucuma) cv. 'Beltrán' e 'Seda'. Plântulas comerciais germinadas in vitro, germinadas a
partir de sementes, foram utilizadas como porta-enxertos e mudas. Os porta-enxertos
foram cultivados em meio de cultura Murashige e Skoog (MS) suplementado com
diferentes concentrações (0,0, 0,1 e 1,0 mg L – 1) de GA3. Os dados mostraram que no
cv. 'Beltrán', a altura máxima do tiro (6,1 ± 1,2 cm) e os nós formados (7) foram
observados na presença de 0,1 mg L – 1 de GA3. Os efeitos de dois meios MS
diferentes contendo 0,1 mg L – 1 de GA3 (MM-1) e 0,1 mg L – 1 de GA3 e 0,4 mg L –
1 de IBA (MM-2) foram estudados no desenvolvimento de plântulas micrografadas. As
pontas dos brotos propagados foram micrografadas em mudas comerciais de lucumo
germinadas in vitro. Os resultados indicaram que a melhor taxa de enxerto foi obtida na
combinação de genótipos 'Seda' × 'Beltrán' (porta-enxerto × enxerto), segurando
enxertos com fio de cobre e pré-tratamento de enxertos com imersão em 1,5 mg L – 1
BAP, atingindo uma taxa de sobrevivência de 87,5%; no entanto, nos meios de cultura
MM-1 e MM-2, a taxa de sobrevivência do enxerto foi semelhante (52,6 e 54,1%,
respectivamente).

