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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA

FIT 5806 - BIOTECNOLOGIA

APOSTILA (v.6)

Rubens Onofre Nodari

Doutor em Genética (UCDavis-CA), Prof. Titular do Dep. de Fitotecnia, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Santa Catarina, C. Postal 476, Florianópolis, SC, 88040-900, e-mail: nodari@mbox1.ufsc.br

Miguel Pedro Guerra

Doutor em Ciências (USP), Prof. Titular do Dep. de Fitotecnia, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Santa Catarina, C. Postal 476, Florianópolis, SC, 88040-900, e-mail:guerra@cca.ufsc.br

Valdir Marcos Stefenon

Doutor em Ciências Florestais/Genética (Uni-Göttingen-Alemanha), Pesquisador CNPq-PDJ no Dep. de Fitotecnia, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Santa Catarina, e-mail: gene_mol@yahoo.com.br

Florianópolis, Setembro de 2008

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CONTEÚDO

PARTE 1 – Princípios de Genética Molecular

1-Introdução às macromoléculas: proteínas e ácidos nucleicos

5

1.1-Proteínas

5

1.2-Ácidos nucleicos

7

2-Replicação

15

3-Transcrição

17

4-Tradução

18

5-Mutação e reparo

19

6-Metilação

21

7-Regulação gênica

21

PARTE 2 – Marcadores genéticos

1- Introdução

23

2-Marcadores morfológicos

23

3-Marcadores proteínas de sementes

24

4-Isoenzimas

26

5-RFLPs

27

6-Minissatélites

29

7-RAPDs

31

8-Microssatélites

32

9-AFLPs

33

10-SCARs

35

11-SNPs

36

12-Análise comparativa

37

13-Aplicações dos marcadores moleculares

37

PARTE 3 – Organismos Geneticamente Modificados

1-Introdução

42

2-Transformação de plantas

42

3-Diferenças entre os métodos de melhoramento convencionais e biotecnológicos

46

4-Oportunidades

48

5-Evolução do cultivo de plantas transgênicas

50

6-Limitações

54

7-Biossegurança – Regulamentação

54

8-Determinação de risco

60

9-Análise de Risco

61

10-Princípio da Precaução

73

11-Rotulagem

74

12-O caso da soja transgênica resistente ao herbicida gliofosate

75

10-Implicações Sócio-econômicas

76

11-Percepção pública

77

PARTE 4 – Legislação Pertinente

1-Direitos de proteção e patentes

81

2-Lei de proteção das cultivares

82

3-Biodiversidade, Biotecnologia e Agricultura

84

PARTE 5 – Bioética

1-Introdução

88

2-Histórico

88

3-Situação na Europa e EUA

88

4-Situação no Brasil

89

5-Implicações da clonagem de animais

89

6-Relevância da bioética

90

7-A bioética leiga

92

8-As novas tecnologias – espécie humana

92

BIBLIOGRAFIA

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APRESENTAÇÃO

Esta apostila reúne conteúdos básicos de biologia celular e molecular e suas decorrentes aplicações biotecnológicas e outras técnicas de uso freqüente, visando conhecer, conservar e melhorar a diversidade genética existente. O objetivo desta apostila é proporcionar ao estudante um conjunto de informações básicas e as principais aplicações das biotecnologias. Este conjunto de informações se constitui no ponto de partida para estudos mais aprofundados.

A biotecnologia em seu sentido mais amplo compreende a manipulação de microorganismos, plantas e animais, objetivando a obtenção de processos e produtos de interesse. Desta maneira, toda atividade que envolva a aplicação dos conhecimentos de fisiologia, bioquímica e genética, é considerada como técnica biotecnológica. Em seu senso mais restrito a biotecnologia compreende a associação de técnicas mais sofisticadas de biologia molecular e celular, engenharia genética e manipulações celulares in vitro. Para o CNPq, biotecnologia pode ser conceituada como a utilização de sistemas celulares para a obtenção de produtos e desenvolvimento de processos. A FAO (1989) conceitua biotecnologia como a aplicação dos princípios científicos e de engenharia para o processamento de materiais por agentes biológicos proporcionando produtos ou serviços. Fernandes (1987) conceitua como o uso das técnicas de regeneração in vitro e do DNA recombinante. As primeiras atitudes do governo brasileiro em relação às biotecnologias tiveram inicio em meados da década de 1980, quando tanto o CNPq quanto o MCT iniciaram o apoio à formação de recursos humanos. Atualmente, o volume de recursos, o número de bolsas e o número de pesquisadores que trabalham com as biotecnologias na área agrícola e florestal atingem valores inferiores a 10% em relação às demais áreas de C&T no pais. Contudo, é cada vez maior o número de pessoas envolvidas com as biotecnologias, as quais passam a ser utilizadas nas diversas disciplinas da área biológica. No estado de São Paulo, a FAPESP, a agência de fomento a pesquisa do estado de São Paulo, financiou um projeto para o sequenciamento da bactéria Xyllela fastidiosa, o agente causador da doença denominada de amarelinho em citrus. Outros programas de pesquisa em biotecnologia de plantas estão em progresso em café, cacau, soja, milho, trigo e outras espécies de importância econômica. A clonagem de mamíferos, obtidas em 1997, desencadeou uma discussão não só no seio da comunidade científica, mas também em toda a sociedade sobre as implicações do poder das biotecnologias. Toma corpo então a Bioética, que discute o modo de ser (ética) da vida. A bioética pergunta-se sobre a legitimidade dos projetos de efeitos biotecnológicos.

Vários agrônomos estão desenvolvendo atividades na geração de processos e produtos, utilizando estas técnicas biotecnologias. O mercado tende a uma expansão nos próximos anos. Além dos conhecimentos técnicos necessários ao desempenho profissional, o Engenheiro Agrônomo tem um importante papel na discussão das questões relacionadas com as biotecnologias com a sociedade. A liberação da soja transgênica em setembro de 1998, resistente ao herbicida glifosate, constitui-se num marco da agricultura e exige que os profissionais formados tenham o conhecimento técnico e científico não só para o correto manuseio destes organismos como também para participar das decisões a respeito das mesmas.

Agradecemos aos estudantes de pós-graduaçao, em particular as Dras. Adriana Cibele de Mesquita Dantas e a Karine Louise dos Santos e ao MSc. Douglas Steinmacher pelas contribuições a esta apostila.

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Os Autores

PARTE 1 – PRINCÍPIOS DE GENÉTICA MOLECULAR

1-INTRODUÇÃO ÀS MACROMOLÉCULAS: PROTEÍNAS E ÁCIDOS NUCLEICOS

1.1-Proteínas

Proteínas são cadeias de aminoácidos (aa). A estrutura básica é composta de um esqueleto e de grupos laterais variáveis (Figura 1). Uma série repetida de ligações peptídicas entre o carbono de um aa e o nitrogênio de outro aa formam moléculas grandes, as proteínas (Figura 2). Devido a natureza da ligação peptídica, uma das extremidades da proteína é H 2 N (H 3 N + ), denominada de N-terminal, e na outra extremidade encontra-se COOH (COO - ), que é chamada de carboxi-terminal. Existem cerca de 20 aa, cada um com sua forma e constituição química característica. Dependendo da composição, as proteínas podem ter carga positiva, neutra ou negativa. Os aa lisina, arginina e histidina contribuem com carga positiva (denominados de básicos) enquanto que o ácido aspártico e o ácido glutâmico são carregados negativamente (denominados de ácidos). Os demais 15 aa são neutros com relação a carga elétrica. Destes, os polares são: serina, treonina, tirosina, triptofano, asparigina, glutamina e cisteína. Os demais apresentam propriedades hidrofóbicas (não polar): alanina, fenilalanina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, prolina e valina. Tais propriedades (polaridade e a hidrofobia) também são incorporadas às proteínas.

Os tipos de aa
Os
tipos
de
aa

Figura 1: Estrutura geral de um aminoácido mostrando suas estruturas fixas e o radical variável, porção que diferencia os diferentes aminoácidos

incluídos

e

principalmente a sua sequência determinam a

conformação tridimensional e portanto, as propriedades de todas as proteínas. O tamanho de uma proteína pode variar de alguns poucos até 30.000 aa. Trinta ou 40 aa são

suficientes para proporcionar uma conformação terciária.

PARTE 1 – PRINCÍPIOS DE GENÉTICA MOLECULAR 1-INTRODUÇÃO ÀS MACROMOLÉCULAS: PROTEÍNAS E ÁCIDOS NUCLEICOS 1.1-Proteínas Proteínas

Figura 2: oligopeptídeo formado por quatro aminoácidos unidos por ligações peptídicas (em vermelho). O primeiro aminoácido (glicina, com o radical H) apresenta a extremida N- terminal, enquanto o último aminoácido (alanina, com o radical CH 3 ) apresenta a extremidade carboxi-termina.

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A estabilidade das proteínas representa um equilíbrio entre a sua síntese e a sua degradação. Existe um processo contínuo de reposição (turnover) que pode ser caracterizado quando se conhece a meia-vida das proteínas, ou seja o tempo necessário para a renovação da metade da sua concentração. A meia-vida das proteínas pode variar de minutos a mais de 20 horas e sua degradação é catalisada por enzimas proteolíticas. Exemplos: proteínas com N-terminal arginina - 2 min; lisina, leucina e fenilalanina - 3 min; prolina - 7 min; tirosina e glutamina - 10 min.

Na maioria das vezes as proteínas para exercerem suas funções devem sofrer modificações, como fosforilação, glicosilação ou metilação. No processo de fosforilação é adicionado à proteína um grupo fosfato pelas kinases, tonando-se fosfoproteínas. A metilação ou acetilação consiste na incorporação de um metil ou acetil à proteína pelas metilases ou acetilases, respectivamente. A incorporação de carboidratos numa cadeia protéica denomina-se glicosilação, origina as moléculas denominadas de glicoproteínas.

Enzima é a denominação de uma proteína quanto esta apresenta a habilidade de acelerar uma reação fazendo ou quebrando uma ligação (covalente) específica. Para o exercício desta função, as proteínas devem apresentar a conformação terciária ou quaternária. A conformação quaternária é na realidade a agregação de duas ou mais sub- unidades, que nesta condição proporcionam a função catalisadora à uma proteína enzima. Exemplo: Rubisco ou ribulose-1,5-bifosfato carboxilase/oxigenase se torna uma enzima quando oito sub-unidades se agrupam, quatro delas codificadas por genes nucleares e as outras quatro por genes do cloroplasto. A Rubisco é responsável pela inclusão de CO 2 numa cadeia de carbono (1ª etapa no ciclo de Calvin). Tratando-se de enzimas, nem todos os aa participam da reação catalítica. Existe um sítio ativo responsável pela catálise. Este sítio ativo é então um conjunto de aa denominado de motivo ou domain. A domain pode ser entendida como a unidade funcional de uma proteína, uma região relativamente independente da proteína. Nas interações com outras proteínas ou ácidos nucleicos apenas uma parte da proteína, o motivo (ou domain), é responsável pela função.

Quando diferentes proteínas desempenham funções semelhantes, constituem uma família de proteínas. A mesma seqüência formadora de uma determinada domain pode se encontrada em várias proteínas de espécies diferentes. Aparentemente, durante a evolução a domain se moveu dentro da sequência linear de aminoácidos sem perder sua função e especificidade de ligação. Estas domains variam quanto ao número de aa: 18 no Colágeno, mais de 250 aa Fibrinogênio. Freqüentemente, as domains podem se repetir (até mais de 30) numa mesma proteína, neste caso denominadas de motivo (motif) sendo que nem todas as repetições são exatamente idênticas. Estas duplicações provavelmente são devido a existência de elementos móveis ou transformação. As duplicações têm provocado a elongação de muitas proteínas. Estimativas admitem a existência de mais de 50 mil tipos de proteínas numa espécie eucariota.

As primeiras técnicas de separação de macromoléculas, foram desenvolvidas na década de 40. Nesta época foi desenvolvido os sistemas de cromatografia que permitem a separação das frações polares das não polares com base na solubilidade das diferentes moléculas. De acordo com este princípio, um solvente não polar move-se carregando solutos com ele. As substâncias migram a diferentes distâncias de acordo com a sua solubilidade no solvente. Atualmente existem uma dezena de diferentes técnicas de cromatografia, que possibilitam inclusive a identificação de moléculas presentes numa mistura.

Nos anos 80 foi descoberto que algumas doenças (desordens degenerativas) poderiam ser causadas por agentes infecciosos formados apenas por proteínas. Estas proteínas foram denominadas de príons ('proteinaceous infections particles'). O príon é uma forma alterada da proteína PrP que normalmente está presente no cérebro de vertebrados. Estas desordens degenerativas ocorrem com freqüência em animais e muito raro na espécie humana.

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O sequenciamento de proteínas é uma técnica, desenvolvida por (Sanger, 1950), com a finalidade de conhecer a seqüência dos aa numa proteína. As implicações desta descoberta são inúmeras. A mais importante se relaciona com a saúde humana, pois a técnica permitiu a identificação de inúmeras doenças. Mutações ao nível de DNA podem provocar a substituição de um aa por outro numa determinada posição da seqüência de uma proteína e dependendo da posição a proteína perde sua função, causando então uma doença. Outra conseqüência foi a possibilidade de inferência da seqüência de bases ao nível de DNA que codifica para as proteínas sequenciadas. Isto permitiu o isolamento e a clonagem dos primeiros genes. Mais tarde, o próprio Sanger desenvolveu um método de sequenciamento de DNA. Por esta contribuição à ciência, Sanger foi agraciado com um segundo prêmio Nobel.

1.2-ÁCIDOS NUCLEICOS 1.2.1-Ácido desoxirribonucleico - DNA

As moléculas de DNA têm estrutura em forma de dupla hélice, semelhante a de uma escada retorcida. Cada fita é formada por uma seqüência de nucleotídeos (dNTP). Cada dNTP é composto de uma base nitrogenada ligadas a uma molécula de açúcar (desoxirribose) e um grupo fosfato. As bases nitrogenadas ligadas a desoxirribose são quatro: adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T). Uma ligação fosfodiéster unindo o grupo fosfato de um dNTP e o açúcar desoxirribose de outro dNTP forma o esqueleto da fita (strand), como se fosse uma das laterais da escada. A outra fita (ou a outra lateral da escada) é formada da mesma maneira, mas com orientação da ligação fosfodiéster contrária, o que impõe a característica de antiparalelismo as duas fitas. Cada fita tem uma orientação (5'-3') em função da natureza da ligação fosfodiéster entre o carbono 3' e o 5' da desoxirribose, sendo que um nucleotídeo só pode ser incluído na cadeia através da ligação do fosfato com o carbono 3'OH da desorribose. Por isto, a orientação da cadeia é 5'-3', pois haverá sempre o carbono 3' numa das extremidade da fita.

Mais do que isto, estas duas fitas são complementares já que quando existir adenina de um lado, somente timina é encontrada na mesma posição na outra fita. O mesmo acontece com citosina e guanina. São estes os dois únicos tipos complementação de bases nitrogenadas possíveis no DNA. Como conseqüência o número de adeninas será igual ao número de timinas num organismo. O mesmo vale para C e G. Entretanto a quantidade de purinas (A e G) é característica de cada espécie. Assim a proporção entre A e G é de 0,7 em Bacillus, 1,56 no homem e 1,7 em Saccharomyces cereviseae. Isto é conhecido como regra de Chargaff.

Entre as bases nitrogenadas existem pontes de hidrogênio, duas entre A e T e três entre C e G. Tais pontes juntamente com outras forças, mantêm as duas fitas unidas. Cada par de bases é análogo a um degrau desta escada. O DNA funciona como um modelo para a síntese de novas fitas de DNA. O DNA é a molécula responsável pelo armazenamento e perpetuação do código genético. Apesar da ocorrência de 3 tipos de DNAs ('A', 'Z', 'B'), aparentemente desempenham a mesma função.

A prova definitiva de que o DNA é a molécula repositório do código genético foi obtida em 1952 por Hershey e Chase. Experimentalmente adicionou-se 32 P numa colônia de bactérias infectadas por vírus, neste caso o fósforo radioativo foi incorporado no DNA, já que pouco ou quase nenhum fósforo é encontrado nas proteínas. Num experimento paralelo, foi feita a adição do isótopo 35 S, que pode marcar radioativamente as proteínas, já que estas têm enxofre, mas não marca o DNA, pois este não contém enxofre. Como só o 32 P foi detectado nas progênies dos vírus, conclui-se que o DNA passava de geração a geração. Na realidade, oito anos antes, outros três cientistas (Avery, MacLead e McCarty) haviam postulado que o agente transformador (possivelmente o DNA) era destruído pela desorribonuclease pancreática que por sua vez não afetava as proteínas.

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A quantidade de DNA pode variar de 10 3 a 10 13 nucleotídeos. Esta quantidade de DNA por célula haplóide é denominada de valor C. São aproximadamente 3 bilhões de pares de bases no núcleo de cada célula humana. Entretanto podem ser apenas 5387 no vírus φx174. A maioria das plantas tem uma quantidade de DNA que varia entre 10 9 a 10 11 . Nos mamíferos existem de 10 9 a 10 10 pares de bases; já alguns peixes ou anfíbios podem ter até 10 13 pares de bases. É muito DNA para pouca função (paradoxo do valor C). Enquanto nos procariotos praticamente quase todo o DNA carrega informações necessárias para a síntese de proteínas e RNAs, a maior parte da seqüência de bases dos eucariotos não codifica para produto algum. Assim apenas 3% (aproximadamente) do genoma humano é formado por genes (estimados em mais de 50 mil) sendo que a função do restante ainda não está suficientemente compreendida. A maior parte deste DNA sem função conhecida é composto por seqüências repetidas, de onde se originou o nome de DNA repetitivo (selfish, nos anos 80).

Quando esticada, uma molécula de DNA de qualquer célula humana mediria 1,80 m e teria a espessura de um trilionésimo de um centímetro (1 micrômetro = 1 milésimo de milímetro). Uma célula humana não comportaria tal estrutura. Dentro de uma célula as moléculas de DNA estão ligadas a proteínas e são retorcidas ou enroladas (supercoil). Quando completamente compactadas são possíveis de serem visualizadas no microscópio ótico e recebem a denominação de cromossomos. A compactação pode alcançar um fator de 7000 vezes. Vírus e bactérias contêm apenas um cromossomo. Já os eucariotos (fungos, plantas, animais) têm dois ou mais cromossomos que em geral, variam de tamanhos.

Figura 3: Nucleotídeos formados com as pentoses ribose (formam RNAs) ou desoxiribose (forma DNA). A diferença
Figura 3: Nucleotídeos
formados
com as pentoses ribose (formam
RNAs)
ou
desoxiribose
(forma
DNA).
A
diferença
entre
as
pentoses
está
realçada
em
vermelho.
Figura 4:
ligação
entre
dois
desoxirribonucleotídeos
(dNTPs),
através
de
uma
ligação fosfodiéster
(em vermelho) entre o grupo fosfato de
um dNTP e a pentose de outro dNTP.
Os carbonos 5’ e 3’ estão realçados em
azul.
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Genoma e gene

A seqüência de pares de bases que formam o DNA pode ser chamada de genoma. A forma do genoma pode ser circular como nos vírus, bactérias, mitocôndria, cloroplasto e plasmídeos ou linear como nos cromossomos dos organismos eucariotos e alguns procariotos. O genoma da maioria absoluta dos organismos é de DNA. Poucos vírus são de RNA, como Influenza, HIV, TMV, poliomielite. A grande maioria também apresenta fita dupla. Exceção a alguns vírus como (φx174, M13 e f1, cujos genomas são constituídos de apenas uma fita de DNA. As características de um indivíduo como a cor dos olhos ou da pele são determinadas por um conjunto limitado de pares de bases contidas no DNA (ou no RNA, como já mencionado, trecho este, denominado de gene.

O conceito de gene evoluiu tanto quanto a biologia. Uma das primeiras observações sobre o tema foi feita por Leonardo da Vinci. Observando a cor dos filhos de mulheres brancas com homens pretos, ele sugeriu que a semente da mãe tinha o mesmo vigor que a do pai (Wallace, 1992). Mas foi Mendel em 1865 quem utilizou pela primeira vez a expressão fator para os componentes hereditários parentais responsáveis pelas características nas progênies. Só mais tarde (1908), Johannsen sugeriu o termo gene para designar os fatores hereditários.

Por gene entende-se a unidade de herança. Contudo, os diferentes textos de genética apresentam diferentes conceitos para gene. Segundo a maioria dos autores, o principal atributo do gene é sua relação com a proteína que codifica. Neste caso, define-se gene como sendo um segmento de DNA, que através da intermediação de uma molécula mensageira de RNA, é responsável pela especificação de uma cadeia peptídica (Wallace, 1992). Entretanto, outros geneticistas incluem, além das proteínas, os RNAs como produtos gênicos transcritos, mas não traduzidos. Neste caso, a definição de gene é um segmento de DNA responsável pela produção de um produto difusível (Lewin, 1994). Como um significativo grupo de RNAs exerce funções outras que a de mensageiro, como por exemplo, a regulação gênica, o segundo conceito de gene é mais realista.

Por se tratar de uma seqüência de DNA, um gene pode ocorrer sob mais que uma alternativa ou alelo. Desta forma, basta uma alteração na seqüência de bases que cause uma mudança no produto, para que se configure uma alternativa (alelo) diferente. Para simplicidade, normalmente utiliza-se um modelo básico de um gene com dois possíveis alelos, já que a maioria dos seres vivos é diplóide, portanto, carregam dois alelos (um em cada cromossomo homólogo) para o mesmo gene. Mas na realidade, um gene pode ter muitas alternativas. Evidentemente que num indivíduo diplóide só ocorrem uma ou duas formas no máximo. Mas diferentes indivíduos podem apresentar formas alélicas diferentes uns dos outros. Um dos exemplos mais conhecido trata-se do tipo sanguíneo, sendo que numa população de indivíduos podem ser encontrados quatro diferentes alelos.

Sequenciamento de ácidos nucleicos

O sequenciamento consiste na identificação ordenada dos nucleotídeos que compõem um fragmento de DNA ou RNA. Existem duas técnicas que são utilizadas normalmente em laboratórios. Por outro lado, nos últimos anos foram desenvolvidos equipamentos sequenciadores de alta velocidade e que estão sendo utilizados no sequenciamento de espécies procariotas (bactécias) e eucariotas (fungos, vegetais e animais, incluindo Homo sapiens).

Conhecer a sequência de bases dos genomas das espécies tem sido um dos objetivos dos biólogos. A sequência completa de vários vírus já é conhecida há bastante tempo, devido ao fato do pequeno número de nucleotídeos participantes de seus genomas. Em 1995 foi finalizado o sequenciamento do genoma das duas primeiras bactérias pelo 'The Institute for Genomic Research' (TIGR – http://www.tigr.org/tdb/): Haemophilus influenzae e Mycoplasma genitalium. A primeira delas, que causa a inflamação no ouvido, tem

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aproximadamente 1,8 milhão de pares de bases e aproximadamente 1700 genes. A segunda que tem apenas 570 genes está associada às infeções reprodutivas. O sequenciamento do organismo deve contribuir para o desenvolvimento de vacinas ou outras estratégias de combate a doença causada por aquela bactéria. Além disso, o seqüenciamento do Saccharomyces cerevisae, iniciado em 1989, foi concluído em junho de 1996, resultante de um projeto feito em parceria por um grupo de pesquisadores de vários países europeus. Esta levedura, além de ser utilizada como modelo genético para estudos em espécies eucariotas, é utilizada na produção de bebidas fermentadas. O seqüenciamento desta levedura é um marco histórico, pois foi o primeiro organismo eucarioto a ter seus genes totalmente inventariados. Brevemente, serão conhecidas a maioria das seqüências de nucleotídeos de várias espécies vegetais e animais de importância econômica e científica.

Tabela 1: Número de genes e tamanho do genoma de espécies parcial ou totalmente sequenciadas

Espécie

Em milhões de pares de bases

Número de genes

Mycoplasma genitalium

0,58

482*

Helicobacter pylori

1,67

1.590*

Haemophilus influenzae e

1,83

1.740*

Bacillus subtilis

4,20

4.000*

Escherichia coli

4,639

4.307*

Saccharomyces cerevisae

12,50

6.034*

Caenorhabditis elegans

100

13.100

Arabidopsis thaliana

150

20.000

Oryza sativa

430

30.000

Sorghum bicolor

760

30.000

Zea mays

2.000

30.000

Homo sapiens

3.000

100.000

Triticum aestivum

16.000

30.000

*Já sequenciados (Adaptado de Science 276:1960, 1997; Science 277:1432, 1997)

O primeiro projeto no Brasil nesta área foi o sequenciamento da bactéria Xyllela fastidiosa que causa uma doença no citrus chamada de amarelinho. O referido projeto foi iniciado em 1997 e tem um orçamento de 14 milhões de dólares, financiado pela FAPESP, que é a Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo. O número de espécies já totalmente sequenciadas cresce ano a ano e várias espécies vegetais e animais estão sendo sequenciadas, entre elas, arroz, milho, soja, boi e porco. Enquanto nos procariotos, a densidade média de genes é de 1 gene a cada 1000 pb aproximadamente, nos eucariotos é de 1 gene a cada 2000 pb nas leveduras, 1 gene em 5000 pb nos nematóides e 1 gene a cada 4800 pb em Arabidopsis. A maior quantidade de DNA pode ser parcialmente explicada pelo fato de que, nos eucariotos a parte regulatória dos genes é muito maior que nos procariotos. Além disso, nos eucariotos existem sequências repetidas, que são ausentes nos procariotos. Embora se saiba o número de genes dos organismos sequenciados, ainda não se conhece as funções de 40 a 60% dos genes, dependendo da espécie. O

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conhecimento da sequência de bases de um genoma permite aos biólogos o entendimento do funcionamento dos organismos, as funções dos genes, que tipo, tamanho, quantidade e características das proteínas formadas. A maior parte das espécies de bactérias já sequenciadas causam doenças à espécie humana. A razão principal para se conhecer sua sequência relaciona-se com a possibilidade do seu controle, via desenvolvimento de vacinas ou outros medicamentos. As plantas são a base da vida na terra. Contudo, pouco se conhece de seu genoma. O genoma das angiospermas é altamente variável, mas ainda praticamente desconhecido. Desconhecemos também o número de espécies e o número de genes em cada espécie. Na verdade, ainda não é conhecido o número de cromossomos de mais de 70% das espécies vegetais. O valor C de DNA só é conhecido em 1% das espécies. Desta forma, o projeto genoma é de fundamental importância para o aprofundamento do conhecimento das plantas, domesticadas ou não.

Muitos cientistas têm afirmado que o seqüenciamento completo do genoma humano (estimado em três bilhões de pares de bases) deverá revolucionar a medicina e poderá auxiliar na cura para as mais de 3000 doenças hereditárias que atingem a raça humana. Iniciado em 1985, o seqüenciamento do genoma humano que reúne cientistas e laboratórios dos Estados Unidos, Canadá, Japão, Inglaterra, França, Rússia, Itália, Austrália e Brasil entre outros, foi completado antes da data prevista (2005). Quando pronto, o arquivo necessário ao armazenamento das informações se torna equivalente a 200 listas telefônicas com mil páginas cada uma. O GenBank (USA) e o DNA Database (Japão) já dispõem de informações de mapeamento e sequenciamento de mais de 2500 diferentes organismos. Mapas físico e de ligação foram divulgados (com resolução elevada) nos anos de 1993 e 1994 por cientistas franceses e americanos. Tais mapas facilitarão a clonagem de genes humanos, como aqueles envolvidos com as doenças, a obesidade, entre outras.

Introns e exons

Foi descoberto nos anos 70 a presença de seqüências presentes no DNA mas não no RNA mensageiro, produto da transcrição do DNA. Tais seqüências foram denominadas de introns (intervening sequences) e estão intercaladas com os exons (expressed sequences), que são as regiões codificadoras dos genes. A remoção dos introns é feita por enzimas e faz parte do processamento que sofre o pré-mRNA antes de sair do núcleo (Figura 5). A presença de introns ou sequências intervenientes sugere uma maior oportunidade para recombinações e maior acúmulo de mutações. Introns são comuns nos eucariotos e raramente encontrados nos procariotos. Quando é o intron que faz o processamento, ele se regenera no final do processo. Neste caso, o intron seria uma enzima, proporcionando ao RNA a função de catálise. Nas bactérias ainda não foram detectados introns. Uma das hipóteses é de que as bactérias perderam os introns durante a evolução. Neste caso os introns teriam se originado no início da vida. Outra hipótese admite que os introns surgiram com os eucariotos. Na realidade, ainda não se sabe exatamente como os introns surgiram, nem tampouco se apareceram logo no início da vida ou surgiram mais recentemente. Embora tenham características similares, os introns são muito diversos quanto ao tamanho, processamento e funções. Certos introns, em especial os do chamado grupo I, comuns em genomas de organelas celulares (como a mitocôndria) e em alguns genes do núcleo (como o rRNA), apresentam características especiais. Eles próprios realizam sua remoção do pré-mRNA (autocatálise) e ligam os exons, fenômeno denominado self- splicing. Alguns introns desse grupo são elementos móveis (transposons), capazes de se transferir em cruzamentos genéticos para alelos que não os continham, pelo processo denominado homing, iniciado com o corte do DNA por uma endonuclease, enzima codificada pelo próprio intron. Outros introns do grupo I codificam cofatores protéicos, como as maturases. São poucos os casos conhecidos em que um mesmo produto desse tipo de intron realiza ambas as funções -- de endonuclease e de maturase.

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Figura 5: Representação esquemática da estrutura de um gene eucarioto, contendo exons e introns. No rocesso

Figura 5: Representação esquemática da estrutura de um gene eucarioto, contendo exons e introns. No rocesso de splicing do RNA, os introns são retirados, ao mesmo tempo que um cap e uma cauda de adeninas são adicionados ao mRNA.

Já são conhecidos casos de transferência de introns do grupo I entre indivíduos da mesma espécie (transferência vertical). Nesse caso, um intron passa de um alelo para outro que não o continha. Também já foi constatado que introns desse grupo presentes no genoma das mitocôndrias podem passar de uma espécie para outra (transferência horizontal, ou lateral), mas dentro do mesmo filo. A transferência lateral, entre organismos que não se acasalam sexualmente, foi objeto de profundo estudo de Yangrae Cho e colaboradores, publicado em novembro de 1998. O estudo envolveu um intron do grupo I do genoma mitocondrial de plantas vasculares, bastante conhecido e localizado no gene cox1 da erva Peperomia polybotrya, que teria sido adquirido de um fungo, por transferência lateral. Analisando o DNA de 335 plantas de diferentes gêneros, os autores verificaram que esse intron está amplamente disseminado nos genes cox1 das angiospermas. O intron estudado está presente em 48 gêneros diferentes, a partir de 32 eventos independentes de transferência lateral. A conclusão sobre as transferências baseia-se em três pontos principais: a presença constante do gene cox1 e esporádica do intron, a incongruência entre as filogenias (histórias evolucionárias) das espécies e dos introns e a

co-conversão (Co-conversão é quando parte das extremidades de um segmento de DNA – 3 a 18 pb -, após o processo de recombinação/reparo, é convertida à sequência do DNA

doador ou invasor. Assim, o DNA da espécie recipiente é parcialmente degradado e uma nova sequência é sintetizada com base no molde do DNA da espécie doadora. Desta forma,

a conversão deixa um rastro, pois a sequência original é alterada.) das seqüências próximas do local de inserção do intron. O primeiro ponto indica que o gene cox1 se disseminou com alta freqüência e manteve-se nas espécies que o receberam, enquanto o intron foi perdido na maioria dos casos. O segundo demonstra que a transferência independe do grau de parentesco entre as diferentes plantas. E o último -- a divergência genética das regiões que flanqueiam a inserção do intron -- revela que a transferência se dá via recombinação/reparo e é catalisada por uma endonuclease. Esse processo, conhecido como homing, é exatamente o que esse tipo de intron promove.

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Os resultados geram várias preocupações. Entre as dúvidas principais estão a causa da extraordinária invasão desse intron, os passos do processo de transferência em nível celular e o caminho evolutivo da dispersão do intron do grupo I do gene cox1 entre as angiospermas. Entre as implicações, a mais importante está ligada à freqüência com que o DNA é transferido de uma espécie a outra. A transmissão planta a planta requer acasalamento sexual ou a ajuda de vetores (vírus, bactérias, insetos e outros). A questão é bastante atual, já que muitas plantas transgênicas estão sendo liberadas para cultivo. O trabalho de Cho e colegas demonstra claramente que a transferência horizontal ocorre e é mais freqüente do que se imagina. Isso torna imperativo estudar o fluxo gênico entre plantas transgênicas e espécies afins, antes de sua liberação para cultivo, para testar a possibilidade de uma irradiação de genes, que podem ser desejáveis em uma espécie mas completamente indesejáveis em outras. A probabilidade desta irradiação aumenta com o aumento do cultivo destas plantas, principalmente no sistema de monocultura. Num dado momento, um mesmo gene poderá estar presente em milhões de plantas, aumentando o risco da transferência horizontal.

