Você está na página 1de 98

| 399

Captulo 4
Micologia
Aurea Maria Lage de Moraes Rodrigo de Almeida Paes Vernica Leite de Holanda 1. Introduo micologia

Os fungos so organismos que convivem conosco todos os dias. Estes organismos so encontrados praticamente em qualquer local do ambiente que nos cerca, inclusive no ar, onde estruturas reprodutivas, na forma de esporos ou condios, esto prontas para, ao cair em um substrato adequado, desenvolver novas estruturas vegetativas e reprodutivas. Estes organismos, muitas vezes, nos so teis, decompondo resduos orgnicos, causando a decomposio ou a degradao de alimentos, ou mesmo atacando seres vivos, parasitando-os e, eventualmente, causando a sua morte. Os fungos so importantes, tanto do ponto de vista ecolgico quanto econmico. Ecologicamente, so considerados os lixeiros do mundo, pois degradam todo tipo de restos orgnicos, independente da origem, transformando-os em elementos assimilveis pelas plantas. J, economicamente, tm implicaes em vrias reas: Medicina humana e veterinria, Farmcia, Nutrio, Fitopatologia, Agricultura, Biotecnologia, entre outras.

400 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Os fungos tiveram seu grupo reconhecido como um reino a partir da descrio de cinco reinos por Whittaker em 1969. Esses organismos foram alocados em reinos com base na morfologia e no modo de nutrio dos seres vivos, sendo criado, ento, o reino Fungi. Em 1990, Carl Woese props o agrupamento dos cinco reinos estabelecidos por Whittaker em trs domnios: Archaea, Eubacteria e Eukaria, onde o reino Fungi faz parte do domnio Eukaria, que rene todos os eucariontes. A Micologia , portanto, a rea da Biologia destinada ao estudo dos fungos.
1.1. Elementos fundamentais dos fungos e Citologia

Os fungos so organismos eucariontes, unicelulares (leveduriformes) ou multicelulares (filamentosos), haploides (homo ou heterocariticos), com parede celular contendo quitina e a-glucano. No apresentam plastos ou pigmentos fotossintticos. Todos os fungos conhecidos, com poucas excees, tm origem nos esporos (reproduo sexuada) ou condios (reproduo assexuada), corpsculos que podem ser comparados s sementes das plantas superiores, embora no sejam morfologicamente semelhantes a estas. Os esporos ou condios, para germinarem, necessitam de calor e umidade e o resultado desta germinao a formao de um ou mais filamentos finos, conhecidos como tubos germinativos. Estes tubos se ramificam em todos os sentidos formando uma massa filamentosa, chamada miclio, que constitui o sistema vegetativo, responsvel pelo desenvolvimento fngico e pela absoro dos alimentos. Os filamentos simples ou ramificados que formam o miclio so denominados hifas. Na maioria dos casos, o sistema vegetativo encontra-se no interior dos tecidos parasitados, no solo ou na matria orgnica em decomposio.

Micologia | 401

Com a formao dos esporos ou condios necessrio que estes tenham acesso livre ao ar, para assegurar sua disseminao. Realiza-se, ento, uma diferenciao das hifas vegetativas, geralmente levantadas verticalmente sobre o plano do miclio, conhecido como esporforo ou conidiforo, e sobre estes se originam os esporos ou condios. As hifas, por sua vez, podem ser apocticas (com septo) ou cenocticas (sem septo). O ciclo de vida dos fungos compreende duas fases. Uma somtica, caracterizada por atividades alimentares, e outra reprodutiva, onde os fungos podem realizar reproduo sexuada ou assexuada. Em ambos os casos, um grande nmero de estruturas formado, dependendo da espcie. As estruturas assexuadas, como tambm as sexuadas, podem ser formadas isoladamente ou em grupos, neste caso, formando corpos de frutificao. Assim, condios podem ser formados em conidiforos isolados ou agrupados, constituindo ento os conidiomas. Os esporos podem ser formados em ascomas (onde so formados os ascos) ou basidiomas (onde so formados os basdios). De acordo com tipo de reproduo realizada, os fungos podem ser divididos em trs grupos:
Holomorfo: aquele que no ciclo de vida realiza ambas as reprodu-

es, sexuada e assexuada.


Anamorfo: aquele que no ciclo de vida realiza apenas a reprodu-

o assexuada.
Teleomorfo: aquele que no ciclo de vida realiza apenas a reprodu-

o sexuada.

402 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Esquema do ciclo de vida geral do fungo.

1.2. Nutrio, metabolismo e habitat

Os fungos so considerados seres heterotrficos, necessitando de materiais orgnicos j formados, que servem como fonte de energia e como constituintes celulares. Por causa da rigidez da parede celular, sua nutrio por absoro de nutrientes solveis simples. Realizam respirao celular ou fermentao para obteno de energia, e sua reserva energtica sob a forma de glicognio. Devido ausncia de clorofila nos fungos, torna-se necessrio que o substrato fornea as substncias j elaboradas indispensveis alimentao, obrigando os fungos a viverem em estado de saprofitismo, parasitismo, simbiose (liquens, por exemplo) ou mutualismo. Eles podem ser subdivididos em:
Saprfitas obrigatrios Fungos que vivem exclusivamente em matria

orgnica morta, no podendo parasitar organismos vivos.


Parasitas facultativos ou saprfitas facultativos Fungos capazes de

causar doenas ou de viver em restos orgnicos, de acordo com as circunstncias.

Micologia | 403

Parasitas obrigatrios Fungos que vivem exclusivamente atacando

organismos vivos. Os fungos so considerados seres cosmopolitas, pois esto presentes em qualquer parte do planeta. Sendo amplamente distribudos pela natureza, so encontrados na gua, no ar atmosfrico, no solo, sobre os animais e vegetais vivos, na matria orgnica em decomposio, nos produtos alimentcios e industriais. A maioria dos fungos tm como necessidades nutricionais, os elementos C, O, H, N, P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Mo, Fe e Zn. Muitas espcies no necessitam de luz para seu desenvolvimento, j outras necessitam para formar suas estruturas de reproduo, podendo ser consideradas fototrficas (que buscam a luz). A temperatura ideal para o crescimento dos fungos fica entre 0 a 350C, mas o timo para a maioria fica entre 20 a 300C e a umidade ideal fica em torno da saturao.
1.3. Posio sistemtica dos fungos

O reino Fungi dividido em sete filos, (Chytridiomycota, Neocallimastigomycota, Blastocladiomycota, Microspordia, Glomeromycota, Ascomycota e Basidiomycota), e um grupo, os fungos anamrficos. Este grupo no possui valor taxonmico, sendo seus membros relacionados aos filos Ascomycota e Basidiomycota. A taxonomia dos fungos tradicionalmente baseada em caracteres citolgicos e morfolgicos. Mas, atualmente, com o desenvolvimento de tcnicas bioqumicas e moleculares, novos caracteres foram adicionados como auxlio na identificao das espcies fngicas. Tais como as tcnicas baseadas em PCR (RAPD, RFLP, AFLP), sequenciamento de DNA, isoenzimas e cromatografia (TLC, HPLC, CG, espectometria de massa).

404 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

1.3.1. Filo Chytridiomycota

Os representantes do filo Chytridiomycota so considerados cosmopolitas e saprfitos aquticos. A maioria de gua doce poucos so marinhos. A principal caracterstica do grupo a formao de zosporo flagelado, estruturas de propagao no ambiente aqutico, onde o flagelo ajuda na sua movimentao. Ex: Chytriomyces sp.
1.3.2. Filo Neocallimastigomycota

So encontrados no sistema digestivo dos grandes mamferos herbvoros e possivelmente em outros ambientes anaerbios terrestres e aquticos. Tratamse de zosporos no flagelados. Ex: Neocallimastix sp.
1.3.3. Filo Blastocladiomycota

Seus representantes apresentam reproduo assexuada com zosporo de um nico flagelo, e reproduo sexuada atravs da fuso de planogametas. So habitantes restritos de gua e solo e parasitos de insetos. Ex: Allomyces sp. e Coelomomyces sp.
1.3.4. Filo Microspordia

Organismos eucariontes sem mitocndria e flagelo desconhecido. So parasitas obrigatrios de animais, e comumente atacam peixes e insetos. Estes organismos foram includos no reino Fungi aps estudos filogenticos.
1.3.5. Filo Glomeromycota

O filo Glomeromycota representado por fungos de micorrizas arbusculares (FMA). Participam de uma associao mutualstica com as razes

Micologia | 405

de algumas plantas, na qual a planta, atravs da fotossntese, fornece energia e carbono para a sobrevivncia e multiplicao do fungo, enquanto este absorve nutrientes, minerais e gua do solo transferindo-os para as razes da planta. Tambm so considerados cosmopolitas. Foi includo neste grupo os representantes do antigo filo Zygomycota, que tem como principais caractersticas, hifas cenocticas e a formao de zigospornangio, por reproduo sexuada; e esporngio, por reproduo assexuada. Os esporngios so estruturas formadoras de propgulos para disperso. Ex: Mucor sp. e Glomus sp.
1.3.6. Filo Ascomycota

O filo Ascomycota compreende o maior grupo do reino Fungi, constitudo de aproximadamente 75% de todos os fungos descritos. Seus representantes so considerados cosmopolitas e so encontrados na natureza como saprfitos, parasitas (especialmente de plantas), ou em associao mutualstica (com algas unicelulares) formando os liquens. A principal caracterstica do grupo a presena de asco contendo ascosporos, geralmente oito, que representam a estrutura de propagao do grupo. So produzidos por reproduo sexuada. A reproduo assexuada tambm pode ser encontrada. O asco formado em uma estrutura denominada ascocarpo (corpo de frutificao), que pode ser encontrado nas seguintes formas: apotcio (ascocarpo em forma de taa), cleistotcio (ascocarpo totalmente fechado, que se rompe com a maturidade), e peritcio (ascocarpo em forma de balo, com um poro na sua ponta). A ausncia da formao de ascocarpo tambm observada, sendo este considerado como ascos nus. Ex: Eurotium sp. e Emericella sp.