No Peru, a família Sapotaceae compreende 10 gêneros (Manilkara, Sideroxylon,

Ecclinusa, Micropholis, Pouteria, Sarcaulus, Chrysophyllum, Diploön, Elaeoluma e
Pradosia). O gênero Pouteria compreende cerca de 50 espécies e é o maior gênero da
família e um componente importante da floresta tropical de planície (Brako, Zarucchi
1993). Pouteria caimito é uma das espécies mais difundidas e Pouteria lucuma é outra
espécie amplamente cultivada, nativa de montanhas úmidas e florestas de nuvens entre
1500 e 3000 m de altitude; o fruto globoso, de 6 a 12 cm de diâmetro, contém uma
polpa marrom-amarelada bastante seca, muito usada para aromatizar sorvetes e bolos
(Pennington et al. 2004). A propagação e criação convencionais do lucumo são por
sementes e enxertos sexuais, mas esses métodos têm algumas limitações causadas pelos
seguintes motivos: natureza perene, ciclo de longa geração, auto-incompatibilidade,
baixa taxa de sucesso de polinização manual, longa duração para maturação das
sementes, clonal diferença de tempo de floração e capacidade de frutificação de alguns
clones, altos níveis de heterozigosidade e outros, como observado em Camellia sinenis
(Mondal et al. 2005). Portanto, a cultura de tecidos é certamente uma alternativa melhor
para propagação convencional e redução no tempo de crescimento e desenvolvimento;
no entanto, as árvores frutíferas estão entre as mais recalcitrantes para a cultura in vitro,
e a regeneração de brotações adventícias de explantes adultos provou ser difícil (Miguel
et al. 1996). Nas árvores frutíferas, a propagação vegetativa por estacas é usada para
minimizar a enorme variação genética causada pela propagação sexual; no entanto,
como o enraizamento é de grande dificuldade, como observado em cultivares de
amêndoa (Prunus dulcis), a microenxertia tem sido o método mais amplamente utilizado
para propagação vegetativa (Yildirim et al. 2010). Nesse sentido, a microenxertia ou
enxertia in vitro é uma técnica relativamente nova para a propagação de plantas que, na
definição clássica de Hartmann et al. (2002), “envolve a colocação de um meristema ou
brotam o explante da ponta em um porta-enxerto decapitado que foi crescido
assepticamente a partir de sementes ou culturas micropropagadas”. A microenxertia foi
inicialmente usada em plantas herbáceas, mas depois em particular em espécies
lenhosas e principalmente em espécies frutíferas; foi modificado e aprimorado para
aumentar o sucesso do enxerto por Murashige et al. (1972) e Navarro et al. (1975). Em
geral, a técnica tem um grande potencial para o aprimoramento de plantas frutíferas e
multiplicação em larga escala, produção de plantas livres de pragas e doenças sistêmicas
(como vírus, viróides, bactérias e fungos), troca internacional segura de germoplasma e
multiplicação de plantas com problemas em plantas. formação do sistema radicular
(Hussain et al. 2014). Na microenxertia de amêndoa (Amygdalus communis) cv.
'Nonpareil', o efeito de vários reguladores de crescimento na micropropagação por
microscopia foi estudado, obtendo a maior regeneração de brotações (6,66) e
comprimento de brotamento (1,95 cm) com meio de cultura Murashige e Skoog (MS)
(Murashige, Skoog 1962) suplementado com 6 benzilaminopurina (BAP) 1,0 mg L – 1
(Işıkalam et al. 2011). Utilizando microenxertos, videira (Vitis vinifera) cv. 'Jing Xiu'
foi usado como descendente e Vitis amuensis cv. 'Shuang you', uma nova variedade de
uva selvagem, como porta-enxerto; dos oito métodos de microenxertia testados, três
apresentaram formação radicular bem-sucedida (taxa de formação> 60%), quando a
ponta da parte aérea foi selecionada como material de enxerto (Zhu et al. 2007).
Em outro estudo, o rejuvenescimento do lentisco maduro (Pistacia terebinthus) pelo
método de microenxerto in vitro foi desenvolvido para a produção de plântulas, e foi
avaliada a estabilidade genética de clones subcultivados 3, 6 e 24 vezes dos genótipos
masculino e feminino. e comparado com as plantas-mãe usando análise de polimorfismo
de comprimento de fragmento amplificado à base de fluorescência (Onay et al. 2016).
Em geral, a microenxertia in vitro tem sido relatada em muitas plantas, como caju
(Anacardium occidentale) (Thimmappaiah et al. 2002), pistache (Pistacia vera) (Onay et
al. 2007), azeitona (Olea europaea) (Revilla et al. 1996), amêndoa (Amigdalus
communis) (Channuntapipat et al. 2003) e cereja (Prunus avium) (Amiri 2006).
Revisões sobre micrografting foram publicadas por Jonard et al. (1983), Jonard (1986),
Roistacher et ai. (1976), Navarro (1988), Parkinson et ai. (1990), Monteuuis (2012) e
recentemente por Hussain et al. (2014). O objetivo do presente estudo foi investigar a
técnica de microenxertia mais confiável e os materiais de enxerto ideais para o lucumo.
Investigamos especificamente a influência do BAP, segurando enxertos, meio de cultura
e genótipos sobre a microenxertia de lucumo.

materiais e métodos

Obtenção de porta-enxertos in vitro e ex vitro

As mudas in vitro utilizadas como porta-enxertos foram obtidas de sementes de Pouteria
lucuma cv. 'Beltrán' e 'Seda', árvores comerciais encontradas na província de Huaral,
Lima, Peru. As sementes maduras foram lavadas com detergente e água e seccionadas
para obter o explante com o embrião e parte do endosperma. O explante foi esterilizado
na superfície por imersão em solução de lixívia comercial a 5,25% (p / v) por 2, 3 e 5
min em vários tratamentos e depois lavado com água esterilizada corrente por 3 a 5
minutos para remover o NaOCl (Tabela 1) , antes de ser inoculado individualmente em
vasos de vidro (10 × 6 cm) contendo 50 mL de meio MS (Murashige, Skoog 1962),
incluindo 0,0, 0,1 e 1,0 mg de ácido giberélico L-1 (GA3). Da mesma forma, em um
experimento separado para obtenção de porta-enxertos ex vitro, as sementes maduras
também foram lavadas com detergente e água e colocadas para germinar no substrato
S1, que continha vermicomposto e areia 1: 1. O vermicomposto era um fertilizante
orgânico obtido do verme vermelho da Califórnia (Eisenia foetida).