1.2.2-Ácido ribonucleico - RNA

Apesar de ser também um ácido nucleíco, o RNA têm muitas diferenças em relação ao DNA. Em primeiro lugar, todos os RNAs são formados por apenas uma fita. Entretanto, pode apresentar uma configuração denominada de secundária, quando ocorre o pareamento entre bases complementares. Ao invés de desoxirribose como no DNA, o açúcar do RNA é uma ribose (uma oxidrila a mais em relação a desoxirribose do DNA). A terceira principal diferença é a presença de uracil (U) ao invés de timina (T). Podem ocorrer pelo menos quatro tipos de RNA: mRNA (1-3%), rRNA (>90%), tRNA (1-2%) e sRNA (?%), denominados de mensageiro, ribossomal, transportador e small RNAs, respectivamente. Cada um deles desempenha funções específicas. Dentro do último grupo, são incluídos um grande grupo de RNAs, muitos dos quais ainda sem função conhecida. Outros estão envolvidos na regulação gênica.

Além das funções de mensageiro entre o DNA e os ribossomos, formador dos ribossomos, e transportador de aminoácidos, os RNAs podem ainda desempenhar a função de catálise e de regulação gênica. A função de catálise (até então exclusividade das proteínas) foi descoberta na década passada e os RNAs que têm esta habilidade, as ribozimas, realizam a separação do RNA transcrito em várias partes, fenômeno que se chama de splicing. O autoprocessamento do RNA não é idêntico à catálise enzimática executada pelas proteínas. Numa reação enzimática, a proteína se envolve mas é liberada intacta ao final do processo. No caso do autoprocessamento, o pré-RNA se processa a si próprio, sem a presença de enzimas, mas não se regenera no fim do processo. Portanto, o pré-RNA não é uma enzima, mas tem a propriedade de catálise. Além disso, foi verificado experimentalmente que o RNA tem a capacidade de retirar bases de um segmento de RNA e adicioná-las em outro, demonstrando a capacidade de sintetizar algo semelhante a si próprio.

mRNA

Resultam da transcrição de um gene. São os RNA mensageiros (mRNA), aqueles que serão decodificados pelos ribossomos e contém informações para a produção de uma proteína. O tamanho dos mRNAs é variável, dependendo do número de bases contidas no gene transcrito. Como contém uma mensagem, diz-se que existe uma colinearidade entre as bases do mRNA e a sequência de aminoácidos da proteína resultante de sua

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decodificação. O tempo de vida de um mRNA é muito pequeno. Na maioria dos procariotos a meia vida de um mRNA não ultrapassa 2 minutos. Já nos eucariotos, alguns mRNAs duram algumas horas.

rRNA

O RNA ribossomal (rRNA) também é resultante da transcrição de genes de uma região do DNA, neste caso denominada de rDNA. O produto da transcrição não é decodificada, pois os próprios RNAs produzidos juntamente com proteínas vão formar os ribossomos e executar a função específica, que é a produção de proteínas. Participam da formação do ribossomo de um procarioto três rRNAs: o 5S rRNA com 120 nucleotídeos, o 16S rRNA com 1542 nucleotídeos e o 23S rRNA com 2904 nucleotídeos. Nos eucariotos, estes rRNAs são um pouco maiores e designados de o 5S rRNA, o 18S rRNA e o 28S rRNA. Entretanto, nem todos os eucariotos têm os rRNAs do mesmo tamanho.

tRNA

Denominada de adaptadores por Francis Crick, o tRNA (RNA transportador) é um RNA que tem a função específica de transportar os aminoácidos até o ribossomo durante a síntese de uma proteína. São moléculas relativamente pequenas, contendo de 73 a 93 nucleotídeos. Dos ácidos nucleicos conhecidos, o tRNA é o único que apresenta algumas bases que não A, C, G e T. Numa célula existem pelo menos tantos tRNAs quanto são os aminoácidos, e estes estão ligados ao tRNA na extremidade 3'OH. A estrutura tridimensional de um tRNA assemelha-se a uma folha de trevo, contendo numa das alças (loop ou hairpin) o anticodon, que é uma seqüência de três bases.

Outros RNAs

Existem outros RNAs, muitos deles transcritos e que permanecem no núcleo da célula sem função aparente (hnRNA). Outros RNAs, de cadeia curta, chamados de snRNA, estão envolvidos na regulação gênica. Mais recentemente, descobriu-se que alguns RNAs podem se deslocar de suas células e desempenhar uma atividade em outra célula,

provavelmente regulatória. Particularmente os RNAi ou RNA interferência é uma classe de RNAs que ação regulatória.

Temos que escrever mais sobre os RNAs ....

1.2.3-Ácido peptídeo nucléico (PNA)

Esta nova molécula, criada em 1991 em laboratório, têm as quatro bases nitrogenadas do DNA ou RNA ligadas ao esqueleto de uma proteína. Este novo composto sintético além de ser mais estável nas células que o DNA e o RNA, se liga naturalmente a estes com uma intensidade 50 a 100 vezes mais forte que os próprios ácidos nucleicos naturais o fazem entre si. Quando se liga ao DNA, forma uma estrutura de três fitas. Isto permite o uso destas moléculas na terapia gênica, pois pode provocar a indisponibilidade daquela região genômica ser acessada por enzimas e proteínas. Neste caso, poderia ser utilizado um PNA para se ligar a um gene defeituoso que, então, deixaria de expressar uma proteína defeituosa. Os PNAs podem procurar e se ligar a outra fita com seqüência complementar de bases, estratégia similar ao antisenso.

O PNA é construído ligando-se cada base nitrogenada a um peptídeo ao invés de um açúcar e um grupo fosfato. Como a cadeia de peptídeos tem carga elétrica neutra, os PNAs apresentam uma grande capacidade de ligação, eliminando a repulsão criada pela carga

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elétrica negativa devido a presença dos grupos fosfatos presentes no DNA e RNA. Além disso, os PNAs podem atacar genes invadindo a dupla hélice, algo que DNA e RNA não conseguem. Mais ainda, a química de peptídeos é simples e mais barata que sintetizar ácidos nucleicos.

Este produto da biotecnologia poderá ser aplicado na saúde humana. O principal argumento da utilização dos PNAs em diagnóstico decorre do fato da grande afinidade com o alvo; quanto maior a afinidade, maior é a possibilidade de ligação com seqüências específicas e consequentemente, a sua marcação. Mas como a molécula é artificial, ainda não se conhece ainda a sua toxicidade.

1.2.4-Ácidos nucleicos e a origem da vida

Como é capaz de armazenar o código genético em alguns vírus, tem a função catalítica e de regulação gênica, o RNA passou a ser admitido (hipótese) como a provável molécula que poderia ter originado a vida a partir do 'caldo primitivo'. Esta teoria tem recebido contribuições científicas por uma grande quantidade de cientistas do mundo inteiro. Duplicando RNAs semelhantes como os RNAs ribossomais e participando da produção das proteínas, o RNA é um forte candidato a ser a estrutura do primeiro ser vivo na face da Terra. A função catalítica, entendida aqui como sendo a capacidade de quebrar e ligar outros RNAs, já foi comprovada. Há também resultados de pesquisa que atribuem ao RNA a capacidade de editoração, um sistema simplificado do sistema de reparo do DNA. Os vírus que possuem RNA como material genético necessitam da enzima transcriptase reversa para produzir DNA e então se replicarem. Quando se provar que o RNA tem ou teve capacidade de autoduplicação, será dado um passo importante favorável a hipótese do 'Mundo do RNA'. Nenhuma outra molécula teria a capacidade e a versatilidade de desempenhar tantas funções como o RNA no 'caldo primitivo'. Outra hipótese considera uma molécula mais simples, precursora do RNA, composta de um ácido nucléico ligado a peptídeos (denominada de PNA). Alguns cientistas não concordam com estas hipóteses por considerarem que as moléculas de RNA são muito complexas para ter tido origem no ambiente primitivo terrestre, onde só havia água, gás carbônico, nitrogênio e radiação ultravioleta. Além disso, no 'caldo primitivo' deveriam existir substâncias muitos tóxicas. Em contrapartida, admitem que sob as condições primitivas, a estrutura cristalográfica dos minerais seria capaz de reduzir dióxido de carbono para formar aldeídos e a partir destes se formariam açúcares e moléculas orgânicas essenciais. A transferência de elétrons de uma molécula outra poderia ter contribuído para as transformações metabólicas. Recentemente, cientistas obtiveram moléculas de RNA mais complexas quando utilizaram uma mistura de pequenas moléculas de RNA sob condições de altas temperaturas, situação que deve ter ocorrido na época do surgimento da vida.

Outra possibilidade da origem da vida seria via metabólitos secundários. Tais metabólitos, considerados secundários no atual estágio evolutivo, teriam sido relevantes no período pré-biótico como integrantes do metabolismo primário responsável pela síntese dos ácidos núcleicos e tradução e replicação.

De qualquer forma, a hipótese de maior consenso é a de que o RNA teria sido o primeiro material genético sobre o qual a evolução agiu, resultando numa quantidade enorme de formas de vida que se conhecem atualmente.

2-REPLICAÇÃO (Replication)

O DNA funciona como um modelo para a síntese de novas fitas de DNA de maneira semiconservativa, ou seja, cada uma das duas moléculas filhas tem uma fita da molécula mãe e outra recém sintetizada. A replicação ocorre bidirecionalmente a partir de uma

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(procariotos) ou várias (eucariotos) origens. A replicação é precisa (alta fidelidade), ou seja, a maioria dos erros são corrigidos. Cabe a replicação o desafio maior de perpetuar, com alta fidelidade, um genoma e ao mesmo tempo permitir erros que originam a variabilidade necessária para a evolução.

A origem de replicação é uma região do DNA que contém uma seqüência de bases específica. Nas bactérias só existe uma destas seqüências. A rigor, a replicação completa do cromossomo de uma bactéria depende da iniciação nesta seqüência. Neste caso, é dito que as bactérias têm apenas um replicon. Replicon é a unidade de DNA no qual a replicação ocorre a partir de uma origem. Já os eucariotos, por terem genomas bem maiores que as bactérias e mais de um cromossomo, têm várias origens de replicação. Nas leveduras (ex: Saccharomyces cerevisiae) existem pelo menos umas 500 origens de replicação, denominadas de ARS (Autonomously Replicating Sequences); ou seja, 500 replicons. Na Drosophila melanogaster existem cerca de 3.500 replicons. Já na Vicia faba estima-se a presença de pelo menos 35.000 replicons. As origens de replicação dos eucariotos são ativados em diferentes tempos durante o período de replicação do ciclo celular (fase S da mitose). Estas origens de replicação estão espaçadas em média de 50 a 100 kb. A velocidade de replicação em Escherichia coli, a bactéria residente no intestino de todas as pessoas, chega alcançar 50.000 bases por minuto. Nos eucariotos, o movimento do garfo de replicação é pelo menos 10 vezes mais lento.

Os vírus apresentam um modo de replicação específico denominado de círculo rolando (rolling circle). Uma vez iniciada a replicação, o genoma circular vai sendo replicado indefinidamente. Posteriormente uma enzima produzida pelo próprio genoma viral, corta a longa cadeia produzida em partes iguais, cada uma contendo uma cópia do genoma do vírus, a ser subseqüentemente encapsulada.

Mais de 20 enzimas atuam diretamente no processo de replicação das bactérias. As principais proteínas envolvidas e sua função na replicação são apresentadas abaixo:

toposisomerases - desenovelam o DNA helicases - separam as duas fitas Single strand binding proteins (SSB) - protegem o DNA na forma de fita simples Primase - adiciona os primers ou iniciadores DNA polimerase III - polimeriza, i.é., adiciona os dNTP no sentido 5'-3'

DNA polimerase I - substitui os iniciadores de RNA por bases do DNA; também tem a função de reparo

ligase - une os dNTP de dois fragmentos.

Nos procariotos, além destas duas polimerases, existe uma terceira, a DNA polimerase II, cuja função ainda é desconhecida. Das três, somente a DNA Pol I apresenta a função de edição ou seja, de correção dos possíveis erros de replicação. A DNA Pol I é formada por várias sub-unidades. O agrupamento de algumas delas forma o que se conhece por fragmento Klenow, utilizado para replicação do DNA in vitro. Este fragmento não tem a habilidade de edição como a enzima completa, pode ser comprado de vários fornecedores e é usado em laboratórios. A DNA Pol III é formada por sete sub-unidades ou polipetídeos.

Nos eucariotos também existem três polimerases. Duas delas atuam no núcleo, sendo que a DNA Pol αααα teria a mesma função que a DNA pol III dos procariotos. A DNA Pol ß teria a função de reparo. A terceira polimerase (DNA Pol γγγγ ) é específica para a replicação do genoma das mitocôndrias.

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A replicação dos genomas dos retrovírus, que são codificados por RNA, é feita pela transcritpase reversa (RT), o que pode produzir inúmeros variantes. O conhecimento da natureza molecular destes vírus permite a criação de estratégias para combatê-los. Moléculas ribozimas de RNA foram engenheiradas e podem ser introduzidas nos hospedeiros para procurar e destruir o genoma do HIV, cortando-os em dois.

O avanço no conhecimento científico sobre a replicação foi de fundamental importância no desenvolvimento da reação da polimerização em cadeia (PCR), uma das técnicas moleculares mais utilizadas no momento.

3-TRANSCRIÇÃO (Transcription)

Transcrição é o processo pelo qual uma região do DNA é transcrita resultando num RNA. Existem dois grandes grupos de RNAs: (i) os RNA mensageiros (mRNA), aqueles que serão decodificados pelos ribossomos e contém informações para a produção de uma proteína e (ii) o outro grupo de RNAs, formado pela transcrição de determinadas regiões genômicas e que permanecem como RNA para executar uma função específica. Entre eles estão o transportador (tRNA), o ribossomal (rRNA) que juntamente com proteínas forma os ribossomos e outros RNAs (snRNA, hnRNA, etc.) com função na regulação gênica ou desconhecida. A região (segmento) do DNA transcrita é a parte estrutural do gene.

A transcrição nos procariotos é feita pela RNA polimerase. Numa E. coli podem existir até 3.000 cópias dela. Esta enzima usa o DNA como molde e sintetiza uma cadeia de nucleotídeos de RNA complementar ao molde. Aparentemente não há conferência do produto transcrito. Se no DNA estão A, C, G e T, vai aparecer no mRNA U, G, C e A, respectivamente. A exemplo da replicação, a transcrição ocorre na direção 5'-3'.

Seis peptídeos ou sub-unidades fazem parte da RNA pol (ß'ßα 2 ωσσσσ). A rigor o fator σσσσ tem a habilidade de reconhecer o promotor, que é a região 5', situada imediatamente anterior ao início da parte codificadora (ou estrutural) do gene. Posteriormente, juntam-se ao fator s os demais peptídeos quando então a RNA Pol inicia o processo de transcrição. Vários fatores de transcrição (pequenos polipeptídeos), os TFs, atuam no início, durante a elongação e no término da transcrição.

O fator σσσσ (é de fundamental importância. Quando um vírus entra numa célula hospedeira, um fator ( do vírus é transcrito e agora os outros cinco peptídeos da RNA Pol ficam a disposição do fator ( do vírus, que reconhece tão somente os genes do vírus. Desta forma, em pouco tempo os vírus conseguem expressar seus genes no hospedeiro e se replicando a uma velocidade impressionante, atingem milhões de cópias. Afetam drasticamente o organismo hospedeiro porque também reprimem a produção de proteínas deste.

O promotor das bactérias é formado por duas seqüências localizadas nas posições - 10 e -35 (região 5') da base codificante +1 do gene. Nestas regiões, normalmente são encontradas as seqüências (consenso) TATAAT (denominada de TATA box ou Pribnow box) e TTGACA (CAAT box), respectivamente. Nos eucariotos, a região regulatória dos genes é bem mais complexa. Em alguns casos, podem ser encontrados vários elementos que controlam ou afetam a transcrição. Entre eles estão o promotor, o enhancer e elementos como o GLE, o MRE, etc. Os enhancers são seqüências de DNA que estão muito distantes dos genes e são compostas de seqüências muitas vezes repetidas. Os elementos são sequências de DNA, que são alvos de ligação para proteínas especificas, que constituem o que se chama de fatores de transcrição (TF). Os fatores de transcrição podem aumentar dramaticamente a taxa de transcrição de um gene nos organismos eucariotos. Além do promotor, outras regiões podem acelerar a taxa de transcrição como os enhancers e os terminadores. Os terminadores são seqüências que a RNA Pol identifica como o fim da região de DNA codificadora ou de um gene.

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Existem algumas diferenças entre eucariotos e procariotos com relação a transcrição. Em primeiro lugar existem três RNA polimerases ao invés de uma. A RNA Pol I só transcreve o rDNA (sequência de DNA que codifica o rRNA). A RNA pol II transcreve os genes que codificam para proteínas, produzindo então mRNAs. Os demais RNAs (tRNA, snRNA e a 5 S rRNA) são transcritos pelo RNA pol III. Nos procariotos, os ribossomos identificam os mRNAs porque estes apresentam uma seqüência denominada de Shine- Dalgarno que é incluída antes das bases codificadoras, complementar a uma região do componente 16 S rRNA. Por sua vez os mRNAs dos eucariotos apresentam uma estrutura denominada de quepe (Cap) resultante de uma ligação 5'-5' entre duas guaninas ou entre G e A. Após a transcrição, ao mRNA é adicionado uma longa cauda de adeninas, o que se convencionou denominar de poli-A. Esta característica dos eucariotos permite a separação dos mRNAs dos demais RNAs, o que normalmente pode ser feito em laboratório. Nos procariotos, a cauda de adenina é bem reduzida. Uma quarta diferença entre procariotos e eucariotos relaciona-se com o processamento do pré-mRNA nas células eucariotas. Nestas, após a transcrição, são removidos os introns do pré-mRNA. Só então, este RNA se desloca para o citoplasma e recebe a denominação de mRNA.

4-TRADUÇÃO (Translation)

Tradução é o processo de decodificação do mRNA nos ribossomos resultando na formação de um peptídeo. Na maioria dos casos as proteínas são formadas por apenas um peptídeo. Para a produção de um peptídeo in vitro são necessários o mRNA, os ribossomos, os tRNAs, os amino ácidos, fatores da tradução e energia.

Os ribossomos dos procariotos são formados por duas sub-unidades: a grande, chamada de 50 S, é constituída por dois rRNAs, o 23 S rRNA e o 5 S rRNA, e por 34 proteínas; a pequena, chamada de 30 S, é constituída pela unidade 16 S rRNA e por 21 proteínas. Dependendo da fase, uma bactéria pode ter aproximadamente 5.000 ribossomos, o que representa 25% da massa celular.

Os tRNAs são os RNAs transportadores, também chamados de adaptadores, que transportam os amino ácidos do meio até os ribossomos para serem incorporados à cadeia peptídica. Uma enzima, é encarregada de carregar o amino ácido específico na extremidade 3'OH do tRNA, com base no seu anticodon. Existem mais de 20 tRNAs, pois na maioria dos casos, mais de um codon codifica para um mesmo amino ácido.

O processo de tradução (5'-3') inicia quando a sub-unidade pequena do ribossomo reconhece a seqüência líder do mRNA. Em seguida o primeiro codon (um conjunto de 3 bases) é lido e geralmente codifica para metionina. Um tRNA traz o amino ácido correspondente ao codon lido. Sucessivamente os codons vão sendo lidos e os amino ácidos correspondentes incorporados ao peptídeo nascente pela enzima peptidil transferase. A velocidade da tradução chega a 40 amino ácidos por segundo. Qualquer um dos codons de terminação UAG, UAA ou UGA, significa o fim do peptídeo, cuja interpretação é feita pelos ribossomos. Nos procariotos, algumas mensagens são policistrônicas.

Nos procariotos a tradução é simultânea à transcrição. Mais ainda, um mesmo

mRNA pode ser traduzido por dezenas de ribossomos enfileirados, o que resulta num

número elevado de cópias repetidas de uma proteína a partir mensageira.

de uma única molécula

O código genético está estruturado em codons (trincas), cada um com três bases. A probabilidade de associar três bases independentemente da ordem e natureza é de 64. Três codons são de terminação. Os outros 61 codificam os 20 amino ácidos. Consequentemente, um mesmo amino ácido pode ser codificado por mais de um codon. As principais características do código genético são:

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  • - estruturado em trinca de bases

  • - não há sobreposição (uma base pertence a um e somente um codon)

- universal (reforça a teoria da origem única da vida); somente poucas diferenças com o código genético das mitocôndrias

  • - degenerativo (mais de um codon codificam para um mesmo amino ácido)

  • - o primeiro codon (das proteínas) é AUG ou GUG

  • - há diferença ou preferência de uso de diferentes codons de um mesmo amino ácido

  • - a hipótese de Wobble permite a não ocorrência dos 61 tRNAs.

O conhecimento do funcionamento desta fábrica permitiu a compreensão da ação dos antibióticos e o desenvolvimento de remédios para várias doenças. Geralmente os antibióticos se ligam ao rRNA ou às proteínas dos ribossomos, impedindo ou a leitura do mRNA, ou o emparelhamento do tRNA com o ribossomo ou impedindo outra atividade nos ribossomos. Como os ribossomos dos procariotos são diferentes dos eucariotos, um antibiótico pode afetar o funcionamento da sub-unidade pequena (30 S) de uma bactéria, sem contudo interferir no ribossomo da célula eucariota hospedeira, cujas sub-unidades tem rRNAs de diferentes tamanhos e seqüência.

Tabela 2. Código genético do RNA mensageiro.

Primeira

 

Segunda

 

Terceira

base

 

base

base

 

U

C

A

G

 
 

UUU - Phe

UCU - Ser

 

UGU – Cys

U

U

UUC - Phe

UCC - Ser

UAU - Tyr UAC - Tyr

UGC – Cys

C

 

UUA - Leu

UCA - Ser

UAA – Stop

UGA – Stop

A

 

UUG - Leu

UCG - Ser

UAG - Stop

 

G

 

CUU - Leu

CCU - Pro

CAU - His

UGG – Trp CGU - Arg

U

C

CUC - Leu

CCC - Pro

CAC - His

CGC - Arg

C

 

CUA - Leu

CCA - Pro

CAA – Gln

 

A

 

CUG - Leu

CCG - Pro

CAG – Gln

CGA - Arg CGG - Arg

G

 

AUU - Ile

ACU - Thr

AAU – Asn

AGU - Ser

U

A

AUC - Ile

ACC - Thr

AAC – Asn

AGC - Ser

C

 

AUA - Ile

ACA - Thr

AAA – Lys

 

A

 

AUG - Met

ACG - Thr

 

AGA - Arg AGG - Arg

G

 

GUU - Val

GCU - Ala

AAG – Lys GAU – Asp

GGU - Gly

U

G

GUC - Val

GCC - Ala

 

GGC - Gly

C

 

GUA - Val

GCA - Ala

GAC - Asp GAA – Glu

 

A

 

GUG - Val

GCG - Ala

GAG – Glu

GGA - Gly GGG - Gly

G

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5-MUTAÇÃO E REPARO

Mutação é uma modificação no DNA. Mutante é o fenótipo resultante da mutação. As mutações são causadas por erros de replicação do DNA e alterações do DNA por deleção, duplicação ou rearranjamentos causados por vírus, transposons, ação enzimática ou processos físicos e químicos. A taxa média de mutação que ocorre naturalmente atinge 1x10 -7 . Agentes químicos e físicos (radiações) são utilizados em laboratório para aumentar esta taxa.

Uma mutação é dita silenciosa quando o codon é alterado, mas não muda o amino ácido codificado e consequentemente, a cadeia peptídica. Ela é neutra quando, mesmo alterando o amino ácido, a proteína permanece com a mesma função. Aqui surge o conceito de polimorfismo a nível molecular: diferentes genótipos com o mesmo ou diferentes fenótipos. A mutação com o efeito mais crítico é aquela que provoca a inserção ou remoção de uma base (frameship). Como conseqüência, todos os codons localizados após a mutação ficam alterados, ou seja, a cadeia se torna diferente do padrão anterior. Mutações ocorrem naturalmente. As mutações mais comuns são aquelas de ponto, onde apenas uma base é alterada. Outras mutações com profundas implicações no fenótipo são aquelas decorrentes de deleções, adições, inversões e transposições.

É preciso salientar que o próprio DNA tem mecanismos de produzir mutações em si mesmo, independentemente do ambiente. Um deles é através dos elementos móveis existentes no genoma: os transposons. Transposons são seqüências de DNA que se movem (pulam) de um lugar para outro no genoma. A transposição deixa duplicadas as bases imediatamente próximas desta seqüência (entre 5 e 9), além de causar interrupções de outros genes quando neles se inserirem. Outras vezes, o transposon se duplica e a nova cópia se insere num outro ponto do genoma. Apesar de não serem ainda bem conhecidos, sabe-se que em alguns casos os transposons carregam genes de resistência a antibióticos. Como eles afetam a evolução, devem ter outras funções celulares ainda não descobertas. Uma deles poderia ser o controle do estresse celular. No entanto, eles têm sido tratados como 'genes egoístas' porque eles só conseguem se replicar quando dentro do cromossomo, garantindo a sua própria permanência no genoma. Nos procariotos, os vírus podem se integrar ao genoma do hospedeiro, podendo causar duplicações ou deleções. Ou seja, existem causas naturais de produção de mutações, responsáveis pela propulsão da evolução.

O número de mutações que ocorre num organismo é relativamente muito grande. Entretanto, os seres vivos dispõem de vários sistemas de reparo, que corrigem a maioria dos erros ocorridos. Outros erros, quando não corrigidos, podem causar enormes problemas tanto na sobrevivência como na reprodução do organismo. Neste caso atua a seleção natural, ou eliminado este indivíduo ou fazendo com que ele deixe um menor número de descendentes. O acúmulo de mutações em diferentes populações pode provocar, a longo prazo (prazo em termos de evolução), a diminuição da freqüência de cruzamentos com o conseqüente início da especiação, processo que pode culminar com a origem de uma nova espécie.

Ao nível de laboratório, os agentes químicos mais utilizados para induzir mutações são: etil metil sulfanato (EMS), ácido nitroso, etil metano e alguns agrotóxicos ou defensivos. A ação dos agentes químicos normalmente produz alteração de uma base qualquer. Exemplo: substituição de A por T. Muitos vegetais contêm substâncias que causam mutações na espécie humana. Ex: nas frutas e legumes são encontradas as psoraleínas (o limão contém quantidades elevadas), que também dimerizam duas timinas, se ocorrem lado a lado. Entre os agentes físicos, os mais usados são as radiações (UV, gama, etc.). Os agentes físicos geralmente causam quebras e rearranjos de cromossomos. Especificamente a radiação UV causa a dimerização de duas timinas se estiverem lado a lado. Durante a replicação, a DNA Pol não consegue ler este dímero, o que provoca a inserção de duas

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bases quaisquer no lugar das timinas, se não houver reparo. Muitos problemas de pele são causados pela radiação UV. É por isto que existe tanta preocupação com a diminuição da camada de ozônio, pois este atua como uma barreira aos raios UV.

A mutagênese direcionada permite a alteração de uma ou mais bases de uma seqüência de DNA qualquer. Inicialmente a seqüência de interesse é inserida num vetor, como o vírus M13 que é de fita simples. Posteriormente é feito um primer (iniciador) num sintetizador de oligonucleotídeos. Este primer é complementar a um certo segmento da seqüência de interesse, mas contendo uma base diferente. Posteriormente, o restante da molécula é duplicado. Resultado: a nova seqüência difere da original por uma base apenas. Esta seqüência pode ser avaliada in vitro ou in vivo. Pela técnica da recombinação homóloga, esta seqüência mutante pode substituir a seqüência normal de um organismo. Desta forma, é avaliado o efeito de uma mutação in vivo.

Foi desenvolvido por Ames, um teste para avaliar a capacidade mutagênica dos produtos químicos utilizados, com base no tipo de mutação que os produtos provocam. Tais produtos químicos são classificados quanto ao potencial de causar danos nas pessoas, dependendo do tipo de mutação e a freqüência que são causadas. Este teste associa a capacidade de ação mutagênica com a capacidade de causar câncer, pois estas duas estão estreitamente relacionadas. Outros tipos de testes também são utilizados para confirmar a periculosidade do produto. Com base nestes testes, a fabricação e a comercialização de muitos produtos químicos já foram proibidas.

6-METILAÇÃO

Uma fração das citosinas no DNA de muitos organismos torna-se metilada (5 m C) após a replicação. Esta metilação não tem distribuição ao acaso. Algumas seqüências como as denominadas ilhas de CpG em animais, são raramente ou não metiladas. Enquanto algumas seqüências são metiladas em certas condições, como aquelas herdadas da mãe e não do pai, outras são sempre metiladas em todos os tecidos.

Nas plantas e fungos as ilhas CpG são freqüentemente metiladas pelas metilases, embora há evidência de uma substancial quantidade delas não metiladas. Em fungos, a metilação atinge 1,5% das Citosinas e não ocorre somente de forma simétrica.

Tanto o controle da metilação quanto sua função nos eucariotos, ainda não são suficientemente compreendidos. A metilação tem sido correlacionada com redução na atividade gênica, havendo evidências de inibição da expressão de vários genes. Em ratos, a redução da metilação do DNA em 70%, resultante da mutação no gene metiltransferase do DNA, leva a morte os indivíduos na embriogênese. A hipótese levantada admite que as regiões com bases metiladas dificilmente são transcritas. Neste caso, a morte dos ratos poderia ter sido provocada pela falta de proteínas e/ou RNAs. A metilação também é requerida para o comportamento normal dos cromossomos em Neurospora crassa. Sua necessidade foi comprovada, mas sua função ainda não está totalmente esclarecida.

7-REGULAÇÃO GÊNICA

Na definição de Jacob e Monod (1961), gene é uma seqüência de DNA que codifica para um produto difusível. A região regulatória do gene é uma seqüência de DNA que não é convertida em outra forma (como a região codificadora) e que só funciona in situ. Além disso, existem genes estruturais e genes reguladores de outros genes.

O princípio básico da regulação gênica é a interação entre proteínas regulatórias e certas regiões (seqüências) do DNA. Assim, nos procariotos a regulação gênica é chamada de negativa se um gene não se expressa caso o repressor, que é uma proteína, liga-se ao DNA na região do promotor do gene (Figura 6). Para que o gene possa ser transcrito, há a

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necessidade de remover a proteína repressora. Isto é possível, pela presença do indutor, para o qual a proteína repressora tem muito mais afinidade que pela região do DNA responsável pela regulação do gene. O indutor então tem um efeito inativador sobre o repressor. Este tipo de regulação gênica é o mais comum nos genes de organismos procariotos. No controle dito positivo, o mais frequente nos eucariotos, o gene é ativado pela presença de um ativador. Em outras palavras, no controle negativo, a interação proteína-DNA desliga o gene, enquanto no controle positivo, a interação liga o gene.

O controle negativo é bastante comum nas bactérias, onde a maioria dos genes estaria ligada (on) até que os repressores os desligariam (off). Já o sistema positivo é mais comum nos eucariotos, onde os genes estariam desligados até que os ativadores os ligariam.

necessidade de remover a proteína repressora. Isto é possível, pela presença do indutor, para o qual

Figura 6: Modelo de funcionamento do operon lac em bactérias. O repressor impede a transcrição dos genes Z, Y e A, que é ativada na presença de β-galactosídio.

A rigor, existem cinco pontos de controle na regulação de um gene eucarioto: 1) na ativação de gene estrutural, 2) no início da transcrição, 3) no processamento da transcrição, 4) no transporte para o citoplasma e 5) na tradução do mRNA. Na ativação de um gene estrutural, um gene é regulado por uma seqüência no promotor e/ou no enhancer, as quais são reconhecidas por proteínas específicas. Esta proteína funciona como um fator de transcrição necessário para o início da transcrição através da RNA Pol. Proteína ativa só é disponível sob condições quando o gene é para ser expresso. In vitro é possível modular a regulação nos diversos pontos de controle. In vivo, a adição de determinados genes permitem o controle de um ou mais pontos de controle.

Nos eucariotos ainda não se conhece profundamente a regulação gênica. Entretanto, vários mecanismos já foram amplamente estudados. Em primeiro lugar, um grande número de genes são ativados em determinados tecidos e órgãos e não em outros. Os genes denominados de Homeobox são os responsáveis por este controle. Já nas primeiras divisões celulares do zigoto formado, os genes Homeobox se encarregam de marcar quais os genes que poderão e quais os genes que não poderão ser expressos num determinado tecido ou órgão. Outros genes dependem de um complexo sistema de eventos: sinal ambiental (temperatura, umidade, etc.) faz com que uma substância seja produzida e/ou movida para as células. Este sinal químico seria recebido por um receptor na célula, cujo complexo tem habilidade para penetrar no núcleo da célula e ativar um conjunto de genes de forma coordenada.