406 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

1.3.7. Filo Basidiomycota

Os representantes do filo Basidiomycota so considerados cosmopolitas e saprfitos. So comumente denominados cogumelos. Tm como principal caracterstica a presena de basdio contendo basidiosporos, geralmente quatro, produzidos por reproduo sexuada. A reproduo assexuada tambm pode ser encontrada. O basdio formado a partir de um basidiocarpo, sendo este constitudo, basicamente, por pleo (o chapu do cogumelo), lamela (estrutura pregueada abaixo do pleo, onde se encontram os basidios) e estirpe (estrutura que sustenta o pleo). Ex: Agaricus sp. e Rhodotorula sp.
1.3.8. Fungos Anamrficos

Os Fungos Anamrficos formam um grupo de fungos onde a reproduo assexuada predominante, com a formao de condios como estrutura de propagao. A reproduo sexuada ausente, desconhecida ou teve a capacidade perdida. Esse grupo est relacionado a gneros do filo Ascomycota e Basidiomycota por comparao de sequncias gnicas. So considerados como cosmopolitas, saprfitos, e parasitas de animais e plantas. Os condios so formados por clulas conidiognicas, presentes nos conidiforos, que so prolongamentos de hifas modificadas, com funo reprodutiva. Os condios podem ter diferentes formas, tamanhos e cores, podem possuir ou no a superfcie texturizada, ornamento ou septo. Ex: Aspergillus sp e Penicillium sp.
Por 2. Por que estudamos os fungos

Os fungos so conhecidos da humanidade h vrios sculos, tanto por seus benefcios quanto pelos problemas que causam. Muitas doenas huma-

Micologia | 407

nas, de animais e plantas (micoses) so causadas por fungos. Em humanos e animais os fungos podem causar alergias respiratrias e cutneas leves ou intensas, dependendo da suscetibilidade e pr-disposio do indivduo. Podem causar infeces em mucosas e outros tecidos subcutneos, assim como infeces crnicas e letais envolvendo rgos inteiros. Cada tecido ou rgo do corpo humano pode ser afetado, com exceo dos dentes. Ns dependemos da agricultura para nos fornecer alimentos, principalmente os gros de cereais (milho, trigo, aveia, amendoim, etc.) que alimentam tanto os humanos quanto os animais. Doenas fngicas em cereais causam perdas significantes na agricultura, tanto para o consumo interno quanto para a exportao de gros atividade to importante em nossa economia. Alm disso, o ataque dos fungos no se restringe ao campo de produo, eles atacam tambm os gros estocados causando sua destruio ou produzindo toxinas carcinognicas potentes (micotoxinas) dentro destes gros. Os fungos tm sido utilizados para os mais diferentes propsitos, desde a antiguidade. O uso mais antigo deles tem sido como alimento, propriamente dito, tendo sido utilizado mais tarde tambm na indstria alimentcia para a produo de pes, queijos, cervejas e vinhos. O sabor e a textura de muitos alimentos, como os queijos e o molho de soja, so dados pelos fungos usados em sua fabricao. Posteriormente, foi descoberto o poder dos fungos na produo de metablitos que poderiam ser teis, como a Penicilina. Estudos em Biotecnologia e Engenharia gentica propiciaram a produo destes metablitos em larga escala. Hoje produtos fngicos usados comercialmente incluem cidos orgnicos, etanol, alguns antibiticos (alm da Penicilina), pigmentos, vitaminas, enzimas e pesticidas biolgicos. Alm de se tornarem valiosos objetos de pesquisa, em particular, como modelos eucariontes, uma vez que so facilmente manipulados em laboratrio, fornecendo informaes importantes sobre a bioqumica, a gentica e a biologia molecular dos eucariontes.

408 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

3. Micologia Mdica

A Micologia mdica tem como principal objetivo estabelecer o diagnstico micolgico das infeces por fungos, que por sua vez se baseia em correta coleta e processamento de espcimes clnicos. A observao das normas de preservao, e transporte adequados dos materiais clnicos at os locais de processamento, como laboratrio de Microbiologia/Micologia tambm tem enorme importncia para a obteno de resultados acurados.
3.1. Classificao das micoses

Didaticamente, podemos dividir as micoses em grupos, como demonstrado a seguir:


3.1.1. Micoses superficiais e cutneas

As MICOSES SUPERFICIAIS so infeces causadas por fungos que invadem as camadas mais superficiais da capa crnea da pele ou a haste livre dos pelos. As leses se manifestam como mancha pigmentar na pele, ndulo ou pelos. A forma invasiva do fungo uma hifa, caracterstica de cada micose. A piedra negra uma micose causada pela Piedraia hortae. Esta micose consiste em ndulos duros, de cor escura, localizados na haste dos pelos e bastante aderentes a eles. Em parasitismo, o fungo se apresenta como um emaranhado de hifas intimamente unidas. Essas hifas so de cor castanha e tm parede e septos espessos. Os ndulos constituem, na verdade, um ascostroma, pois em meio ao enovelado de hifas formam-se lculos ovalados contendo oito ascsporos. J a piedra branca causada por leveduras do gnero Trichosporon. Nesta infeco o fungo cresce sobre a haste dos pelos, formando ndulos de hifas hialinas septadas e ramificadas, facilmente destacveis dos

Micologia | 409

pelos, que podem se desarticular, resultando em artrocondios retangulares que se tornam esferides ou polidricos. Leveduras do gnero Malassezia so os agentes da pitirase versicolor. Esses fungos vivem normalmente sobre a pele do homem, na forma de levedura. Usualmente podem filamentar e invadir as clulas queratinizadas das camadas superficiais da pele, determinando a micose. A doena se manifesta como manchas descamativas distribudas pelo trax, abdome e membros superiores. Ao contrrio do que muitos pensam, a micose no adquirida na praia; o que ocorre que quando o doente se bronzeia, os locais da pele onde o fungo est em parasitismo no se queimam, permitindo que as leses possam ser visualizadas com maior facilidade. O diagnstico definitivo se d somente pelo exame direto atravs da observao de hifas curtas e curvas e elementos redondos. A Malassezia no cresce nos meios de cultura habituais usados na rotina porque necessita de suplemento lipdico para seu crescimento. As MICOSES CUTNEAS se caracterizam por serem causadas por fungos que invadem toda a espessura da capa crnea da pele ou a parte queratinizada intrafolicular dos pelos ou a lmina ungueal. Na pele, as leses se manifestam como mancha inflamatria, nos pelos como leso de tonsura e na unha por destruio da lmina ungueal. O contgio feito atravs de animais, homens ou de solo infectado. As dermatofitoses constituem manifestaes clnicas muito variadas causadas por um grupo de fungos, denominados dermatfitos, que produzem leses na pele, pelos ou unhas. Os fungos dermatfitos degradam queratina e pertencem aos gneros Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton. H reconhecidamente 27 espcies patognicas para o homem, dentre as quais 15 ocorrem no Brasil. Destas, as principais so: Trichophyton rubrum,

410 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Epidermophyton floccosum, T. mentagrophytes, Microsporum canis, M. gypseum e T. tonsurans.


As dermatofitoses podem ser classificadas nas seguintes modalidades clnicas: dermatofitose ou tinha do couro cabeludo, da pele glabra, da barba e da face, dos ps, das unhas e inguinal, dependendo da localizao da leso no paciente. J nos cabelos, pela relao com os fungos, podem ser diferenciados dois tipos de parasitismo: endotrix, onde os artrocondios se localizam somente no interior do pelo, esse causado, por exemplo, por T. tonsurans; e ectotrix, onde os artrocondios se dispem no interior e ao redor do fio de cabelo. Podemos citar M. canis e T. mentagrophytes como agentes deste tipo de parasitismo pilar. Em cultivo, os dermatfitos, em sua maioria, produzem dois tipos de condios: macrocondios e microcondios que, juntamente com a caracterstica macroscpica da colnia, vo permitir a identificao das diferentes espcies dos dermatfitos. Os macrocondios so caractersticos dos seguintes gneros:
Microsporum So fusiformes, grandes, multisseptados de pare-

des rugosas.
Epidermophyton So clavados, robustos bi ou trisseptados com

paredes lisas e espessas.


Trichophyton Quando existentes so delicados, clavados,

multisseptados de paredes finas e lisas. O quadro a seguir mostra as caractersticas macro e micromorfolgicas que so observadas nas colnias dos principais fungos responsveis por dermatofitoses.

Micologia | 411

Fungo dermatfito
Trichophyton rubrum

Macromorfologia
Colnia branca, granular ou cotonosa, com pigmento vermelho no verso

Micromorfologia
Microcondios em gota de lgrima dispostos ao longo da hifa e macrocondios, que quando existem, so comuns do gnero Macrocondios do gnero, microcondios redondos numerosos Microcondios numerosos e polimrficos, usualmente clavados ou alongados Macrocondios fusiformes, multisseptados de paredes rugosas e mais espessas que a dos septos, poucos microcondios Numerosos macrocondios fusiformes, multissepados, de paredes rugosas e finais poucos microcondios Macrocondios em grupos de trs ou mais na extremidade de conidiforos, microcondios inexistentes

T. mentagrophytes

Colnia branca, granular ou cotonosa, com pigmento que vai do amarelo ao marron no verso Colnia acastanhada com pigmento vermelhoferruginoso no verso Colnia branca, penugenta com pigmento amarelo alaranjado no verso

T. tonsurans

Microsporum canis

M. gypseum

Colnia pulverulenta de cor camura, com pigmento pardo no verso Colnia membranosa de cor verde-limo

Epidermophyton flocosum

A candidase micose causada por leveduras do gnero Candida, em especial pela espcie C. albicans. Elas so hspedes normais do trato gastrintestinal do homem e fazem parte da microbiota de determinadas regies do tegumento cutneo. Porm a Candida pode invadir a camada crnea da pele ou a lmina ungueal de hospedeiros normais. As leses tm localizao

412 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

peculiar: nas unhas das mos e nas reas intertriginosas da pele (regio inguinal, espaos interdigitais das mos, regio submamria e axilar). Tambm possvel ocorrerem leses nas unhas dos ps. H ainda outras micoses de pele e de unha que no so causadas nem por fungos dermatfitos nem por fungos do gnero Candida. Dentre esses fungos destacam-se: Fusarium sp., Scytalidium dimidiatum, e S. hyalinum que podem causar leses principalmente em unhas e em espaos interdigitais dos ps. Em cultivo, S. dimidiatum se apresenta como colnia cotonosa, branca no incio tornando-se cinza a negra em dez dias. Microscopicamente, se compe de hifas demceas e hialinas, com artrocondios septados e no septados. S. hyalinum considerado um mutante de S. dimidiatum incapaz de sintetizar melanina e, com isso, as hifas e os condios so sempre hialinos. As culturas de Fusarium sp. podem ser as mais variadas possveis, quanto macroscopia. Esta depender da espcie que causa a leso. Porm, microscopicamente, o que caracteriza Fusarium sp. a presena de macrocondios em forma de lua, bi ou trisseptados.
3.1.2 . Micoses subcutneas

As MICOSES SUBCUTNEAS se caracterizam por resultar da inoculao de um fungo patognico por ocasio de um traumatismo, manifestando-se como tumefao ou leso supurada da pele ou do tecido subcutneo, produto da disseminao do fungo por contiguidade ou por via linftica, porm limitada ao territrio aqum do linfonodo regional. A esporotricose tem como agente Sporothrix schenckii. Esse um fungo dimrfico, logo, muda entre as formas miceliana e leveduriforme, de acordo com a temperatura e as condies do ambiente onde se encontra. Assim sendo, S. schenckii, em parasitismo nos tecidos apresenta-se como

Micologia | 413

elementos leveduriformes bem pequenos, com brotamento geralmente em forma de charuto. Na natureza, em associao a vegetais e madeira, vive na forma filamentosa. A transmisso clssica da esporotricose se d por traumatismo causado por vegetais onde o fungo se encontra ou pela forma zooflica, ou seja, atravs de leses provocadas por animais infectados por S. schenckii, em especial gatos, como vm ocorrendo no estado do Rio de Janeiro, que uma rea endmica de esporotricose. A leso inicial da esporotricose uma ppula ou ndulo que surge no ponto da inoculao, usualmente localizado nos membros. Desse local o fungo pode propagar-se por contiguidade, determinando uma leso circunscrita ou por via linftica, ocasionando o aparecimento de ndulos em nmero varivel sobre o trajeto de um linftico superficial. O diagnstico definitivo se d com o isolamento em cultivo do fungo em amostras de pus ou bipsia das leses. Testes de deteco de IgG e IgM em amostras de soro podem auxiliar no diagnstico e no acompanhamento teraputico desta infeco. A cromoblastomicose uma infeco que se caracteriza pelo aspecto parasitrio de seus agentes: o corpo muriforme. Esses so elementos globosos, com parede acastanhada espessa e septados em planos distintos. Podem ser visualizados tambm elementos no septados e outros com apenas um septo, porm o que caracteriza o corpo muriforme a presena de septos em planos diferentes. As principais espcies que podem causar cromoblastomicose no ser humano so Fonsecaea pedrosoi, F. compacta, Cladophialophora carrionii, Phialophora verrucosa, e Rhinocladiella aquaspersa. No Brasil, normalmente, os casos dessa micose so causados por F. pedrosoi, aps traumatismo com matria orgnica vegetal. Micetoma o nome coletivo de micoses produzidas por algumas espcies de fungos ou de actinomicetos aerbios, os quais, nos tecidos, se organizam em um agregado de hifas ou filamentos bacterianos, denominados gros. Os agentes de micetoma possuem habitat na natureza associado a vegetais,

414 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

nutrindo-se de outros vegetais em decomposio ou como fitopatgenos. O micetoma eumictico se distingue do actinomictico por ser: causado por um fungo, enquanto o actinomictico causado por bactrias filamentosas. Os gros, de tamanho e forma variados, podem ter colorao branco-amarelado, vermelha ou negra. O que caracteriza a cor de um gro somente o fungo ou actinomiceto agente da doena. Por isso, a cor do gro obtido das leses do paciente j fornece um indicativo de qual seja o agente do micetoma. O quadro a seguir o relata alguns desses agentes, com o respectivo tipo e colorao dos gros:
Fungos causadores de micetoma
Gro eumictico negro Madurella mycetomatis Gro eumictico branco Acremonium sp.