Fonte de descendente
As mudas in vitro utilizadas como copa foram obtidas de sementes de P. lucuma cv.
'Beltrán' e 'Seda', árvores comerciais. As sementes de P. lucuma foram selecionadas e
esterilizadas seguindo o mesmo protocolo usado para desinfetar porta-enxertos e
inoculadas individualmente em tubos de ensaio (25 × 150 mm) contendo 25 mL de
meio MS suplementado com 0,1 mg L – 1 de GA3. Pontas apicais estéreis e gemas
axilares (1,5 a 2,0 cm de comprimento) foram obtidas diretamente dos segmentos apical
e nodal, respectivamente. Em experimentos ex vitro, ramificações jovens foram
coletadas de árvores de lucumo cv, com 15 anos de idade. 'Seda' cresce no Jardim
Botânico da Universidade Nacional Pedro Ruiz Gallo, Lambayeque, Peru; como antes,
utilizamos pontas apicais obtidas de porta-enxertos germinados no substrato S1 para os
últimos experimentos. Esses explantes foram lavados com água corrente por 10 min,
esterilizados na superfície em 10 mL de solução de água sanitária comercial (5,25%
NaOCl) 1,0 L – 1 em água destilada estéril por 10 minutos e enxaguados cinco vezes
com água estéril.

Procedimento de microenxerto in vitro e manutenção de microenxertos

Sob condições assépticas, brotos de comprimento uniforme (2,0 cm) e diâmetro (1 a 2
mm), com 8 semanas de idade, foram selecionados a partir de culturas in vitro e
utilizados como porta-enxertos e enxertos na microenxertia. O porta-enxerto foi
decapitado e uma incisão vertical de 5 mm foi feita a partir do topo de cada porta-
enxerto, e o enxerto foi cortado em um ângulo de 45 ° (forma de cunha) a partir da base.
A parte unida foi ligada com papel de alumínio asséptico (1,0 × 0,5 cm) ou com fios
assépticos de cobre. Para evitar a desidratação dos enxertos in vitro, antes da
microenxertia, a área de corte do enxerto foi imersa em solução de BAP (1,5 mg L – 1).
As plântulas micrografadas foram cultivadas em dois diferentes meios MS contendo
3,53 g L – 1 de CaCl2 H2O e 0,1 mg L – 1 de GA3 (MM-1) e 3,53 g L – 1 de CaCl2
H2O, 0,1 mg L – 1 de GA3 e 0,4 mg L-1 IBA (MM-2). Os procedimentos para a
microenxertia ex vitro foram semelhantes aos utilizados para a microenxertia in vitro. O
número de microenxertos bem sucedidos foi registrado 12 semanas após o microenxerto
e a porcentagem de sucesso foi registrada.

Condições de mídia e cultura

Neste estudo, em todas as experiências, o meio MS básico foi suplementado com as
vitaminas mio-inositol 100 mg L – 1 e tiamina HCl 1,0 mg L – 1 e 6,0 g L – 1 de ágar.
O pH de todos os meios foi ajustado para 5,8 ± 0,1, com KOH e HCl, antes da autoclave
a 121 ° C a 105 kPa por 20 min. Cada tratamento compreendeu 10 explantes e foi
realizado duas vezes. O material vegetal foi mantido em uma sala de crescimento com
temperatura controlada de 26 ± 2 ° C, umidade relativa do ar de aproximadamente 80%
e fotoperíodo de 16 horas de luz com densidade de fluxo de fótons fotossintético 60
µmol m – 2 s – 1 via branco frio lâmpadas fluorescentes (40 W).

Enraizamento
A indução de raízes não foi necessária, pois os porta-enxertos mantiveram suas raízes
durante o processo de microenxertia.