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PARTE 2 - MARCADORES GENÉTICOS

1-INTRODUÇÃO

Marcador genético é uma característica que é capaz de detectar diferenças entre dois ou mais indivíduos ou organismos. Entre suas propriedades um marcador genético deve:

  • (i) ser capaz de diferenciar os progenitores e

(ii) ser reproduzido com precisão na progênie.

Do ponto de vista molecular, um marcador genético (ou loco marcador) serve para identificar um local ou uma região de um cromossomo. Um marcador genético ideal deve apresentar uma série de atributos:

  • (i) alto nível de polimorfismo

(ii) estabilidade em diferentes ambientes (iii) detectar grande número de locos não ligados

(iv) herança simples

Entretanto, a simplicidade e os baixos custos do método são fatores determinantes no uso de forma rotineira de um marcador molecular. Aqui será apresentada uma descrição resumida dos principais tipos de marcadores genéticos bem como suas principais aplicações no melhoramento de plantas.

Todo e qualquer fenótipo molecular proveniente de um gene expresso, como no caso de isoenzimas , ou de um segmento específico de DNA (correspondendo a regiões expressas ou não do genoma) é chamado de marcador molecular.

2-MARCADORES MORFOLÓGICOS

Até os meados da década de 60, os marcadores utilizados em estudos de genética e melhoramento eram controlados por genes associados a caracteres morfológicos, Em geral, características fenotípicas de variação discreta são utilizadas como marcadores morfológicos desde os tempos de Mendel, como fenótipos de fácil identificação visual (Ex.: nanismo, deficiência clorofítica, cor de pétala ou morfologia foliar). Um número variável de marcadores morfológicos existe para as diferentes espécies de plantas, contudo insuficientes para mapeamento genético ou outras aplicações. Além disso, esses marcadores freqüentemente são afetados pela ação gênica de dominância, efeito ambiental, pleiotropia e epistasia. O reduzido número e a natureza dos marcadores morfológicos restringiram os estudos dos caracteres quantitativos (QTs) às espécies onde havia sido alcançada uma caracterização genética substancial. Sax (1923) verificou em feijão que as diferenças nas médias do peso de grãos estavam associadas a cor das sementes. Foi a primeira tentativa de caracterização individual dos locos (QTL) envolvidos na expressão de um caráter quantitativo (QT) com auxílio de marcadores morfológicos.

Marcadores morfológicos apresentam a desvantagem de serem somente identificados em sua maioria, na planta inteira ou adulta.

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3-MARCADOR DE PROTEÍNAS DE SEMENTES

As proteínas das sementes podem ser classificadas de acordo com a sua solubilidade em quatro diferentes grupos. Numerosos métodos têm sido utilizados in vitro para caracterizar as proteínas de sementes. Polipeptídeos variantes que apresentam distintos pesos moleculares podem ser separados em gel de poliacrilamida através do processo de eletroforese (ver Quadro 1). A eletroforese de duas dimensões (SDS-PAGE) tem habilidade de separar proteínas pelo ponto isoelétrico (carga) e pelo peso molecular (tamanho). Diferentes variantes aparecem como distintas bandas num gel. Embora o número de variantes de uma proteína (polimorfismo) seja relativamente alto, o número de proteínas de sementes que podem ser analisados é baixo. Apesar da base genética complexa (normalmente são famílias de genes) a interpretação é relativamente simples (Observar foto abaixo, Guimarães et al. 2002).

3-MARCADOR DE PROTEÍNAS DE SEMENTES As proteínas das sementes podem ser classificadas de acordo com a

Figura 2: Perfil eletroforético de proteínas extraídas pelo calor em sementes de cafeeiros nos estágios de desenvolvimento verde (A), verde-cana (B) e cereja (C), com diferentes tratamentos de secagem.

QUADRO 1: ELETROFORESE

O termo eletroforese foi criado por Michaelis em 1909, para descrever migração de colóides sob a influência de um campo elétrico. Seu princípio é simples: moléculas de carga negativa migram para o pólo positivo, e moléculas com carga positiva migram para o pólo negativo. A eletroforese visa a separação de moléculas em função de suas cargas elétricas, de seus pesos moleculares e de suas conformações, em suportes porosos (géis) e soluções - tampões (estabilizam o pH do meio e permitem o fluxo de corrente elétrica). Ou seja, na prática a eletroforese consiste da extração de amostras, seja de proteínas, RNA ou DNA obtido de um tecido e da migração destas num gel (amido, agarose, acrilamida) submetido a uma corrente elétrica contínua. O sentido e a velocidade de migração são determinados pelo tamanho e carga das proteínas. Por exemplo, quanto maior a carga elétrica de uma proteína, mais rápido a sua migração no gel em direção ao eletrodo de carga contrária, como é observado na figura 1. A passagem de corrente elétrica através de uma solução-tampão segue a Lei de Ohm:

V = R. I

onde,

V = voltagem R= resistência I = amperagem

A eletroforese pode ser conduzida ora sob voltagem, ora sob amperagem (corrente) ou, então, wattagem (potência) constantes reguladas pela fonte elétrica. É bom observar que para cada tipo de marcador a ser utilizado diferencia grandemente na corrente elétrica a ser utilizada. A eletroforese pode ser desenvolvida em suportes como papel-filtro, sílica gel, membranas de acetato de celulose e géis de agarose, de amido ou de poliacrilamida. Para enzimas, géis de amido e poliacrilamida oferecem melhor separação do que outros suportes. Para marcadores DNA os mais utilizados são géis de agarose e poliacrilamida.

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Quadro 1: Continuação

Quadro 1: Continuação Figura 1: Princípios gerais do sistema de eletroforese. A B Figura 2: Exemplos
Figura 1: Princípios gerais do sistema de eletroforese. A B
Figura 1: Princípios gerais do sistema de eletroforese.
A
B

Figura 2: Exemplos de aparatos de eletroforese. A) Cuba de eletroforese horizontal submersa para gel de agarose. B) Cuba de eletroforese vertical para gel de acrilamida.

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4-ISOENZIMAS

Na década de 1960, um novo tipo de marcador genético foi desenvolvido: as isoenzimas, então denominados de marcadores bioquímicos. Isoenzimas foram definidas como diferentes formas moleculares (variantes) de uma mesma enzima, apresentando função idêntica ou similar, presente num mesmo indivíduo (Markert & Moller, 1959). É o resultado da presença de mais de um gene codificando cada uma das enzimas.

As vantagens sobre os marcadores morfológicos são a insensibilidade à pleiotropria e à epistasia, além de sua natureza co-dominante (possibilita a identificação de indivíduos homozigotos e heterozigotos). Desde a sua resolução pelos métodos histoquímicos, a principal aplicação das isoenzimas é nos estudos de diversidade genética e evolução,o que têm sido extremamente importantes para as investigações sobre variação intraespecífica, genética de populações, também na evolução e mapeamento genético, já realizadas em centenas de espécies. Apesar de estar sendo utilizada em vários programas de melhoramento, o reduzido número de sistemas enzimáticos polimórficos impõe limitações variáveis dependendo do objetivo do estudo ou atividade.

Comumente muitas enzimas existem em múltiplas formas moleculares, mas apresentando a mesma especificidade. O princípio básico da técnica reside no uso de eletroforese em gel de amido ou poliacrilamida e na visualização do produto enzimático por métodos histoquímicos (Hunter e Market, 1957). As distintas bandas observadas no gel, representam diferentes formas moleculares que apresentam diferentes propriedades de mobilidade eletroforética. Subsequentemente, a posição de uma enzima no gel de amido pode ser verificada pela sua atividade que é detectada por um sistema de revelação colorimétrica. Este sistema inclui reagentes específicos para revelar uma determinada enzima. A conseqüência é o aparecimento de uma ou mais bandas no gel. Portanto, as distintas formas de uma mesma enzima, as isoenzimas, codificadas por diferentes alelos, podem ser detectadas em diferentes regiões do gel, caso apresentem diferentes mobilidades eletroforéticas. Com esta técnica o estudo da variabilidade genética de populações de uma dada espécie será baseada na variação observada nas isoenzimas. Cada banda revelada no gel se constitui num marcador genético, já que por marcador genético entende-se a constituição genotípica de um loco num determinado indivíduo. As isoenzimas começaram a ser utilizadas como marcadores genéticos somente a partir de 1966 (Lewontin & Hubby, 1966).

4.1-Vantagens das isoenzimas em relação aos marcadores morfológicos:

  • a) determinação genotípica dos locos em qualquer parte da planta,

  • b) ocorrência de um número razoável de alelos,

  • c) ausência de efeitos deletérios associados com alelos isoenzímicos,

  • d) herança Mendeliana simples com codominância entre alelos na maioria dos locos,

  • e) ausência de efeitos epistáticos, pleiotrópicos e ambientais.

4.2-Aplicabilidade das isoenzimas:

A propriedade mais expressiva é a base genética simples envolvida na expressão destas enzimas (Soltis & Soltis, 1989), o que torna a identificação de polimorfismos rápida e simples (Brewer, 1970).

A maioria das enzimas já reveladas em gel de amido tem mais de uma isoenzima. Como conseqüência, uma grande quantidade de sistemas isoenzimáticos são potencialmente informativos.

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A eletroforese de enzimas tem proporcionado dados úteis na abordagem de questões importantes em sistemática e evolução de plantas (Crawford, 1989; Doebley, 1989). Do ponto de vista da variação intraespecífica, as isoenzimas têm contribuído para o estudo da organização da variabilidade genética e a identificação de raças (Singh et al., 1991a;

1991b).

Além da caracterização da diversidade genética de populações naturais e genótipos cultivados, as isoenzimas têm sido utilizadas com bastante freqüência em outros estudos.

Ligação genética entre sistemas enzimáticos ou destes com outros locos tem aumentado a resolução de mapas genéticos em várias espécies como Capsicum annuum, Cicer arientinum, Lens culinaris, Phaseolus acutifolius e Pisum sativum (Tanksley, 1984; Gauer & Slinkard, 1990; Havey & Muehlbauer, 1989; Garvin et al., 1989; Weeden, 1985). As isoenzimas também têm sido utilizadas na identificação de genes que controlam caracteres quantitativos em feijão, milho, soja e tomate (Koenig & Gepts, 1989; Graef, 1989; Kahler & Wehrhahn, 1986; Tanksley et al., 1982; Weller et al., 1988).

4.3-Base genética dos marcadores isoenzimáticos

A premissa básica de se utilizar dados enzimáticos é que diferenças na mobilidade de isoenzimas em um campo elétrico são resultantes de diferenças nas seqüências de DNA que codificam tais enzimas. Assim, se os padrões de bandas de dois indivíduos diferem, assume-se que estas diferenças possuem base genética e sejam herdáveis. O controle genético de isoenzimas ocorre através de vários genes, que podem ser alelos de um mesmo loco, ou estar situados em diferentes locos.

Isoenzimas codificadas por genes alélicos são também chamados de aloenzimas. A expressão das isoenzimas é co-dominante, isto é, em um indivíduo diplóide ambos os alelos de um loco são expresso e visualizados, ou seja, discrimina o heterozigoto do homozigoto.

5-RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphism)

As variações nos nucleotídeos do DNA devido à mutação, deleção, inserção e inversão, podem ser detectadas se ocorrerem num sítio de corte das enzimas de restrição. Se o DNA de plantas diferindo num ou vários desses nucleotídeos forem expostos a essas enzimas, fragmentos de diferentes tamanhos, portanto polimórficos, são gerados e podem ser identificados e clonados. Tais fragmentos são denominados de RFLPs ('Restriction Fragment Length Polymorphims'; polimórfismo no comprimento de fragmentos restrição) e foram desenvolvidos por Botstein et al. (1980). Os polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição ou polimorfismo de tamanho de fragmento são locos no DNA que podem ser identificados e mapeados. Os RFLPs têm sido suficientemente numerosos na maioria dos cruzamentos e têm permitido uma cobertura adequada do genoma, proporcionando a construção de densos mapas genéticos de ligação, que possibilitam a realização de análises genéticas e moleculares e várias aplicações no melhoramento de plantas, como clonagem de genes e mapeamento de QTLs (Nodari et al., 1993). O elevado custo e o tempo necessário na geração destes marcadores restringem drasticamente seu uso de forma freqüente, principalmente em países como o Brasil.

A obtenção de RFLPs envolve várias etapas. Em primeiro lugar é preciso extrair e purificar o DNA de um indivíduo. Após, este DNA deve ser digerido (cortado) por enzimas de restrição (ER) que são capazes de reconhecer um pequena seqüência de pares de bases (pb) e então cortar o DNA neste sítio de reconhecimento ou clivagem. Entretanto, a maioria das plantas contém mais de um bilhão de pb. Como conseqüência, a digestão do DNA de uma planta com apenas uma ER produz milhares de fragmentos que variam em comprimento de acordo com a distribuição dos sítios de clivagem. Tal quantidade impossibilita a análise de todos de uma só vez.

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A terceira etapa do processo consiste em separar esta mistura de fragmentos de diferentes comprimentos pela eletroforese em gel de agarose. A migração dos fragmentos de DNA num gel é dependente do seu tamanho, migrando mais rapidamente, os menores. Subseqüentemente, os fragmentos de DNA na condição de fita simples (após tratamento com hidróxido de sódio), são transferidos para uma membrana de nylon ou celulose (carregada positivamente), técnica que é denominada de Southern blot, e que proporciona um suporte sólido para o DNA que passa a ser imobilizado neste suporte. Agora é possível analisar individualmente cada um destes fragmentos.

A próxima etapa do RFLP é a hibridização do DNA destas plantas já imobilizados em membranas com uma sonda radioativa de DNA (que pode ser um fragmento de DNA da própria planta, um clone) complementar ao fragmento de interesse. Para que haja hibridização, há a necessidade que pelo menos parte da sonda seja complementar ao fragmento de interesse. Existem outras alternativas de marcação de sondas que não a radioativa.

A última etapa, a autoradiografia, consiste da exposição da membrana hibridizada com a sonda radioativa a um filme de Raio X, que é queimado somente onde houve as hibridizações. A sonda sendo radioativa, emite radiação que pode ser detectada por filmes de Raio X. Já que a sonda só hibridiza com fragmentos complementares, a precisão é elevadíssima. Portanto, as cópias únicas (genes) normalmente aparecem uma vez só no genoma, e, portanto apenas uma banda pode ser detectada nos indivíduos homozigotos. Assim, a associação enzima de restrição e sonda identificam um loco RFLP, que tem herança mendeliana.

Admitindo-se que duas plantas diferem em um sítio de reconhecimento, apresentarão fragmentos de diferentes comprimentos, com relação a uma sonda complementar. Tais fragmentos localizam-se em diferentes posições na membrana. Consequentemente apresentarão bandas ocupando diferentes posições no filme, indicando a existência do polimorfismo ao nível de DNA, portanto genotípico. Os fragmentos de diferentes tamanhos são denominados de alelos, e apresentam herança mendeliana. A principal característica da técnica do RFLP é a sua habilidade em detectar tais diferenças.

As seqüências genômicas de duas plantas de uma mesma espécie são muito parecidas. Entretanto, as plantas sofrem freqüentes alterações ao nível de DNA: mutações simples, rearranjamentos e recombinação; as quais podem ocasionalmente alterar a seqüência ou substituir bases nitrogenadas em um ou mais sítios de reconhecimento de uma determinada ER. Numa população, estas variações podem ocorrer numa planta e não em outra. Tais diferenças (que normalmente são denominadas de variação genética) produzem fragmentos de DNA de diferentes tamanhos (polimorfismo de comprimento de fragmento) quando o DNA é exposto a estas enzimas.

Para o desenvolvimento das sondas, o DNA de uma planta precisa ser digerido por uma ER ou quebrado mecanicamente e os fragmentos inseridos em um vetor (geralmente plasmídeo), uma espécie de carregador. Este plasmídeo recombinante pode ser amplificado ilimitadamente, após sua inclusão numa bactéria ou mesmo in vitro. A denominação de sonda ocorre quando uma certa quantidade amplificada deste DNA é marcada com radioisótopos, ou ligada a reagentes que posteriormente podem ser coloridos, portanto identificáveis. As sondas desta forma são utilizadas para detectar seqüências complementares a elas.

Os RFLPs mais informativos são aqueles cuja seqüência ocorre somente uma vez no genoma, denominados de cópia única. Desta forma, os RFLPs são específicos. Como as isoenzimas, os RFLPs nucleares exibem codominância. Pleiotropia e epistasia que afetam a resolução dos marcadores morfológicos, não têm o menor efeito sobre os RFLPs. Além disso, os RFLPs apresentam alta estabilidade. O DNA a ser analisado pode ser extraído de qualquer parte da planta. Outra característica fundamental é a de que a herdabilidade deste tipo de marcadores é virtualmente 1. Isto possibilita a realização da seleção indireta, cuja

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teoria foi desenvolvida há bastante tempo, mas sua implementação não existiu por falta de marcadores com as características dos RFLPs. Por sua segura informação genotípica e ocorrência em grande número, estes marcadores possibilitam o desenvolvimento de mapas genéticos de ligação altamente saturados. Estes são a ferramenta básica para estudos de genética, evolução e melhoramento de plantas.

6-MINISSATÉLITES

Os minissatélites ou locos VNTR ('Variable Number of Tandem Repeats') são regiões dispersas no genoma que contém um número variável de seqüências repetidas e enfileiradas (tandem) de DNA que têm um núcleo comum de 10 a 15 pares de bases (Jeffreys et al., 1985). Podem ser analisados tanto através de RFLPs ou PCR (reação em cadeia da polimerase, Quadro 2). Muitos dos minissatélites são altamente polimórficos, produzindo um grande número de bandas. Por estarem espalhadas por todo o genoma e apresentarem um número variável de repetições em diferentes indivíduos em relação a uma mesma região cromossômica (loco), os minissatélites simultaneamente proporcionam um conjunto de marcadores genéticos que se constitui no que tem sido denominado de impressões digitais de DNA, conseqüentemente, indivíduo-específicos.

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QUADRO 2: A REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

Esta reação foi concebida em 1983 por Kary Mullis (Prêmio Nobel em 1993), publicada em 1985, mas utilizada de forma rotineira a partir de 1988 (Saiki et al., 1988). Esse método tem a habilidade de amplificar um fragmento de DNA, normalmente de até 4000pb, mas em condições especiais de até 30 kb). Para amplificar, o primer (ou iniciador) utilizado, que é um oligonucleotídeo de aproximadamente 10 nucleotídeos, precisa anelar com seqüências complementares e invertidas com relação às duas fitas que foram previamente separadas pelo aumento da temperatura (92-94°C). O anelamento entre os primers e as seqüências complementares é efetuado a uma temperatura de 35 a 50°C. Uma Taq DNA polimerase estende (ou sintetiza) as cadeias originadas pelos primers, cuja temperatura ótima de catálise é de 72°C. Existem máquinas programáveis de PCR, os termocicladores, capazes de modificar a temperatura rapidamente. Na realidade cada ciclo da PCR é composto de três etapas: a separação das fitas (92-94°C), o anelamento do primers com o DNA (35 a 50°C) e a extensão ou polimerização da cadeia (72°C). Os tempos utilizados em cada fase são aproximadamente de 1 min, 1 min e 2 min, respectivamente. A rigor, uma vez atingida as temperaturas de cada fase, são necessários poucos segundos para que a reação ocorra. E as máquinas de PCR têm a capacidade de alterar a temperatura de forma rápida e repetir o ciclo tantas vezes quantas ordenadas. O número de fragmentos amplificados duplica a cada ciclo. Sucessivos ciclos de separação, anelamento e de síntese produzem milhões de fragmentos virtualmente idênticos, em apenas algumas horas. Os produtos da PCR podem ser facilmente visualizados num gel de agarose. Esta visualização é possível com auxílio do brometo de etila, que quando presente no gel se interpõe entre as duas fitas do DNA e se torna avermelhado com absorção da luz ultravioleta. A técnica da PCR tem dezenas de aplicações. A amplificação de fragmento(s) a partir de primers arbitrários (sequência de bases completamente casualizadas) foi denominada de RAPD. Em plantas, os RAPDs têm facilitado a realização de estudos em genética e melhoramento, até então, considerados inexequíveis com as técnicas tradicionais. Uma diferença entre duas plantas ao nível de DNA que ocorra na região de anelamento do primer é identificada pela ausência da referida banda em uma delas e presença da banda na outra. No caso de indivíduos heterozigotos, estes produzem as mesmas bandas que os homozigotos. De fato, os marcadores RAPDs são dominantes. Combinando DNA de plantas segregantes com uma grande quantidade de sondas, é possível a identificação de dezenas, centenas e mesmo milhares de RFLPs e/ou RAPDs. Quanto mais próximas as diferenças no DNA, maior será o grau de co- segregação entre elas. A análise da segregação destes alelos permite o estabelecimento da relação da ordem e da distância entre eles nos cromossomos, o que pode ser visualizado num mapa genético de ligação.

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Quadro 2: continuação Na área da saúde, a técnica da PCR está sendo utilizada intensamente (Vosberg, 1989). Uma das aplicações é na diagnose de doenças causada por vírus como Hepatite, AIDS, etc. Nestes casos, utilizam-se os primers que anelam a regiões específicas do DNA do vírus causador da doença. Portanto, primers com sequência conhecida e pré-estabelecida. Se houver amplificação de uma banda a partir do DNA de uma pessoa, é porque existe DNA do vírus nas células humanas. Este diagnóstico, rápido e confiável, já está sendo feito em várias cidades brasileiras. Existe um esforço integrado entre a Secretaria da Saúde e a UFSC no desenvolvimento deste sistema aqui em Florianópolis. O mais fascinante, entretanto, é a amplificação de DNA de espécies extintas fossilizadas ou conservadas na forma de múmia, o que é denominado de DNA ancestral (ancient DNA). Atualmente é possível amplificar segmentos de DNA extraído de ossos e outros tecidos macios, o que tem permitido conhecer seqüências de DNA de vários mamíferos fósseis. Outra maneira de conhecer o DNA dos fósseis ou espécies extintas seria a de decodificar o DNA extraído de insetos sugadores, embebidos em amber a milhões de anos atrás. Amber é a designação dada à resina solidificada de árvores antigas e tem a capacidade de proteção contra água e o ar. Tais insetos podem carregar nas estruturas que usam para sugar ou no aparelho digestivo, o sangue de animais. Estas descobertas auxiliaram a realização do filme Jurassic Park. Em maio de 1995, do interior de uma abelha envolta de amber e que teria vivido há 20-25 milhões de anos atrás, foi isolada uma bactéria que está se reproduzindo normalmente e de cujo DNA, foram amplificados vários fragmentos via PCR. A sequência destes fragmentos mostrou grande similaridade com o DNA da bactéria Bacillus.

7-RAPDs (Randomly Amplified Polymorphic DNA)

Na década de 80, surgiu um novo tipo de marcador molecular denominado de RAPDs ('Randomly Amplified Polymorphic DNA'; DNA polimórfico amplificado ao acaso; Welsh & McClelland, 1990; Williams et al., 1990). O uso da reação da polimerização em cadeia (PCR) proporciona a amplificação de um segmento de DNA, delimitado por dois iniciadores (ou primers), comumente com 10 pares de bases, que são complementares a dois sítios de nucleotídeos: um em cada fita do DNA, posicionados inversamente a uma distância geralmente não superior a 4kb. Os produtos resultantes da amplificação podem ser visualizados como bandas em géis de agarose ou poliacrilamida. Diferenças ao nível do DNA são inferidas pela presença ou ausência de um determinado fragmento amplificado (banda no gel). Em relação aos RFLPs, os RAPDs são mais baratos, requerem pouco tempo e não necessitam de radioisótopos. Nos últimos anos, alguns mapas desenvolvidos com RFLPs e isoenzimas, se tornaram altamente saturados com RAPDs, como em soja, tomate, milho, feijão, ervilha, amendoim, Arabidopsis e em muitas outras espécies domesticadas ou não. Outros mapas foram desenvolvidos somente com marcadores RAPDs.

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Figura 3: Padrão de bandas polimórficas (indicadas por setas) e monomórficas de marcador RAPD em Araucaria

Figura 3: Padrão de bandas polimórficas (indicadas por setas) e monomórficas de marcador RAPD em Araucaria angustifolia. As bandas são separadas em gel de agarose e visualizadas sob luz ultra-violeta após coloração com brometo de etídeo. (Fonte: Stefenon et al., 2004).

O princípio dos RAPDs está igualmente baseado na identificação de diferenças ao nível do DNA. Entretanto a metodologia é totalmente diferente daquela dos RFLPs e minissatélites e se baseia na PCR. Uma desvantagem dos RAPDs é sua natureza dominante (incapacidade de discriminar entre homozigotos e heterozigotos). As bandas observadas no gel após a eletroforese são codificadas como presentes ou ausentes em cada indivíduo.

8-MICROSSATÉLITES

Entre as diversas seqüências repetidas em tandem, algumas são simples, formadas por um ou poucos nucleotídeos. Tais repetições curtas em tandem são denominadas de microssatélites. Microssatélites, também chamados STR ('Short Tandem Repeat'), SSRP ('Simple Sequence Repeat Polymorphisms') ou STMS ('Sequence Tagged Microsatellite Sites') são sequências repetidas de um, dois, três ou quatro nucleotídeos e que estão espalhadas pelo genoma de um indivíduo. São altamente polimórficos em plantas, animais e microorganismos. Em plantas seria mais fácil utilizar microssatélites GA (ou CT) e GT (ou CA), pois os AT, embora freqüentes, causam problemas. Assim, cada região genômica que contenha um determinado número de repetições de uma destas sequências constitui-se num loco genético, altamente variável entre indivíduos e multialélico, portanto, altamente informativo (Ferreira e Grattapaglia, 1995).

Comparativamente aos RFLPs, os microssatélites proporcionam 3 a 4 vezes mais polimorfismo ou informação. Entretanto, para o uso rotineiro dos microssatélites, há a necessidade de primeiro amplificar uma região, posteriormente sequenciá-la e em terceiro lugar, sintetizar os iniciadores específicos para cada loco. Uma vez feito isto, o loco marcador pode ser utilizado indefinidamente naquela espécie. Desta forma, existe um custo elevado e trabalho no início, mas o custo subsequente é baixo e a simplicidade a posteriori, é muito grande. O mapeamento genético e a caracterização varietal para fins de proteção e de germoplasma para fins de conservação de várias espécies está sendo feito com o uso dos marcadores microssatélites. Seu uso está associado principalmente à caracterização varietal para fins de proteção e de conservação germoplasma. O alto polimosfismo e a natureza co-dominante dos marcadores microssatélites permitem sua utilização em estudos de genética populacional e evolução de espécies selvagens, como na caracterização de estrutura genética intra-populacional (Stefenon et al., 2008a) e reconstrução da história demográfica (Stefenon et al., 2008b) do pinheiro brasileiro.

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Figura 4: Esquema geral da amplificação e visualização de marcadores microssatélites. 9-AFLPs ( Amplified Fragment Length

Figura 4: Esquema geral da amplificação e visualização de marcadores microssatélites.

9-AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Os polimorfismos de comprimento de fragmentos amplificados (AFLPs; Zabeau, 1993) é resultante do uso combinado de enzimas de restrição e da reação da polimerização em cadeia. Suas principais características são a alta especificidade e resolução e poder de amostragem. Nos protocolos dos AFLPs constam pelo menos sete etapas importantes: 1) digestão do DNA, 2) ligação dos adaptadores, 3) primeira amplificação, 4) segunda amplificação, 5) preparo do gel, 6) a corrida do gel e 7) o processamento do gel.

O DNA e digerido por duas enzimas de restrição, uma que corta sítios de seis pares de base (geralmente a EcoRI) e a outra que corta seqüências de 4 pares de bases (geralmente a MseI). Este processo de clivagem gera milhões de fragmentos de distintos tamanhos. O DNA utilizado deve ser de alta qualidade. De preferência utilizar um protocolo ou etapa que inclua fenol. A qualidade do DNA é a base de todo o processo.

O processo de ligação dos adaptadores envolve o uso de ligases que permite que os fragmentos de DNA que foram cortados se liguem a pequenos oligonucleotídeos de DNA de seqüência conhecida.

Subseqüentemente é feita a primeira amplificação, que consiste na amplificação dos fragmentos agora ligados aos adaptadores através da reação da polimerização em cadeia com o uso de iniciadores, complementares aos adaptadores com uma extra base a mais na extremidade 3’. Isto é importante, pois somente 25% dos fragmentos serão amplificados (aqueles com a base complementar ao nucleotídeo final da extremidade 3’ do iniciador), caso contrário todos os fragmentos cortados seriam amplificados e a resolução no gel seria virtualmente impossível. Neste ponto do protocolo é importante verificar se a reação foi bem feita. Para tanto deve-se rodar um gel com parte da reação de amplificação. Dependendo do resultado se continua ou não o processo.

A segunda amplificação é feita com uma pequena amostra da primeira amplificação. Neste caso são utilizados iniciadores que são compostos de todas as bases dos primers da primeira amplificação, mais duas a três bases na extremidade 3’, dependendo do nível de polimorfismo da espécie ou da população. Caso isto não seja conhecido, há a necessidade de experimentar diferentes combinações de iniciadores. Para

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os laboratórios que usam

radioisótopos, neste quarto passo também é feita

simultaneamente a marcação radioativa dos produtos da PCR, para posterior detecção em filme de raio X. Na realidade se marca só um dos iniciadores porque o sinal é suficiente para detecção.

O preparo do gel (geralmente de poli-acrilamida) é uma etapa delicada. A completa limpeza do material, o tipo de molduras, a maneira de colocar as soluções nos moldes, etc., afetam a qualidade do gel. Qualquer defeito no gel pode causar a perda de reação completa. Existem diferentes aparatos para corrida. Nos diferentes laboratórios, há diferentes equipamentos. Todos com suas vantagens e desvantagens.

A corrida

do

gel

envolve o carregamento e a corrida propriamente dita. O

carregamento das amostras é um passo crucial. Os cuidados vão desde a limpeza das cavidades no gel, o uso adequado das pipetas, a precisão na liberação das amostras e o acompanhamento na fase inicial da corrida. Como o gel é submetido a alta voltagem, há a

necessidade de acompanhar a temperatura que não pode ultrapassar a 55°C, sob pena de desnaturar o sistema.

A fase final consiste no processamento do gel. Existem basicamente três formas de visualização das bandas. A primeira delas é com nitrato de prata. A segunda envolve a utilização de radioisótopos e a terceira utiliza terminações coloridas. De maneira geral, a maioria dos laboratórios usa o fósforo y-33 P radioativo, por vários motivos. Em primeiro lugar, a nitidez dos géis é bastante alta com radioatividade. Em segundo lugar, o filme é um documento importante. O uso dos radioisótopos gamas como o 33 P possibilita o seu manuseio sem grandes riscos para as pessoas, uma vez que este tipo de radiação não vai além de alguns centímetros. Outra vantagem deste radioisótopo é que a sua meia vida é maior que a do 32 P. A principal desvantagem é que o aparecimento de sinal no filme requer um tempo maior que os outros isótopos. Entretanto, já existem câmaras intensificadoras de sinal, mas cujo preço é muito alto. A outra maneira consiste na utilização de kits comerciais com terminadores coloridos (dyes) e utilizar sequenciadores automáticos. Desta forma, evita-se a radioatividade. A última forma de visualizar as bandas é através da coloração do gel de poli-acrilamida com nitrato de prata. Entre as principais vantagens estão a ausência de radioatividade e o baixo custo. Entretanto, a resolução não é tão boa quanto os outros dois métodos. Empresas químicas já estão anunciando o desenvolvimento de dyes para a utilização direta em géis. Desta forma, por colorimetria será possível visualizar bandas, no futuro, diretamente no gel sem qualquer outro tratamento. Contudo, não sabe-se ainda o preço que custarão tais kits.

A reação de digestão do DNA permite a obtenção de fragmentos grandes, pequenos e uma combinação de grandes de pequenos, respectivamente. Com isto, um grande número de fragmentos podem ser amplificados e resolvidos num só gel. Desta forma, esta estratégia permite que sejam analisadas num único gel o maior número de marcadores comparativamente às outras metodologias. Embora robusto e de alta reproducibilidade, os marcadores AFLPs são dominantes não se distinguindo heterozigotos de um dos homozigotos. As principais restrições deste grupo de marcadores referem-se a necessidade do uso de radioisótopos, da alta qualidade do DNA e da proteção por patente desta tecnologia.