M. grisea Pyrenochaeta romeroi Exophiala jeanselmei

Pseudallescheria boydii (Scedosporium apiospermum) Neotestudina rosatii Aspergillus nidulans (Emerciella nidulans)

Actinomicetos causadores de micetoma


Gro actinomictico vermelho Gro actinomictico branco

Actinomadura pelletieri

Actinomadura madurae Nocardia brasiliensis N. asteroides, N. caviae Streptomyces somaliensis

H outras micoses subcutneas de interesse, como a lobomicose e a entomoftoramicose. No entanto, a esporotricose, cromoblastomicose e micetomas so as mais comuns no Brasil.

Micologia | 415

3.1.3. Micoses sistmicas e oportunsticas

As MICOSES SISTMICAS se caracterizam por serem adquiridas por inalao de propgulos fngicos, sendo, consequentemente a leso primria pulmonar, com tendncia regresso espontnea. O fungo pode se disseminar pelo corpo atravs do sangue, originando leses extrapulmonares nos indivduos. Os agentes de micoses sistmicas raramente so implantados traumaticamente; quando isso ocorre, determinam uma leso granulomatosa circunscrita, com ou sem linfangite regional, que regride espontaneamente. Ao invadir os tecidos, os fungos desencadeiam resposta imunolgica no hospedeiro, que pode ser evidenciada por reao intradrmica, na qual se verifica a resposta celular dada pelo hospedeiro, por reaes de hipersensibilidade tardia e por provas de deteco de anticorpos em amostras de soro (imunodifuso dupla e fixao do complemento), onde avaliada a resposta humoral. Uma reao intradrmica positiva evidencia que o indivduo j foi previamente sensibilizado pelo fungo e as provas sorolgicas indicam que h anticorpos contra o fungo. Porm, as provas sorolgicas podem fornecer resultados falso-positivo e falso-negativo, visto que podem ocorrer reaes cruzadas com outros anticorpos na prova aplicada. As provas sorolgicas auxiliam no diagnstico de micoses sistmicas, mas o que realmente diagnostica a doena o isolamento do fungo em cultivo ou sua observao no exame micolgico direto dos materiais adequados para o exame, tendo as provas imunolgicas valor diagnstico presuntivo. As provas imunolgicas so teis para avaliaes epidemiolgicas, para avaliao prognstica e para a triagem de pacientes. As reaes intradrmicas apresentam valor diagnstico baixo, uma vez que no discriminam entre infeces passadas ou recentes. Porm so de grande valor nos estudos epidemiolgicos.

416 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

As micoses sistmicas so a coccidioidomicose, a blastomicose, a histoplasmose, e a paracoccidioidomicose. As duas primeiras no so comuns no Brasil, embora sejam relatados casos de coccidioidomicose no semirido do Nordeste, em especial no Piau em caadores de tatus, que revolveram o solo para desentocar a caa. H tambm a esporotricose sistmica, que resultado da inalao de condios de S. schenckii os quais vo causar infeco pulmonar que pode sistematizar-se. Este tipo de apresentao clnica da esporotricose bastante raro. O aspecto macro e micromorfolgico do fungo o mesmo do agente da esporotricose subcutnea. A histoplasmose uma infeco sistmica, causada por Histoplasma capsulatum var. capsulatum ou H. capsulatum var. duboisii. Enquanto o primeiro agente tem distribuio cosmopolita, o outro tem sua distribuio geogrfica restrita ao continente africano. O cultivo de H. capsulatum temperatura ambiente constitudo de colnia branca que, quando muito velha, assume colorao camura. O crescimento do fungo bem lento. Microscopicamente se observam hifas finas e delicadas e condios de dois tipos. Os macrocondios esfricos e tuberculados so estruturas marcantes para a identificao do fungo. Porm, a presena de microcondios esfricos necessria para a correta identificao do agente, pois h alguns fungos saprfitas, pertencentes ao gnero Chrysosporium, que tambm produzem estruturas de propagao semelhantes. Deve-se, para a correta identificao do agente da histoplasmose, realizar a converso desse fungo para a fase leveduriforme em meios enriquecidos com incubao a 37C. Todavia, a converso de H. capsulatum no facilmente obtida e depende tambm das caractersticas fisiolgicas de cada isolado. Quando convertidos fase leveduriforme observam-se colnias glabras, lisas, branco-amarelada, e na microscopia notam-se leveduras ovais e unibrotantes. A paracoccidioidomicose uma micose sistmica causada por Paracoccidioides brasiliensis, caracterizada pela forma parasitria do seu agente: clula leveduriforme mutibrotante com parede celular birrefringente. a micose

Micologia | 417

sistmica mais frequente na Amrica Latina. Afeta usualmente agricultores, que mantm contato direto com a natureza, em principal com o solo. A micose endmica no Brasil. As manifestaes clnicas da paracoccidioidomicose resultam da inalao de elementos infectantes do fungo ou de uma reativao de leso primria quiescente, ou seja, de uma leso adquirida h algum tempo, muitas vezes mais de trinta anos, e que no tinha ainda se desenvolvido. O fungo, alm de acometer o pulmo, dissemina-se para outras partes do corpo, atingindo principalmente as mucosas do indivduo, sua pele e linfonodos. O aspecto macroscpico da cultura de leveduras desse fungo tem colorao creme-clara, consistncia cremosa e conseguido em meios especiais, como o meio de Fava-Neto, com incubao a 37C. O cultivo a 25C d origem a colnias de crescimento muito lento, filamentosas, algodoadas ou aveludadas, compostos de uma trama de hifas sem condios. As MICOSES OPORTUNSTICAS so causadas por fungos termotolerantes (que crescem a uma temperatura de 37C), de baixa virulncia e que determinam doenas em hospedeiros com graves deficincias do sistema imunodefensivo. Esses fungos tm porta de entrada varivel, usualmente provocam reao supurativa necrtica. Podem acometer os mais variados rgos, produzindo quadros polimrficos que se apresentam como manifestao cutnea, subcutnea ou sistmica. Os fungos invadem os tecidos como uma hifa. A criptococose causada por leveduras do gnero Cryptococcus, das quais destacam-se duas espcies: C. neoformans, que acomete principalmente indivduos imunodeprimidos e C. gattii, que pode acometer indivduos imunocompetentes. A micose de frequncia elevada nas grandes cidades, onde so diagnosticadas suas formas clnicas mais graves. As formas subclnicas ou as que se manifestam como infeco respiratria inespecfica devem ser

418 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

bastante frequentes. A doena endmica no Norte e no Nordeste do pas, acometendo crianas, jovens e adultos, de ambos os sexos e todas as faixas etrias, com ou sem depresso do sistema imunolgico. O fungo apresenta tropismo pelo sistema nervoso central e o lquor do paciente pode simular meningite viral, bacteriana e tambm tuberculose. As leveduras do gnero Cryptococcus possuem uma caracterstica especial, que a presena de uma cpsula polissacardica que envolve todo o fungo. Essa cpsula pode ser evidenciada em exames laboratoriais por contraste com tinta nanquim ou com a colorao pelo Mucicarmin de Mayer. C. neoformans e C. gattii so capazes de produzir a enzima extracelelular fenol oxidase, que extremamente til para a identificao do agente da criptococose, pois esta enzima faz com que a levedura se torne melanizada quando colocada em cultivo com compostos fenlicos. Esta enzima e a cpsula polissacardica esto relacionadas com a virulncia desse fungo ao organismo. A aspergilose causada por membros do gnero Aspergillus que se apresentam nos tecidos como hifas hialinas septadas e ramificadas dicotomicamente, ou seja, num ngulo de 45. A micose se manifesta em trs formas clnicas: a alrgica, de colonizao e a forma invasiva. Poucos grupos de Aspergillus causam infeco no homem. Espcies de Aspergillus dos grupos fumigatus, niger e flavus so os patgenos mais comuns, porm tambm podem causar infeco fungos dos grupos nidulans, terreus, ustus e restrictus. O aspecto microscpico do conidiforo permite a distino entre as diferentes espcies. A candidase oportunista tem incidncia mundial e resulta da invaso por espcies de Candida dos tecidos de hospedeiros com endocrinopatias, nos que recebem teraputicas imunodepressivas, nutrio parenteral e administrao prolongada de antibiticos ou esteroides, e ainda em pacientes com complicaes aps grandes cirurgias. Nos tecidos, as espcies de Candida se apresentam como hifas de aspecto peculiar, com exceo de C. glabrata (nun-

Micologia | 419

ca filamenta, sempre se apresenta na forma de levedura). O agente mais comum C. albicans, espcie que faz parte da microbiota do tubo digestivo do homem. Vive tambm em menor nmero na rvore brnquica e na cavidade vaginal. Os microrganismos responsveis pela candidase so classificados em sua forma anamrfica, usando provas fisiolgicas de assimilao e fermentao de acares. medida que vm sendo descobertas as formas teleomrficas das espcies de Candida, as caractersticas dos esporos demonstram que elas pertencem a vrios gneros distintos.
3.2. Agentes antifngicos

O nmero de frmacos disponveis para o tratamento de infeces fngicas sistmicas limitado. Nos ltimos anos, a anfotericina B e os azis principalmente cetoconazol, fluconazol e itraconazol tm sido os frmacos de primeira escolha na terapia. Estas duas classes de medicamentos tm como alvo a membrana celular dos fungos. Os polienos ligam-se a uma poro esterol, basicamente ergosterol, presente na membrana de fungos sensveis, formando poros ou canais. O resultado um aumento na permeabilidade da membrana que permite o extravasamento de diversas molculas pequenas, levando morte celular. A anfotericina B um antibitico fungicida de largo espectro e potente, mas seu uso associado a efeitos adversos significantes, como nefrotoxicidade e febre com calafrios, como reao aguda infuso intravenosa, j que a farmacocintica deste frmaco no permite a administrao oral. Os azis so compostos totalmente sintticos. O mecanismo de ao destes frmacos baseia-se na inibio da esterol-14-a-desmetilase, um sistema enzimtico microssomal dependente do citocromo P450, que prejudica a sntese do ergosterol na membrana citoplasmtica e leva ao acmulo de 14- ametilesteris. Esses metil-esteris no possuem a mesma forma e propriedades fsicas que o ergosterol e levam formao da membrana com propriedades alteradas, que no desempenha as funes bsicas necessrias ao desenvolvi-