Análise estatística
O sucesso, a cicatrização e a taxa de alongamento de plântulas micrografadas foram
registradas em microenxertos após 12 semanas. Os dados foram analisados
estatisticamente por análise de variância (ANOVA), e o teste de Tukey (= 0,05%) foi
aplicado para separar as médias, utilizando o software SPSS 11.5 (SPSS, EUA).

Resultados e discussão
Iniciação cultural
Neste experimento, 70% de contaminação foi observada quando os explantes foram
tratados com hipoclorito de sódio a 5,25% por 3 min e depois lavados duas vezes com
água destilada; no entanto, 80 a 90% de desinfecção dos explantes foi alcançada com
hipoclorito de sódio a 5,25% por 5 min e depois lavada três vezes com água destilada ou
com hipoclorito de sódio a 5,25% por 3 min, seguida por lavagem duas vezes com água
destilada ou com Hipoclorito de sódio a 5,25% por 3 min e lavagem duas vezes com
água destilada (Tabela 1). Isso resultou em uma redução significativa no nível de dano
(necrose apical e escurecimento), para apenas 10% dos explantes, e escassa
contaminação (20%) foi observada (Tabela 1). Na iniciação da cultura e no crescimento
axilar de pitaiaiás roxos (Hylocereus costaricensis), explantes maiores (5 a 7 cm de
comprimento) foram esterilizados com detergente alcalino por 10 minutos, seguidos de
imersão em etanol a 70% (v / v) por 15 a 30 s, uma mistura de fungicida e bactericida
por 30 minutos e desinfecção em hipoclorito de sódio (1,0% v / v) por 15 minutos, o
que resultou em uma redução significativa do nível de dano em apenas 16% dos
explantes e na ausência de contaminação (Viñas et al. 2012). Esses resultados foram
muito semelhantes aos observados em nosso estudo, onde o método de desinfecção
utilizado produziu taxas de contaminação comparáveis aos melhores resultados
publicados para espécies de árvores in vitro usando explantes de campo (Işıkalan et al.
2011; Cortizo et al. 2004). Outras características prejudiciais foram observadas
minimamente em nosso estudo. Essas características eram necrose apical;
escurecimento das superfícies cortadas, o que inibe o crescimento e desenvolvimento de
novas células e resulta em má união do enxerto; e escurecimento do tecido, o que
geralmente resulta na morte de pequenos descendentes.

Atira a altura e a formação de nós

Os explantes estéreis, sementes com embrião zigótico e endosperma parcial (1,0 a 1,5
cm3), foram cultivados no meio MS contendo 0,0, 0,1, 1,0 mg L – 1 de GA3
separadamente. A partir dos resultados apresentados na Tabela 2, parece que a altura
máxima de tiro (6,1 ± 1,2 e 5,2 ± 0,4 cm) da cv. 'Beltrán' e 'Seda' foram observados na
presença de 0,1 e 1,0 mg L – 1 de GA3, respectivamente, e a menor altura de brotação
foi observada em meios suplementados com 0,1 mg L – 1 de GA3 na cv. "Seda" (4,6 ±
0,7 cm). Na ausência de reguladores de crescimento, atire o crescimento em ambos os
cv. 'Beltrán' e 'Seda' também foram observados Os resultados mostraram que o uso do
GA3 não era absolutamente necessário para o crescimento da parte aérea. Da mesma
forma, o número médio máximo de nós formado por explante foi observado nos meios
suplementados com 0,1 mg L – 1 de GA3 em ambas as var. 'Beltrán' e 'Seda' com 7 e 6
nós, respectivamente (Tabela 2). Na ausência de reguladores de crescimento, observou-
se formação mínima de nós nas duas cultivares.