Marcadores AFLP têm sido utilizados na construção de mapas genéticos, estudos de filogenia (Stefenon et al., 2006), genética populacional (Stefenon et al., 2007) e identificação de variação somaclonal em clones de plantas micropropagadas (Steinmacher et al., 2007).

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Figura 5: Etapas da geração de marcadores AFLP. 10-SCARs ( Sequence characterized amplified RAPD ) As

Figura 5: Etapas da geração de marcadores AFLP.

10-SCARs (Sequence characterized amplified RAPD)

As etapas principais no desenvolvimento de um SCAR são: 1) identificação de um iniciador que confere polimorfismo a dois bulks de DNA com fenótipos contrastantes, 2) o isolamento e a clonagem do fragmento amplificado em um vetor (plasmideo), 3) sequenciamento do fragmento isolado, 4) desenho dos iniciadores de tamanho maior que os decâmeros e 5) o teste final (Paran e Michelmore, 1993).

Para a identificação de um iniciador que confere polimorfismo a dois bulks contrastantes, é necessário a extração de DNA de plantas da geração F 2 . Posteriormente, estas plantas F 2 ou a sua progênie (F 2:3 ) são testadas com relação a uma característica, resistência a uma raça de uma doença por exemplo. Desta forma, as plantas F 2 são agrupadas em duas classes fenotípicas ou alternativamente se for utilizado as plantas F 2:3 em três classes fenotípicas. Misturando-se quantidades equimolares de DNA de seis plantas de mesmo fenótipo (ex: resistência), pode-se dizer que os seis genótipos têm uma seqüência de DNA em comum, que é em relação ao gene que confere o referido fenótipo e talvez um conjunto adicional de pares de bases. Da mesma forma se constrói o outro bulk, com base no fenótipo contrastante (susceptibilidade). Desta forma, os dois bulks só são diferentes, genotipicamente com relação a característica analisada. Testando iniciadores que amplificam seqüências arbitrárias de DNA, por pura chance, é possível encontrar iniciadores de 10 pares de bases (decâmeros) capazes de amplificar o DNA de um bulk e não o do outro. Quando se testa este iniciador em todos os DNAs das demais plantas F 2 e a seqüência realmente está ligada, ou seja quando todas (ou a maioria) das plantas

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resistentes apresentam a banda e todas ou uma minoria das plantas susceptíveis não apresentam a banda, conclui-se que o segmento amplificado está ligado ao gene de interesse. Pela quantidade de recombinação entre o local do anelamento do iniciador e o fenótipo das plantas pode-se estimar a distância entre o marcador e o gene de interesse. O Ideal é que o marcador deve estar o mais próximo possível do gene, para que possa ser utilizado como critério de seleção.

O segundo passo é o isolamento e a clonagem do fragmento amplificado em um vetor, geralmente um plasmídeo. Posteriormente, os plasmídeos contendo os fragmentos de DNA desejados são utilizados para transformar bactérias. Das colônias transformadas é preciso separar as que contêm o fragmento daquelas que não contém o fragmento de DNA desejado. Posteriormente deve se crescer as colônias selecionadas e extrair o DNA do plasmídeo. Como o DNA vai para sequenciamento, há a necessidade de alta pureza. Existem vários métodos e kits comerciais disponíveis para clonar este fragmento. O melhor seria a purificação com cloreto de césio, mas o método é trabalhoso. Após a obtenção do DNA plasmidial, deve verificar se os plamídios contêm o fragmento desejado. Então digere- se com uma enzima de restrição capaz de cortar o plamídio em sítios que flanqueiam o inserto. Corre-se um gel e verificam-se quais os plamídios com insertos.

O terceiro passo é o sequenciamento do fragmento isolado. O sequenciamento é necessário para se conhecer a seqüência do fragmento, ou seja, as bases que estão entre os iniciadores. De posse da seqüência, se desenham os iniciadores (quarto passo) com comprimento variável entre 16 e 24 pares de bases. A idéia de um iniciador mais comprido surgiu de cálculos feitos sobre o comprimento mínimo de um iniciador capaz de amplificar uma seqüência única num genoma da maioria das plantas. Desta forma, espera-se a presença de uma única banda com o uso dos referidos iniciadores. Existem critérios que são levados em consideração no desenho de iniciadores: a inclusão do decâmero que originou a banda, uma percentagem mínima de 50% de C e G, tamanho mínimo que proporciona uma temperatura de anelamento maior que 56 C, a terminação em C ou G e a possibilidade de formação de estrutura secundária (hairpin ou loopback). Existem programas de computador que auxiliam a tomada de decisão, já que proporcionam valiosas informações comparativas a respeito de diferentes iniciadores que são gerados quando é fornecido ao programa uma determinada seqüência de bases.

Finalmente, de posse nos iniciadores, se fazem os testes incluindo-se tanto os bulks como também um certo número de amostras da população F 2 e de outras plantas da mesma espécie.

11-SNPs (Single Nucleotide Polymorphism)

Diferenças em um único nucleotídeo em um ponto particular do genoma são chamadas polimorfismo de simples nucleotídeo (single nucleotide polymorphism ou SNP). Esse tipo de polimorfismo ocorre aproximadamente uma vez a cada 1000 bases no genoma humano. SNPs são detectados principalmente através do sequenciamento de fragmentos de DNA. Nas quatro seqüências hipotéticas abaixo existem dois SNPs, um na seqüência 3 e outro na seqüência 4.

SEQÜÊNCIA CONCENSO:

A C T T

T G A C C A A A T T G

SEQÜÊNCIA 2:

A C T T

T G A C C A A A T T G

SEQÜÊNCIA 3:

A C T T

T G A C C

C
C

A A T T G

SEQÜÊNCIA 4:

A C T T T G A

G
G

C A A A T T G

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12-ANÁLISE COMPARATIVA

A escolha do marcador a ser utilizado depende de diversos fatores, como o tipo de estudo, as facilidades laboratoriais e os custos envolvidos. As características mais importantes a serem considerandas quando se comparam marcadores para um determinado estudo são a capacidade multiplex (número de locos aplificados em uma única reação), o número de alelos por locos) e a proporção de locos polimórficos (Figura 6). A natureza dominante ou co-dominante do marcador também é crucial para alguns estudos (Tabela 3).

12-ANÁLISE COMPARATIVA A escolha do marcador a ser utilizado depende de diversos fatores, como o tipo

Figura 6: Comparação de técnicas de marcadores moleculares quanto ao conteúdo informativo. Foram considerados três componentes que influenciam o conteúdo informativo médio de cada técnica: o número de locos amostrados por ensaio (capacidade multiplex): o número de alelos identificados por loco e a proporção de locos polimórficos observados em cada ensaio (SAT = minissatélite)

13-APLICAÇÕES DOS MARCADORES MOLECULARES

Especificamente no melhoramento de plantas os marcadores moleculares têm muitas aplicações. Em primeiro lugar, o desenvolvimento de mapas de ligação, altamente saturados com marcadores. Estes mapas servem de base para o mapeamento de outras características de importância agronômica, principalmente as de natureza quantitativa e governadas por muitos genes. Desta forma é possível verificar as associações (ligações genéticas) entre os marcadores moleculares e os genes que afetam um caráter quantitativo.

Quando isto está estabelecido, o critério de seleção agora pode ser um ou vários marcadores (bandas) e não mais o fenótipo, já que selecionando-se um marcador, teoricamente seleciona-se os genes próximos a este. Assim é possível se fazer uma seleção genotípica ao invés de seleção fenotípica, que é muito menos eficiente. A seleção indireta faz sentido mesmo para um caráter qualitativo, quando este é muito caro ou difícil para ser avaliado, como é o caso de resistência a nematóides ou produção de uma determinada proteína ou substância de interesse industrial ou farmacológico.

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Os marcadores moleculares ainda têm outras utilidades como a identificação de germoplasma, a identificação de variedades, o controle de qualidade na produção de sementes híbridas, a caracterização genética de populações, o monitoramento nos retrocruzamentos e auxílio na identificação e clonagem de genes, entre outras.

* Construção de mapas genéticos - Em primeiro lugar o grande volume de marcadores disponíveis possibilita o desenvolvimento de densos mapas de ligação, uma ferramenta tanto para pesquisa básica quanto aplicada. Os marcadores de DNA segregam em proporções mendelianas e não interferem na segregação de outros genes. Quando em grande quantidade segregando num cruzamento, é possível a construção de um mapa genético de ligação, cuja densidade depende da quantidade de marcadores. Mapas genéticos de alta densidade eram praticamente utopia numa fase anterior ao desenvolvimento desses marcadores. Nos últimos anos foram construídos mapas genéticos de ligação das principais espécies vegetais cultivadas, de animais domesticados e de espécies utilizadas como modelo em laboratório.

Além de mapas, os marcadores facilitam o mapeamento de genes específicos. cDNA é uma molécula de DNA sintetizada a partir do mRNA. Portanto, o cDNA seria um gene (DNA) sem os introns. Quando o cDNA é obtido de um mRNA de um gene conhecido, sabe- se a função deste cDNA. O gene patatin foi mapeado numa extremidade do cromossomo 8 tanto em batata quanto em tomate (Ganal et al., 1991). Além disso, uma outra região contendo apenas a parte regulatória desse mesmo gene, foi localizada no cromossomo 3. Em tomate, as duas formas da enzima SOD, citosólica e cloroplástica, foram mapeadas nos cromossomos 1 e 11 respectivamente (Perl-Treves et al., 1990).

* Caracterização da variabilidade genética - Entre 1966 e 1984 (18 anos) a eletroforese foi utilizada em mais de 1000 espécies, para estudos de genética e evolução. De maneira geral, foram avaliados em média de 23 locos em mais de 200 indivíduos. Uma vez caracterizado o germoplasma disponível, o melhorista pode escolher genotipicamente os progenitores para um cruzamento tanto com o objetivo de maximizar a segregação de genes de importância agronômica como restringir esta segregação a poucos genes. Além da escolha dos progenitores, será possível identificar os recombinantes desejados.

* Monitoramento - Monitorar a recuperação do genoma do pai doador nos retrocruzamentos (intra e interespecíficos) através de marcadores específicos pode diminuir o tempo e a quantidade de trabalho necessários para a introgressão de um ou poucos genes. A avaliação genotípica através de marcadores moleculares de 120 linhagens BCF6 de tomate, provenientes do cruzamento entre L. pennellii e L. esculentum e retrocruzadas para o L. esculentum, foi verificado que 21 delas cobrem 95% do genoma da espécie L. pennellii.

* "Fingerprinting" - Fingerprinting ou a caracterização genética de um genótipo é outra aplicação dos marcadores moleculares. Isoladamente os mini ou microssatélites ou em conjunto com outros marcadores moleculares, podem ser utilizados para caracterizar e distinguir uma variedade de outra. Para a diferenciação varietal três requisitos básicos são essenciais: 1º) distinção - diferentes genótipos devem apresentar distintos padrões de bandas; 2º) uniformidade - o mesmo padrão de bandas deve ser obtido se o procedimento for repetido e 3º) estabilidade - o padrão de bandas não se altera mesmo que o genótipo for cultivado em diferentes ambientes. Dependendo da legislação brasileira de proteção às cultivares e regras de patenteamento a ser definida, as impressões digitais de DNA ('fingerprinting') poderão ter grande utilidade.

* Mapeamento de QTLs - A maioria das características relacionadas com os processos de crescimento em plantas dependem da expressão de muitos genes. Historicamente, a biometria possibilitava a análise em massa desses genes, sem a caracterização da contribuição individual de cada um dos componentes do sistema. Com o advento dos mapas genéticos de ligação, altamente saturados, foram criadas as condições

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para o estudo individualizado dos QTL (Quantitative Trait Loci), pois tais mapas proporcionam marcadores moleculares em todas as regiões do genomas, em alguns casos espaçados apenas de menos de 2 cM.

Neste caso, a progênie oriunda do cruzamento entre plantas que diferem para um QT (Quantitative trait), são agrupadas com base num marcador molecular e então estimada a média e variância da característica fenotípica das plantas de cada classe. Uma diferença significativa entre as médias das classes, indica a relação entre o marcador e a característica, mais especificamente, uma ligação entre o marcador de DNA e um dos alelos que afeta este caráter.

Vários QTL relacionados com as características do fruto em tomate (Paterson et a., 1988, 1991) e com as interações entre bactéria e feijão comum (Nodari et al., 1993). No primeiro caso, foram identificados seis QTL afetando o tamanho do fruto e explicando 58% da variação fenotípica do caráter. Alguns desses QTLs demonstraram efeito sobre o caráter em dois ou mais ambientes e outros em apenas um só ambiente.

Cinco QTLs associados com a tolerância a baixo teor de fósforo foram identificados em milho com auxílio de um mapa de RFLP (Reiter et al., 1991). Todos os cinco QTLs apresentaram efeitos apenas aditivos. Entretanto, uma interação entre dois QTLs foi significativa. Alelos que contribuem para a tolerância foram detectados em ambos os progenitores.

O mapeamento de QTLs proporciona a identificação não só de alelos envolvidos na expressão do caráter, mas o que é mais importante, as possíveis interações entre os QTLs, proporcionado ao melhorista informações que podem ser úteis na escolha dos progenitores para a realização dos cruzamentos. Proporciona ainda condições para o desenvolvimento de estoques genéticos com diferentes composições genéticas. Tais combinações permitirão a comprovação dos efeitos individuais dos QTLs, anteriormente estimados.

Existem

programas

que

permitem

determinar as distâncias genéticas entre

marcadores como é o caso do Linkage-1 (Suiter et al., 1983) e outros que facilitam a

construção de mapas como o MAPMAKER (Lander et al., 1987).

* Seleção assistida por marcadores (MAS) - A prática da seleção indireta para caracteres de baixa herdabilidade poderá ser intensamente explorada desde que os genes de interesse estejam fortemente ligados a marcadores moleculares. A seleção indireta e genotípica (marcador molecular como critério de seleção), possibilita ainda a seleção de alelos com efeitos positivos provenientes dos dois ou mais progenitores envolvidos na geração da população segregante (Lande e Thompson, 1990). A ligação entre o alelo Aps1 da fosfatase ácida e o gene Mi (distância de ± 1cM) que codifica a resistência ao nematóide, tem possibilitado a seleção de plantas de tomate resistentes em populações segregantes através da eletroforese desde 1974, quando foi iniciado por Charles Rick. O alelo Aps1 que está ligado do gene Mi que causa resistência ao nematóide em L. esculentum foi transferido do L. peruvianum através do sistema por retrocruzamento (mais de 30 retrocruzamentos para o L. esculentum). Um segundo exemplo relaciona-se com a incorporação de três genes de resistência à ferrugem em feijão realizada por James Kelly, da Universidade de Michigan, utilizando marcadores RAPDs, altamente ligados aos 3 principais genes de resistência (Kelly e Miklas, 1996).

O

procedimento

'Bulked

Segregant

Analysis'

(Michelmore

et

al.,

1991)

em

conjugação com a PCR é uma alternativa eficiente de mapear genes específicos e selecionar indiretamente genótipos desejados.

* Clonagem de genes - Em sétimo lugar, os marcadores auxiliam na clonagem e transferência de genes de interesse agronômico. Entre os mais freqüentemente citados encontram-se os genes de resistência a pragas e doenças. Entretanto, outros genes podem causar profundo impacto nos produtos finais das plantas. Trata-se dos genes que podem

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proporcionar às plantas o uso de rotas metabólicas alternativas, resultando em produtos novos ou modificados, em muitos casos de alto valor econômico.

Os genes já caracterizados pela genética clássica, têm seu fenótipo conhecido, mas normalmente seu produto é desconhecido. Um marcador de DNA que está próximo de um desses genes, pode ser o ponto de partida para o sua identificação e clonagem. Uma das alternativas é pela técnica denominada de 'caminhar no cromossomo’ (chromosome walking). Esta técnica compreende o isolamento de vários clones com sobreposição parcial. O marcador de DNA é utilizado inicialmente como sonda para identificar um desses clones. Pela sub-divisão desse clone identificado, é possível a identificação de um segundo clone, adjacente ao primeiro, e é similar a este na região de sobreposição. Este segundo clone é então utilizado como sonda para identificar um terceiro clone e assim por diante. Esta 'caminhada' pode eventualmente atingir o gene de interesse, que estaria contido num dos clones.

Recentemente, vários genes foram isolados com auxílio deste 'caminhar no cromossomo'. Entretanto esta técnica é difícil, cara e demorada. Ainda apresenta alguns problemas como seqüências repetidas de DNA que podem estar em um grande número de clones, impossibilitando a 'caminhada' na direção exata do gene de interesse. O outro problema, refere-se a grande distância entre um marcador e o gene de interesse.

Recentes avanços como a possibilidade de clonar fragmentos de grande tamanho (YAC; Yeast Artificial Chromosome) e de separar grandes moléculas de DNA (PFGE; Pulse Field Gel Electrophoresis) facilitarão a clonagem de um gene a partir de um marcador molecular

* Estudos de crescimento e desenvolvimento das plantas - O crescimento e o desenvolvimento das plantas estão sob o controle de muitos genes. Vários desses genes já foram identificados, inicialmente através da genética clássica e mais recentemente com auxílio da genética molecular (Young, 1993). Exemplos: fitocromo e genes que afetam o padrão de cor das plantas. O gene Phs responsável pela produção da faseolina como a principal proteína de reserva das sementes de feijão foi mapeado com auxílio de marcadores moleculares (Nodari et al., 1993). O gene nts (nodulação tolerante ao nitrato) foi mapeado com auxílio de marcadores moleculares numa população F 2 (10cM).

* Modificações na organização do genoma - Existem amplas evidências do surgimento de variantes durante a regeneração a partir de cultura de tecidos. Variação somaclonal que ocorre ao nível do DNA, tanto nos sítios de reconhecimento de uma enzima de restrição ou na região de anelamento de um primer podem ser detectadas via RFLP, AFLP ou RAPD, respectivamente. Variação no número de cópias também pode ser detectadas pela intensidade de hibridização, via RFLP. Os RFLPs também têm potencial para detectar variação fenotípica decorrente de alterações no padrão de metilação, já verificado em milho (Phillips et al., 1991). Variação somaclonal em milho foi atribuída a variação ocorrida ao nível do DNA (Brown et al., 1991).

Além disso, os marcadores moleculares são extremamente úteis na diagnose de doenças, sexo, oncogenes, etc. Neste caso, os marcadores com base na PCR são os mais adequados, considerando-se rapidez, distinção, custos e praticidade.

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Tabela 3 - Análise comparativa entre os marcadores moleculares

Proteínas

Atributos

Isoenzimas

de sementes

RFLPs

RAPDs

Microssatélites

AFLPs

Nível de Polimorfismo

baixo

alto

baixo-alto

baixo-alto

muito alto

muito alto

Estabilidade

moderada

alta

alta

alta

alta

alta

ambiental

Número de locos

moderado (<50)

baixo (<10)

alto

alto

alto

alto

 

co-dominate

co-dominante

co-dominante

dominante

co-dominante

dominante

Expressão genética Número de alelos por loco

2-5

multialélico

multialélico

2

multialélico

2

Distribuição no

regiões de cópia

regiões de cópia

várias

ao acaso

ao acaso

ao acaso

única

única

genoma Acessibilidade

muito alta

muito alta

média

muito alta

muito baixa

média

tecnológica Aplicabilidade no

rápido,

rápido,

lento,

rápido, baixo

lento, custo alto

rápido, custo

melhoramento

baixo custo

baixo custo

custo médio

custo

baixo

 

Identificação de

baixa

baixa

alta

muito alta

muito alta

muito alta

genótipos Avaliação de

média

baixa

alta

alta

alta

muito alta

germoplasma Mapeamento

baixa

muito baixa

alta

alta

muito alta

alta

genético Mapeamento de

baixa

inadequado

média

muito alta

média

muito alta

regiões específicas Mapeamento

baixa

inadequado

muito alta

baixa

alta

baixa

comparativo Genética de

baixa

baixa

média

alta

muito alta

muito alta

Autógamas Genética de

média

baixa

média

alta

muito alta

muito alta

Alógamas Análise Filogenética

média

baixa

muito alta

média

alta

média

Adaptado de Gepts (1993) e Ferreira & Grattapaglia (1995).

PARTE 3 - ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS

  • 1. INTRODUÇÃO

Organismos transgênicos (ou Organismos Geneticamente Modificados - OGM) são organismos (plantas, animais ou microrganismos) que têm inserido em seu genoma, uma sequência de DNA manipulado em laboratório por técnicas moleculares ou biotecnológicas. O DNA inserido pode ser da mesma ou de outra espécie. Tais técnicas, desenvolvidas nos últimos 20 anos, possibilitam o corte e a ligação de fragmentos de DNA de uma forma altamente precisa. Particularmente, seqüências de DNA (genes) podem ser removidas de um organismo, ligadas a seqüências regulatórias e inseridas em outros organismos. A fonte destes genes pode ser qualquer organismo vivo (microorganismo, planta, animal) e o organismo recipiente, nesse caso específico, uma variedade de uma espécie de planta cultivada.

As plantas, animais e microrganismos transgênicos possibilitam tanto (i) estudar questões biológicas fundamentais a nível molecular como também (ii) materializar aplicações da biologia celular e molecular, como por exemplo o controle biológico através de endotoxinas modificadas ou a produção de vacinas comestíveis.

A expressão engenharia genética surgiu em 1973 quando moléculas DNA de diferentes espécies foram recombinadas in vitro. Basicamente, trata-se do uso de dois grupos de enzimas: as de restrição (do tipo II) que são capazes de reconhecer uma pequena seqüência de pares de bases e então cortar o DNA neste sítio de reconhecimento ou de corte e as ligases, que são enzimas capazes de ligar dois fragmentos de DNA. O primeiro plasmídeo in vitro (Cohen et al, 1973) foi construído a partir do corte de DNA com enzimas de restrição e a cola de fragmentos específicos com as ligases. Surge então o que convencionou denominar de tecnologia do DNA recombinante ou engenharia genética. É uma tentativa de se fazer in vitro o que ocorre na natureza: a recombinação de fragmentos de DNA. Contudo, na natureza dificilmente DNA de uma espécie pode ser cortado e ligado ao DNA de outra espécie.

A introdução de uma molécula de DNA recombinante numa planta se constitui na transformação de plantas. Para tal, utiliza-se de um vetor para que a construção genética feita em laboratório seja inserida no genoma da planta. As técnicas de engenharia genética possibilitam a transferência de genes por via não sexual.

  • 2. TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS

A transformação de plantas consiste na introdução de um fragmento de ácido nucléico em um genoma. Existem duas estratégias para transformar plantas: direta e indireta. A estratégia indireta é aquela que utiliza um vetor como a Agrobacterium tumefaciens (o método mais usado para a obtenção de plantas transgênicas) ou A. rhizogenes como veículo de entrega do DNA à planta. Métodos químicos e físicos possibilitam a transformação direta de genomas. Dentre eles destacam-se: biobalística (ou aceleração de partículas), eletroporação, microinjeção e métodos químicos (como polietilenoglicol) e físicos.

Agrobacterium tumefaciens - Pertencente ao grupo das bactérias gram-negativas, tipo bacilo aeróbico, A. tumefaciens causa em algumas plantas uma doença chamada de galha- da-coroa, uma espécie de tumor. Este tumor é causado por genes bacterianos, que naturalmente são transferidos pela bactéria e inseridos no genoma nuclear da planta hospedeira. O segmento de DNA transferido à planta é denominado de T-DNA, que faz parte do plasmideo bacteriano, chamado de plamídeo Ti (tamanho variável de 120 a 250 kb). O processo de transferência ocorre após a infecção, que tem inicio após a liberação de determinados compostos pela planta. Imediatamente vários genes da região vir do plasmideo são expressos, os causadores da virulência, O T-DNA transferido está contido entre duas

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sequências terminais de 25 pares de bases, denominadas de extremidades esquerda e direita. A extremidade direita é imprescindível para a transferência. As demais sequências que naturalmente são transferidas às plantas não são necessárias ao processo em si de transferência. Desta forma, um plasmideo pode ser engenheirado, com a substituição de todas as bases, exceção àquelas que compõem as extremidades, por genes de interesse. Assim, a A. tumefaciens se encarrega de transferir e inserir no genoma nuclear das plantas uma construção quimérica contendo genes de interesse. O método é bastante eficiente, entretanto, esta bactéria não consegue infectar um grande número de espécies vegetais, o que limita bastante seu uso, como no caso das monocotiledoneas em geral. A primeira planta transformada com Agrobacterium tumafasciens foi em 1983 e só 11 anos mais tarde, a primeira variedade transgênica foi liberada para cultivo, o tomate longa vida (Flavr Savr).

A similaridade entre os métodos diretos de transformação de plantas consiste na capacidade de romper a parece celular e do envelope nuclear. Estes métodos são mais adequados do que os indiretos para transformação de pólen, embrião e meristemas (Brasileiro e Dusi, 1999). Serão descritos, agora, brevemente alguns métodos.

Biobalistica ou aceleração de partículas - É um método que utiliza microprojéteis em alta velocidade envoltos por DNA, com objetivo de superar a parede celular pela força, na esperança que algumas moléculas de DNA atinjam o núcleo e se integrem ao genoma nuclear. Os microprojéteis são constituídos principalmente de partículas esféricas de ouro ou tungstênio, de 1 mm de diâmetro. O DNA adere facilmente e fortemente a estas partículas, pois tais metais são carregados positivamente. Geralmente os equipamentos utilizam o gás hélio, eletricidade ou propulsão a ar e alta pressão na aceleração das partículas. Esta estratégia é empregada em plantas que normalmente não conseguem ser infectadas por A. tumefaciens. Por utilizar a força bruta para penetrar no núcleo da célula, esta estratégia pode a rigor ser utilizada em qualquer tecido e planta. A obtenção de uma planta transformada depende da regeneração de uma célula transformada.

Eletroporação - Método que consiste em submeter protoplastos misturaddos com DNA a uma descarga elétrica controlada opor um curto espaço de tempo. Esta descarga cria poros na membrana nuclear, facilitando a entrada de DNA no núcleo. Nesta solução de protoplastos, que células sem a parece celular (núcleos com citoplasma) também estão presentes plasmídeos contendo genes de interesse. Com a criação de poros pela descarga elétrica, um ou mais plasmídeos podem penetrar no núcleo e se integrarem no genoma da célula. A obtenção de uma planta transformada também depende da regeneração de uma célula transformada.

Químicos – Existem várias substâncias químicas que facilitam a entrada no núcleo de construções quiméricas bem como a sua integração no genoma de células de plantas. O polietilenoglicol (PEG), é um policátion, é um dos mais utilizados, mas é de baixa eficácia. O PEG também é utilizado conjuntamente com outras estratégias. Polivinil álcool (PVA) também é utilizado.

Lipossomas – Neste método o DNA é envolto pelos lipossomas, que são vesículas fosfolipídicas, que são misturadas com protoplastos previamente tratados com PEG. De eficência muito baixo, é pouco utilizado.

Microinjeção - Tubos microcapilares (microsseringas) são utilizados para injetar o DNA no núcleo das células, sem causar danos severos. Este método é mais comum em animais. O uso de agulhas permite ultrapassar a parede celular e também o envelope nuclear. Outros métodos incluem o uso de fibras (de Silicon Carbide) ou laser, para perfurar a parece celular. Neste processo, são misturados os plasmideos contendo os genes de interesse com fibras de silicon carbide e as células a serem transformadas. Sob agitação, as fibras de silicon carbide conseguem abrir poros nas células vegetais, o que permite a entrada de DNA. Alternativamente, microrraios laser podem perfurar a parede celular.

Também a embebição de uma solução de DNA com sementes e tubo polínico podem levar a transformação de células.

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2.1-CONCEITO DE OGM OU TRANSGÊNICO

A transformação genética de plantas consiste na inserção no seu genoma de uma ou mais seqüências, geralmente isoladas de mais de uma espécie, especialmente arranjadas, de forma a garantir a expressão gênica de um ou mais genes de interesse. Neste contexto, o prefixo “trans” era plenamente justificado, pois exprimia a idéia de além de, neste caso, significando o rompimento da barreira da espécie. Com o estabelecimento de normas gerais de biossegurança é que se começou a utilizar a expressão Organismo Geneticamente Modificado - OGM. Em tese, a expressão Organismo Geneticamente Modificado causa certa confusão, porque alguns cientistas dizem que todos os organismos são geneticamente modificados. Entretanto a Lei de Biossegruança no Brasil,define claramente o que são OGMs.

Quando se utiliza a transgenia, uma nova sequência gênica é introduzida, geralmente geralmente não nativa daquela espécie. Em muitos casos, a sequência inserida é formada por partes de diferentes genes de diferentes espécies ou sequências semi-sintéticas. O conjunto destas seqüências é chamada de quimera. Assim, a Soja RR transgênica resistente ao Round-up, herbicida à base de glifosato, contém material genético de pelo menos quatro diferentesorganismos: promotor do vírus-do-mosaico-da-couve-flor (CaMV), peptídeo sinal da petúnia, gene EPSPS da Agrobacterium CP4 e a sequência 3’ (NOS) da Agrobacterium tumefasciens.

Do ponto de vista legal, no Brasil, OGM é o organismo cujo material genético (ADN/ARN) tenha sido modificado por qualquer técnica de engenharia genética. A Lei 8.974, de 5/01/95, definiu ainda engenharia genética como a atividade de manipulação de moléculas ADN/ARN recombinantes. Pela legislação brasileira, então, qualquer planta que tenha seqüência(s) de DNA ou RNA engenheiradas (neste texto ADN e DNA serão utilizados como sinônimos, assim como ARN e RNA), deve ser considerada OGM, e está, portanto, submetida aos efeitos da referida lei, mesmo porque ela regulamenta os produtos obtidos pelo processo do DNA recombinante. No presente trabalho, OGM será utilizado como sinônimo de transgênico, embora não haja concordância absoluta a respeito desta sinonímia.

Desta forma, pode-se definir plantas transgênicas (ou OGM) como plantas que têm inserido em seu genoma, uma ou mais seqüências de DNA manipulado em laboratório por técnicas de DNA recombinante ou engenharia genética. Alternativamente, plantas transgênicas poderiam ser definidas como organismos que tiveram seu material genético alterado por métodos que não aqueles naturais, considerando-se como métodos naturais em plantas o acasalamento sexual e a recombinação genética.

A indução à mutagênese era até então outra maneira utilizada pelo homem para alterar geneticamente uma planta. Neste caso, o genótipo do indivíduo é alterado também diretamente in vivo. Um exemplo disto é a exposição de sementes a agentes químicos, como o metil sulfonato, ou físicos, como raios de cobalto ou X, na esperança que alguma modificação ocorra no genótipo previamente escolhido. No sentido conceitual de modificação in vivo, a transgenia equivaleria à mutagênese, pois também provoca uma alteração genética num genótipo previamente escolhido. Também há similaridade entre ambas quanto à aleatoriedade no loco onde ocorrerá a modificação, o que impossibilita, com o que se conhece hoje, antecipar o que vai acontecer.

Contudo, existem várias diferenças entre ambas. O processo, e em muitos casos, a natureza da alteração deste dois métodos são diferentes. Enquanto na mutagênese as modificações podem ser de substituição de uma base por outra, deleção ou duplicação de uma ou mais bases e rearranjos diversos, na transgenia as seqüências introduzidas são, em tese, previamente conhecidas e serão adicionadas, no todo ou em parte, ao genoma previamente escolhido.

Esta diferença é crucial, pois na tecnologia está embutida a possibilidade da aplicação de leis de propriedade industrial que permite o patenteamento das seqüências engenheiradas,

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bem como do processo de transgenia. Esta possibilidade baseia-se naquilo que é adicionado, uma vez que é conhecido, engenheirado e patenteado. O mesmo não ocorreu com a técnica da mutagênese de plantas, embora uma cultivar desenvolvida com esta estratégia possa ser protegida por leis de proteção intelectual. Mutações proporcionaram, além de um prêmio Nobel, concedido a Henry Muller, um defensor do determinismo genético, avanços no conhecimento genético das espécies e algumas variedades para cultivo.

A mutagênese sítio-dirigida, embora permitindo alterar uma seqüência, é feita in vitro e não in vivo, como a transgenia. Além disso, a mutagênese sítio-dirigida é limitada em termos de número de bases alteradas, comparativamente à transgenia. Recentemente, uma outra técnica desenvolvida para terapia genética na espécie humana, a quimeroplastia, foi adaptada para plantas (Beetham et al., 1999; Zhu et al., 1999). Ela possibilita a substituição ou a adição de uma base, em uma seqüência conhecida. Neste caso a diferença em relação à transgenia clássica é a utilização de oligonucleotídeos quiméricos. Seu alcance, contudo, é menor, restringindo-se a alterar ou adicionar uma ou poucas bases.