420 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

mento do fungo. Os azis causam menos reaes adversas que a anfotericina B, mas so menos potentes que ela. Podem ter ao fungisttica ou fungicida. O uso excessivo dos azis levou ao aparecimento de resistncia em espcies suscetveis. Um outro agente antifngico sistmico utilizado o pr-frmaco flucitosina. Todos os fungos sensveis so capazes de desaminar a flucitosina em 5fluorouracila, um potente antimetablito; como resultado final, a sntese de cido desoxirribonucleico dos fungos fica prejudicada. Embora as clulas dos mamferos no convertam a flucitosina em fluorouracila, o que crucial para ao seletiva do composto, alguns microrganismos da flora intestinal o fazem, causando certa toxicidade aos humanos. A atividade antimicrobiana de um composto pode ser quantificada com base na determinao da concentrao mnima capaz de inibir o crescimento de um dado microrganismo, um valor chamado CIM (Concentrao Inibitria Mnima), ou MIC (Minimum Inhibitory Concentration) em ingls. Este valor pode ser determinado atravs do mtodo das diluies sucessivas ou do mtodo da difuso em gar, ou ainda atravs do uso de tiras contendo um gradiente de concentrao de antibitico, conhecido como E-teste. Do ponto de vista microbiolgico e clnico, o conceito de sensibilidade e resistncia aplicado para classificar o isolado como sensivel ou resistente. No aspecto microbiolgico, uma cepa considerada resistente a um antifngico quando a concentrao inibitria mnima mais elevada que a habitual do antifngico frente a essa espcie. Podemos observar trs diferentes tipos de resistncia aos agentes antifngicos:
Intrnseca: dita quando nenhum membro de uma espcie sensvel

ao antifngico, ou seja, todos so insensveis.

Micologia | 421

Primria: ocorre quando dentro de uma espcie, normalmente sensvel

a determinado antifngico, encontra-se uma cepa com resistncia natural a ele, sem necessidade de contato prvio com a droga.
Secundria: ocorre quando uma cepa, previamente sensvel, desen-

volve resistncia droga aps ter sido exposta a ela.


3.3. Diagnstico imunolgico das micoses pulmonares

As provas imunolgicas prestam valiosos auxlios no diagnstico de uma infeco fngica. Os dados obtidos atravs de tais provas, devem ser criteriosamente interpretados e correlacionados com os achados micolgicos, evidncias clnicas e circunstncias epidemiolgicas. Para segurana e facilidade na interpretao dos resultados, soros controles positivos devem ser includos nas provas sorolgicas para deteco de anticorpos em soro. Essas provas devem ser realizadas com uma bateria de antgenos. No caso especfico das micoses pulmonares, essa bateria deve incluir, no mnimo, antgenos de Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma capsulatum, Aspergillus fumigatus e Coccidioides immitis. Para melhor avaliao prognstica, as provas devem ser executadas com amostras seriadas do soro colhido em diferentes perodos, possibilitando assim a elaborao da curva sorolgica. importante salientar que as provas imunolgicas tm valor presuntivo no diagnstico das infeces fngicas, sendo o exame de cultivo o padro-ouro para diagnstico definitivo das micoses.

422 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

3.4. Interpretao das provas imunolgicas


3.4.1. Paracoccidioidomicose

Pacientes portadores de paracoccidioidomicose ativa sem tratamento apresentam positividade nas provas sorolgicas acima de 90%. Os ttulos da reao de fixao de complemento so mais elevados nas formas graves e agudas da doena, sofrendo quedas medida que ocorre melhora clnica. A reao no tem muito valor diagnstico quando tomada como dado isolado. A correlao com os dados clnicos, epidemiolgicos e resultados fornecidos por outras tcnicas faz com que a importncia diagnstica aumente. Na imunodifuso dupla de Ouchterlony pode ocorrer a formao de vrias bandas de precipitao, sendo mais frequente a demonstrao de apenas uma delas. A reao dotada de alta especificidade. Reaes cruzadas so mnimas e podem ocorrer principalmente com soros de pacientes portadores de histoplasmose. A contraimunoeletroforese mais sensvel que a imunodifuso dupla e permite que os resultados sejam conhecidos em tempo reduzido. Ao lado do alto valor diagnstico, a reao permite tambm acompanhar a evoluo sorolgica do paciente, atravs da titulao seriada de amostras do soro. O sorodiagnstico especfico da paracoccidioidomicose pode ser obtido por intermdio da imunoeletroforese, atravs da demonstrao do arco de precipitao correspondente ao antgeno E2 ou gp43. O arco de precipitao correspondente forma-se na regio catdica da lmina.
3.4.2. Histoplasmose

Anticorpos fixadores do complemento podem ser demonstrados na maioria dos pacientes, j a partir da quarta semana aps a infeco. Preconizase a utilizao dos antgenos obtidos da fase leveduriforme do Histoplasma

Micologia | 423

capsulatum bem como do antgeno obtido da sua fase filamentosa para aplicao no teste, uma vez que o antgeno leveduriforme apresenta uma maior especificidade e o antgeno filamentoso maior sensibilidade. Os resultados inespecficos esto geralmente relacionados aos ttulos de 1:8 e 1:32. Consequentemente ttulos inferiores a 1:8 so considerados normais, e entre 1:8 e 1:32 so considerados de valor presuntivo. Ttulos de 1:32 ou mais elevados so altamente sugestivos de histoplasmose em atividade. Aps a cura clnica, os ttulos caem rapidamente e normalmente desaparecem aps nove meses. Reaes cruzadas podem ocorrer com soros de portadores de paracoccidioidomicose.
Na imunodifuso dupla podem ser verificadas duas faixas de precipitao de importncia diagnstica, denominadas bandas H e M. A faixa M forma-se prxima do orifcio que recebe o antgeno e pode ser demonstrada com soros de pacientes com formas agudas ou crnicas de histoplasmose, ou em indivduos sensveis a histoplasmina e que se submeteram a recente teste intradrmico com o antgeno. A precipitina H demonstrada no soro de pacientes com a doena ativa ou at dois anos aps recuperao clnica, raramente ocorre na ausncia de M. A contraimunoeletroforese tem praticamente o mesmo valor da imunodifuso dupla, permitindo ainda a titulao dos anticorpos anti- H. capsulatum. A deteco de antgeno de H. capsulatum em espcimes de urina, sangue e fluido crebroespinhal oferece um mtodo rpido para o diagnstico, para o monitoramento de terapia, assim como para a identificao de recadas na histoplasmose disseminada. Resultados falso-positivos tm sido observados somente em pacientes com blastomicose, paracoccidioidomicose e infeco por Penicillium marneffei, e menos frequentemente em pacientes com coccidioidomicose.

424 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

3.4.3. Aspergilose

Nos aspergilomas, os ttulos de anticorpos especficos demonstrados pela reao de fixao de complemento esto geralmente elevados. As bandas de precipitao reveladas pela imunodifuso dupla e contraimunoeletroforese so geralmente mltiplas, podendo ser acima de dez. Aps a remoo cirrgica do aspergiloma ou tratamento adequado, estes anticorpos deixam de ser detectados em pouco tempo. Na aspergilose brnquica alrgica os ttulos de anticorpos especficos so baixos, e na asma aspergilar raramente so demonstrados. Atravs de provas cutneas com aspergilina, pode-se demonstrar reaes de hipersensibilidade do tipo I e III na aspergilose brnquica alrgica, e do tipo I na asma aspergilar. Nas formas invasivas da doena raramente se demonstram anticorpos atravs das provas usuais, necessitando-se o emprego de provas mais sensveis tais como radioimunoensaios e imunoenzimticas. Na imunodifuso dupla e contraimunoeletroforese, podem ocorrer reaes inespecficas devido protena C-reativa do soro do paciente. A eliminao de tal reao inespecfica se faz atravs da lavagem da lmina, em soluo de citrato de sdio a 5% durante trinta minutos.
3.4.4. Criptococose

O imunodiagnstico da criptococose se baseia principalmente na demonstrao de antgeno solvel de C. neoformans , (GLUCORONOXILOMANANA) atravs da reao de soro ou lquor com partculas de ltex sensibilizadas com gamaglobulina de coelho antipolissacride capsular. Interferncias, tais como fator reumatoide e efeito prozona podem ser encontradas neste teste, e so facilmente eliminadas com tratamento das amostras com pronase.

Micologia | 425

Os reagentes para demonstrao de antgeno solvel so encontrados no comrcio, de procedncia norte-americana, na forma de KIT. Anticorpos podem ser demonstrados na fase inicial e final da criptococose. As provas mais utilizadas para tal propsito, so as reaes de imunofluorescncia indireta e aglutinao de suspenso de clulas de C. neoformans, porm apresentam baixo rendimento.
4. Meios de cultura e corantes 4.1. Meios de cultura

Os meios de cultura so preparaes que contm as fontes nutricionais necessrias para o crescimento e multiplicao dos organismos. O cultivo de microrganismos pode ter diferentes propsitos, mas em todos eles o meio de cultura deve suprir as necessidades mnimas para que in vitro se consiga um ambiente semelhante ao que se encontrava o organismo na natureza. Levando em considerao que os nutrientes so unidades estruturais e fontes de energia para a construo e manuteno da estrutura e organizao dos microrganismos, o meio de cultura deve cont-los para que viabilize o seu crescimento. So esses os principais constituintes do meio de cultura:
gua: sempre deve ser usada gua destilada para o preparo de meios

de cultura. A gua da torneira de constituio desconhecida, variando especialmente em ons e em pH.


Fonte de carbono: necessria para a sntese de numerosos compos-

tos orgnicos que fazem parte do protoplasma. A glicose a principal fonte de carbono utilizada pelos microrganismos.

426 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Fonte de nitrognio: muitos componentes da clula, principalmente as

protenas, contm nitrognio.


Minerais: enxofre e fsforo. Elementos de trao: so os minerais que so exigidos em quantidades

mnimas. Exemplos: potssio, magnsio, etc.


Fatores de crescimento: um fator de crescimento um componente

orgnico que a clula deve conter para crescer, mas incapaz de sintetizar. Exemplos: aminocidos, purinas, etc. Observao: Para o preparo do meio de cultura, as drogas usadas devem ser de maior pureza. O pH, a temperatura e a aerao devem ser cuidadosamente controlados. Sempre se deve observar o prazo de validade do produto. Os meios de cultura podem ser classificados da seguinte forma: Quanto ao estado fsico
Slido: contm gar (agente solidificante) na concentrao de 1,5g

a 3,0g por litro.


Semisslido: 0,1g a 1,1g de gar. Lquidos (caldos): ausncia de gar.

Agentes solidificantes:
Gelatina: pode ser hidrolizada. mais utilizada hoje em provas

bioqumicas.
gar: uma substncia hidrocarbonada extrada de vrias espcies

de algas vermelhas, e imune ao desdobramento pela maioria dos microrganismos.


Slica gel: usada quando se deseja cultivar microrganismos autotrficos.

Micologia | 427

Quanto composio qumica


Naturais ou Complexos: formados por substncias de composio

qumica no definida.
Sintticos: quando a composio qumica conhecida e seus com-

ponentes servem para suprir as fontes necessrias de carbono, nitrognio, vitaminas, etc. Quanto ao emprego
Meios de enriquecimento: so meios enriquecidos com determina-

dos nutrientes que favorecero o desenvolvimento de determinado microrganismo, entre vrios outros.
Meio de manuteno: garante a viabilidade do microrganismo, por

longos perodos, de modo a torn-los disponveis em qualquer experimentao.