Formação de brotações e raízes

Em ambos os cv. 'Beltrán' e 'Seda', o número médio de brotações por explante diminuiu
com o aumento da concentração de GA3 de 0,0 para 1,0 mg L-1, embora apenas uma
sessão tenha sido formada com 1,0 mg L-1. Para formar dois rebentos, foi necessário
adicionar 0,1 ou 1,0 mg L – 1 de GA3 (Tabela 3); no entanto, para formar uma e duas
raízes, não foi necessário adicionar GA3 (tabela 3). Em contraste, o crescimento de
indução e brotação é mínimo em plantas herbáceas cultivadas em culturas in vitro de
espécies lenhosas. Por exemplo, no processo de rejuvenescimento do lentisco maduro
(Pistacia lentiscus) por microenxerto, o maior número de brotações e altura de
brotamento por explante no genótipo feminino foi de 2,2 e 1,4 cm, respectivamente,
obtidos com 1,0 mg L – 1 de GA3 + 1,0 mg L -1 BA (Onay et al. 2016).

Altura dos microenxertos

Após 12 semanas de microenxertia, foi observada altura máxima de brotação (3,04 cm)
no meio de cultura MM-2 suplementado com 0,1 mg L – 1 de GA3 e 0,4 mg L – 1 de
IBA no 'Seda' × 'Seda' (porta-enxerto × ) combinação. Com relação ao desenvolvimento
das microscópicas, o melhor resultado (2,76 cm) foi obtido quando imersos em 1,5 mg
L – 1 de BAP no meio de cultura MM-2 e, no caso dos enxertos de retenção, o melhor
resultado (3,02 cm ) foi observada com o uso de folha de alumínio no meio de cultura
MM-2 (Tabela 4). O enxerto em cunha ou fenda teve que ser realizado para preparar
porta-enxerto e enxerto para microenxertia (método de colocação na superfície), porque
era necessário garantir que a espessura do porta-enxerto e do material do enxerto fossem
grandes o suficiente para permitir uma cunha no material do enxerto (Hussain et al.
2014), e pelo fato de que um contato firme entre o porta-enxerto e o descendente, com a
consequente formação de calos, garantiu o sucesso do processo, como foi observado na
microenxertia in vitro de pistache (Pistacia vera) em porta-enxertos de pistache
selvagem (Canan et al. 2006). Por outro lado, várias técnicas foram desenvolvidas para
manter os enxertos juntos até a fusão. Essas técnicas incluem tubos de silicone
translúcido, tira elástica, ponte de papel de filtro e tubos de vidro, faixas de nylon, tubos
de papel alumínio, aparelhos de dupla camada de papel alumínio e papel absorvente
(Hussain et al. 2014). Em nosso estudo, uma nova técnica, que utiliza fios de cobre, foi
testada.

Cicatrização e formação de calos

Na escala de 1 a 3, o sucesso do enxerto foi determinado por cicatrização e indução de
calos. A maior cicatrização e, consequentemente, a maior indução de calos, foi
observada no meio de cultura MM-2, quando o fio de cobre foi utilizado (2,92) como
enxerto de retenção e imersão em 1,5 mg L – 1 de BAP (2,91) como pré-tratamento,
para as combinações de genótipos porta-enxerto × enxerto (2,86 a 2,88); no entanto,
esses resultados não apresentaram significância estatística (Tabela 5). Em um estudo de
enxerto in vitro de uva com cultivares de porta-enxertos resistentes a filoxera, foi
relatado que o sucesso do enxerto foi determinado pela formação de calos e
enraizamento (Kim et al. 2005). Da mesma forma, no enxerto de Sedum e Solanum,
Moore e Walker (1983) observaram que as massas de calo adjacentes tendiam a
enxertar com sucesso na ausência de diferenciação vascular, e na Opuntia a formação de
calo foi determinada como independente do sucesso do enxerto, embora o crescimento
de calo constituísse um fator chave no desenvolvimento da união do enxerto (Jeffree,
Yeoman 1983). Na microenxertia de pinheiros maduros (Pinus pinea), a proliferação de
um calo intermediário entre o porta-enxerto e o descendente durante a primeira semana
de cultivo também foi um evento determinante (Cortizo et al. 2004).