Com o objetivo de confundir a opinião pública, freqüentemente é dito por cientistas que “o homem vem produzindo transgênicos há milênios com a seleção artificial de plantas”. Como é possível perceber pela definição de OGM, ou transgênico, os agricultores que domesticaram as plantas cultivadas ou os melhoristas não conseguiram alterar um genótipo in vivo. Selecionavam sim, as novas combinações (progênies), oriundas da recombinação genética da geração anterior. É preciso não esquecer que o processo evolutivo é composto de forças que criam ou amplificam a variabilidade genética e outras que afetam o destino desta variação, como bem destacou Charles Darwin, em sua obra A origem das espécies (1859). O efeito conjunto das mutações, aqui incluídas todas as modificações de DNA em condições naturais, e das recombinações entre mutantes, promove o surgimento de uma ampla gama de associações alélicas (Allard, 1960; Fehr, 1987), cujo destino é então dependente das diversas forças evolutivas como seleção, migração e deriva. Os primeiros agricultores selecionaram estas novas associações alélicas que melhor se adaptavam a sua maneira de cultivar em cada situação. Assim, não cabe aqui falar de transgenia, mas sim de processo evolutivo.

2.2-GENES MARCADORES E GENES REPÓRTERES PARA SELEÇÃO

Os genes marcadores são utilizados para possibilitar a discriminação entre células transformadas e não transformadas, e conseqüentemente a seleção das primeiras. Tais genes são introduzidos para facilitar o trabalho de identificação das mesmas, pois são uma minoria em relação ao total de células submetidas a transformação.

Os genes marcadores são geralmente genes de resistência a antibióticos. Assim, no momento da regeneração das plantas a partir de uma célula, a adição de antibiótico ao meio, permitirá apenas o crescimento daquelas células transformadas que expresses a referida proteína.

Os genes marcadores (e suas respectivas proteínas) mais utilizados são: gene neo, isolado do transposon Tn5 de Escherichia coli, codifica para neomicina fosfotransferase (NPTII), que confere resistência a kanamicina, e o gene hpt, também isolado de Escherichia coli, codifica para higromicina fosfotransferase (HPT).

Genes de resistência a herbicidas também estão sendo utilizados; Dentre eles destacam-se: gene bar, isolado de Streptomyces hygroscopicus, codifica para fosfinotricina acetiltransferase (PAT) que induz a resistência a herbicidas a base de fosfinotricina; gene aroA, isolado de Salmonella typhimurium, que induz a resistência a herbicidas a base de glifosato e o gene csr1, que induz a resistência a herbicidas a base de imidazolidonas e sulfonilureas.

Genes repórteres codificam para proteínas que são facilmente detectáveis. Dentre os genes reportes, os mais utilizados são: gene uidA, extraído de Escherichia coli, codifica para a β–glucuronidase (GUS), detectada por métodos histoquímicos; gene gfp, extraído da medusa

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Aequorea victoria, codifica par a proteína fluorescente verde (GFP); gene luc, isolado do vagalume Photinus pyralis, codifica para a luciferase.

3-DIFERENÇAS ENTRE OS MÉTODOS DE MELHORAMENTO CONVENCIONAIS E BIOTECNOLÓGICOS

Os agricultores, assim como os melhoristas, utilizam os princípios da diversidade genética quando fazem cruzamentos, e da segregação quando selecionam plantas ou animais considerados superiores. O melhoramento genético pode ser considerado uma forma de

biotecnologia, empregada há milênios para diversos propósitos, incluindo a introdução novas variedades de plantas no ambiente. De fato, o melhoramento envolve a manipulação genética, mas não envolve as técnicas da engenharia genética conforme ficaram conhecidas desde

1973.

Por meio dos métodos de melhoramento, agora também chamados de convencionais, tradicionais ou clássicos, novas combinações genéticas são geradas por meio de cruzamentos sexuais entre plantas que apresentam as características consideradas como desejadas. Cruzamentos são feitos entre plantas da mesma espécie e, ocasionalmente, quando a variação genética desejada não existe dentro da espécie, alelos ou genes são transferidos ou substituídos de outras espécies do mesmo gênero. Juntamente com os genes desejados, outros segmentos de DNA do genótipo doador, podem também ser transferidos ou substituídos e podem expressar características indesejáveis. Desta forma, a amplitude do estoque genético (gene-pool) para o melhoramento é determinada pela compatibilidade sexual de uma espécie e espécies aparentadas. Técnicas radicais como resgate de embrião e o cultivo de embriões têm contribuído para aumentar o gene-pool, mas de forma muito limitada. Quando se utilizam métodos de melhoramento, os cruzamentos sexuais possibilitam a substituição de alelos via recombinação homóloga e não a adição de uma quimera como na transgenia.

Das metodologias utilizadas pelo melhoramento de plantas, a introgressão de genes, feita por retrocruzamentos sucessivos do F 1 para o genótipo recorrente, é a que mais se

assemelha à transgenia, em termos de obtenção de uma nova associação alélica. Contudo, existem muitas diferenças entre ambas, que estão explicitadas na Tabela 4.

Na transgenia, seqüências de DNA (genes) podem ser removidas de um organismo, modificadas ou não, ligadas a outras seqüências, incluindo as regulatórias, e inseridas em outros organismos. A fonte destes genes pode ser qualquer organismo vivo (microorganismo, planta, animal) ou vírus.

Uma das principais implicações da transgenia é o rompimento da barreira sexual. Desta forma, a transformação genética possibilita uma alternativa de introdução de genes em plantas. A rigor, isto implica que, teoricamente, qualquer gene, natural ou sintético, pode ser introduzido numa espécie vegetal. Assim, o pool gênico de uma espécie se torna extraordinariamente grande. As oportunidades para o melhoramento aumentam drasticamente, pois além dos recombinantes produzidos naturalmente pela meiose, é possível obter recombinantes não convencionais. Desta forma, problemas de difícil solução ou mesmo a expressão de características em outros organismos poderiam ser adequadamente resolvidos.

Tabela 4. Comparação entre o método do retrocruzamento e a transgenia.

Retrocruzamento

Transgenia

Objetivo

Alterar ou introduzir uma

Alterar ou introduzir uma

Natureza

característica Substituição de alelos

característica Introdução de seqüências novas (quimera)

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Tempo

3 a 6 anos

Variável

Tecnologia

Simples

Sofisticada

Pool gênico

Limitado

Ilimitado

Custo

Baixo

Elevado

Resultados

Previsíveis

Imprevisíveis

Limitados

Ilimitados

Efeitos adversos

Raros Ex: alelos indesejáveis

Freqüentes Ex.: genes marcadores, promotores e outras seqüências filogeneticamente bem distintas; efeitos pleiotrópicos

Distribuição dos

Instituições públicas e privadas,

Grandes empresas, grandes

benefícios

pequenos agricultores, consumidores.

agricultores, melhoristas

Neste cenário, e considerando-se o ponto de vista científico, duas limitações restringem o uso de genes via transgenia: a criatividade e o julgamento inadequado do valor de um gene, desde que há disponibilidade de tecnologias de isolamento e transformação de uma dada espécie. Esta última limitação refere-se a situações em que o pesquisador não consegue perceber ou não tem informações sobre a utilidade de um gene num programa de melhoramento de uma espécie.

Além dessas limitações, já estão sendo adicionadas outras, como: a real necessidade de um determinado OGM (comparação com outras alternativas) e a magnitude das implicações que ele possa apresentar se cultivado e ou consumido em larga escala.

A transgenia introduz novos genes exóticos e cria recombinações não naturais cujas localizações no genoma do organismo são imprevisíveis, ou seja, a tecnologia ainda não permite o controle do local da inserção. Isto pode resultar em efeitos imprevisíveis no metabolismo, fisiologia e bioquímica do organismo receptor. O relatório do Governo da Noruega, divulgado em 1999, denominado Too early maybe too late: ecological risks associated with the use of naked DNA as a biological tool for research, production and therapy, concluiu que qualquer OGM deve sofrer avaliação de impacto ambiental antes de ser liberado. Este relatório refuta a idéia de que a transgenia em plantas é similar ao melhoramento genético convencional (Traavik, 1999).

O desenvolvimento de OGMs pode ser denominado de Tecnologia? Tradicionalmente uma tecnologia está associada com (i) previsibilidade, (ii) controle e (iii) reproducibilidade. Contudo, o atual estágio das tecnologias utilizadas na obtenção de OGMs podem ser caracterizadas como (i) sem previsibilidade; (ii) sem controle dos sítios alvos; (iii) sem controle do destino do transgene ou partes dele; (iv) sem controle nas mudanças de expressão gênica; (v) sem controle dos transgenes no ecossistema e (vi) de difícil reproducibilidade.

Ou seja, ainda não existe tecnologia disponível para a inserção da construção quimérica num loco específico do genoma da espécie recipiente. Um exemplo disto é o fato de que duas sequências de DNA (72 e 250 pb) derivadas da transformação original foram inesperadamente encontradas na Soja RR (The Scientist 14[15]:20, Jul. 24, 2000) Elas estão separadas do transgene que condiciona a resistência ao herbicida Roundup. "Isto demonstra que a modificação genética é inerentemente imprevisível.” que seqüências. Tampouco os resultados das transformações são previsíveis, sendo que algumas dão o resultado esperado, outras não. Também não é possível controlar a expressão gênica do gene inserido. Um exemplo disco é que diferentes variedades de milho com o mesmo gene de Bt produzem diferentes quantidades de toxina nos diferentes órgãos estudados e comparados. Outro aspecto importante é que não se consegue controlar o transgene inserido, uma vez que ele pode se disseminar para outras espécies e causar poluição genética, e como tal enormes e

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irreparáveis danos. Exemplo disto foi a contaminação de várias plantações de milho nos Estados Unidos provocada pelo cultivo de uma variedade transgênica, StarLink, que causou enormes prejuízos aos agricultores, aos consumidores e à empresa.

4-OPORTUNIDADES

PLANTAS

Como aproximadamente 90% das calorias provem de plantas, é no reino vegetal que existe um grande potencial de oportunidades para as diversas biotecnologias, incluindo-se a transgenia, especialmente na produção de alimentos e energia. Contudo, na área da saúde são esperados investimentos financeiros elevados e o desenvolvimento de muitos produtos, muitos deles, de aplicação praticamente pessoal.

O aumento da resistência de plantas a pragas e moléstias pela ação de produtos naturais com auxílio da engenharia genética é a oportunidade importante. A maioria dos genes inseridos em plantas inclui aqueles que conferem resistência a insetos, fungos, vírus e herbicidas. Outros genes controlando o teor de proteínas e óleos em plantas estão sendo utilizados. A partir de 1994, foram identificados, clonados e sequenciados vários genes de resistência a doenças. O conhecimento pleno destes genes possibilitará um melhor entendimento de como ocorrem as reações de resistência ou susceptibilidade de plantas à fungos, bactérias e vírus, bem como desenhar estratégias apropriadas de melhoramento e seleção de plantas resistentes.

Oportunidades agrícolas incluem ainda genes que conferem tolerância a estresses climáticos (altas temperaturas e seca) e de solo (baixos teores de nutrientes e altos teores de elementos tóxicos). Embora, não se saiba ao certo o mecanismo de tolerância, novas abordagens para a manipulação genética visando a tolerância aos estresses estão sendo desenvolvidas.

Características relacionadas a reprodução das plantas também estão sendo alvo de modificação. Assim, genes engenheirados de macho esterilidade para obtenção de híbridos ou de genes responsáveis pela apomixia estão sendo introduzidos em plantas com o objetivo de controlar a reprodução das mesmas.

Uma segunda área de grande atividade da engenharia genética é relacionada com o aumento do valor de certas espécies agrícolas pode ser alcançado através de modificações genéticas que alteram a quantidade ou composição de compostos de reservas não protéicos, os quais podem substituir inclusive certos produtos derivados do petróleo.

O valor de muitas plantas de importância econômica é determinado pela presença de compostos cuja concentração não ultrapassa 1% do peso seco, como é o caso dos compostos usados como medicinais, pesticidas, fragrâncias, corantes e aromatizantes. Na medida em que os genes envolvidos na expressão destes compostos se tornam disponíveis, novas oportunidades surgem para aumentar ou modificar a produção destes compostos. Além disso, estima-se que mais de cem mil metabólitos secundários são produzidos pelas plantas; entretanto, geralmente em baixas quantidades. A manipulação de genes de enzimas que catalisam os principais passos da rota de produção ou dos fatores de transcrição, podem aumentar a produção destes metabólitos e tornar exequível o cultivo de plantas transgênicas com tal finalidade.

Agora existe a possibilidade de introduzir genes que modificam enzimas para produzir amidos modificados. Vários genes envolvidos na biosíntese de amilose e amilopectina foram clonados. Genes antisenso que reduzem a produção de amilose em batata foram clonados, sugerindo que a produção deste composto é manipulável.

As plantas também poderão se tornar fábricas de produtos ou substâncias, já que, na maioria dos países, a produção de uma substância em cultura de células ou em determinados microrganimos tem inúmeras restrições. Exemplo disto são os testes em andamento para a

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produção de produtos como o hormônio do crescimento humano em milho, vacinas, anticoagulantes entre outros. Mas neste caso, o benefício não chega ao agricultor.

Embora o uso de biofármacos (fármacos produzidos biologicamente) é um fenômeno recente, diversas proteínas terapêuticas têm recebido ampla aceitação e estão sendo rotineiramente utilizadas. Exemplos incluem eritropoietina, calcitonina e α-1 antitripsina. Mais recentemente, alguns destes fármacos estão sendo produzidos por plantas transformadas, como é o caso de as hirudina (Parmenter et al., 1996). Hirudina é um poderoso anticoagulante do sangue que é produzido pela sanguessuga Hirudo medicinalis, que agora pode ser extraído de sementes destas plantas transgênicas. A produção do antigeno de superfície do vírus da Hepatite B (HBsAg) foi obtida em plantas e vacinas orais estão sendo utilizadas em testes clínicos com humanos desde 1997 contra uma linhagem de E. coli enterotoxigenica. Vacinas orais são apropriadas para proteção contra patógenos que infectam as superfícies mucosas, particularmente contra bactérias e vírus causadores de diarréias (Mason et al., 1992).

Vacinas comestíveis produzidas por plantas, advogam alguns cientistas, é um sistema bastante apelativo, pois apresenta inúmeras vantagens sobre as formas convencionais:

armazenamento em condições menos sofisticadas, simplicidade de aplicação, custos reduzidos, fácil produção e diminuição dos riscos de transmissão de outras doenças com equipamentos e materiais contaminados. Contudo, uma questão ainda pendente é a segurança e a eficiência destas vacinas produzidas por plantas. Outra preocupação relaciona- se com a quantidade da fruta ou alimento a ser ingerido, bem como o controle da produção dos mesmos. Embora o assunto é complexo e polêmico, vários laboratórios em muitos países estão desenvolvendo este tipo de vacinas utilizando estratégias diferentes.

Uma outra aplicação relacionada com a manipulação dos metabólitos secundários é a produção de polímeros biodegradáveis. Tais polímeros são na realidade uma mistura de amido e polietileno. Quando o amido é o maior componente, temos os plásticos complexos, já em comercialização como Novon e Fertec. (Novon - 80% amido mais etileno-acetato de vinil ou co-polímero etileno-ácido acrílico; Fertec - 50% amido e polímeros). Os filmes são resultantes de misturas com baixos teores de amido.

Do ponto de vista alimentar, novas promessas estão sendo anunciadas. São as chamadas segunda e terceira ondas, cujas aplicações da engenharia genética estão relacionadas com o aumento da qualidade dos produtos alimentícios. Como exemplo menciona-se que estão sendo desenvolvidos OGMs com alto teor de aminoácidos, proteínas ou alta qualidade do óleo e plantas que produzem altas quantidades de vitaminas, como experimentalmente já obtido em cenoura e arroz. Tais alimentos são chamados de nutracêuticos.

ANIMAIS

A primeira leva de animais transgênicos foi destinada a produzir substâncias para uso na saúde humana ou para fornecer órgãos para transplante, também para a espécie humana. Dentre as proteínas humanas produzidas em animais transgênicos destaca-se o fator de coagulação, necessário no tratamento da hemofilia, a eritropoietina, que é utilizada para estimular a medula óssea quando deprimida por outras drogas e a alfa-1 antitripsina, utilizada no tratamento de enfisema pulmonar.

Peixes transgênicos já estão prestes a chegar à mesa do consumidor americano. A liberação de salmão transgênico depende apenas da aprovação da FDA, a agência que regula a entrada de alimentos e medicamentos no mercado americano. Quando isto acontecer, será a primeira vez que um animal transgênico estará disponível para consumo humano. A diferença entre os salmões naturais e os transgênicos é que nestes foi inserido um gene que acelera seu crescimento, isolado de outro peixe, a lampréia. Os genes introduzidos estimulam a produção contínua de hormônios de crescimento.

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Além disso, os animais transformados com genes humanos destinados à produção de órgãos para xenotransplantes, como é o caso de suínos, estão sendo alvo de inúmeras discussões, não só do ponto de vista ético, mas também biológico. Em relação a saúde humana, os riscos dos xenotransplantes estão basicamente centralizados na disseminação de vírus ou outras entidades (micoplasmas e partículas infecciosas) que também podem causar doenças ou injúrias à saúde humana. Do ponto de vista ético e religioso, é pertinente uma discussão mais ampla com os diversos segmentos da sociedade, uma vez que este assunto é extremamente polêmico.

Mais recentemente, galinhas transgênicas foram desenvolvidas para render mais carne como é o caso da Terminator Chicken – da empresa AviGenics. A mesma empresa engenheirou galinhas com genes humanos para produzir medicamentos. Em ambas, a empresa inseriu também uma seqüência de DNA que considera segredo e que possibilita ser detectada, visando a rastreabilidade para fins comerciais, ou seja, impedir que alguém use as galinhas sem pagar pela tecnologia. Animais de outras espécies também já foram modificados via transgenia como vacas, ovelhas e ratos.

MICRORGANISMOS

Com relação aos microorganismos (especialmente bactérias e fungos) existe grande potencial para obtenção de produtos industrializados, como por exemplo para a medicina humana, pois podem ser produzidos aminoácidos e vitaminas nestes microrganismos. Bactérias geneticamente transformadas podem ser usadas para produzir muitas proteinas importantes, hormônios de crescimento humano (hGH), interferons e vacinas (como contra a Hepatite B) para imunização contra viroses. O uso dos microorganismos também se estende para a fermentação Láctea e alcoólica e a degradação de poluentes.

O primeiro produto comercial decorrente do uso da tecnologia do DNA Recombinante foi a insulina, comercializada a partir de 1982 nos Estados Unidos, justamente a partir de uma microorganismo transgênico. O gene humano responsável pela insulina foi isolado na espécie humana e introduzido na bactéria Escherichia coli, que passou a produzir e excretar este produto. Após a purificação, a insulina produzida em laboratório passou a substituir a insulina extraída de pâncreas de animais, uma vez que proporciona menos riscos aos diabéticos, que dependem deste medicamento. No Brasil, a insulina também já vem sendo produzida com microrganismos transgênicos. Cabe destacar que o produto não é transgênico, uma vez que é a expressão do próprio gene humano, mas somente o organismo que o produz.

Outro aspecto importante, é que estes produtos destinados à saúde humana oriundos de microrganismos transgênicos passam pelos mesmos testes que passam os medicamentos convencionais. Sendo assim, a expectativa é de que estes produtos apresentam mais riscos relacionados a contaminações do que propriamente decorrentes do uso per se da tecnologia do DNA Recombinante.

TERAPIA GENÉTICA

Na espécie humana, a terapia gênica se constitui numa das áreas de maior pesquisa. Trata-se de uma estratégia que visa disseminar no corpo humano ou num órgão específico, um gene normal para que o mesmo possa expressar seu produto adequadamente, naqueles casos onde um ser humano é portador de defeito genético. Os elementos que auxiliam o transporte e expressão destes genes são previamente modificados in vitro de forma a garantir sua inocuidade como elementos transportadores de sequências gênicas. Mesmo dos retrovírus, modificados in vitro para carrear genes codificadores de proteínas de amplo interesse médico, como a expressão de adenosina deaminase - ADA, cuja ausência impede a maturação dos linfócitos e, conseqüentemente, leva à ausência de qualquer resposta imunológica, espera-se não causarem doenças nos pacientes que estão recebendo este tipo de vírus transgênico como carreador de um gene de interesse.

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Várias experiências resultaram em mortes de pacientes ou de aparecimento de doenças como a leucemia, após o tratamento com terapia genética.

5-EVOLUÇÃO DO CULTIVO DAS PLANTAS TRANSGÊNICAS

Nos Estados Unidos os testes de campo iniciaram em 1987 e o primeiro cultivo comercial só ocorreu em 1994 com a liberação do tomate FLAVR SAVR, que apresenta a característica de retardar a maturação. A inserção do gene da poligalacturonase (do próprio tomate) no sentido anti-senso retarda a o acumulo desta enzima em quantidades suficientes para a degradação das paredes celulares, causando um atraso na maturação.

Não há uma estatística oficial da área cultivada com transgênicos no mundo. Assim, utiliza-se dados de uma organização mantidas pelas empresas interessadas. A área plantada com plantas transgênicas saltou de pouco mais de 1,7 milhões de hectares em 1996 para 43 milhões de hectares em 2000 (Tabela 5). Embora o número de países que plantaram transgênicos no ano de 2000 era 12, os três países responsáveis por 98% da produção mundial de grãos transgênicos são os Estados Unidos, a Argentina e o Canadá (Tabela 5). Portanto, o cultivo destas variedades ainda é um fenômeno restrito. Extra oficialmente sabe-se que na China existem dezenas de cultivares transgênicas em cultivo, carregando diferentes características. Contudo, as cifras oficiais são desconhecidas.

As estimativas para o ano de 1999 eram de que soja, milho, algodão e canola eram responsáveis por 58%, 12%, 12% e 7% to total da área plantada com transgênicos no mundo todo. Comparativamente a área plantada com não transgênicos, os transgênicos de soja, milho, algodão e canola representavam 34%, 7%, 16% e 11%, respectivamente. O total mundial em termos de área plantada neste ano de 2000 com estas 4 espécies atingiu 273 milhões de hectares (72 de soja, 140 de milho, 34 de algodão e 25 de canola). Desta forma, a área total com transgênicos (43 milhões de ha) equivale a 16% da área total plantada com estas espécies. Com exceção da soja transgênica, que já alcançou um terço da área total, as demais variedades transgênicas de outras espécies ainda são plantadas em baixa proporção. Do total da área plantada em 1999, estimou-se que as variedades das empresas Monsanto, Aventis, Syngenta, Basf e DuPont contribuíram com 80%, 7%, 5%, 5%, e 3%, respectivamente.

Tabela 5. Principais países produtores de plantas transgênicas.

Área (milhões de ha)/Ano

País

1966

1997

1998

1999

2000

USA

1,7

8,1

20,5

28,7 (72%)

30,0 (70%)

Argentina

1,4

4,3

6,7 (17%)

9,0 (21%)

Canadá

1,3

2,8

4,0 (10%)

3,0 (7%)

Austrália

0,1

0,1

±0,1

0,1

México

< 0,1

< 0,1

< 0,1

Espanha

-

< 0,1

< 0,1

França

-

< 0,1

< 0,1

África do Sul

-

< 0,1

±0,1

0,1

Portugal

-

-

< 0,1

Ucrânia

-

-

< 0,1

Romênia

-

-

< 0,1

China

?

?

?

0,3

Total

1,7

11,0

27,8

39,9

43,0

Fonte: ISAAA

50

Estima-se que a safra de 2007 alcançou 8% da área cultivada no planeta. Mas, 176 países do mundo (92%) não cultivam transgênicos. Apenas quatro paises (Estados Unidos, Canadá, Argentina e Brasil) são responsáveis por aproximadamente 90% da produção mundial de OGMs. E apenas quatro espécies (soja, milho, algodão e canola) são aproximadamente 99% das colheitas transgênicas.

Dentre as características introduzidas nestas variedades mais cultivadas destacam-se resistência a herbicidas, resistência a insetos ou ambas (Tabela 6). Projetos de alteração na composição nutricional estão em andamento. Um exemplo disto é o arroz dourado, assim chamado porque foi introduzido numa variedade de arroz um gene que deverá produzir vitamina A. A produção em grandes quantidades da pró-vitamina A no arroz ainda não está garantida, razão pela qual, uma pessoa deveria ingerir quantidades elevadas de arroz (estimativas riam de de 1,9 a 4,3 kg/dia) para satisfazer as necessidades diárias deste componente alimentar.

Tabela 6: Principais características introduzidas

 

1998

2000

Característica

Percentagem da área

Resistência à herbicidas

Milhões de há (%) 17,3 (63)

73

Resistência à insetos

10,0 (36)

22

Resistência à herbicidas/insetos

<0,3 (<1)

5

Qualidade

<0,3 (<1)

<1

Total (ha)

27,5

43,0

Fonte: ISAAA

Este quadro não se alterou muito nos últimos anos, pois os dois principais genes são os de resistência a herbicidas ou de produção de toxinas mortais a insetos. Estas cifras sugerem que a tecnologia não se alastrou como se esperava, nem tampouco alcançou a maioria dos paises ou das espécies.

Na Europa existe uma grande controvérsia a respeito de plantas transgênicas que também apresentam genes de resistência a antibióticos estão sendo proibidas para cultivo. A rigor, desde 2004, nenhuma nova variedade transgênica pode aprovada para plantio ou consumo se contém genes de resistência a antibióticos.

E o Brasil ?

No Brasil existe a Soja Roundup Ready (Soja RR), da Monsanto, liberada pela CTNBio (setembro de 1998), registrada no o Ministério da Agricultura e Abastecimento (junho de 1999), mas com cultivo e consumo suspenso por decisão judicial até que sejam feitos os estudos de impacto ambiental e relatório de impactos no meio ambiente (EIARIMA) e cumpridas outras exigências como elaboração de normas de fiscalização e rotulagem. Posteriormente, por meio de Medidas Provisórias o Governo decidiu e o Congresso aprovou a colheita da safra ilegal de 2002/2003 e o plantio e colheita da safra 2003/2004. Por fim, a nova Lei de Biossegurança ( Lei n 11.105, de 24 de março de 2005) incluiu artigos que aprovaram o cultivo e o consumo da Soja RR. Mesmo assim, o processo judicial não está concluído.

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É possível que na safra 2008/2009 o cultivo com não há cifras oficiais a este respeito.

soja RR alcance os 50%. Contudo

Os testes com plantas transgênicas no Brasil ultrapassavam a casa dos 900 (em meados de 2001), sendo que aproximadamente a metade como lavouras demonstrativas. Os demais são relacionados a testes de performance agronômica, valor de cultivo e uso, de transferência de transgenes de uma variedade para outra, mas poucos para avaliar os impactos ambientais. Nos anos de 1997 a 2000 foram liberados 50, 360, 344 e 99 experimentos, respectivamente. Com exceção de 1998, nos demais anos os experimentos estavam concentrados no Sudeste e Centro-oeste.

Um agravante que se apresentou neste processo é que até 1999 grandes áreas experimentais estavam em mãos de agricultores inexperientes no trato com plantas transgênicas. E estas lavouras não podem, a rigor, ser consideradas planejadas. Como só existem normas com respeito às experimentações planejadas, estas delegadas à iniciativa privada ficam à margem de qualquer fiscalização.

De 1997 a fevereiro de 2001 foram realizados experimentos em 12 estados do país. Os experimentos estão concentrados da seguinte forma: Goiás, 386,98 ha, Minas Gerais, 153,13 ha; São Paulo, 138,85 ha; Paraná, 86,63 ha; Rio Grande do Sul, 37,17ha; Mato Grosso, 28,18 ha; Distrito Federal, 6,45 ha; Mato Grosso do Sul, 1,2 ha; Bahia, 0,681 ha; Santa Catarina, 0,604 ha; Piauí, 0,008; Roraima, 0,005 ha. De 1997 a 2001, a área de lavoura transgênica atingiu 882,2 ha.

Atualmente centenas de testes são feitos em diferentes estados da federação com diferentes OGMs.

Variedades transgênicas de poucas espécies têm sido utilizadas na experimentação no Brasil. Elas se restringem às lavouras de algodão, cana-de-açúcar, fumo, batata, arroz, eucalipto, mamão, milho e soja. As empresas notadamente estão apostando em três espécies:

milho, soja e algodão, mas de fato concentram-se em duas: milho e soja. Estas lavouras tiveram suas áreas experimentais aumentadas desde 1997

De um total de 904 experimentos, o Grupo Monsanto detinha 678 e as outras empresas 226. Isso representava na época 75% dos experimentos, contra 25% das outras organizações. A maioria dos testes estavam concentrados em torno de plantas resistentes à herbicidas e no desenvolvimento de plantas bioinseticidas.

Outra decisão judicial proibiu o plantio pelo período de 3 anos, mesmo que experimental, de plantas biocidas, ou seja, aquelas que produzem substâncias agrotóxicas ou afim à agrotóxicas, conforme explicitado na sentença Judicial, cuja parte final é:

“Ante o exposto DEFIRO A LIMINAR com fundamento no art. 12, da Lei n. 7.347/85 para determinar que se suspendam todas as autorizações para cultivo de quaisquer sementes geneticamente modificadas com características de agrotóxicos ou afins em que os interessados não detenham o Registro Especial Temporário RET, bem ainda, para que não sejam expedidas novas autorizações sem a observância desse requisito. Deverá a CTNBio abster-se de emitir qualquer conclusão sobre a biossegurança de cultivares que receberam o gene de resistência a insetos transportado da bactéria BACILLUS THURINGIENSIS, sob pena de multa diária de R$ 10.000,00 (dez mil reais). Oficie-se ao IBAMA para que proceda à fiscalização dos locais onde é efetuada a manipulação desses organismos, atendendo-se as determinações desta decisão.” (CHARLES RENAUD FRAZÃO DE MORAES, Juiz Federal Substituto da 14ª Vara-DF, Brasília, 27 de abril de 2001).

Atualmente, a única restrição legal que existe é de transgênicos que contenham tecnologias genéticas de restrição de uso, também denominadas de GURTs. Alguns tipos de GURTs são conhecidos como “Terminator” pelo fato que as plantas produzem os grãos com o

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embrião defeituoso. Isto impede a sua germinação e, assim, o agricultor é obrigado a comprar sementes, que são patenteadas, todos os anos.

Além da soja RR, a CTNBio aprovou em 2005 o Algodão Bollgard (evento 531), que contém o gene Cry1Ab, de Bacillus thuringiensis.

Neste ano de 2008, o CNBS decidiu não dar provimento aos recursos do IBAMA e da ANVISA contra a decisão da CTNBio de liberar os milhos transgênicos:

Evento T25 ou milho LL 25, da Bayer, contendo uma versão sintética do gene pat isolado de Streptomyces viridochromogenes, raça Tü 494, que codifica para a síntese da enzima fosfinotricina – N – acetiltransferase (PAT), enzima esta que catalisa a conversão de L-fosfinotricina, inativando o ingrediente ativo Glufosinato de Amônio e, deste modo, conferindo à planta a resistência ao referido herbicida.

Evento MON 810 ou milho Yeldgard da Monsanto, que contém o gene cry1Ab, proveniente de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, que codifica a proteína Cry1Ab com efeito tóxico sobre os insetos da ordem Lepidoptera lagarta-do-cartucho, lagarta- da-espiga e lagarta-do-colmo;

Evento Bt 11 da Syngenta, contendo os genes (i) cryIA(b) que expressa uma forma truncada da toxina; (ii) o gene pat que codifica a enzima

fosfinotricina-N-acetil transferase que confere

resistência

ao

herbicida

glufosinato de amônia (L-Fosfinotricina, PPT - Phosphinothricin), obtido da bactéria de solo Streptomyces viridochromogenes.

Adicionalmente a CTNBio continua liberando outros OGMs.

6-LIMITAÇÕES

Uma das principais limitações da modificação de plantas é a dificuldade de identificar e isolar genes úteis. A maioria dos genes inseridos em plantas é proveniente de bactérias e vírus porque o reduzido genoma desses organismos facilita a identificação e clonagem de genes. Intensivos estudos em vários laboratórios estão sendo feitos em Arabidopsis thaliana, que hoje se constitui no organismo experimental para isolamento e clonagem de genes de plantas. Aproximadamente 50% da seqüência genômica desta planta já é conhecida e em breve será concluído o sequenciamento da espécie. Estimativas indicam a existência de 21 a 25 mil genes. Da parte já sequenciada, não se conhece a função de mais da metade dos genes. Desta forma, o conhecimento da regulação gênica do referido gene é fundamental neste caso. O desenvolvimento de densos mapas de ligação genética e o sequenciamento de parte do genoma de outras plantas cultivadas facilitará a identificação e isolamento de importantes genes. Outro fator limitante é a necessidade de obtenção de uma planta adulta a partir de uma célula transformada. A regeneração não ocorre em todas as espécies. Nestes casos, a transformação é feita em tecidos cotiledonares. Embora existem muitos métodos de transformação de plantas, algumas espécies são bastante recalcitrantes. Em geral, pode-se transformar a maioria das dicotiledôneas com Agrobacterium tumefasciens. O mesmo não se pode dizer das monocotiledôneas. Para este grupo de plantas utiliza-se um dos métodos diretos. Contudo, para cada espécie ou tecido a ser transformado, há a necessidade de testes sobre o método e o protocolo de regeneração das células ou tecidos transformados.