Meio diferencial: permite ao microrganismo produzir estruturas ou

reaes que podem ser usadas na sua diferenciao entre gneros ou espcies.
Meio seletivo: permite o crescimento de um determinado grupo

ou gnero de microrganismo, em detrimento de outros. Os meios de cultura devem ser preparados e esterilizados cuidadosamente, de acordo com o protocolo a seguir: a) Pesagem dos ingredientes
Se o meio preparado a partir de seus ingredientes bsicos,

suas massas corretas para o volume desejado devem ser pesadas isoladamente.

428 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Para meios desidratados, pesar a massa correspondente ao volume

desejado. b) Dissoluo dos ingredientes


Nunca usar recipientes de cobre ou zinco para dissoluo dos

ingredientes do meio de cultura, usar preferencialmente o balo de vidro, quimicamente limpo.


Adicionar ao recipiente contendo os ingredientes uma quantidade

de gua destilada, aproximadamente a metade do volume desejado, agitando constantemente com basto de vidro, e evitando a formao de bolhas; aquecer brandamente.
Usar gua destilada temperatura ambiente, no preparo de meios

lquidos.
Completar o volume do meio com a gua aps a formao de

suspenso homognea. Isso essencial, principalmente em meios contendo agentes solidificantes.


O aquecimento para uma efetiva dissoluo dos ingredientes e

esterilizao do meio deve ser feito no menor tempo possvel. Os meios que contm gar devem ser aquecidos at o seu ponto de ebulio para uma completa dissoluo.
Resfriar os meios contendo gar temperatura aproximada de

50 C, reajustar o volume de gua destilada aquecida de 45 a 50 C, se houver perda significativa de gua durante o aquecimento. c) Determinao e ajuste de pH
Determinar o pH de meios formulados antes de adicionar o gar. Quando se tratar de meios formulados, se deve aferir 0,2 unida-

des de pH acima do desejado, haja visto que o pH abaixa aproxima-

Micologia | 429

damente este valor aps a autoclavao. Nos meios desidratados, no necessrio o ajuste do pH, pois os meios j vm tamponados.
Determinar o pH atravs de um potencimetro ou por papel indi-

cador de pH.
Ajustar o pH com soluo de cido clordrico (HCl) 0,1N ou

soluo de hidrxido de sdio (NaOH) 0,1N. d) Distribuio dos meios


Distribuir os meios em recipientes, quimicamente limpos e no caso de

meios que no suportem nova autoclavao, usar recipientes estreis.


Ao distribuir em frascos de Erlenmeyers ou bales de fundo chato,

evitar ultrapassar 50% do volume total do frasco.


A distribuio em placas deve ser de aproximadamente 15mL; 6ml

em tubos para meio inclinado, 5ml para camada alta e 6ml para caldos em geral.
A distribuio nos tubos deve ser feita com pipetas; Codificar os meios conforme padro ou conveno do laboratrio;

e) Esterilizao dos meios


Com algumas excees, esterilizar os meios em autoclave a 121 C

durante 15 minutos. f) Preparo de gar inclinado em tubos


Ao retirar os tubos contendo meio slido da autoclave, inclin-los

apoiando-os num suporte de madeira, permanecendo os mesmos com aproximadamente 1cm de meio na base. Deixar solidificar temperatura ambiente.

430 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

g) Plaqueamento de meio de cultivo


Fundir o meio slido em banho-maria, resfri-lo em banho dgua,

de modo a evitar ou diminuir a umidade que se condensa na tampa da placa de Petri, quando o gar se solidifica.
Flambar a boca do recipiente que contm o meio, antes de

distribu-lo na placa.
Prximo chama do bico de Bunsen, verter o meio, levantando

parte da tampa da placa de Petri estril, o suficiente para permitir a introduo da boca do tubo ou outro recipiente que contm o meio, sem tocar as bordas da placa. Pode-se usar uma pipeta para a distribuio.
Fechar a placa, moviment-la levemente sobre a bancada para

permitir uma distribuio uniforme, e deixar solidificar temperatura ambiente. h) Armazenamento e conservao dos meios de cultura:
Para perodos de tempo prolongados, recomenda-se guardar os

tubos e frascos de Erlenmeyers contendo meio em temperatura de 12 a 15 C. Os meios contendo gar no devem ser guardados abaixo de 0 C para no alterar seu gel.
Geralmente possvel sua conservao durante um ou dois meses

temperatura ambiente em locais secos, limpos e abrigados da luz;


Identificar todos os tubos, placas ou frascos que contenham meios

de cultura.
Para que no haja perda de gua do meio para o ambiente, os

recipientes devem ser bem vedados. No caso de placas de Petri, seus bordos podero ser lacrados com parafilme.

Micologia | 431

Lista de meios de cultura mais utilizados em laboratrio de Micologia gar extrato de arroz (Rice extract agar) Meio desidratado gar gua destilada 15g 30g 1000mL

Suspender o p na gua e deixar embeber o gar durante trinta minutos, fundir, distribuir e esterilizar em autoclave por quinze minutos a 121 C.
Dextrose Peptona gar gua destilada

gar Sabouraud glicosado (Sabouraud glycose agar) 30g 10g 30g 1000mL Misturar todos os elementos em balo, deixar embeber o gar por trinta minutos, levar autoclave e aquecer lentamente 120 C. Agitar e ajustar o pH para 6,5. Esterilizar por quinze minutos a 121 C.

Batata dextrose gar (Potato dextrose agar BDA) Meio desidratado 39g gar 5g gua destilada 1000mL Suspender em gua e deixar embeber o gar por quinze minutos. Aquecer at a dissoluo completa. Esterilizar em autoclave por quinze minutos a 121 C.

432 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Mycosel (Mycobiotic) agar Farinha de soja digerida Dextrose Cicloheximida Cloranfenicol Agar gua destilada

10 g 10 g 0,4 g 0,05 g 15 g 1000 mL

Misturar os reagentes. Esquentar agitando frequentemente at dissolver todos os ingredientes. Autoclavar a 118C por quinze minutos. No aquecer de forma excessiva. Para o meio desidratado seguir o mesmo procedimento sem adio do gar. Czapeck dox gar (CZ) Sacarose Nitrato de sdio Fosfato di-potssico Sulfato de magnsio Cloreto de potssio Sulfato ferroso gar gua destilada 30 g 3g 1g 0,5 g 0,5 g 0,01g 30 g 1000mL

Misturar e dissolver os reagentes. Juntar o gar e deixar embeber durante trinta minutos. Ajustar o pH para 7,3 antes de esterilizar. Fundir o gar e esterilizar em autoclave por quinze minutos a 121 C. Para o meio desidratado, seguir o mesmo procedimento sem adio do gar. gar infuso de crebro e corao (Brain Heart Infusion agar BHI) Infuso de 200g de crebro de bezerro 7,7 g Infuso de 250g de corao de vaca 9,8 g Proteose Peptona 10 g

Micologia | 433

Dextrose Cloreto de sdio Fosfato dissdico gar

2g 5g 2,5 g 20 g

Misturar e dissolver os reagentes. Juntar o gar e deixar embeber durante trinta minutos. Ajustar o pH para 7,4 antes de esterilizar. Fundir o gar e esterilizar em autoclave por quinze minutos a 121 C. Para o meio desidratado seguir o mesmo procedimento sem adio do gar. gar dextrose farinha de milho (Corn meal agar CMA) Farinha de milho 40 g Dextrose 20 g gar 20 g gua destilada 1000 mL Colocar a farinha em Becker com gua e aquecer em banho-maria a 60 C por uma hora. Em seguida, filtrar em gaze dobrada duas vezes. Restabelecer o volume inicial com gua destilada. Transferir para balo que j contenha o gar e a dextrose pesados. Esterilizar em autoclave a 121 C por vinte minutos. Para o meio desidratado usar o mesmo procedimento usado no BDA, porm esterilizar a 121 C por vinte minutos. OBS: Quando este meio utilizado para Mucoracea, trocar a dextrose por glicose. Extrato de malte gar (Malt extract agar MEA) Extrato de malte 30 g gar 30 g gua destilada 1000 mL Usar o mesmo procedimento do meio BDA, e ajustar o pH para 7,0.

434 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Sabouraud Glicose Peptona gar gua destilada

30 g 10 g 20 g 1000 mL

Usar o mesmo procedimento do meio Sabouraud glicosado. Meio seletivo para fungos entomopatognicos Farinha de aveia 10 g gar 10 g Sulfato de estreptomicina 0,50 g Dodine 0,45 g Penicilina G 0,20 g Cristal violeta 2,5 mg gua destilada 500 mL

* Soluo estoque de cristal violeta: 0,1g de cristal violeta em 200 ml de gua destilada. *Soluo estoque de antibiticos: 4g de penicilina G e 10 g de sulfato de estreptomicina em 40 mL de gua destilada.
Mistura-se aveia e gar em 490 mL de gua destilada; agitase vigorosamente aquecendo at a fervura, adiciona-se Dodine e 5 mL da soluo estoque de cristal violeta enquanto estiver quente, e autoclava-se por vinte minutos. Quando estiver na temperatura de 50 a 55 C, adicionam-se 2 mL de soluo estoque de antibiticos; agita-se bem e distribui-se imediatamente o meio em placas de Petri.

Micologia | 435

Farinha de aveia gar (Oatmeal gar OM) Farinha de aveia 60 g gar 12,5 g gua destilada 1000 mL Bater a farinha no liquidificador com um pouco da gua por um minuto. Depois adicionar o gar e a gua e homogeneizar. Esterilizar em autoclave a 121C por vinte minutos. OBS: No utilizar o frasco de Erlenmeyer na medida exata do meio, pois durante a autoclavao, o meio ferve e pode molhar a rolha ou transbordar. Extrato de levedura-peptona-glicose-gar (Yeast extract-peptoneglucose-agar PYGA) Peptona 5g Extrato de levedura 5g Glicose 20 g gar 13 g gua destilada 1000 mL Seguir os mesmos procedimentos usados para Sabouraud glicosado. MP-5 (meio seletivo para fungos aquticos) Peptona 1g Maltose 4g gar 20 g gua destilada 1000 mL Seguir os mesmos procedimentos usados para o Sabouraud glicosado Observao:Todos os meios utilizados no laboratrio de Micologia podem ser acrescidos com antibiticos (cloranfenicol, estreptomicina, etc.) para evitar o crescimento de outros microrganismos.