Desenvolvimento de microenxertos
O sucesso da microenxertia depende principalmente da técnica de enxertia. Em nosso
estudo, o enxerto de fendas, onde as partes unidas foram ligadas com papel de alumínio
asséptico ou fio de cobre asséptico, provou ser o método mais bem-sucedido e eficiente
para microenxertos in vitro. A taxa de sobrevivência do enxerto foi de 87,5 e 83,3%
para os genótipos 'Seda' × 'Beltrán' (porta-enxerto × enxerto) com fio de cobre e 'Seda' ×
'Seda' também com fio de cobre, respectivamente (Tabela 6). Essas combinações foram
as duas melhores entre as 16 combinações experimentadas. O sucesso do enxerto foi
determinado pela formação de calos e enraizamento. O calo tendia a se formar na
junção de uma união de enxerto, surgindo das células vivas de ambos, descendente e
porta-enxerto. Além disso, no meio de cultura MM-1 e MM-2, a taxa de sobrevivência,
após o enxerto, foi de 52,6% e 54,1%, respectivamente (Tabela 6). No enxerto in vitro
de uva com cultivares de porta-enxertos resistentes à filoxera, o sucesso do enxerto foi
determinado pela formação de calos e enraizamento; Neste estudo, o porta-enxerto
'Couderc 3309' foi bem-sucedido no enraizamento, formação de calos e crescimento em
todos os tipos de enxerto, e entre os porta-enxertos ou enxertos, constatou-se que as
compatibilidades de enxerto variavam entre 11% ('Tamnara' / 'Rupestris du Lot ') e
100% (' Schyler '/' Couderc 3309 ') (Kim et al. 2005). Em nosso estudo, a sobrevida do
enxerto foi de cerca de 50% em todas as combinações de genótipos (porta-enxerto x
enxerto). Por outro lado, na microenxertia de pinheiros maduros (Pinus pinea), após a
remoção da bainha da agulha, foi feito um corte para extirpar a braquialblastia e, em
seguida, um corte em forma de V de 2 mm ortogonal ao plano da agulha foi realizada e
os enxertos foram inseridos na fenda e as bordas do hipocótilo foram mantidas juntas
com um anel feito de tubo de cromatografia de parede de 1 mm (Cortizo et al. 2004).
Nesse estudo, o sucesso médio no desenvolvimento (fora da contaminação) do
protocolo foi de 43%, representando os cinco clones testados, resultado um pouco
menor do que o obtido em nosso trabalho. A técnica de microenxerto melhorou a
viabilidade do explante, embora o resultado não tenha sido estatisticamente
significativo. Da mesma forma, o pré-tratamento do descendente permitiu selecionar o
ápice viável e ajudou seu desenvolvimento, o que melhorou bastante o sucesso da
microenxertos, especialmente quando foram usados ápices de brotações de tamanho
muito pequeno (Hussain et al. 2014). Em nosso estudo, o pré-tratamento do enxerto por
imersão em 1,5 mg L – 1 de BAP melhorou a viabilidade do explante, embora o
resultado não tenha sido estatisticamente significativo. MosellaChancel et al. (1979)
relataram 64% de microenxertos bem-sucedidos em pêssego quando foram pré-tratados
com zeatina (0,1 mg L -1) por 48 h, em comparação com os 21,7% de microenxertos
bem-sucedidos obtidos quando não usaram pré-tratamento. Obtivemos os mesmos
resultados usando microenxerto ex vitro e microenxerto in vitro. As plantas climatizadas
ex vitro precisam ser testadas para determinar seu valor agronômico real. Para nosso
conhecimento, este é o primeiro relatório sobre enxerto in vitro para P. lucuma.

Conclusão
No presente estudo, foi estabelecido um protocolo de microenxerto in vitro eficiente,
simples e reprodutível para Pouteria lucuma. O enxerto de fissura provou ser o método
mais eficaz e eficiente para micrografografar in vitro, onde a parte unida foi ligada com
papel de alumínio asséptico ou fio de cobre asséptico. P. lucuma é uma das espécies
nativas mais difundidas amplamente cultivadas nas florestas montanas e nubladas do
Peru.