Embora há precisão no isolamento do gene, não há possibilidade de controlar a integração do inserto no genoma. O local da inserção da construção quimérica pode ser qualquer ponto do cromossomo. Como consequência, poderá ocorrer a interrupção da expressão gênica de um gene da planta se o inserto se integrar no referido loco. Ou ainda, a inserção do gene transferido poderá ocorrer numa região rica em heterocromatina, onde a

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expressão gênicapoderá ser reduzida ou insignificante. Além disso, uma vez inserido, a nova sequência poderá ser alvo de metilação e a consequente inativação em termos de transcrição. Outras vezes, o gene pode ser silenciado ou ocorrer a interferência de outro gene ou inserção (Brasileiro e Dusi, 1999).

Como o número de cópias inseridas é variável, muitas plantas são descartadas por possuírem um número elevado de cópias. Nenhum método é controlável a ponto de possibilitar apenas uma inserção.

Existem vários casos, onde o gene isolado de uma espécie não se expressa adequadamente em outra, em geral devido a diferença na preferência de uso de codons pelas diferentes espécies. Neste caso é feita uma modificação feita em alguns codons do gene que foi isolado de uma planta nativa da África (Thaumatococus danielli) sem alteração do produto final. Tem-se então, os genes semi-sintéticos. Este gene que codifica a proteína denominada de 'taumatina', cuja intensidade adocicante é cerca de 3000 vezes superior a sacarose (peso/peso), após modificado, foi introduzido em leveduras para que a proteína seja produzida em larga escala. Na planta, a referida proteína só é produzida nas flores e em pequena quantidade. O uso de genes semi-sintéticos é cada vez mais freqüente. Um outro exemplo é o uso de um gene do Bt (δ-endotoxina) que foi sintetizado in vitro a partir do molde natural e que proporciona resistência a lagarta Heliotis em milho. Testes com plantas transgênicas (com estes genes, parcialmente sintetizados in vitro) já foram concluídos e variedades comerciais já estão sendo cultivadas em vários países (inclusive na América do Sul).

7-BIOSSEGURANÇA - REGULAMENTAÇÃO

Biossegurança, na visão da FAO, significa o uso sadio e sustentável em termos de meio ambiente de produtos biotecnológicos e aplicações para a saúde humana, biodiversidade e sustentabilidade ambiental, como suporte ao aumento da segurança alimentar global. Desta forma, normas adequadas de biossegurança, análise de riscos de produtos biotecnológicos, mecanismos e instrumentos de monitoramento e rastreabilidade são necessários para assegurar que não haverá danos à saúde humana e efeitos danosos ao meio ambiente.

Normas de biossegurança já têm sido utilizadas desde 1975 para experimentos confinados. No início, estas normas foram feitas pelos próprios cientistas e seguidas voluntariamente. Posteriormente, com o a comercialização de produtos e processos, os paises começaram a fazer suas leis ou normas relacionadas a liberação comercial de produtos transgênicos.

Em outubro de 1991 a 'European Community' emitiu um documento, o qual inclui os procedimentos para o manuseio dos testes e liberação de organismos transgênicos. Cada Estado membro foi obrigado a estabelecer sua regulamentação (ou legislação) em harmonia com as diretrizes emitidas pela EEC.

Em 1999, a União Européia decidiu rever as diretrizes de liberação de transgênicos. Contudo, vários países já decretaram ou estão em fase de adotar uma moratória comercial, até que novos estudos sobre biossegurança dos produtos transgênicos indiquem riscos aceitáveis para a saúde humana e ao meio ambiente. Como resultado disto, não houve nenhuma nova liberação para plantio comercial desde junho de 1999. Contudo, as pressões das grandes empresas começam a surtir efeitos e já há indícios de que o processo de liberação de novas variedades transgênicas seja retomado, embora, a contrariedade dos Ministros de Meio Ambiente.

Em 14/02/2001 as novas diretrizes sobre a liberação de OGMs no ambiente (Revisão da diretiva 90/220/EEC) foram aprovadas pelo European Parliament. Os principais aspectos são mencionados a seguir:

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• Genes marcadores – eliminação dos genes de resistência a antibióticos: até final de

2004

para fins comerciais; até 2008 para fins de pesquisa;

• Responsabilidade ambiental – Legislação sobre responsabilidade ambiental ainda em 2001, cobrindo danos resultantes de OGMs;

• Efeitos interativos de longo prazo entre o ambiente e os OGMs devem ser levados em conta na análise de risco antes da liberação;

• Exceção para aos fármacos; • Experimentos devem ser registrados e detalhes dos mesmos tornados públicos; • Aprovação por tempo limitado – Primeira aprovação por 10 anos no máximo;

• Rotulagem e rastreabilidade – Regras gerais para OGMs; Comissão vai propor regras sobre legislação da rastreabilidade e rotulagem de OGMs e derivados.

 

A nova Diretiva inclui ainda:

 

• monitoramento obrigatório após o OGM ir para o comércio; • consulta obrigatória a Comitês Científicos relevantes; • consulta pública obrigatória em relação às liberações experimentais e comerciais; • aplicação do princípio da precaução na implementação da Diretiva;

• oportunidade para consultar Comitês de Ética sobre assuntos de natureza geral;

• instituição

de

um

novo procedimento inter-institutional de acordo com a decisão do

1999/468/EC.

 
 

O Brasil já tinha uma legislação de biossegurança desde 1995. A lei que trata do

assunto, Lei n° 8.974 (DOU de 6/1/95), foi votada pelo Congresso Nacional em dezembro de

1994

e sancionada pelo Presidente da Republica em 05 de janeiro de 1995. A lei estabelecia

normas de segurança e mecanismos de fiscalização no uso das técnicas de engenharia genética na construção, cultivo, manipulação, transporte, comercialização, consumo, liberação e descarte de Organismos Geneticamente Modificados (OGMs), visando proteger a vida e a saúde do homem, dos animais e das plantas, bem como o meio ambiente. O aspecto mais relevante da lei brasileira diz respeito que o que está sob regulamentação é o produto oriundo da engenharia genética, ou seja, a lei regulamente o produto se oriundo de um processo específico.

Em 28/12/2000 entre as mais de 70 Medidas Provisórias baixadas pelo Presidente, a MP 2137 (DOU de 29/12/2000) acresceu e alterou dispositivos da Lei nº 8.974. A mais importante foi a criação da CTNBio vetada cinco anos antes. Esta medida resolveu uma critica do judiciário que considerou a CTNBio virtual, já que não tinha sido criada legalmente até então, sendo seus atos passíveis de nulidade.

Em 2005, foi aprovada a nova Lei de Biossegurança, a Lei n° 11.105, de 24 de março de 2005. Regulamenta os incisos II, IV e V do § 1º do art. 225 da Constituição Federal, estabelece normas de segurança e mecanismos de fiscalização de atividades que envolvam organismos geneticamente modificados – OGM e seus derivados, cria o Conselho Nacional de Biossegurança – CNBS, reestrutura a Comissão Técnica Nacional de Biossegurança – CTNBio, dispõe sobre a Política Nacional de Biossegurança – PNB, revoga a Lei nº 8.974, de 5 de janeiro de 1995, e a Medida Provisória nº 2.191-9, de 23 de agosto de 2001, e os arts. 5º, 6º, 7º, 8º, 9º, 10 e 16 da Lei nº 10.814, de 15 de dezembro de 2003, e dá outras providências.

O fato mais relevante foi a inclusão do Principio da Precaução na lei: Artigo 1º - Esta Lei estabelece normas de segurança e mecanismos de fiscalização sobre a construção, o cultivo, a produção, a manipulação, o transporte, a transferência, a importação, a exportação, o armazenamento, a pesquisa, a comercialização, o consumo, a liberação no meio ambiente e o descarte de organismos geneticamente modificados – OGM e seus derivados, tendo como

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diretrizes o estímulo ao avanço científico na área de biossegurança e biotecnologia, a proteção à vida e à saúde humana, animal e vegetal, e a observância do princípio da precaução para a proteção do meio ambiente.

A lei traz ainda artigos sobre definições, proibição, composição e atributos do Conselho Nacional de Biossegurança (CNBS) e da Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio), além das atribuições dos órgãos e entidades de registro e fiscalização.

Outra importante inclusão foi o principio da publicidade. Na gestão das informações de biossegurança, há que ser observada a transparência. Da mesma forma, a Legislação, atos administrativos; processos em andamento; decisões da CTNBio, do CNBS e dos órgãos de registro e fiscalização; atas das reuniões e outras informações consideradas não sigilosas, bem como os votos fundamentados de cada membro deverão ser tornados públicos.

Poucos países da América do Sul têm legislação referente aos testes e a comercialização de produtos oriundos da engenharia genética. Na Argentina não existe uma lei de Biossegurança semelhante a do Brasil. Apenas um decreto. No Paraguai, só recentemente houve uma portaria do governo criando uma comissão de biossegurança que tem também representantes da universidade e de organizações não governamentais. Em um de seus primeiros atos, a Comissão de Biossegurança não autorizou a introdução da Soja RR da Monsanto no Paraguai.

Nos Estados Unidos também não existe uma lei específica. Basicamente as leis já existentes foram emendadas para tratarem também dos produtos transgênicos. Como neste país, o processo não é considerado relevante, importa o produto apenas. Se um produto transgênico é considerado equivalente a um não transgênico, os testes exigidos são de comum acordo entre as agencias governamentais e as empresas, estando os consumidores totalmente fora das decisões. Naquele país, nos primeiros anos, foram concedidos (em média) autorizações para 98,7 % do total de solicitações feitas. Destas, 87% eram de empresas e 13% de instituições oficiais e universidades. O sistema após análise desregulamenta o produto. O processo de concessão de autorização é baseado no fenótipo da planta, na segurança ambiental, utilização do produto e risco do produto.

Uma pergunta frequente tem sido: a liberação destas plantas nos EUA foi precedida por testes rigorosos e análises rigorosas das agências americanas Food and Drug Administration - FDA, Environmental Protection Agency - EPA e United States Department of Agriculture - USDA?

As plantas transgênicas, aprovadas para o cultivo comercial nos Estados Unidos, tiveram sua liberação baseada no princípio da equivalência substancial. Assim, a soja RR foi considerada “equivalente” a sua antecedente natural, a soja convencional, porque não difere dela nos aspectos cor, textura, teor de óleo, composição e teor de aminoácidos essenciais e de nenhuma outra qualidade bioquímica. Desta forma, não foram submetidas à rotulagem pela agência americana encarregada de sua liberação, a FDA.

Este conceito de equivalência substancial tem sido alvo de críticas, entre outras, porque a falta de critérios mais rigorosos pode ser útil à indústria, mas é inaceitável do ponto de vista do consumidor e da saúde pública (Millstone et al., 1999). Há dificuldades práticas no conceito de equivalência entre plantas engenheiradas e naturais, ou obtidas por técnicas convencionais de melhoramento genético. Equivalência significa dispor de igual valor ou outro atributo, normalmente expresso em unidades ou parâmetros: um grama do produto Y equivale a X calorias. Equivalência se refere sempre a quantidade ou algo mensurável a que corresponde um sentido tecnicamente comparável (Momma, 1999). A rigor, em termos de genoma, elas não são equivalentes nem iguais. Só seriam iguais se uma fosse originária da outra por multiplicação vegetativa ou micropropagação. A construção genética inserida na planta contém elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados nas plantas, que proporcionam novos produtos gênicos e que podem desencadear efeitos pleiotrópicos substanciais, para que sejam considerados desprezíveis.

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Por este critério, a vaca louca seria equivalente, em termos de segurança, a vaca sadia, já que a diferença entre ambas é apenas da conformação espacial de uma proreina.

Uma das criticas se originou da análise da documentação que foi utilizada pela FDA para considerar a Soja RR substancialmente equivalente a soja convencional. Segundo Barbara Keeler que fez a análise, existem diferenças significativas entre soja não transgênica e Soja RR: em 3 dos seis macronutrientes; em um ácido graxo; 29% menos de choline; mais (27%) de inibidor de tripsina, um potente alergênico. Para chegar a conclusão de que ambas variedades eram equivalentes, não foram aplicados testes estatísticos nas comparações. Além disso, em um dos 3 experimentos feitos em Porto Rico foi omitido da publicação no Journal of Nutrition, mas os dados foram submetidos ao FDA. Estes revelaram que a Soja RR apresentou menor nível de proteína e de fenilalanina; o inibidor de tripsina foi 18% maior nas tortas tostadas a base de Soja RR que nos controles e as lectinas apareceram em dobro. Neste caso, por esta análise a soja convencional e a Soja RR não seriam equivalentes.

Esta estratégia baseada na equivalência substancial foi introduzida na década passada para evitar que as indústrias tivessem custos maiores com testes de longa duração, como na área farmacológica. Quando se utiliza a equivalência substancial, nenhum teste é requerido para excluir a presença de toxinas prejudiciais, carcinogênicas e mutagênicas. Este critério da equivalência substancial é equivocado, carece de base científica e deveria ser abandonado em favor de testes biológicos, toxicológicos e imunológicos mais aprofundados e eficazes (Guerra e Nodari, 1999). Com base nesta equivalência, o FDA exige apenas testes de curta duração com animais e testes bioquímicos para avaliar, entre outros, a alergenicidade. Esta insuficiência de dados, que não consegue subsidiar cientificamente a análise da segurança alimentar, está sendo questionada não só pela população em geral, mas também por grande parte da comunidade científica e agora (outubro de 2000) pelos governos, como é o caso da Itália.

Como o transgene é, na verdade, uma nova característica – em geral desconhecida – introduzida num genoma cultivado que vem sendo lapidado pelas seleções natural e artificial, ainda não há experiência acumulada, nem conhecimento suficiente para tratar adequadamente este assunto. Contudo, a comunidade científica e os agricultores já têm experiência acumulada com os agroquímicos ou agrotóxicos que foram liberados, após a Segunda Guerra Mundial para uso, sem a realização de testes adequados de biossegurança. Só posteriormente, parte dos efeitos nefastos causados por eles se tornaria conhecido. Foi preciso a morte e a dor de inúmeras pessoas contaminadas para que as restrições de uso aumentassem. Até hoje não houve reparação alguma por partes das empresas fabricantes destes produtos às vitimas intoxicadas ou mortas (Nodari e Guerra, 2001).

Na verdade as empresas biotecnológicas americanas querendo segurança sobre o retorno de seus investimentos nas áreas farmacêuticas e agrícola exerceram forte pressão sobre o governo para ‘restringir o rigor regulatório’ das agências regulatórias americanas. A decisão do uso da equivalência substancial foi tomada para evitar os testes toxicológicos e de impacto ambiental de longa duração e de amplo espectro, que tornariam excessivo o custo de desenvolvimento destes produtos. Esta estratégia possibilitou que os transgênicos fossem aprovados de forma mais rápida e barata: 1/3 do tempo e 1/7 a 1/6 do custo, comparativamente aos fármacos.

A equivalência substancial é utilizada também pelo Canadá e Argentina. Nestes países a rotulagem não é obrigatória. Nos Estados Unidos é proibida (ver o caso da rotulagem do leite de cava produzido em vacas alimentadas com hormônio transgênico).

A rigor, nenhum dos processos de solicitação de liberações comerciais j’aprovadas pela CTNBio continha os estudos de avaliação de risco à saúde humana ou ao meio ambiente, razão pela qual ANVISA e IBAMA impetraram recurso junto ao CBNS contra a decisão da CTNBio.

Nem mesmo os princípios e a metodologia estabelecidos no Anexo III do protocolo de Cartagena sobre Biossegurança têm sido seguido. De um lado as empresas não fazem os

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estudos recomendados, de outro lado a CTNBio não exige. Assim, nem a comunidade cientifica dispõe de informações técnico-científicas a respeito dos riscos. Isto contribui para um debate na sociedade, vazio de informações científicas e técnicas.

Protocolo Internacional de Biossegurança

A Convenção sobre a Diversidade Biológica – CDB - estabeleceu nos itens 3 e 4 do artigo 19 que: (3.) As Partes devem examinar a necessidade e as modalidades de um protocolo que estabeleça procedimentos adequados, inclusive, em especial, a concordância prévia fundamentada, no que respeita a transferência, manipulação e utilização seguras de todo organismo vivo modificado pela biotecnologia, que possa ter efeito negativo para a conservação e utilização sustentável da diversidade biológica; e (4.) Cada Parte Contratante deve proporcionar, diretamente ou por solicitação, a qualquer pessoa física ou jurídica sob sua jurisdição provedora dos organismos a que se refere o § 3 acima, à Parte Contratante em que esses organismos devam ser introduzidos, todas as Informações disponíveis sobre a utilização e as normas de segurança exigidas por essa Parte Contratante para a manipulação desses organismos, bem como todas as Informações disponíveis sobre os potenciais efeitos negativos desses organismos específicos.

Nas várias rodadas realizadas para negociar o referido Protocolo Internacional de Biossegurança, duas posições, praticamente antagônicas se firmaram. De um lado estavam os Estados Unidos e os demais países do Grupo de Miami (Argentina, Austrália, Canadá, Chile e Uruguai) e de outro lado, os demais países. Os primeiros (i) queriam exportar commodities geneticamente modificadas (OGMs e seus derivados) como alimentos, fármacos e ração para animais sem solicitar permissão aos países importadores e (ii) tornar o protocolo um instrumento legal independente ou ligado a organização mundial do comércio (OMC). Os demais países queriam (i) análise de impacto sócio-econômico inserido na análise de impacto ambiental a ser realizada previamente a liberação comercial; (ii) que o protocolo contenha instrumentos de compensação em caso de acidentes de transporte com OGMs e (iii) que o protocolo não deveria conflitar com outros acordos internacionais atualmente existentes. Alguns países, como os da África, querem ainda que o protocolo assegure compensação financeira em caso de impactos negativos na saúde humana ou danos ao ambiente.

Finalmente, na rodada realizada em janeiro de 2000, na cidade de Montreal, o referido Protocolo foi acordado. Os dois principais pontos são: (i) o princípio da precaução deve ser adotado em caso de dúvida ou falta de conhecimento científico e (ii) os produtos transgênicos devem ser rotulados (art. 18a). O referido protocolo tem cerca de 40 artigos e trata basicamente da movimentação de transgênicos entre países, com atribuição de responsabilidades em caso de danos. Garante ainda, que o país importador recuse o produto caso não esteja acompanhado de estudo de risco adequado. Um terceiro aspecto, explicitado no artigo 15 e anexo II, impõe que a análise de risco seja conduzida cientificamente pelo exportador. Na ausência desta análise, os importadores podem se negar a receber os produtos.

Já foram realizadas quatro reuniões anuais (denominadas de MOP), nas quais foram tomadas decisões consensuadas sobre vários temas, sendo o mais polêmico os requisitos em termos de informação sobre o OGM que deve acompanhar o documento fiscal nos carregamentos de OGM em movimentos transfronteiriços.

Até o final de 2007, 143 países haviam assinado o Protocolo Internacional, incluindo o Brasil. Mas não ratificaram o Protocolo, Estados Unidos e Argentina, por exemplo.

Situação em Santa Catarina

No nosso Estado, existem duas leis promulgadas pela Assembléia Legislativa, que foram vetadas pelo governador, mas o veto derrubado pelos parlamentares. A primeira é a Lei

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Promulgada Nº 11.403, de 10/05/2000, que dispõe sobre pesquisas, testes, experiências ou atividades nas áreas de Biotecnologia e Engenharia Genética e adota outras providências.

Seu Art. 1º diz “As empresas nacionais ou estrangeiras, que desenvolverem no Estado de Santa Catarina pesquisas, testes, experiências e outras atividades nas áreas da biotecnologia e engenharia genética, envolvendo Organismos Geneticamente Modificados (OGMs), bem como os produtos advindos desta tecnologia, deverão notificar o Poder Executivo na forma disposta nesta Lei.” Já o Art. 3º proíbe a comercialização em todo o Estado de Santa Catarina dos produtos advindos da tecnologia.

A segunda é a Lei Promulgada 11.643, de 4/06/2000, que cria o Conselho Técnico Catarinense de Biossegurança – CTCBio – e adota outras providências. Seu Art. 1º diz: “ Fica criado o Conselho Técnico Catarinense de Biossegurança – CTCBio –, órgão normativo- jurisdicional, consultivo e de assessoramento vinculado diretamente ao Poder Executivo, com a finalidade de deliberar sobre matéria relacionada a sua área de competência.”

Ambas as leis embora vigentes ainda não foram implementadas até esta data (junho/2001).

Paralelamente e com apoio da Assembléia Legislativa, foi criado o Forum dos Transgênicos, do qual participam várias instituições públicas e ONGs como as Comissões de Saúde e Meio Ambiente, Direitos Humanos e do Consumidor, Agricultura e Tecnologia e Cooperativismo da AL, Órgãos da Secretarias de Estado da Saúde (Vigilância Sanitária) e da Agricultura (EPAGRI, CIDASC, PROCOM-SC), Ministério Público, OAB, AMC, UFSC, CEPAGRO, ACATS (Associação Catarinense de Supermercados), Associação Cívica 21/SC, Comitê de Defesa do Consumidor Organizado (DECONOR), CUT, Federação dos Trabalhadores na Agricultura Familiar (FETRAF/SUL), Federação dos Trabalhadores na Agricultura (FETAESC), Sindicato dos Engenheiros Agrônomos (SEAGRO), Federação das Associações de Apicultores (FAAS/SC) e Federação Catarinense das Associações dos Municípios (FECAM).

Umas das ações deste Forum foi a obtenção de uma acordo negociado entre o Ministério Público e empresas que cujos produtos são suspeitos de conter ingredientes transgênicos. Nestes casos, as empresas custeiam as análises laboratoriais que serão realizadas por laboratórios públicos. De outro lado, os supermercados iniciaram um processo de conhecer não só a legislação mas também a opinião dos consumidores.

8-DETERMINAAÇÃO DE RISCO

Apesar da Legislação Brasileira de Biossegurança ter sido promulgada desde 1995 e da CTNBio ter sido implantada em 1996 e re-implantada em 2005, a operacionalização da fiscalização dos produtos transgênicos nas Unidade da Federação tem enfrentado várias dificuldades. A fiscalização tanto de experimentos quanto de área plantada clandestina não está sendo feita a contento. Até abril de 1999, apenas 5% dos experimentos haviam sido fiscalizados. A situação não mudou muito depois disso. Com o objetivo de levantar os principais problemas e entraves que têm dificultado o cumprimento da legislação de biossegurança na área de competência do Ministério da Agricultura e contribuir para a solução dos problemas da fiscalização, a Divisão de Controle do Trânsito e Quarentena Vegetal – DTQ/CPP, em 23/11/00, encaminhou o fax nº 150/2000- Circular para todas as DDA e SEDAG das DFA. Quatorze Unidades da Federação (AM, BA, CE, DF, GO, RR, RS, SC, TO, PA, PR, MG, MS, MT) responderam no prazo estipulado e, com base nessas respostas, o presente documento foi elaborado (por Paccelli M. Zahler). Os problemas enfrentados pela fiscalização federal agropecuária dos transgênicos podem ser divididos em três tipos: pessoal, operacionais e legislativos. 1) Problemas de pessoal:

• falta de técnicos em número suficiente para realizar as fiscalizações; • falta de treinamento em biossegurança; • falta de uma Comissão de Biossegurança no Ministério da Agricultura, de modo que as posições defendidas sejam posições institucionais.

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2) Problemas operacionais:

• falta de um manual de procedimentos de fiscalização de transgênicos; • desconhecimento do conteúdo dos processos submetidos à CTNBio; • falta de recursos financeiros para a intensificação das fiscalizações; • falta de métodos de amostragem e de kits para a detecção das modificações genéticas; • falta de laboratórios credenciados para a análise de transgênicos; • falta de um Plano Operativo específico nas áreas de defesa e produção das DFA destinado ao cumprimento da legislação de biossegurança; • falta de informação; • inexistência de encontros e reuniões entre membros da CTNBio e o corpo técnico das DFA; • falta de recursos financeiros para o pagamento de análises.

3) Problemas legislativos:

• falta de Instrução Normativa regulamentando a importação de transgênicos destinados ao consumo humano e animal; • falta de instâncias de julgamento e de valores de multa para as infrações cometidas com transgênicos; • dificuldade no cumprimento das decisões da CTNBio; • falta de clareza em alguns pontos da legislação de biossegurança, dificultando a classificação dos organismos geneticamente modificados quanto ao grupo de risco ao qual pertencem;

Os problemas não só pelo lado do governo. As empresas também contribuem para tornar os problemas ainda mais graves conforme dois exemplos ilustrativos. O primeiro deles refere- se às inúmeras irregularidades apontadas no Relatório de viagem de fiscalização de 33 ensaios com OGMs no RS feito pelo Eng° Agr° José de Ribamar Costa Júnior-DFA/RS. Dentre elas cabem destaque para: 6 processos onde os croquis não permitiram a localização dos ensaios; 2 ensaios destruídos e não comunicados a CTNBio pela Empresa; 2 ensaios onde os OGMs estavam em risco de escape descontrolado. Em 31/05/2001, a Folha do Paraná publica uma notícia dando conta de que o Ministério Público Federal estaria investigando denúncia de plantio de soja transgênica em escala comercial no Paraná. As áreas apontadas com soja transgênica estão em Ponta Grossa, de propriedade da multinacional Monsanto, e em Cascavel, de propriedade da Cooperativa Central de Pesquisa (Codetec), órgão de pesquisa das cooperativas de produção agrícola. A denúncia é que tanto a Monsanto como a Codetec, que tinham permissão para plantar a soja transgênica, em caráter experimental, extrapolaram no plantio. A Monsanto tinha uma autorização para produzir um hectare de soja transgênica em seus campos experimentais de Ponta Grossa e plantou aproximadamente 25 hectares. Já a Codetec que tinha permissão para plantar 1,5 hectare em Cascavel, também em caráter experimental, plantou 97 hectares. Além da interdição da área, foram apreendidas 340 toneladas de sementes da Codetec e outras 853 sacas da Monsanto. Esses produtos também se encontram à disposição da Justiça e as empresas flagradas estão como fiel depositárias. O presidente da Codetec, Irineo da Costa Rodrigues, disse que a cooperativa vai se defender na Justiça porque toda a área plantada com soja transgênica estava sob a supervisão do Ministério da Agricultura e que nada estava escondido. Ele disse que para efeito de pesquisa é necessário plantar uma área maior, até para a Codetec se preparar para o mercado, caso a liberação do plantio de soja transgência saia ainda este ano. "Se o plantio for liberado, as cooperativas precisam ter o material para plantio", argumentou. O Art. 13. da Lei 8974 dizia que constituem crimes:

V - a liberação ou o descarte no meio ambiente de OGM em desacordo com as normas estabelecidas pela CTNBio e constantes na regulamentação desta Lei. Pena - reclusão de um a três anos. Pergunta: alguém irá para a cadeia se esta denúncia for comprovada??

60

Tanto a Lei 8974 quanto a nova MP não deixam dúvida de quem é a responsabilidade pela fiscalização.

O Art. 7

o

da MP 2131 dizia que “Caberá aos órgãos de fiscalização do Ministério da

Saúde, do Ministério da Agricultura e do Abastecimento e do Ministério do Meio Ambiente, no campo das respectivas competências, observado o parecer técnico prévio conclusivo da

CTNBio e os mecanismos estabelecidos na regulamentação desta Lei:

... II - a fiscalização e o monitoramento das atividades e projetos relacionados a OGM; ... X - a expedição de autorização temporária de experimento de campo com OGM.

Na época vigência da lei anterior, não houve a aplicação de infrações ou d eoutras penalidades.

Mesmo com

a nova

lei

em 2005, pouco ou nada mudou. Fatos comprovados por

jornalistas e mesmo pela fiscalização comprovaram a existência de algodão e milho transgênicos antes de terem sido liberados no país. Assim, a fiscalização é praticamente ineficiente para proteger o país de cultivos ilegais e de contaminação por transgenes.

9-ANÁLISE DE RISCO

As Biotecnologias têm sido utilizadas por milênios para diversos propósitos, incluindo as fermentações para produção de alimentos e bebidas e a seleção de novas variedades de plantas ou animais. Na última metade do século passado, novas biotecnologias foram desenvolvidas, dentre as quais merecem destaque a micropropagação, a fusão de protoplastos, os marcadores moleculares, a clonagem de animais, DNA recombinante e a transgenia. Conseqüentemente, a precisão e o poder de manipulação dos organismos vivos aumentou consideravelmente com o avanço da genética molecular. De todas elas, o que causa maior apreensão é a transgenia, não em si pela tecnologia, mas pelas implicações que seus produtos podem apresentar à saúde humana e ao meio ambiente. Se um transgênico é diferente de uma variedade comum e o gene nele inserido pode apresentar um determinado risco, há a necessidade da avaliação do risco, tanto para a saúde humana como para o meio ambiente. A razão disto está no fato de que os genes transferidos de fora do gene-pool de uma espécie, produzem produtos com os quais temos pouca ou nenhuma experiência. Não se conhecem as implicações que podem ser provocadas pela introdução desses genes em plantas. Desta forma, há um consenso entre os pesquisadores que a sociedade precisa desenvolver regras para o desenvolvimento, testes e comércio de OGMs.

Estes aspectos constituem um grande desafio, pois até o advento dos OGMs nenhuma nova cultivar passava por testes de biossegurança. Embora a engenharia genética transfira somente seqüências curtas de DNA, comparativamente ao genoma de uma variedade, o fenótipo resultante, que inclui a característica transgênica, é possivelmente acompanhado de mudanças nas características e pode produzir um organismo novo em termos de relações ecológicas (Wolfenbarger e Phifer, 2000). Segundo estes autores, os ecossistemas são complexos e nem todo o risco associado com a liberação de um OGM pode ser identificado e considerado. Os testes a serem realizados, os protocolos mais apropriados, os termos de referência, os instrumentos mais adequados ainda são pouco conhecidos e estão sendo discutidos e desenvolvidos. Risco pode ser definido como uma medida dos efeitos de uma ocorrência em termos de sua probabilidade e da magnitude de suas conseqüências. Em seu texto-depoimento (1999) ao Parlamento Inglês, o Prof. Dr. Chris Glidon, da University of Wales, definiu avaliação de risco (‘risk assessment’) como sendo o processo com base científica que consiste na identificação e caracterização dos perigos, da avaliação da exposição e da caracterização dos efeitos dos riscos. Por perigo entende-se a propriedade de uma substância ou processo que

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cause dano. Ou seja, dano é a materialização do perigo. Então, se o potencial de dano é elevado, mesmo uma baixa probabilidade pode significar um risco inaceitável. A avaliação de segurança deve ser baseada nos riscos potenciais impostos pelo produto obtido (Fontes et al., 1996). Assim, a avaliação deve levar em consideração as características do doador, do recipiente, ou quando apropriado, do organismo parental. Devem ainda ser avaliadas as características e a utilização pretendida do OGM, incluindo a escala e a freqüência das introduções e considerações ambientais e de saúde. O manejo dos riscos deve levar em conta as alternativas decorrentes da avaliação de riscos e, se necessário, a seleção e implementação de opções de controle apropriadas, incluindo normas regulatórias. Os danos podem ser diretos ou indiretos, intencionais ou involuntários, imediatos ou não. Segundo o Dr. Chris Glidon, espera-se, ao final do processo, eliminar ou reduzir o risco que possa causar um dano de fato. A diretriz maior é a de que o produto deve ser seguro e sadio para a espécie humana e para o meio ambiente. Portanto, o impacto de um transgene no ambiente e na saúde humana deve ser criteriosamente avaliado (Glidon, 1999). Pode-se também definer Risco como sendo a medida dos efeitos (injúrias, ambientais, econômicos) de uma ocorrência em termos de probabilidade e da magnitude de suas conseqüências. Neste caso, um OGM poderia ser POTENCIALMENTE PERIGOSO, em razão de apresentar, como propriedade, uma substância ou processo que causa dano (injúria ou perda). Assim, DANO seria a manifestação de uma substância ou processo perigoso. Tais danos podem se Diretos ou Indiretos, Imediato ou Longo prazo, Naturais ou Tecnológicos e Intencionais ou Imprevisíveis. Em tese, os riscos não estão relacionados ao que os cientistas sabem, mas ao que eles não sabem (Caruso, 2006). Ou seja, riscos estão associados a incertezas. Neste mesmo sentido “é no contexto da incerteza que viceja a esperança, o juízo e a valoração da subjetividade, capaz de concretizar o inusitado”, segundo Lieber e Romano-Lieber (2003). Já em 1989, pelo menos 15 anos antes da liberaçao no meio amniente da primeira planta transgenica, o tomate Flavr Svr, Tiedje et al. (1989) anteciparam os sete principais riscos ambientais:

criação de novas pragas e plantas daninhas; um aumento das pragas já existentes por meio da recombinação gênica entre a planta transgênica e outras espécies filogeneticamente relacionadas; a produção de substâncias que são ou poderiam ser tóxicas a organismos não-alvos; o efeito disruptivo em comunidades bióticas e o desperdício de valiosos recursos genéticos, seguido de contaminação de espécies nativas com características originadas de parentes distantes ou de espécies não relacionadas e efeitos adversos em processos dos ecossistemas; origem de substâncias secundárias tóxicas após a degradação incompleta de químicos perigosos; efeito adverso nos processos ecológicos; extravagância de recursos biológicos valorosos.