436 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Meio de cultura Fava Netto (para antgeno de P. brasiliensis) Proteose peptona n0 3 (Difco) 3g Peptona 10 g Extrato de carne 5g Cloreto de sdio 5g Extrato de levedura 5g Dextrose 40 g gar 18 g gua destilada qsp 1000 mL Fundir o meio em banho maria fervente. Ajustar o pH entre 7,2 e 7,4. Autoclavar a 1200C durante vinte minutos. Meio de cultura - Smith-Asparagina ( para histoplasmina) L-Asparagina 7g Cloreto de amnio 7g Fosfato monocido de potssio 1,31 g Citrato de sdio 0,9 g Sulfato de magnsio heptahidratado 1,5 g Citrato frrico 0,3 g Glicose 10 g Glicerina 25 g gua destilada qsp 1000 mL Dissolver a asparagina em cerca de 300 mL de gua destilada aquecida a 500C. Dissolver os sais separadamente em 25 mL de gua destilada, sendo que o citrato frrico dever ser dissolvido em gua quente. Misturar as solues dos sais com a soluo de asparagina. Homogeneizar. Acrescentar a glicose e a glicerina. Completar o volume com gua destilada. Homogeneizar. Distribuir o meio, pores de 200 mL, em bales de 500 mL. Autoclavar a 1200C durante vinte minutos

Micologia | 437

Meio de Cultura Negroni (Filtrado de cultura de P brasiliensis) . Dissolver 60 g de neopeptona em 120 mL de gua destilada aquecida a 45C. Colocar a soluo de neopeptona em tubos para dilise (membranas de celofane) e dialisar contra gua destilada (cerca de 2 litros) durante cinco horas a 70C, e por uma noite em geladeira a 4C. Retirar o contedo do tubo de dilise e completar o volume com gua destilada para 1.800 mL. Adicionar 36g de glicose, 0,18 g de tiamina e 0,36 g de asparagina. Homogeneizar e acertar o pH, que deve ser entre 6.8 e 7.0; Distribuir o meio, pores de 150 mL em frascos Erlenmeyer ou bales de 300 mL de capacidade. Autoclavar a 120C durante 15 minutos. Observao: Todos os meios utilizados no laboratrio de Micologia podem ser acrescidos com antibiticos (cloranfenicol, estreptomicina, etc), para evitar o crescimento de outros microrganismos.
4.2. Corantes

A colorao um meio utilizado em laboratrios de Micologia com o objetivo de visualizar estruturas vegetativas e reprodutivas dos fungos, as formas de leveduras, e realizar testes de viabilidade. As solues utilizadas so:
a) Soluo de hidrxido de potssio KOH (soluo clarificante)

Concentraes:

40% - unhas (fneros). 30% - pelos e pele. 10% - pele tenra de criana. 6% - para exame de escarro. 5% - para estudo de Basiodiomycotina e outros fungos.

438 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Frmula (para soluo 30%):

KOH em lentilhas gua destilada


Preparo:

30 g 70 mL

Dissolver os dois ingredientes em movimentos giratrios, at a total dissoluo dos componentes. A soluo deve ficar transparente. Armazenar em vidro escuro.
b) Lactofenol de Amann com azul de algodo

Usado para tornar mais distintas as estruturas hialinas dos fungos (corante citoplasmtico)
Frmula:

cido fnico cido ltico Glicerina gua destilada Azul de Poirrierblau


Preparo:

20 g 20 g 40 g 20 mL 0,05 g

Misturar todos os componentes e dissolver pelo calor. Depois adicionar 0,05g de azul de Poirrierblau. Esperar 24 horas e filtrar. Observao: Para estudar as estruturas de fungos demceos (negros) pode-se utilizar Lactofenol de Amann sem adio de azul de algodo.

Micologia | 439

c) Acridine Orange

Corante vital usado para teste de viabilidade que distingue clulas vivas e mortas, onde as clulas vivas adquirem colorao laranja, e as clulas mortas, colorao verde.
Frmula:

Acridine orange PBS pH 7,7


Preparo:

0,02 g 100 mL

Dissolver os dois ingredientes e agitar.


d) Verde janus B

Usado na diferenciao de clulas vivas e mortas. As clulas vivas permanecem incolor, enquanto as clulas mortas adquirem colorao azul.
Frmula:

Verde-janus B gua destilada


Preparo:

0,05 g 100 mL

Dissolver os dois ingredientes e agitar.


e) Reagente de Melzer

Usado para deteco de reao amiloide ou dextrinoide de esporos, ascas e tecidos himeniais de Ascomycotina e Basidiomycotina, na qual uma colorao azulada determina uma reao amiloide e uma marrom determina uma reao dextrinoide.

440 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Frmula:

Iodo Potssio iodado Hidrato de cloro gua destilada


Preparo:

0,5 g 1,5 g 20 g 20 mL

Dissolver os ingredientes e agitar.


f) Floxina B

Usada para o estudo do citoplasma de Basiodiomycotina.


Frmula:

Floxina B Glicerina gua destilada


Preparo:

10 g 75 mL 175 mL

Misturar todos os componentes e dissolver pelo calor. g) Glicerina 10% Preserva a colorao original do fungo estudado.
Frmula:

Glicerina gua
Preparo:

10 mL 90 mL

Misturar os ingredientes com leve agitao.

Micologia | 441

5. Tcnicas micolgicas 5.1. Diluio seriada

A diluio seriada uma tcnica simples que pode ser usada para vrios propsitos, como: separao de duas cepas fngicas que estejam misturadas em um tubo ou placa (contaminao no tubo ou na placa), contagem de colnias em amostras, isolamento de fungos de substratos lquidos (anlise de gua, leite, etc) e de solo, alm da determinao da quantidade e qualidade de um inculo para processos fermentativos ou inculos lquidos.
a) Preparo da amostra

Separao de duas cepas de fungos Fazer uma raspagem com a ala em L na placa ou no tubo onde se encontram as duas cepas a serem separadas no caso de separao de duas cepas de fungos. Este raspado deve ser colocado em um tubo com 10mL de soluo salina a 0,85% e homogeneizar. Isolamento de fungos de substratos lquidos Colocar 2 mL da amostra lquida (gua, leite, etc) em um tubo com 10 mL de soluo salina a 0,85% e homogeneizar. Isolamento de fungos de solo Colocar 1g do solo a ser analisado em um tubo com 10 mL de soluo salina a 0,85% e homogeneizar.
b) Diluio da amostra

Utilizando uma srie de dez tubos com 9 mL de salina, colocar no primeiro tubo 1ml da suspenso homogeinizada do primeiro tubo (devese usar uma pipeta para cada transferncia); homogeneizar e transferir

442 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

1mL para o segundo tubo; homogeneizar novamente e transferir 1mL para o terceiro tubo. Repetir este procedimento at o ltimo tubo
c) Semeadura nos meios de cultura

Preparar uma placa de Petri com o meio de cultura escolhido para cada tubo de diluio. Todas as placas devem ser marcadas com as respectivas diluies. Retirar 0,1mL ou 1mL ( escolha) de cada uma das diluies e transferir para a placa de Petri com a pipeta (deve-se usar uma pipeta para cada diluio) e espalhar na placa com o auxilio da ala de Drigalski. Incubar as placas por, no mnimo, sete dias na estufa a 250C. Aps o perodo de incubao, observar as placas e fazer a contagem das colnias ou no caso de separao das cepas fngicas, observar as placas e retirar a colnia desejada com a ala em L.
d) Observao dos resultados Contagem

A contagem de colnias feita a partir da observao das placas e contagem manual das colnias crescidas e quantificao da diluio original, ou seja, quantos condios ou esporos haviam na sua suspenso original. O nmero de condios presentes na suspenso original ser igual ao nmero de colnias multiplicado pelo fator de diluio. Ex: Se na diluio 10-4 obtivemos cinquenta colnias com inculo de 1mL, a concentrao original ser de 50 x 104 = 5 x 105 condios/mL. Se na diluio 10-6 obtivermos 135 colnias com um inculo de 0,1ml, a concentrao original ser de 135 x 106 x 10 = 135 x 107 = 1,35 x 109 condios/mL. Observao: Para a contagem de condios ou esporos em uma soluo tambm podemos usar a Cmara de Neubauer

Micologia | 443

5.2. Tcnicas de semeadura e microscopia


5.2.1.Semeadura de fungos

Inoculao em placas As tcnicas usadas para inocular fungos em placas so fundamentalmente efetuadas para obter culturas axnicas (culturas puras) e so bem desenvolvidas, j que a identificao de fungos filamentosos baseia-se principalmente nas caractersticas morfolgicas. Procedimento:
Flambar a ala ao rubro e esfriar. No caso de a amostra estar em tubo: remover a tampa de rosca ou tampo de algodo do tubo

que contm a cepa, com o dedo mnimo da mo direita, segurando o tubo com a mo esquerda;
flambar a boca do tubo, imediatamente antes e depois da

inoculao;
No caso de a amostra tambm estar em placa: tomar a placa com a mo esquerda, de modo que a base da

placa fique segura e a tampa possa ser manipulada num movimento de abrir e fechar, com os dedos polegar e indicador;
proceder a uma rpida flambagem na placa toda vez que esta

tenha que ser aberta;


manipular a placa na altura da chama do bico de Bunsen;

444 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

introduzir a ala ou agulha no tubo ou placa de Petri com amostra,

e retirar uma quantidade suficiente do inculo;


tomar uma placa, abrir conforme exposto anteriormente e inocular

no centro da placa ou conforme especificaes em trs pontos eqidistantes.


Incubao das placas: incubar as placas, invertidas em estufa ou temperatura

ambiente, para evitar que, durante a incubao, a gua de condensao da superfcie do gar, provoque crescimento confluente do organismo, impedindo a formao de colnias isoladas.
obedecer aos requisitos fisiolgicos de crescimento do mi-

crorganismo, tais como temperatura ideal de incubao, iluminao, tempo de incubao, etc.
Inoculao em tubos ou frascos de Erlenmeyers

A inoculao em tubos ou frascos de Erlenmeyers pode ser feita em meios slidos e lquidos. Apresentam inmeras finalidades de uso. Em todos os casos, tomam-se medidas asspticas durante a inoculao.
a) Meio lquido para meio lquido

Quando a cultura estiver em meio lquido e se pretende repic-la para um tubo contendo meio lquido, deve-se usar uma ala de platina ou nquel-cromo em forma de gota, observando-se as condies de assepsia.

Micologia | 445

b) Meio lquido para meio slido

Tomar com uma ala em forma de gota um inculo da amostra em

meio lquido.
Introduzir a ala sobre a superfcie do gar inclinado, at a base do

mesmo.
Fazer estrias ou um esfregao em direo boca do tubo, sobre a

superfcie inclinada at da sua extenso. A superfcie inclinada do gar deve ficar voltada para cima, com a mo do operador por baixo do tubo, de modo que a superfcie inclinada possa ser vista sem obstculo.
c) Meio slido para meio lquido

Introduzir a agulha ou ala em forma de L estril no tubo que contm

a cultura em gar inclinado e tomar uma pequena quantidade do inculo. Evite carrear pedaos ou fragmentos do meio com o inculo.
Imergir o inculo no meio lquido, agitar a agulha suavemente contra a

parede do tubo para ressuspender o inculo.


Homogeneizar o meio sob leve agitao.
d) Meio slido para meio slido

Tomar com uma agulha ou ala em forma de L o inculo no meio

slido.
Introduzir a agulha sobre a superfcie do gar inclinado, at a sua base. Fazer estrias ou um esfregao em direo boca do tubo, sobre a

superfcie inclinada, at aproximadamente da sua extenso. O procedimento o mesmo da inoculao de meio lquido para o meio slido.

446 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Incubao dos tubos:


preferencialmente todos os tubos com meio slido

devem ficar em posio vertical em estantes ou outros tipos de suporte.


6.2.2. Microscopia Exame direto de um pedao da colnia

Com a ala de platina em forma de L ou agulha esterilizada, cortar um pedao da colnia e coloc-lo sobre uma lmina. No se deve raspar a superfcie da colnia, porque apenas os condios sero retirados. Desta forma, em muitos casos possvel identificar o fungo. Colocar uma gota do corante lactofenol de Amann com azul de algodo ou outro corante desejado sobre o pedao da colnia. Se o fungo for muito escuro, substituir o corante por uma soluo clarificante ou uma gota de gua. Cobrir a preparao com uma lamnula, comprimindo-a com o cabo do bisturi ou do estilete. Examinar ao microscpio, com objetivas de 10X, 40X e 100X.
Tcnica de cultivo em lmina

Na maioria das vezes, necessrio obter preparaes onde as estruturas do fungo so observadas por inteiro. Isto porque h muitos gneros cujos esporos ou condios por si s no so caractersticos. Neste caso, as estruturas responsveis pela formao e sustentao dos condios ou esporos necessitam ser observadas por completo. Isto nem sempre possvel com a tcnica de exame direto, havendo necessidade de se fazer o cultivo na prpria lmina. Com isto, obtm-se os fungos com suas estruturas intactas.

Micologia | 447

Procedimento:
Vazar em placa de Petri uma camada fina do meio de cultura adequado

para cada gnero ou espcie de fungos a ser examinado.


Aps a solidificao do meio, com o auxlio de um bisturi, cortar

fragmentos de 0,5 cm2.


Montar uma placa de 15 cm de dimetro e cobrir o fundo com papel

de filtro e colocar sobre este um basto em forma de U, duas lminas e duas lamnulas.
Aps a esterilizao, colocar o quadrado de meio sobre cada lmina; Inocular nos quatro lados do quadrado do meio de cultura, fragmentos

miceliais e/ou esporos.


Colocar sobre o meio de cultura a lamnula. Molhar o papel de filtro com gua destilada estril formando uma

cmara mida.
Deixar em temperatura ambiente, por aproximadamente uma semana

ou mais dependendo do fungo estudado.


Observar crescimento e esporulao. Fixar pelo formol por 24 horas. Montar lminas e lamnulas com corante e observar em microscpio

tico com objetivas de 10x, 40x e 100x.


Tcnica da fita adesiva

Esta tcnica d excelentes resultados quando o fungo est sendo cultivado em placa de Petri. Na maioria das vezes, suas estruturas aparecero inteiras, como no cultivo em lmina.

448 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Procedimento:
Cortar um pedao de fita adesiva um pouco menor do que a lmina e

coloc-lo sobre a colnia, com a cola para baixo.


Comprimir com a ala de platina em forma de L para que o fungo cole

na fita.
Colar a fita sobre o corante na lmina. Observar ao microscpio tico com objetivas de 10X, 40X e 100X.
Cultivo sob lamnula

O objetivo desta tcnica a observao das microestruturas vegetativas e reprodutivas do fungo mais intactas. Procedimento:
Inocular em uma placa de Petri, contendo 20 mL de meio de cultura

especfico para o gnero a ser identificado, fragmentos do fungo em trs pontos equidistantes entre si, e sobre cada um destes colocar uma lamnula de 24x32mm, previamente flambadas em bico de Bunsen.
Aps sete dias de crescimento, as lamnulas sobre os pontos de

inculo devem ser retiradas do interior da placa, com auxlio de uma pina, previamente flambada. As lamnulas devem ser colocadas invertidas sobre lminas contendo uma gota de Lactofenol de Amann com azul de algodo.
Observar ao microscpio ptico com objetivas de 10X, 40X e 100X.

Micologia | 449

Tcnicas para estudo de Ascomycotina

Procedimento:
O uso de um microscpio estereoscpico (lupa) indispensvel para

o exame do material.
Seces verticais no corpo frutfero do fungo estudado podero ser

feitas com auxlio de uma gilete ou bisturi.


A maioria das lminas para posterior observao ao microscpio ptico

montada normalmente em gua para medio dos ascosporos e observao de sua colorao, o reagente de Melzer s tambm devendo ser usado para o estudo dos anis apicais das ascas.
O estudo destes fungos em meio de cultura tambm deve ser feito

para que se conhea o seu anamorfo. Isto poder ser feito atravs da tcnica de isolamento de ascoporos (single ascospore isolation).
Tcnica para estudo de Basidiomycotina

O material montado em KOH a 5%. O reagente de Melzers tambm usado para os esporos de fungos

Agaricceos. Impresso de esporos: Uma das mais importantes caractersticas que permite o agrupamento dos gneros em sees a colorao dos basidisporos em massa, ou seja, a impresso de esporos. Procedimento:
Selecionar um corpo frutfero fresco e maduro e cortar sua haste junto

ao pleo.

450 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Colocar o pleo sobre uma folha de papel de duas cores (preta e

branca) com as lminas ou poros para baixo.


Cobrir o pleo e o papel com papel encerado, cristalizador ou com

uma campnula. Se o corpo frutfero do fungo estiver em boas condies, a impresso de seus esporos poder ser obtida em uma hora.
5.3. Coleta e isolamento de fungos ambientais

Observaes quanto ao complexo fungo-substrato so de grande valia por ocasio de qualquer coleta. Deve-se notar que as estruturas mais visveis de um fungo no representam, necessariamente, o seu todo. Alm disso, grande parte de seus ciclos ou remanescentes estruturais podero estar perdidos no interior do substrato. Desta forma, conclui-se que a amostra que se coleta de um fungo, na verdade no passa de um momento do seu ciclo biolgico. As partes mais evidentes, nos fungos, representam em geral, aquelas que mais resistem ao manuseio e ao tratamento para secagem. As condies ideais para o estudo dos fungos residem no isolamento dos organismos a partir de diferentes substratos, e nos diversos ambientes em que os fungos ocorrem: solo, ar, gua ou mesmo na vegetao. Independente do espcime a ser coletado, alguns materiais gerais devem ser providenciados para as coletas: * altmetro * fsforo ou isqueiro * jornal * caderneta de campo * lupa de mo * lpis * mochila ou cesta * mquina fotogrfica * canivete ou esptula * papel indicador de pH * faca afiada * saco plstico * fita crepe * saco de papel * fita mtrica ou trena

Micologia | 451

A. Solo

Considera-se o solo um mosaico de micro-habitats devido a sua grande complexidade, longe de ser um simples amontoado de matria inorgnica sem vida. Ao contrrio, o solo costuma ser rico em microbiota e mesofauna, o que fora o pesquisador a usar tcnica ou substncias especiais quando pretende isolar um grupo definido. O mtodo de diluio o mais usado para se estudar a incidncia de fungos em solos. O material, ao ser coletado, deve ser colocado em latas esterilizadas ou em sacos plsticos. As amostras destinadas anlise devem ser manipuladas com o auxlio de uma esptula ou colher, parcialmente esterilizadas com algodo embebidos em lcool ou com auxlio de uma lamparina. De preferncia, o perodo entre a coleta de material e as diluies, no deve ultrapassar quatro horas. Procedimento:
Tomam-se 10g de cada amostra de solo e coloca-se em frascos de

Erlenmeyer contendo 90 mL de soluo salina esterilizada. Agitar vigorosamente (soluo 1:10 - mesmo princpio da diluio seriada porm em maiores propores).
Desta suspenso, pipeta-se 1mL e adiciona-se a tubo contendo 9 mL

de soluo salina esterilizada, aps agitao (soluo 1:100).


Retira-se ento outro 1mL desta ltima soluo e coloca-se em um

novo tubo contendo tambm 9 mL de soluo salina esterilizada, sempre aps agitao (soluo 1:1000).
Por fim, se necessrio, a mesma operao anterior pode ser repetida, e

uma alquota de 1 ou 0,1mL plaqueada em um meio de cultura apropriado. Em geral, usa-se gar Sabouraud acrescido de antibitico (cloranfenicol, estreptomicina ou penicilina).

452 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Aps sete dias, faz-se o isolamento dos fungos, repicando-se as

colnias para tubos de ensaio contendo meio slido.


Aps o desenvolvimento das colnias, procede-se identificao

genrica-especfica dos fungos. A coleta de substratos orgnicos, como folhas, frutos, razes e troncos em diferentes estdios de decomposio tambm interessante. Estercos de herbvoros devem ser coletados frescos, com uma esptula grande e acondicionados em sacos plsticos. Importante lembrar que as regras de assepsia parcial e etiquetagem (local de coleta, data, condies ambientais e substrato) so idnticas para qualquer coleta, e devem receber ateno especial. O mtodo da placa de solo consiste em se colocar, com uma esptula, quantidades pequenas de solo em uma placa esterilizada, evitando os torres de terra. Verter ento o meio de cultura com antibitico (sugere-se a utilizao do meio de MARTIN, com rosa-bengala e sulfato de streptomicina) e deixar solidificar. Para o isolamento de fungos de substratos orgnicos pode-se utilizar o mtodo de presso de folhas. Este consiste em se pressionar com uma pina uma folha sobre a superfcie do meio de cultura com antibitico, retirando-a em seguida. A placa, ento, deixada temperatura ambiente, observando-se diariamente o crescimento das colnias. Outra opo seria plaquear amostras de substratos (folhas, galhos, insetos, etc), cortadas com bisturi em pequenos pedaos. Deposita-se de uma a trs amostras equidistantes sobre o gar, umedecendo-as levemente com gua esterilizada. Se a amostra for de insetos muito pequenos, coloc-los intactos.

Micologia | 453

B. Fungos macroscpicos

Existe uma variao muito grande de fungos macroscpicos, de consistncia diferente. Alguns se decompem logo aps serem coletados, outros so mais resistentes. De qualquer modo, cuidado e bomsenso tornam-se necessrios para o sucesso de uma coleta. Os materiais comumente usados so:
Cristalizador. Folha de papel dupla face (branca/preta), para coleta de esporos. Frascos de vidro escuros com fixador lcool a 5%. Papel de filtro ou algodo.

No caso de o substrato ser esterco de herbvoros, preparar um cristalizador contendo papel de filtro embebido em gua e glicerina (para no ressecar rapidamente), antes de introduzi-lo no recipiente. Tampar, ento, deixando o conjunto temperatura ambiente e ao abrigo do sol, porm com iluminao. Impedir o ataque de inseto ou outros artrpodes e observar o crescimento macroscpico dos fungos. Nas coletas, deve-se retirar o material por inteiro com o auxlio de uma faca ou esptula, cuidadosamente, para evitar quebra ou esfarelamento. Se possvel, trazer parte do substrato junto. Aconselha-se no misturar materiais diferentes em um mesmo saco a fim de evitar a mistura de esporos. Ao transport-los para outro lugar, acomod-los na mochila ou cesta, protegendoas com folhas de jornal. Amostras delicadas podem ser coladas no fundo de uma caixa de fsforos. Durante as coletas, anotaes sobre cor, textura e tamanho do material coletado devem ser feitas, pois na maioria dos casos os fungos tm suas caractersticas alteradas depois de secos.

454 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

C. Ar atmosfrico

O ar representa um repositrio natural, sob a forma de esporos, dos mais diversos tipos e grupos de fungos. O isolamento depende do local, do tempo de exposio e do substrato empregado. A coleta de ar pode ser realizada de duas formas: 1. Com um amostrador de ar por impactao - Nestes amostradores h um compartimento onde colocada uma placa de Petri com o meio de cultura escolhido e quando o amostrador ligado, a placa recebe todo o ar puxado em um volume determinado por dez minutos. Ao trmino, essas placas so incubadas a 250C por sete dias. As colnias so contadas e repicadas para tubo de ensaio e deve-se ento proceder identificao dos fungos isolados. 2. Expondo as placas de Petri com meio de cultura escolhido, por cinco, dez ou quinze minutos ao ar atmosfrico no ambiente selecionado, incubando em seguida a 250C por sete dias. Repicar as colnias para tubo de ensaio e proceder identificao dos fungos isolados.
D. gua

Fungos aquticos Em ambientes aquticos, encontramos tanto fungos zoospricos como tetraradiados (no zoospricos). Os primeiros so realmente adaptados ao ambiente aqutico, pois possuem esporos flagelados mveis. O segundo grupo, sem flagelos, apresenta esporos de forma radiada, com trs ou quatro braos partindo de um mesmo ponto, ou ainda sigmides ou ovalados. Esta morfologia concede maior facilidade de flutuao, disperso e aderncia ao substrato.