Praticamente todos os efeitos adversos previstos ocorreram com os OGMs liberados. Portanto, não é correto dizer que os mesmo são imprevistos, pois os efeitos adversos ou os danos foram alertados por parte da própria comunidade cientifica.

Riscos à saúde humana

A maioria das plantas transgênicas desta primeira geração de OGMs contém genes de resistência a antibióticos, cuja função é possibilitar a seleção das células transformadas. O que os genes de resistência a antibióticos tem a ver com a saúde humana? Nos últimos 20 anos, mais de 30 novas doenças ocorreram na espécie humana (AIDS, ebola e hepatites, entre outras). Além disso, houve o ressurgimento de doenças como a tuberculose, malária, cólera e difteria com muito mais agressividade por parte dos microrganismos patogênicos.

62

Paralelamente, houve um decréscimo na eficiência dos antibióticos. Nos anos 40, um antibiótico tinha uma vida útil de 15 anos. Nos anos 80, a vida útil passou para cinco anos, ou seja, três vezes menos. Os estudos comprovam de que tanto a recombinação como a transferência horizontal entre bactérias acelerara a disseminação de regiões genômicas destes organismos causadores de doenças, bem como a disseminação de genes de resistência a antibióticos (Ho et al., 1998). É bem conhecido o exemplo da estreptomicina em suínos. Após um ano de aplicação aos animais (1983), genes de resistência a estreptomicina estavam presentes nos plasmídeos de bactérias que viviam na garganta e estômago dos suínos. Um ano mais tarde, bactérias humanas dos familiares que lidavam com estes animais também apresentaram resistência a estreptomicina. Esta é uma prova inequívoca de transferência lateral de genes entre bactérias. Em 1990, este antibiótico foi retirado de circulação. Embora a frequência de transformação e, consequentemente, a transferência horizontal em bactérias é extremamente baixa, os genes de resistência a antibióticos inseridos em plantas transgênicas, poderão ser transferidos para bactérias humanas, o que se constitui num risco a ser considerado. Tem sido sugerido o desenvolvimento de OGMs sem genes de resistência a antibióticos para evitar os riscos acima mencionados. Cabe então o aperfeiçoamento do sistema de seleção tanto via desenvolvimento de outras formas de seleção ou utilização de outros genes. Um segundo tipo de risco relaciona-se com as reações adversas dos alimentos OGMs ingeridos, que podem ser agrupadas em duas categorias: alergênicos e intolerantes. Neste grupo estão os alimentos que causam hipersensibilidade ou alergia. No segundo grupo estão as alterações fisiológicas, como reações metabólicas anormais, toxicidade, reações farmacológicas e idiossincráticas (Finardi, 1999). Então faz sentido saber se uma nova variedade transgênica intensifica ou não a alergia. No caso da Soja RR, os testes realizados não foram suficientes para discriminar as possíveis variações nas 16 proteínas alergênicas desta espécie. Os testes revelaram que houve um aumento (26,7%) do inibidor de tripsina, também alergênico e antinutricional (Padgette et al., 1996), além de uma maior reatividade de uma banda relativa a uma proteína alergênica. Segundo a análise feita por uma pesquisadora independente, Barbara Keeler, a documentação que a empresa forneceu a FDA demonstra que em um dos experimentos também o teor de lectina, que é alergênico, produzido pela Soja RR foi maior (o dobro) que na convencional. O desafio neste caso é sabe quais os tipos de ensaios que fornecem os dados mais inequívocos sobre alergenicidade. Existe ainda uma série de outros riscos à saúde humana que devem ser analisados com protocolos adequados. Um deles é o efeito tóxico que um alimento transgênico pode causar à saúde humana.

Riscos ao meio ambiente

A avaliação de risco ambiental é a avaliação sistemática dos riscos associados à saúde e à segurança humana e ambiental. Os procedimentos devem incluir a identificação dos perigos e a estimativa de suas magnitudes e freqüências de ocorrência, bem como das alternativas ao OGM. Como os riscos associados a uma variedade transgênica dependem das interações complexas decorrentes da modificação genética, da história natural dos organismos envolvidos e das propriedades do ecossistema no qual o OGM é liberado (Peterson et al., 2000; Wolfenbarger e Phifer, 2000), estes procedimentos devem ser aplicados em escala ampla, em termos espaciais e sociais (ver Figura 1). O conhecimento dos riscos também é indispensável porque possibilita a elaboração de planos de seu gerenciamento. O manejo dos riscos é um processo que envolve a análise das alternativas decorrentes dos resultados alcançados com a avaliação destes. Quando requerido, o manejo seleciona e implementa opções apropriadas de controle, incluindo normas reguladoras (Glidon, 1999). Assim, o manejo de riscos deve também fazer parte do estudo de impacto ambiental para fins de licenciamento de atividades com plantas transgênicas. Na ausência de efeitos pleiotrópicos, os efeitos diretos do transgene numa planta seriam razoavelmente previsíveis. Quando os biólogos moleculares dizem que foram feitos

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estudos e não foram detectados efeitos adversos, eles normalmente estão se referindo à primeira das várias células possíveis de serem analisadas (Figura 7). Existem também estudos de parcela (segunda célula da Figura 7), associados predominantemente à performance agronômica do OGM, e que, a rigor, não podem ser tomados como estudos de impactos e riscos ambientais. Não há estudos científicos relacionados a todas as células relevantes desta matriz. Existem sim, relatos científicos de estudos isolados com algumas espécies e que serão apresentados mais adiante.

estudos e não foram detectados efeitos adversos, eles normalmente estão se referindo à primeira das várias

Figura 7. Efeitos diretos e indiretos de variedades transgênicas (OGM) e as interações complexas que fazem parte da avaliação de risco ambiental (Adaptado de Peterson et al., 2000).

A complexidade da avaliação é decorrente do fato de que os riscos e os benefícios associados a uma cultura específica mudam e tornam-se mais difíceis de serem avaliados na medida que a área de cultivo aumenta e outros aspectos são considerados. Impactos indiretos nos ecossistemas são muito mais difíceis de investigar, monitorar e, portanto, predizer (Peterson et al., 2000). Segundo estes autores, esta é uma das origens da controvérsia estabelecida entre os ambientalistas e os biólogos moleculares. Enquanto os primeiros referem-se aos impactos sociais e nos ecossistemas, os últimos fazem menção aos testes feitos com uma ou poucas plantas em laboratório ou em casa de vegetação. A complexidade também é decorrente do fato de que inúmeros trabalhos científicos demonstraram que o padrão de variação fenotípica, sua base genética e a seleção natural sobre eles variam em diferentes condições ambientais (Susuki et al., 1986; Ackerly et al., 2000). O problema da biologia é que, em contraste com outros ramos do mundo físico, nos quais poucas grandes forças dominam os fenômenos, o organismo vivo é resultante de um grande número de caminhos fracos causais determinantes, fazendo com que seja extremamente difícil proporcionar explanações completas (Lewontin, 2000). Em seu recente texto, o autor afirma ainda que um organismo vivo num momento qualquer de sua vida é a conseqüência única da história do desenvolvimento que resulta de interações e determinações de forças internas e externas. Devido aos contextos históricos, políticos e econômicos da biotecnologia seria apropriado questionar o que vem sendo praticado em termos de avaliação de risco. As agências regulatórias não têm utilizado critérios ecologicamente compreensíveis para avaliar os riscos de organismos transgênicos (Peterson et al., 2000). Uma revisão dos pedidos de liberação para a comercialização de OGM na Comunidade Européia revelou claramente que a avaliação de risco ambiental não foi feita ou interpretada adequadamente pelos Estados Membros (Glidon, 1999). A recomendação de bastidores destes experimentos de campo sugere que está sendo aplicado o ditado popular “não olhe, não encontre”. Tampouco esta avaliação de riscos e dos impactos ambientais foi adequadamente feita no Brasil com os OGMs cuja liberação para cultivo foi solicitada por empresas a CTNBio. Entre os riscos ambientais, a poluição genética, por meio da transferência vertical e da transferência horizontal, é a ameaça considerada mais importante. Em decorrência disto, espécies que adquirirem certos transgenes poderão alterar seu valor adaptativo e,

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conseqüentemente, a dinâmica de suas populações e de outras espécies as quais interagem estará desafiada. Contudo, outros riscos são possíveis como efeitos danosos em espécies não-alvo (aves, minhocas, peixes, entre outros), contaminação de solo e água, cujas dimensões também são impossíveis de prever antes dos estudos a serem realizados (Nodari e Guerra, 2000a). Do ponto de vista agrícola, a transferência de genes pode provocar o surgimento de plantas daninhas e pragas resistentes, bem como variantes genéticos, cujas características não se pode antecipar. Além disso, a agrodiversidade, que é a diversidade genética em cultivo mantida pelos agricultores, poderá ser afetada.

Transferência vertical

Refere-se ao acasalamento sexual entre indivíduos sexualmente compatíveis, geralmente da mesma espécie e, raramente, de espécies afins. O acasalamento é uma via para o fluxo gênico, entre plantas da mesma espécie, como entre plantas de diferentes espécies. Assim, de longa data têm sido observados cruzamentos entre indivíduos de populações em estado incipiente de especiação ou de espécies aparentadas. Exemplos disso são os cruzamentos entre o arroz cultivado e o arroz perene, milho e teosinto, um de seus possíveis ancestrais (Doebley, 1990), beterraba cultivada e beterraba não domesticada e entre espécies cultivadas e inços do gênero das abóboras (Wilson, 1990). Os impactos ecológicos da transferência de pólen, um mecanismo reprodutivo pelo qual a introgressão pode ocorrer, dependem da capacidade dos híbridos em sobreviver e reproduzir. Taxas de sobrevivência ou de reprodução indicam a oportunidade da introgressão de transgenes em populações naturais, dependendo do fluxo gênico subseqüente e da pressão de seleção (Wolfenbarger e Phifer, 2000). Estes autores relataram 11 casos de formação de híbridos entre variedades transgênicas e plantas aparentadas e/ou daninhas. Para se tornar uma ameaça, como uma planta invasiva, os híbridos precisam ser viáveis e competitivos, além de férteis quando dependem da reprodução sexual para propagação. Com base no se conhece hoje, nem todos os híbridos vão atingir a última fase. Os poucos estudos associados à introgressão de transgenes e suas conseqüências ecológicas em populações naturais ainda não permitem fazer previsões confiáveis. Contudo, a experiência anterior com plantas de lavoura sugere que os efeitos negativos são possíveis. Para doze das treze espécies de maior importância econômica mundial, a hibridização com parentes selvagens contribuiu para a evolução de algumas espécies de ervas daninhas. Em alguns casos, os elevados níveis de introgressão a partir de parentes cultivados ou introduzidos eliminaram a diversidade genética e contribuíram para sua extinção (Ellstrand et al., 1999). Quando são viáveis e havendo fertilidade, mesmo baixa, a sobrevivência dos híbridos interespecíficos se torna possível, e estes podem cruzar com plantas de qualquer uma das duas espécies parentais. Caracteriza-se, então, o processo de introgressão de genes de uma espécie para outra. No caso do cruzamento entre canola transgênica e a mostarda silvestre, o número de sementes da segunda geração do híbrido foi dez vezes maior do que o F .

1

Algumas plantas descendentes do cruzamento produziram 10 mil sementes e o gene de resistência ao herbicida ainda permanecia numa grande quantidade de plantas. Isto demonstra que a transferência de genes que condicionam resistência a herbicidas pode ocorrer com maior intensidade e facilidade do que se imaginava antes desta descoberta (Chèvre et al., 1998). Uma vez dentro de populações silvestres, os transgenes poderão tornar estas plantas mais invasivas e, portanto, potencialmente perigosas para a agricultura ou a biodiversidade (Fontes et al., 1996). Mas também pode ocorrer, segundo as autoras, que a presença do transgene diminua a adaptação natural, o que tornaria a população vulnerável à extinção. No caso de transferência de outras características para outras espécies afins, praticamente nada pode ser antecipado, devido à ausência de dados. Contudo, se o valor adaptativo de um híbrido interespecífico for aumentado com a presença deste gene transferido, é factível que tal gene se mantenha via introgressão.

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O número dce contaminações de variedades crioulas ou mesmo convencionais por

transgenes aumenta todo o ano. Um conjunto de organizações da sociedade civil vem

acompanhando

e

registrando

estas

contaminações

(http://www.gmcontaminationregister.org). Entre 1997 e 2006 ocorreram 107 contaminações genéticas; 24 cultivos ilegais e 8 efeitos colaterais agrícolas negativos. Destes 144 casos comprovados, envolveram 44 países, sendo a media de 14,2 ao ano. O mais espantoso é que 35% ocorreram com milho, que é um alimento nobre! Diante disso começaram as preocupações com a coexistência. A coexistência, segundo a Diretiva 556/03/ECC, significa a possibilidade efetiva, para os agricultores, de escolherem entre o modo de produção convencional ou biológico, ou ainda a produção de culturas GM, no respeito das obrigações legais em matéria de rotulagem ou de normas de pureza. A rigor, é impossivel ocorrer a coexistência sem contaminação. A CTNBio baixou a Resoluçao Normativa n° 4, de 16 de agosto de 2007 e publicada no DOU, n° 163 de 23/08/2007, p.19. Nela esta estabelecido que “Para permitir a coexistência, a distância entre uma lavoura comercial de milho geneticamente modificado e outra de milho não geneticamente modificado, localizada em área vizinha, deve ser igual ou superior a 100 (cem) metros ou, alternativamente, 20 (vinte) metros, desde que acrescida de bordadura com, no mínimo, 10 (dez) fileiras de plantas de milho convencional de porte e ciclo vegetativo

similar ao milho geneticamente modificado” (art. 2). Ironicamente ou intrigantemente, no mesmo dia a CTNBio aprovou o evento MON810, milho transgenico, por meio do Parecer Técnico nº 1.100/2007, de 16 de agosto de 2007. Nele, está escrito que “Comparando-se as concentrações a 1 m da cultura fonte sob ventos baixos a moderados estimou-se que, aproximadamente, 2% de pólen são anotados a 60 m, 1,1% a 200 m e 0,75-0,5% a 500 m de distância. Ou seja, a RN n 4 é totalmente ineficiente para garantir a coexistência sem contaminaçao caso o que está contido no próprio parecer da CTNBio, o pollen do milho deve se disseminar pelo menos a 500 m de distância.

Também a transgenia ainda pode afetar o processo reprodutivo em plantas. Um aumento da taxa de fecundação cruzada foi verificado em Arabidopsis thaliana. Bergelson et al. (1998) constataram um aumento de 20 vezes na freqüência de fecundação cruzada em plantas transgênicas comparativamente às plantas não-transgênicas.

Tabela 8. Exemplos selecionados de transferência de genes de resistência a herbicida de plantas transgênicas para suas plantas daninhas.

Cultura

Planta daninha

Herbicida

Autor

Canola

Mostarda silvestre

Basta

Chèvre et al., 1998

Trigo

Aegilops cylindrica

Round-up

Steven et al.,1998

Sorgo

‘Johnson grass’

Round-up

Arriola e Ellstrand,

 

1998

Beterraba

Beterraba não domesticada

Round-up

New Scientist,

 

21/10/2000

Agrostis stolonifera

A. canina, A. capillaris, A. castellana, A. Gigantea e A. Pallens.

Round-up

Wipff e Fricker, 2000

As plantas daninhas resistentes a herbicidas também podem se originar pela pressão de seleção sobre os recombinantes cada vez mais tolerantes, gerados naturalmente, ao herbicida aplicado. Dentre as mais de 100 plantas resistentes a herbicidas, três delas são plantas daninhas resistentes a formulações comerciais à base de glifosato: poaia-branca (Richardia brasiliensis), trapoeraba (Commelina virginica) e erva-quente (Spermacoce latifolia) (CTNBio, 1998). A própria soja RR se tornou uma planta invasora, porque os grãos que ficam na susperficie do solo após a colheita germinam e são resistentes ao glifosato.Isto está obrigando

66

os agricultores a utilziar outros herbicidas igualmente ou mais tóxiucos que o glufosato. O fato de empresas produtoras do herbicida 2,4-D terem solicitado registro para uso deste produto visando pó controle da soja RR como planta invasoa é a demonstração do fato.

Transferência horizontal ou lateral (TH)

Quando existe transferência de genes entre espécies filogeneticamente diferentes, na ausência do acasalamento sexual, configura-se a transferência lateral ou transferência horizontal. Neste caso, o material genético é transmitido de uma espécie para outra, provavelmente com auxílio de vetores (plasmídios, transposons e vírus). Elementos similares a transposons são veículos para cortar e ligar DNA genômico de um organismo noutro. Vírus também poderiam ser responsáveis pela transmissão de genes entre eucariotos. Na verdade, os mecanismos de transferência lateral são pouco estudados e, portanto, praticamente desconhecidos. Diversos casos de absorção de DNA por parte de células eucariotas foram também registrados (Tappeser et al., 1999). Num deles, foi demonstrado que o DNA fornecido na alimentação de ratos não só não era totalmente destruído no trato gastrointestinal, mas também poderia alcançar a corrente sangüínea e temporariamente ser detectado nos leucócitos ou células do fígado. Outros exemplos de detecção de DNA de eucariotos em bactérias e animais, como DNA de milho transgênico em bactérias de intestino de abelhas ou DNA de milho transgênico em vários órgãos de galinhas, estão sendo noticiados pela imprensa, mas necessitam aparecer em publicações científicas ou serem validados cientificamente. A transferência horizontal é bem mais conhecida em bactérias, sendo os eventos menos comuns em animais e no homem comparativamente a plantas e microrganismos. A filogenia de plantas indica que a TH de genes está envolvida no processo evolutivo. A fusão endosimbiótica – a mitocôndria e o cloroplasto fundidos com a célula nucleada em plantas – seria um caso específico de TH. Os genes citocromo c e gapdhA (gliceraldeido-3- fosfato-desidrogenase) devem ter sido transferidos de microrganismos para plantas (Syvanen, 1994). A transferênciade material genético de Agrobacterium tumefasciens para plantas também é um exemplo bem ilustrativo. A edição de 21/05/99 da revista Science (1999) inclui inúmeros exemplos de transferência horizontal de genes. Assim, genes humanos já foram detectados em Mycobacterium tuberculosis, a bactéria que causa a tuberculose. Experimentalmente, Nielsen et al. (2000) verificaram que o DNA de beterraba transgênica pode ser transferido para Acinetobacter sp. Strain BD413, uma bactéria de solo. Neste caso, a TH ocorreu de um extrato celular para plasmídeos de bactérias. Casos de transferência via recombinação homóloga são mais freqüentes do que se imaginava (Nielsen et al., 1998). Um outro estudo recente demonstrou também que a promiscuidade na transferência de DNA entre plantas é maior que se suspeitava. O intron do grupo I do genoma mitocondrial de plantas vasculares, que está localizado no gene coxl da espécie Peperomia polybotrya, teria sido adquirido por transferência horizontal (ou lateral) de um fungo. Analisando o DNA de 335 plantas de diferentes gêneros, Cho et al. (1998) verificaram que este intron está amplamente disperso nos genes cox1 das angiospermas. O referido intron está presente em 48 gêneros diferentes, a partir de 32 eventos independentes de transferência horizontal. Esta constatação revela a grande freqüência das trocas de material genético na natureza e traz preocupações, em especial quanto à possível interação entre plantas transgênicas e outros vegetais. Uma pergunta comumente feita relaciona-se com as conseqüências da introdução em plantas de genes (intactos ou modificados) originados de vírus patogênicos. Trocas de material genético também podem ocorrer entre plantas e vírus. A primeira evidência experimental sobre a recombinação entre uma planta transgênica contendo genes virais e um vírus foi obtida por Greene e Allison, em 1994, embora este tipo de recombinação já fosse conhecido desde os anos 80. A introdução de genes que codificam a capa protéica originada de vírus patogênicos, ou outras seqüências virais, é utilizada para conferir às plantas resistência aos próprios vírus doadores. É difícil estabelecer as conseqüências, caso este gene seja transferido para outras plantas. Contudo, um vírus poderá infectar um planta

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transgênica que tem a proteína do encapsulamento de outro vírus. Neste caso ocorrerá uma transencapsidação, cujas conseqüências são totalmente desconhecidas. Recentemente também, um estudo com arroz transgênico, conduzido no John Innes Institute, da Inglaterra, corroborou a evidência de que o promotor do vírus do mosaico-da- couve-flor (CaMV), que também está presente na maioria das plantas transgênicas e nas suas progênies, é um sítio de alta freqüência de recombinação gênica. Recombinação gênica é a troca de material genético entre duas moléculas de DNA, altamente similares geneticamente, que pode resultar numa terceira molécula diferente das duas parentais, e, portanto, um variante. O mais intrigante, entretanto, é que os autores verificaram que a maioria dos eventos era do tipo de recombinação “ilegítima” ou não-homóloga e não requeriam uma similaridade substancial na seqüência de bases. Tais eventos podiam ocorrer mesmo na ausência de genes virais (Kohli et al., 1999). Além disso, a seqüência de bases do promotor do CaMV, usado em várias plantas transgênicas, como a soja e o milho, é similar a regiões de vírus patogênicos à espécie humana. Desta forma, não se pode descartar a possibilidade de recombinações entre o transgene e outros vírus, resultando em novas combinações genéticas, cujas propriedades não são conhecidas, mas que necessitam ser estudadas antes do cultivo em larga escala de plantas que contêm estas seqüências. A priori, não se pode descartar, então, que a inserçãoinserção de seqüências virais em plantas poderá tornar os vírus mais promíscuos e com isto provocar mais doenças em plantas. Embora não se conheça a magnitude da contribuição da engenharia genética para a transferência horizontal, é possível levantar a hipótese de que o cultivo em larga escala de plantas transgênicas deve favorecer a TH. Geralmente, as plantas transgênicas contêm elementos mediadores da transformação in vitro, ou parte deles, e também da TH, como plasmídeos, transposons e vírus. Os vetores utilizados para a obtenção de plantas transgênicas freqüentemente apresentam na construção quimérica origem de replicação, seqüências de transferência, promotores fortes e genes de resistência a antibióticos. Todos estes elementos facilitam a recombinação e a transferência de genes. Plasmídeos e vírus quiméricos estão sujeitos a instabilidades estruturais, o que facilita também a recombinação (Ho et al., 1998). Na natureza, a poluição com metais pesados pode se constituir em fator benéfico para a transferência de genes. Como parte das seqüências introduzidas são homólogas a muitos procariotos, a transferência de material genético para eles via recombinação é factível. Dependendo das seqüências introduzidas na planta transgênica, haverá uma maior ou menor probabilidade de favorecimento para a TH. Outro aspecto importante está relacionado com a freqüência de ocorrência da TH.

Embora, algumas estimativas sejam baixas, como 2x10

-17

, o número de cópias em cultivo

poderá ser muito alto. O fato de que uma planta pode conter mais de dois trilhões de células, e um hectare de soja mais de 300 mil plantas, permite supor a probabilidade da existência de

mais de 1,2 x 10

-18

de cópias por hectare, de um transgene. Considerando o cultivo em pelo

menos cinco milhões de hectares, não é difícil concluir que uma ou mais recombinações podem de fato ocorrer, mesmo porque, a probabilidade de sua ocorrência, embora baixa, é finita, ou seja, tem um valor que é influenciado por vários fatores. De crucial importância também é o efeito individual de cada transgene. Na tecnologia denominada de ‘terminator’, os embriões contidos nas sementes a serem colhidas pelos agricultores são defeituosos. Um dos componentes do sistema é a enzima recombinase, a qual tem o potencial de misturar genomas. Esta foi a conclusão a que chegaram Schmidt e colegas (2000). A recombinase Cre é parte do sítio específico de recombinação Cre/lox, originalmente isolado do bacteriófago P1. Cre catalisa a recombinação entre dois sítios lox, retirando qualquer pedaço de DNA entre ambos. Estes sítios 'ilegítimos' freqüentemente carregam pouca similaridade em relação ao elemento lox. Não há dados sobre o reconhecimento ilegítimo em animais e plantas. Segundo os autores, altos níveis de expressão de Cre nas espermátides de ratos transgênicos heterozigotos levam a 100% de esterilidade em machos, mesmo na ausência dos sítios lox. A esterilidade seria causada pela quebra e reunião de DNA em sítios inapropriados. Embriões fertilizados por estes espermas

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não passam do estágio de quatro células. “Estes resultados indicam que Cre tem conseqüências patológicas em animais” concluíram os autores. São duas, então, as principais implicações da TH. A primeira refere-se à maior probabilidade de transferência horizontal de genes a partir de plantas transgênicas comparativamente às variedades tradicionais. A segunda refere-se ao fato de que os genes com potencial de disseminação podem dar vantagem seletiva aos organismos receptores, o que poderá alterar dramaticamente a dinâmica das populações e a paisagem. Como ainda não é possível determinar a probabilidade de um evento de TH ocorrer, bem como suas conseqüências, torna-se praticamente impossível fazer qualquer previsão realística na ausência de novos estudos.

Transferência horizontal em bactérias

Estudos comprovaram que a recombinação e a transferência horizontal entre bactérias aceleram a disseminação de regiões genômicas destes organismos causadores de doenças, bem como a disseminação de genes de resistência a antibióticos (Ho et al., 1998). É bem

conhecido o exemplo da estreptomicina em suínos. Após um ano de aplicação deste antibiótico em animais (1983), genes de resistência à estreptomicina estavam presentes em bactérias que viviam na garganta e estômago dos suínos. Um ano mais tarde, bactérias humanas dos familiares que lidavam com estes animais também apresentaram resistência à estreptomicina. Esta é uma prova inequívoca de transferência lateral de genes entre bactérias. Em 1990, este antibiótico foi praticamente retirado de circulação porque já não era mais efetivo.

A maioria das plantas transgênicas desta primeira geração de OGMs contém genes de resistência a antibióticos, cuja função é possibilitar a seleção das células transformadas. Embora a freqüência de transformação e, conseqüentemente, a transferência horizontal em bactérias seja extremamente baixa, os genes de resistência a antibióticos inseridos em plantas transgênicas poderão ser transferidos para bactérias humanas, o que se constitui num risco a ser considerado. A relação entre os genes de resistência a antibióticos e a saúde humana está no fato de que nos últimos 20 anos, mais de 30 novas doenças ocorreram na espécie humana (AIDS, ebola e hepatites, entre outras). Além disso, houve o ressurgimento de doenças como a tuberculose, a malária, a cólera e a difteria com muito mais agressividade por parte dos microrganismos patogênicos. Paralelamente, houve um decréscimo na eficiência dos antibióticos. Nos anos 40, um antibiótico tinha uma vida útil de 15 anos. Nos anos 80, a vida útil passou para cinco anos, ou seja, três vezes menos (Ho et al., 1998). A transferência horizontal de material genético entre diferentes bactérias é relativamente comum. Sendo assim, o desenvolvimento de OGMs sem genes de resistência a antibióticos pode evitar os riscos acima mencionados. Ameaças diretas aos componentes da biodiversidade – As ameaças aos componentes da biodiversidade são múltiplas, pois, em um ecossistema devem ser considerados não somente os organismos vivos, mas também os processos ecológicos. Um trabalho que causou grande impacto na comunidade científica avaliou o efeito do pólen de milho transgênico em lagartas da borboleta monarca (Danaus plexippus). A taxa de mortalidade destas lagartas atingiu 44% quando se adicionaram ao seu alimento natural folhas de Asclepias curassavica, pólen de uma variedade de milho transgênico, que contém um gene de Bacillus thuringiensis (Bt) que codifica para uma toxina, que é tóxica a vários insetos. Entretanto, todas as lagartas que receberam pólen de milho não-transgênico ou nenhum pólen, sobreviveram (Losey et al., 1999). O trabalho recebeu críticas metodológicas, porém, um ano depois, resultados semelhantes foram obtidos em experimentos no campo. Neste caso, o pólen das variedades de milho transgênicas KnockOut (evento 176) e YieldGard (Bt 11), ambos da Novartis Seeds, também provocou mortalidade (Hansen Jesse e Olbrycki,

2001).

Também se conhece pouco sobre as possíveis alterações na associação entre plantas e fungos micorrízicos. O primeiro estudo sobre os exudatos na rizosfera de plantas transgênicas foi publicado recentemente (Saxena et al., 1999). Nesse trabalho observou-se

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que as toxinas inseticidas Bt podem permanecer ativas no solo, onde se ligam a argila e ácidos húmicos. Mesmo ligadas a estes componentes do solo, as toxinas mantêm suas propriedades inseticidas e são protegidas contra a degradação por microrganismos porque estão ligadas às partículas do solo, onde podem persistir por pelo menos 234 dias. Quais são as implicações destes fatos? Uma revisão recente feita por Wolfenbarger e Phifer (2000) assinala nove estudos focalizados no perigo de variedades transgênicas sobre organismos não alvo, incluindo os já mencionados. Em um terço deles, nenhum efeito negativo foi observado nas características avaliadas. Os resultados revelaram que as variedades transgênicas causaram maior mortalidade e diminuíram a viabilidade de ovos e a longevidade dos adultos de insetos não alvos, além de diminuir a diversidade bacteriana na rizosfera. Como conseqüência, a taxa de decomposição dos restos culturais e dos níveis de carbono e nitrogênio poderá diminuir e afetar a fertilidade do solo. Assim, a produtividade dos cultivos poderá decrescer em face da diminuição da diversidade dos microrganismos de solo. Um dos aspectos relevantes na atualidade é a preservação da identidade do produto como requisito de qualidade. Não se trata apenas de segregação, mas de manter a identidade de um produto desde sua origem até o consumo. Contudo, na agricultura, esta preservação de identidade está longe de ser atingida. Nem a segregação simples pode ser garantida, mesmo por países como Estados Unidos. É ilustrativo o caso do milho transgênico StarLink (da Aventis CropScience) um tipo de Bt que contém o gene Cry9C, aprovado pela Environmental Protection Agency (EPA) para alimentação animal mas não para consumo humano. Este milho contém uma proteína (Cry9C) que pode causar reações alérgicas em humanos, uma vez que ela não foi quebrada imediatamente nos testes de digestão. Tanto grãos quanto subprodutos foram misturados com grãos não-transgênicos, conforme análise de produtos alimentícios de consumo humano. Além disso, houve também a contaminação de colheitas que deveriam ser não-transgênicas devido à disseminação do pólen. Não só o cultivo de variedades melhoradas não-transgênicas, mas a agrodiversidade, que pode ser definida como a diversidade de espécies agrícolas, composta de variedades crioulas mantidas pelos agricultores, também pode ser ameaçada pelo cultivo dos transgênicos. Na análise dos riscos está sendo ignorada uma realidade fundamental: o pólen de milho pode ser carregado pelo vento até 9,6 km. Segundo o professor Walter Fehr, melhorista da Iowa State University, "não é somente o que você faz. É também o que seu vizinho faz", ressaltando que “agricultura é vizinhança”, quando se trata de identificação, segregação e rotulagem de cultivos transgênicos. Com esta mobilidade do pólen, uma simples lavoura de transgênicos pode contaminar várias outras não-transgênicas, numa área relativamente grande. Como decorrência, separar os agricultores em duas classes, uma que produz transgênicos e outra que não os cultiva, não ajuda muito (Washington Bureau, 01/10/2000). Este alerta é corroborado por vários episódios de contaminação de lavouras de milho com pólen de milho transgênico. Alguns destes casos estão sendo analisados pela justiça americana. Em diversos municípios do Sul do Brasil, estão sendo organizadas anualmente Feiras de Sementes. Na segunda edição de uma delas, realizada em 15 de julho de 2000 em Porto União (PR), 49 representantes de comunidades situadas em 13 municípios expuseram amostras de 41 variedades crioulas de milho e 46 de feijão, para citar apenas duas das 51 espécies identificadas na referida feira. Surpreendentemente, formas de teosinte também são mantidas pelos agricultores daquela região. Assim como esta, uma ampla diversidade de espécies e formas dentro de espécies é exposta ano a ano nestas feiras de sementes. Ensaios com variedades crioulas feitas por técnicos da Emater/RS, em David Canabarro, revelaram que seu potencial chegou a mais de seis toneladas por hectare (Dados não publicados). Além do rendimento, estas variedades crioulas contêm uma ampla gama de características, com alta variabilidade genética, estando continuamente submetidas ao processo evolutivo e gerando, anualmente, novas recombinações. Esta agrodiversidade deve ser considerada nas avaliações de riscos ambientais. O mínimo que se pode fazer é informar

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aos agricultores o que poderá acontecer com seus materiais, caso transgênicos sejam cultivados nas proximidades e levar em consideração a opinião deles. Nas regiões de ocorrência natural de alta diversidade genética de uma espécie ou espécies afins, como é o caso de algodão ou amendoim no Brasil, o cultivo de plantas transgênicas destas espécies merece análise mais rigorosa. No México, por exemplo, ainda não foi liberado o cultivo comercial de milho transgênico, devido à existência de extensas áreas com populações ancestrais e parentes silvestres da espécie. O Brasil é ainda berço de várias espécies cultivadas ou apresenta regiões com alta variabilidade genética nas populações crioulas ainda em cultivo, situação esta que requer muita cautela. Como avaliar adequadamente este tipo de risco é sem dúvida um grande desafio. A determinação de riscos de plantas transgênicas que contêm inseticidas é complexa. Não se conhece ainda profundamente o efeito destas sobre insetos ou outros organismos benéficos. Tampouco, os poucos estudos sobre pássaros ou outros animais que se alimentam de insetos que se alimentam de plantas transgênicas não proporcionam um conhecimento amplo do assunto.

Riscos socioeconômicos, com ênfase na agricultura

Dentre eles, os mais relevantes seriam o aumento da população de pragas e microrganismos resistentes e/ou patogênicos, o aumento ou promoção de plantas daninhas resistentes a herbicidas, a contaminação de variedades crioulas mantidas pelos agricultores, a contaminação de produtos naturais como o mel, a diminuição da diversidade em cultivo com o aumento da vulnerabilidade genética, a dependência dos agricultores a poucas empresas produtoras de sementes, produtividade e os preços ainda indefinidos. Um fato é inquestionável: os insetos que hoje são susceptíveis ao Bt, no futuro, serão resistentes ao Bt. Resta saber em quanto tempo. Se houver uma grande área plantada com variedades transgênicas resistentes a um inseto, somente os resistentes sobreviverão, gerando progênies recombinantes, que eventualmente apresentarão maior nível de resistência à toxina. Após vários ciclos de recombinação, deverão aparecer insetos resistentes ao gene Bt. No caso de esta resistência ser condicionada por genes dominantes, a velocidade do aumento da freqüência dos alelos de resistência é extraordinariamente maior, comparativamente àquela observada para alelos recessivos (Figura 8; Crow, 1986). Com isto, cria-se uma superpraga, como já ocorreu com o uso de agrotóxicos. O fato de que a resistência da lagarta European corn borer (Ostrinia nubitalis) às formulações comerciais de Bt (ex: Dipel) seja controlada por um gene parcialmente dominante (Huang et al., 1999) indica que o sistema de refúgio só será efetivo por poucos anos, porque a maioria da progênie dos insetos será resistente à toxina e, portanto, atacará as variedades Bt. O que de fato acontecerá com a freqüência dos insetos resistentes, alvos e não-alvos, nas condições brasileiras, é difícil de prever.

aos agricultores o que poderá acontecer com seus materiais, caso transgênicos sejam cultivados nas proximidades e

Figura 8. Evolução da freqüência de um alelo de resistência (p) quando é recessivo (h=1), dominante (h=0) ou quando existe co-dominância. (h=1/2). Para esta simulação, o indivíduo deve

estar sob pressão de seleção e o coeficiente de seleção deve ser igual a 1, ou seja, no caso de insetos susceptíveis, eles morrem após se alimentarem de tecidos de uma planta que contém a

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toxina de Bt por exemplo. Para aquelas pragas cujos genes de resistência às toxinas são recessivos, o aumento da freqüência ocorrerá lentamente. O contrário ocorrerá com aquelas pragas que carregam genes dominantes para a resistência (Adaptado de Crow, 1986).

O sistema de refúgio apregoado como uma prática de manejo, que retardaria o aumento na freqüência de insetos resistentes, consiste no cultivo de uma pequena faixa com variedades susceptíveis, o que permitiria o acasalamento entre insetos susceptíveis e resistentes. Uma das premissas para que o sistema seja duradouro, é que a resistência dos insetos à toxina Bt deve ser recessiva. Em caso contrário, rapidamente os alelos de resistência serão prevalentes. Com o aumento rápido da freqüência de insetos resistentes ao Bt, o uso atual de formulações comerciais à base de Bt em lavouras orgânicas fica comprometido, como também a produção de produtos com este tipo de inseticida, considerado muito menos tóxico que os demais.

O aumento dos custos de produção já é uma realidade em vários países. Na China, por exemplo, a estratégia de refúgio para algodão Bt transgênico não foi empregada pelos agricultores. Como resultado, as pragas secundárias se tornaram importantes e o custo com inseticidas aumentou a tal ponto de que a rentabilidade das tecnologias convencional ou transgênica se equivalem cinco anos após sua implementação (Wang et al., 2006). O aumento do uso dos agrotóxicos nos cultivos transgênicos foi decorrente da alteração do status de algumas pragas que eram secundárias e passaram a ser primárias e predominantes. Sobre a rápida evolução de pragas secundárias tornarem-se primárias na China, a empresa atribui o fato à inexistência de um programa de manejo de insetos. Segundo o mesmo artigo, em certas regiões da China, o custo com inseticidas em lavouras de algodão Bollgard aumentou a tal ponto que a rentabilidade das tecnologias convencional ou transgênica se equivaleram cinco anos após sua implementação.

A soja RR também está perdendo a competitividade no Brasil. Pela primeira vez, os produtores de soja convencional tiveram mais rentabilidade do que os de soja transgênica. A Confederação Nacional da Agricultura (CNA) revelou que, este ano, a comercialização da saca de soja convencional deverá render ao produtor R$ 0,27 a mais do que a da convencional no Mato Grosso. A explicação para a inversão é o aumento de 46,2% no preço do glifosato, principal herbicida utilizado na cultura. No Brasil, a Monsanto é praticamente a única empresa a comercializar o glifosato, com cerca de 90% do mercado. De acordo com a CNA, na Argentina, o produto custa entre US$ 2 e US$ 2,50 o litro, mas no Brasil, embora comercializado pela mesma empresa, chega a US$ 5 o litro. Por isso, os produtores preferem importá-lo. Apesar do aumento do custo, vamos insistir na produção do transgênico. Não podemos perder este mercado, porque há oportunidades para os dois produtos - disse Fábio de Sá Meirelles, da CNA. Com o aumento do preço, o custo de produção ficou extremamente alto - disse Meirelles. O preço do litro do glifosato no Mato Grosso passou de de R$ 8 para R$ 11,63 o litro na safra 2007/2008, o que gerou uma acréscimo de 23% nas despesas em lavouras transgênicas e de 14,3% nas convencionais. O resultado foi um aumento de 7,5% no custo operacional da soja geneticamente modificada e de 3,8% no da convencional. (Cláudia Dianni Viviane Monteiro - Jornal do Brasil 19/12/2007)

A transgenia também pode levar ao aumento de pragas de solo. Na cultivar transgênica de algodoeiro, Paymaster 1560 BG, resistente ao glifosato, observou-se um aumento na susceptibilidade ao nematóide-das-galhas (Meloidogyne incognita Kofoid e White), quando comparado com o parental não-transgênico Paymaster 1560 (Colyer et al., 2000). Embora um número limitado de cultivares tenha sido avaliado, os dados demonstram diferenças na susceptibilidade ao nematóide das galhas entre algumas cultivares transgênicas e seus parentais não-transgênicos. O resultado deste trabalho também indica a necessidade de estudos sobre a reação de plantas transgênicas às pragas e doenças antes da liberação para cultivo.

A dinâmica das populações de microrganismos de solo também poderá ser afetada pelo cultivo de plantas transgênicas. O uso de glifosato combinado ou não com outros herbicidas nas doses recomendadas sobre o cultivo de Soja RR apresentou maior incidência

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de fusarium nas raízes uma semana após a aplicação, comparativamente à soja não- transgênica que não recebeu (Kremer et al, 2000). Os testes que foram realizados no campo no período 1997-2000 revelaram que a freqüência de fusarium nas raízes aumentou de 0,5 a 5 vezes entre a segunda e a quarta semana após a aplicação dos herbicidas. O fusarium causa a síndrome da morte repentina (SDS) em soja. O artigo More "Funny" Honey, publicado no FOEE Biotech Mailout, aborda aquestão da perda de status do mel como alimento sadio e natural, como resultado da poluição causada pelos OGM. Análises efetuadas no mel indicaram a presença de pólen de canola transgênica tolerante a um herbicida. Este mel, coletado na Inglaterra em 1999 e analisado no Austrian Federal Laboratory em Vienna revelou a presença de DNA do gene de resistência ao mesmo herbicida. Os apicultores do Canadá também estão tendo problemas com a comercailização do mel, pois análises feitas na Europa detectaram contaminação com pólen de canola de variedades transgênicas. Agora, diante das novas normas da Europa, os apicultores se sentem sem o menor poder de reação e os preços do mel (contaminado) despencaram. Ainda são desconhecidos outros efeitos dos transgênicos sobre as abelhas, pois isto dependerá das proteínas codificadas pelos genes engenheirados. Contudo, dentre os trabalhos efetuados em abelhas com inibidores de proteases, cabe destacar um que demonstrou seus efeitos adversos quando abelhas foram alimentadas com açúcar contendo os referidos inibidores (Pham-Delégue M.-H., 1997). Este inibidores poderão se converter em estratégias de resistência a insetos, como já foi demonstrado em canola. Neste caso o efeito sobre abelhas poderá ser grande. Entretanto, ainda não está clara a associação entre a concentração dos inibidores e a magnitude dos efeitos. O autor verificou ainda que pólen de canola e soja transgênicas encurtou o ciclo de vida e alterou comportamentos associados ao olfato e à habilidade de apreender de abelhas melíferas. Os resultados dos primeiros experimentos sobre os efeitos da inclusão de derivados de OGM na ração animal feitos por pesquisadores independentes começam a ser analisados. Segundo o jornal britânico The Guardian, de 04/11/2000, os pesquisadores Steve Kestin e Toby Knowles, da University of Bristol, verificaram que a mortalidade de frangos alimentados com milho transgênico foi praticamente o dobro (7,14%) comparativamente à mortalidade de frangos tratados com milho convencional (3,57%). Os cientistas questionaram ainda os métodos e conclusões dos estudos da Aventis submetidos para análise das autoridades britânicas visando à liberação do milho transgênico. Contudo, estes resultados ainda devem ser validados cientificamente, pois este tipo de experimento deve ser efetuado para diferentes combinações de nutrientes, raças e condições climáticas. Em resumo, s ameaça a diversidade biológica decorre da liberação de um OGM devido as propriedades do transgene ou de sua transferência e expressão em outras espécies. A adição de um novo genótipo numa comunidade de plantas pode proporcionar vários efeitos indesejáveis: deslocamento ou eliminação de espécies não domesticadas, exposição de espécies a novos patógenos ou agentes tóxicos, poluição do pool gênico, erosão da diversidade genética e interrupção da reciclagem de nutrientes e energia. As alternativas às plantas transgênicas - As principais demandas dos mais de seis milhões de pequenos agricultores familiares no Brasil, os quais, historicamente, ainda produzem a maior parte dos alimentos que chega à mesa dos consumidores, não estão associadas à necessidade das plantas transgênicas, mas, sim, à necessidade de uma política agrícola e agrária que vise à sustentabilidade e à rentabilidade de suas atividades. Assim, a necessidade e a urgência das plantas transgênicas para a agricultura brasileira é uma falsa questão. É importante mencionar que as plantas transgênicas desenvolvidas até o presente momento não atendem às necessidades da pequena propriedade familiar, ainda preponderante no país. As evidências científicas da utilização de plantas transgênicas com características de resistências a herbicidas (por exemplo, RR) ou portadoras de biocidas (por exemplo, Bt) na produção de commodities agrícolas nas grandes propriedades revelam o aumento na freqüência de plantas invasoras e insetos resistentes aos transgenes, implicando a vida curta dessas tecnologias. Isto gerará demandas de novas tecnologias (variedades transgênicas e/ou agrotóxicos), o que aumentará o grau de dependência dos agricultores. A

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avaliação de risco deve necessariamente conter informações sobre outras alternativas que poderiam ser utilizadas, bem como um comparativo entre os riscos das diversas soluções. Assim, é preciso avaliar simultaneamente alternativas sustentáveis do ponto de vista agrícola e ambiental. Uma delas seria a agrodiversidade, termo empregado para definir a diversidade genética (intra-específica) e a diversidade de espécies (interespecífica) em cultivo nas propriedades agrícolas. Recentemente, pesquisadores chineses demonstraram que a heterogeneidade das culturas é uma alternativa possível à vulnerabilidade das monoculturas às doenças. Observou-se que variedades de arroz susceptíveis à doença bruzone, cultivadas em mistura com variedades resistentes a esta doença, apresentaram 89% de acréscimo na produtividade e uma redução de 94% de severidade dessa moléstia comparativamente à monocultura (Zhu et al., 2000). O sucesso dessa técnica, que é a simples mistura de diferentes variedades, foi tão significativo que, no segundo ano, não foi necessária a aplicação de fungicidas. Os resultados mostraram que a diversificação intra-específica das culturas proporciona um ambiente adequado para o controle de doenças que pode ser efetivo em grandes áreas, podendo contribuir para a sustentabilidade da produção agrícola. O país que detém a maior diversidade de espécies vegetais certamente deve ter um número de espécies comestíveis e agricultáveis capaz de proporcionar diferentes dietas balanceadas para as diferentes populações, respeitando-se sua cultura e suas necessidades. Vitamina A ou caroteno, por exemplo, são encontrados em dezenas de espécies comestíveis. O fato é que as plantas transgênicas estão sendo consideradas como a única maneira de aumentar a competitividade. Mas análises comparativas com outras matrizes de produção agrícola ainda não foram feitas.

A Pertinência dos Estudos de Impacto Ambiental

Embora a matéria seja complexa, há o entendimento de que estes estudos são necessários conforme determinam o artigo 225 da Constituição Federal, a Lei Ambiental e a Resolução 237/97 do Conama, o que não teria sido observado pela Comissão Técnica Nacional de Biossegurança - CTNBio - no caso do pedido de liberação da Soja RR em 1998. Utilizando as competências inclusas no art. 2º do Decreto 1.752, que diz no item XIV “exigir como documento adicional, se entender necessário, Estudo de Impacto Ambiental (EIA) e respectivo Relatório de Impacto no Meio Ambiente (RIMA) de projetos e aplicação que envolvam a liberação de OGM no meio ambiente, além das exigências específicas para o nível de risco aplicável”, a CNTBio decidiu pela sua não exigência. Com base no artigo 225 da Constituição Federal, a sentença judicial exarada pelo Juiz Antonio Prudente exige o Estudo de Impacto Ambiental -EIA - acompanhado do Relatório de Impacto no Meio Ambiente - RIMA - como condição indispensável para o plantio em escala comercial da Soja RR. Não bastasse isto, a Convenção sobre a Diversidade Biológica - CDB - estabeleceu no Art. 14 que trata da Avaliação de Impacto e Minimização de Impactos Negativos, que cada Parte Contratante, na medida do possível e conforme o caso, deve estabelecer procedimentos relacionados com a avaliação de impacto ambiental de projetos que possam ter sensíveis efeitos negativos na diversidade biológica, a fim de evitar ou minimizar tais efeitos e, conforme o caso, permitir a participação pública nesses procedimentos. Uma série de perguntas relacionadas com as conseqüências da introdução em plantas de genes originados de outros organismos, incluindo os patogênicos (como genes de vírus ou parte deles) ainda permanece sem resposta. Um dos desafios, então, é o estabelecimento de um conjunto mínimo de protocolos e termos de referência que deverão nortear os testes para a obtenção de informações adequadas durante a realização da avaliação de riscos. Assim, a avaliação de riscos deve fazer parte do estudo de impacto ambiental de uma planta transgênica, como parte imprescindível do pedido de licenciamento ambiental para atividades com OGMs.

10-PRINCIPIO DA PRECAUÇAO

É importante ter em mente que a engenharia genética opera com base na manipulação do DNA de organismos vivos. Esta intervenção ocorre em âmbito muito mais complexo do que

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qualquer outra tecnologia já anteriormente aplicada. Esta tecnologia é aplicada em um nível de funcionamento da natureza a respeito do qual nossa base de conhecimento científico é ainda insuficiente (Griffiths, 1999). Embora tenha havido avanços no conhecimento científico sobre os riscos associados ao cultivo de plantas transgênicas, o desenvolvimento da tecnologia de OGM ainda se baseia em processos do tipo “tentativa e erro”, portanto, imprecisos e pouco científicos. Assim, os cientistas têm poucas condições de prever o comportamento do novo gene no organismo hospedeiro, sendo inadequado caracterizar-se a transgenia como science-based technology. Em suma, a engenharia genética encontra-se em seu estágio básico de pesquisa e ciência, sendo ainda prematura a liberação comercial de plantas transgênicas (Guerra e Nodari, 1999). Desta forma, assume importância a adoção do Princípio da Precaução, estabelecido em acordos internacionais, como um princípio ético que afirma que a responsabilidade pelas futuras gerações e pelo meio ambiente deve ser combinada com as necessidades antropocêntricas do presente. Adotado no preâmbulo da CDB-, o Princípio da Precaução destaca “que quando exista ameaça de sensível redução ou perda de diversidade biológica, a falta de plena certeza científica não deve ser usada como razão para postergar medidas para evitar ou minimizar essa ameaça”. Assim, a adoção do Princípio da Precaução, se constitui em alternativa concreta a ser adotada diante de tantas incertezas científicas. Desta associação respeitosa e funcional do homem com a natureza, surgem as ações antecipatórias para proteger a saúde das pessoas e dos ecossistemas. Este princípio deve guiar as atividades humanas, mas incorpora outros atributos, como justiça, equidade, respeito, senso comum e prevenção (Raffensperger e Tikner, 1999). Também, este princípio admite que a adoção de cautela poderia evitar conseqüências danosas que, eventualmente, um OGM possa apresentar como resultado de sua liberação apressada ao meio ambiente. As avaliações, ainda iniciais, dos impactos ambientais potenciais, podem permitir uma decisão balanceada entre os possíveis benefícios e a extensão e irreversibilidade dos danos e riscos. É importante que a toxicidade ambiental relativa seja incorporada na análise das mudanças de padrões de uso e quantidade de pesticidas, e que os impactos das culturas tolerantes a herbicidas na conservação do solo sejam quantificados. Por outro lado, devem ser tomadas medidas que possam prevenir a transferência de genes para populações selvagens, bem como reduzir a evolução da resistência aos transgenes. Como concluem Wolfenbarger e Phifer (2000), tanto os riscos quanto os benefícios dos OGM podem variar temporal e espacialmente e devem ser analisados caso a caso. A elucidação destes riscos e benefícios dos OGM envolve a necessidade de estudos comparativos com outros sistemas e práticas agrícolas, tais como a agricultura orgânica. Nossa capacidade de predizer os impactos ecológicos de espécies introduzidas, incluindo OGM, é imprecisa e os dados empregados para avaliar impactos ecológicos potenciais apresentam limitações. Esta inabilidade de predizer acuradamente as conseqüências ecológicas, especialmente no longo prazo, aumentam a incerteza associada à avaliação de riscos, exigindo modificações nas estratégias de manejo destes riscos. O intrigante neste momento de crise no uso das biotecnologias ditas modernas é que muitos dos riscos potenciais previamente anunciados estão de fato ocorrendo. Em 1989, Tiedje e colegas, e Pimentel e colegas mencionaram que os principais riscos potenciais dos OGM ao meio ambiente seriam: criação de novas pragas e plantas daninhas e um aumento das pragas já existentes por meio da recombinação gênica entre a planta transgênica e outras espécies filogeneticamente relacionadas; a produção de substâncias que são ou poderiam ser tóxicas a organismos não-alvos; o efeito disruptivo em comunidades bióticas e o desperdício de valiosos recursos genéticos, seguido de contaminação de espécies nativas com características originadas de parentes distantes ou de espécies não relacionadas e efeitos adversos em processos dos ecossistemas e origem de substâncias secundárias tóxicas após a degradação incompleta de químicos perigosos. Trabalhos publicados confirmaram os dois primeiros. Quanto aos dois últimos há a necessidade de estudos. O Principio da Precauçao está estabelecido no artigo 1 da nova lei de biossegerurança. Portanto é obrigação de todos os brasileiros observarem.

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11.

ROTULAGEM

A rotulagem dos alimentos está prevista no Código de Defesa do Consumidor (Lei n° 8.078, de 11/09/90 – art. 6°, III e art. 8°). Trata-se então de uma norma, que garante ao cidadão ser informado sobre um produto, o que lhe permite o direito de escolha. Além disso, a rotulagem permite a rastreabilidade, pois em casos de efeitos na saúde humana, os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos. No Brasil, a fiscalização sobre a rotulagem está a cargo da Vigilância Sanitária. Contudo, a decisão e mesmo o conteúdo e outras características do rótulo, está no âmbito do Ministério da Justiça. O Decreto nº 4.680, de 24 de abril de 2003, regulamenta o direito à informação, assegurado pela Lei no 8.078, de 11 de setembro de 1990, quanto aos alimentos e ingredientes alimentares destinados ao consumo humano ou animal que contenham ou sejam produzidos a partir de organismos geneticamente modificados, sem prejuízo do cumprimento das demais normas aplicáveis. Na comercialização de alimentos e ingredientes alimentares destinados ao consumo humano ou animal que contenham ou sejam produzidos a partir de organismos geneticamente modificados, com presença acima do limite de um por cento do produto, o consumidor deverá ser informado da natureza transgênica desse produto. Tanto nos produtos embalados como nos vendidos a granel ou in natura , o rótulo da embalagem ou do recipiente em que estão contidos deverá constar, em destaque, no painel principal e em conjunto com o símbolo a ser definido mediante ato do Ministério da Justiça, uma das seguintes expressões, dependendo do caso: "(nome do produto) transgênico", "contém (nome do ingrediente ou ingredientes) transgênico(s)" ou "produto produzido a partir de (nome do produto) transgênico". O consumidor deverá ser informado sobre a espécie doadora do gene no local reservado para a identificação dos ingredientes. A informação também deverá constar do documento fiscal, de modo que essa formação acompanhe o produto ou ingrediente em todas as etapas da cadeia produtiva. A rotulagem consitui-se em:

NECESSIDADE DE SABER - A rotulagem plena é um requisito fundamental e imprescindível para se estabelecer uma efetiva vigilância dos alimentos contendo OGMs e seus derivados. DIREITO DE SABER – Direito previsto no Código de Defesa do Consumidor. O tipo de gene inserido, os aspectos religiosos e os valores culturais e pessoais devem ser considerados. CONVENIÊNCIA DE SABER – É um requisito que considera o quantitativo de ADN e de proteína recombinante no produto final (Ex: acima de 1%).

Em termos de saúde pública, tudo tem que ser rotulado, não importa quanto tem dentro da embalagem. A nível internacional, existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi encarregado de preparar uma versão preliminar a ser discutida na reunião do Codex Alimentarius. Tomando-se em consideração o que houve na Conferência de Partes da CDB, pode ser que ainda no ano de 2000, a reunião do Codex também aprove as normas internacionais de rotulagem dos alimentos transgênicos ou que contenham ingredientes de OGMs.

  • 12. O CASO DA SOJA TRANSGÊNICA RESISTENTE AO HERBICIDA ROUNDUP

O pedido de desregulamentação de soja transgênica que a Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio) analisou, merece uma reflexão profunda por parte da sociedade brasileira. Com a liberação para plantios comerciais da Soja RR (Roundup Ready), todas as variedades contendo o gene cp4 epsps, que condiciona resistência ao herbicida glifosate, estarão livres para registro, uso, ensaios, plantios, transporte, armazenamento, comercialização, consumo, importação, liberação e descarte. O glifosate, princípio ativo do herbicida Roundup, controla plantas daninhas através de seu efeito inibitório sobre a enzima 5’-enolpiruvato-chiquimato-3-fostato-sintase (EPSPS). Esta enzima catalisa uma reação na cadeia de biossíntese dos amino ácidos aromáticos (como

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fenilalanina, triptofano e tirosina) em plantas e microrganismos. Esta cadeia está ausente em animais, peixes e aves. Existem várias questões no processo de liberação sem informações ou com informações incompletas ou não inequívocas Assim, não é informado no referido processo: 1) o nome completo da espécie doadora do gene cp4 epsps, 2) a sequência de nucleotídeos da construção quimérica presente nas linhagens transgênicas, 3) os possíveis efeitos pleiotrópicos da construção quimérica inserida, 4) a toxicidade para a espécie humana, 5) o efeito da aplicação do glifosate na planta, 6) o cultivo do cultivo desta soja transgênica mais glifosato na diversidade biológica do ambiente e 7) os riscos de transferência horizontal de genes. Tais informações são exigidas pelas Instruções Normativas da própria CTNBio. Também não é informado no processo sobre o efeito do transgene no processo de fixação simbiótica do nitrogênio intermediado pelo Rhizobium. Tampouco não há informação sobre o impacto do cultivo destas variedades transgênicas na microbiota dos solos brasileiros. Outras questões técnicas foram formuladas a CTNBio por várias organizações civis brasileiras aguardam respostas. Mas o mais grave relaciona-se com a qualidade dos poucos dados apresentados. Assim, os poucos testes são de curta duração e insuficientes. Por exemplo: não há uma análise profunda sobre alergenicidade ou reações imunológicas. Além disso, os resultados apresentados a CTNBio são oriundos da Soja RR sem a aplicação do Roundup. O que ocorre com o Rloundup ou seu efeito na alimentação humana via grãos com resíduos do referido herbicida ainda são desconhecidos. Além disso, trabalhos científicos publicados indicam que os produtos comerciais a base de glifosato se acumulam no solo, são prejudiciais a peixes e a ratos. Tais trabalhos demonstraram ainda que o referido herbicida é prejudicial a minhocas e insetos, além de causar problemas reprodutivos em ratos. Na verdade, o processo não informa sobre a degradação do herbicida nos diferentes solos e regiões brasileiras onde esta espécie é cultivada. Um fato grave que é omitido no processo trata-se das reações tóxicas que o herbicida poderia causar na espécie humana, sendo que na Califórnia, é a terceira causa mais frequente de reações tóxicas. A questão é saber se estas novas variedades intensificam ou não a alergia, uma vez que três proteínas associadas a reação alérgica já foram identificadas em outros genótipos de soja. Contudo, o efeito mais drástico na saúde humana é a forte associação entre a exposição prolongada a este agrotóxico e um aumento de risco de um câncer do tipo linfoma non-Hodgkin (Hardell e Eriksson, 1999). Roundup também inibe a síntese de esteróides através da interrupção da expressão da proteína StAR (Walsh et al., 2000), causando distúrbios reprodutivos em mamíferos. O fato de que estas plantas transgênicas foram aprovadas nos Estados Unidos não significa que elas não impõem riscos. Ao contrário, pois naquele país é adotado o princípio da “equivalência substancial”. Análises em órgãos internos, características reprodutivas ou testes com a espécie humana não foram realizados. Portanto, os dados são insuficientes do ponto de vista científico, para subsidiar a análise da segurança ambiental e alimentar. Em havendo poucos dados, não há o que afirmar em relação aos riscos. O que de fato ocorreu foi que a CTNBio tomou a ausência de evidências como a evidência da ausência de riscos. E isto tem sido considerado um equívoco muito grande.

12. IMPLICAÇÕES SÓCIO-ECONÔMICAS

O desenvolvimento de um OGM tem um custo elevado o que significa dizer que um pequeno número de empresas, que dispõe de capital e tecnologia, está conseguindo produzir plantas ou animais transgênicos, para serem cultivados ou criados em escala mundial. No caso de plantas nos Estados Unidos, as variedades transgênicas fazem parte de um pacote, pois se uma variedade de soja é resistente a um herbicida, o agricultor é obrigado, por força de contrato, a usar o herbicida produzido pela mesma empresa. Desta forma, a dominação tecnológica levará aos países periféricos a uma dependência na produção de alimentos, o que de fato é uma questão de segurança nacional. O alto retorno econômico, devido ao efeito de escala, proporcionará um novo salto destas empresas, com as quais dificilmente as empresas nacionais ou mesmo instituições

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poderão competir. Não se descarta a hipótese de que a maioria dos programas de

melhoramento no país ou serão absorvidos pelas grandes empresas multinacionais ou

fecharão.

Do ponto de vista comercial, já existem fatos concretos relacionados aos transgênicos.

Assim, grandes cadeias de supermercados na Europa (Ex: ASDA na Inglaterra e Carrefour na

França) estão banindo de suas prateleiras produtos transgênicos ou produtos feitos com

materiais transgênicos. Recentemente, a Austrália, que ainda não cultiva canola transgênica,

teve uma encomenda especial a maior exatamente por não ser transgênica. Algumas

cooperativas brasileiras estão tentando estabelecer comércio com países Europeus e Japão

para garantir o envio de soja não transgênica, já que estes países assim a preferem. Embora

já existam indícios fortes de algum prêmio a ser pago a maior por organismos não

transgênicos (variável de 5 a 20%, para a safra de soja de 2000), ainda é cedo para prever o

que acontecerá no futuro.

Das liberações para cultivo comercial, alguns produtos transgênicos estão com

problemas de comercialização. O tomate FLAVR SAVR, o primeiro transgênico a ser cultivado

em larga escala, foi retirado de mercado no hemisfério norte em 1999, face ao sabor inferior

(gosto de verde, mesmo quando maduro) ao não transgênico, a problemas de processamento

e desinteresse pelo consumidor.

A safra de milho Bt americana está sem comercialização garantida, uma vez que vários

compradores de porte significativo (como cervejarias japonesas, empresas processadoras de

alimentos, etc) não querem utilizar os transgênicos em seus produtos, o que está causando a

redução no preço do milho Bt transg6enico. A contaminação de milhos Bt ou não transgênicos

com o Starlink também gerou cancelamentos de compra de milho americano, principalmente

por países asiáticos. Segundo estimativas da associação de produtores americanos de milho,

a safra de milho Bt transgênico do ano 2000 foi inferior a de 1999.

A soja transgênica também enfrenta resistência por parte dos consumidores. Este fato

levou a empresas compradoras de grãos a exigirem a segregação das sementes e um prêmio

a soja não transgênica.

A liberaçao da soja RR está prejudicando quem nda ter a ver com isso: os produtores

orgânicos. Abaixo está o relato de um entre centenas de casos já comprovados.

Dedicado ao cultivo de produtos orgânicos, sem agrotóxicos e com sementes naturais,

por mais de 30 anos, o agricultor Max Enro Dockhorn, de 73 anos, desistiu, no ano

passado, da lavoura de soja que mantinha em uma área de 70 ha no município gaúcho

de Três Passos. "Na safra de 2005 para 2006 perdi metade da minha produção

orgânica. No momento de vender, testes identificaram proteína transgênica na minha

soja", conta Dockhorn, desapontado com os meses de dedicação à lavoura. Além da

perda de valor, que superava os 10 reais por saca, ele teve de pagar royalties por ter

sido acusado de usar sementes transgênicas. “

...

bastou

que, ao redor de minha

propriedade, outros produtores usassem sementes transgênicas para haver a

contaminação". Os riscos da omissão, Revista Carta Capital, p.22-29, 18/07/2007

11-PERCEPÇÃO PÚBLICA

Embora está ocorrendo um aumento da discussão na sociedade, a questão das

plantas e animais transgênicos é quase que desconhecido da maioria da população brasileira.

Também para a maioria das pessoas que têm um diploma de ensino superior, estes tópicos

são indecifráveis. É preciso então desenvolver ações junto a população no sentido de

desconstruir esta novidade. Para tal, a mídia bem como os cientistas têm um papel

preponderante, se engajados num processo educativo, sem paixões ou crenças. Há a

necessidade do envolvimento de pessoas que têm conhecimento sobre o assunto de

participarem sem preconceitos ou interesses além daquele de desconstruir este assunto

complexo.

Inúmeras ONGs estão envolvidas na discussão desta questão. Dias globais de ação

contra a Biotecnologia foram organizados. Contudo, nem tudo o que é dito ou escrito tem base

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científica ou técnica. Um posicionamento pessoal com base em crenças pode levar o processo