Micologia | 455

Os fungos aquticos podem tambm ser encontrados no solo, graas formao de estruturas de resistncia que lhe permitem sobreviver at que condies de umidade favorveis se estabeleam. Para observao destes fungos, torna-se necessria a coleta de amostras de gua e solo, s quais adicionam-se iscas especiais. Assim, o material para a iscagem :
cido clordrico a 1%. Frasco de 100ml, de boca larga e tampa. Hidrxido de potssio a 2%. Hipoclorito de sdio a 10%. Iscas como: asa de insetos, celofane, ecdise de cobra, exoesqueleto

de camaro, folha de gramnea descorada ou fervida, frutos (ma, jabuticaba, etc), gro de plen do Pinus, gravetos e sementes (cnhamo, Crotalaria sp.).
Papel alumnio. Papel encerado. Saco de tela de nilon ou lata.

A iscagem pode ser realizada no campo ou no laboratrio. importante salientar que a transparncia do material ir determinar sua eficincia como isca. De preferncia, os frascos devem ser esterilizados. Para fins taxionmicos, este requisito passa a ser obrigatrio. No momento da coleta da gua, juntar ao pote gravetos ou folhas que estiverem nas proximidades. Uma vez no laboratrio, transferir uma parte do coletado para placas de Petri esterilizadas, adicionar as iscas e deixar temperatura ambiente. Com o desenvolvimento das colnias, entre 48 e 72 horas, procede-se ao isolamento da cultura pura, utilizando o meio MP-5. Aps o crescimento em meio slido, retirar um pequeno quadrado de 1x1cm da parte mais perifrica da colnia, colocando-o em uma placa esterili-

456 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

zada com gua destilada estril e duas a trs metades de sementes de cnhamo. Decorridas 48 horas, o material deve estar pronto para ser observado diretamente ou montado em lmina. Todos os substratos que portarem crescimento micelial devem ser separados, lavados em gua destilada e recolocados em placas contendo novas amostras do mesmo substrato com gua destilada esterilizada renovada. Em lmina, pode-se observar os flagelos colocando-se uma a duas gotas de Karo na montagem, a fim de diminuir a mobilidade dos zosporos. Para as espcies que dificilmente ocorrem neste tipo de iscagem, recomenda-se a submerso de frutos, gravetos ou folhas dentro de latas perfuradas ou bolsas de nilon. Estas devem ser amarradas com fio plstico e, de preferncia, protegidas da observao pblica. Aps duas ou trs semanas, este material deve ser retirado e lavado em gua corrente por cerca de trinta minutos, para a remoo de detritos, bactrias, protozorios e pequenos invertebrados. Se os fungos estiverem presentes, pstulas esbranquiadas aparecero na epiderme do fruto, as quais devero ser observadas.

5.4. Preservao de fungos

Culturas microbianas so extremamente vulnerveis e podem se contaminar, mutar ou morrer. Muitas vezes, culturas so insubstituveis, e sua perda pode ser muito grave. Outras vezes ela pode ser reisolada ou adquirida de uma coleo de culturas. Em qualquer um dos casos, tempo, informao e dinheiro so desperdiados, mas isto pode ser evitado ou minimizado com um sistema eficiente de preservao de linhagens. Esta uma das funes mais importantes de uma coleo de culturas. A preocupao central a preservao de linhagens com suas caractersticas originais durante um longo perodo de tempo. Novas espcies, mutantes, organismos portadores de plasmdeos e linhagens produzidas por engenharia gentica devem ser preservadas, de forma

Micologia | 457

a manter as suas propriedades. Assim, essencial que colees de culturas executem pesquisas no intuito de definir tcnicas de preservao apropriadas. importante frisar que no existe nenhum mtodo universal para uma preservao adequada a todos os microrganismos. Grupos taxonmicos de microrganismos, e at linhagens dentro da mesma espcie, variam quanto a sua resposta aos diferentes mtodos de preservao.
Mtodos de preservao

Estes mtodos tm como objetivo manter as culturas num estado vivel sem mudana morfolgica, fisiolgica ou gentica. Para se obter um bom resultado na aplicao de um mtodo de preservao, a cultura deve estar em timas condies, deve-se respeitar as condies timas de crescimento, temperatura, umidade, aerao, iluminao e meio de cultivo.
A. Repique

gar

O mtodo mais tradicional de preservao de culturas atravs da transferncia peridica da cultura (repique) para um novo meio de cultivo slido ou lquido. O intervalo entre cada transferncia varia com o microrganismo, o meio de cultivo empregado e as condies ambientais. A maioria dos fungos pode crescer em BDA ou EM, contudo, alguns tm requerimentos especiais de crescimento. O perodo de tempo entre as transferncias varia de fungo para fungo. Para alguns, a cada duas ou quatro semanas, a maioria a cada dois a quatro meses, enquanto outros podem sobreviver 12 meses sem transferncia. Trs condies devem ser determinadas quando se usa este mtodo para preservao de microrganismos:

458 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Meio adequado para manter as culturas. Temperatura ideal de estocagem. Frequncia entre as transferncias.
Preservao sob leo mineral

Muitas espcies de fungos podem ser preservadas por meses ou anos atravs de um mtodo relativamente fcil e simples, que o de imerso em leo mineral. O leo deve ser esterilizado por aquecimento em um forno Pasteur a 170C por uma ou duas horas ou autoclavagem dupla por quinze minutos a 121C. Deixar crescer a cultura em meio apropriado. O repique pode ser feito em gar inclinado ou no. Aps um crescimento adequado, colocar assepticamente o leo mineral estril sobre a superfcie da cultura a uma altura aproximada de 1 a 2cm (quando a cultura estiver em gar inclinado, cobre-se completamente a superfcie). Isto impede a desidratao e reduz a atividade metablica, assim como a velocidade de crescimento do microrganismo, devido reduo da tenso do oxignio. Guardar as culturas com leo mineral na posio vertical. Fazer testes de viabilidade periodicamente para determinar se a cultura est deteriorando.
Blocos de gar em gua

O mtodo consiste em cultivar o microrganismo em uma placa de Petri contendo um meio de gar apropriado. Aps o crescimento vigoroso o gar cortado com uma lmina estril em blocos de aproximadamente 4 a 6 mm. No caso de fungos, a partir do final do crescimento das colnias, um nmero apropriado de cubos transferido assepticamente para tubos ou frascos con-

Micologia | 459

tendo 10 a 15 mL de gua destilada estril. Para reativao, basta retirar assepticamente um dos cubos e deposit-los sobre um meio adequado, a sua aplicao fica restrita a microrganismos que tenham grande aderncia ao gar, como no caso de fungos filamentosos e algumas leveduras.
B. Secagem

Secagem em areia, solo e slica-gel

Tambm considerada como um bom mtodo de conservao de microrganismos. Pode ser uma simples secagem de esporos ou secagem sob vrias condies, como, por exemplo, em secador com ou sem vcuo. Para tanto, emprega-se a seguinte linha de trabalho: Preparar o tubo para estocagem (pode ser de tampa rosquivel ou frascos de penicilina), enchendo-o at com gel (slica-gel purificada, sem indicador, 6-22 mesh), depois esterilizar no mnimo durante trs horas a 180C (calor seco), e colocar em atmosfera seca para seguir em banho de gelo overnight. Fazer uma suspenso de esporos em leite frio desnatado (5%). Derramar a suspenso fria sobre a slica gelada e depois levar para um banho de gelo, pelo menos durante quinze minutos. Deixar os gis temperatura ambiente (25 a 30C) dentro de dessecadores at que, com a agitao, os cristais sejam separados (cerca de uma a duas semanas ou dois a trs dias para fungos de crescimento rpido). Armazenar os tubos em dissecadores em sala fria ou recipientes com slica em geladeira (4C), embora bons resultados possam ser obtidos temperatura ambiente.

460 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Armazenamento em solo estril

A preservao de fungos em solo estril, pode ser feita de duas maneiras:


pela inoculao de uma suspenso de esporos; pela inoculao de esporos secos em solo seco ou em substrato

similar, com subseqente estocagem do material seco. O mtodo de estocagem em solo empregado consiste em inocular 5g de solo (20% de umidade e esterilizado pelo menos duas vezes a 121C por quinze minutos) com 1mL de suspenso de esporos em gua, com subsequente crescimento durante cerca de dez dias temperatura ambiente. O armazenamento dever ser feito de preferncia em refrigerador a 5C.
C. Liofilizao (freeze-drying)

A liofilizao, ou freeze-drying um dos mtodos mais econmicos e eficientes de preservao a longo prazo. O mtodo permite a produo de grande nmero de liofilizado porque o uso de ampolas pequenas facilitam a estocagem. Enquanto o procedimento da liofilizao relativamente simples, o aspecto terico bastante complexo, pois a liofilizao envolve a remoo de gua de uma suspenso de microrganismos congelados por sublimao sob presso reduzida, isto , a gua evaporada sem passar pela fase lquida (passagem do estado slido para o estado gasoso). As clulas secas podem ser estocadas por longo perodo, se mantidas longe de oxignio, umidade e luz. Elas podem a qualquer hora ser facilmente re-hidratadas e ativadas. A liofilizao pode ser realizada de vrias maneiras, pois vrios tipos de aparelhos foram desenvolvidos para este fim. No caso dos fungos, importante lembrar que o sucesso da liofilizao varia entre linhagens de mesma espcie; em geral, aqueles que crescem e

Micologia | 461

esporulam bem em cultura sobrevivem ao processo, enquanto que isolados em estado deteriorado ou debilitado no resistem liofilizao. Requisitos bsicos para liofilizao Meio de suspenso externo para congelamento (lcool metlico ou etlico + gelo seco). Gerador e mantenedor de vcuo (bomba). Absorvente do vapor de gua (dissecante - condensador - lquido refrigerante). Parmetros de liofilizao Tipo de clula; crescimento e idade da cultura; concentrao celular; meio de suspenso (crioprotetores); velocidade de resfriamento; mtodo de secagem; condio de estocagem; mtodo de constituio e mtodos de anlise (medidas de viabilidade, injria, morte e outros parmetros). Crioprotetores Materiais proteicos, carboidratos; aminocidos; leite desnatado e outros. Meios de suspenso: Leite desnatado 10%; leite desnatado 10% + inositol 5%. Sacarose 7% + peptona 7%; inositol 5% em soro de sangue de cavalo e outros. Mtodo de liofilizao: Pr-congelamento + vcuo (umidade residual 1% a 2%); Centrifugao + vcuo Secagem primria: umidade residual 5% a 10%. Secagem secundria: umidade residual 1% a 2%.

462 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Congelamento: A preservao das caractersticas de microrganismos armazenados em um freezer com faixa de temperatura de 0 a -20C produz resultados diversos, sendo que seu sucesso depende da espcie de fungo. Parmetro de congelamento: Escolha do tipo de refrigerador, escolha de ampolas e frascos, agentes crioprotetores, culturas e preparao de suspenso, velocidade de resfriamento, estocagem e velocidade de descongelamento. Pr-resfriamento para congelamento: Freezer (velocidade de resfriamento, vr = 1C/min.). Gelo seco (vr = 7C/min). Fase vapor de nitrognio (vr = 18oC/min). Congelamento direto: Fase lquida de nitrognio (vr = 200 C).
D. Armazenamento em nitrognio lquido

Utiliza-se o nitrognio lquido para se conseguir temperaturas ultrabaixas. Isso tem sido satisfatrio para grande nmero de clulas vivas. O mtodo apresenta certas desvantagens: a aparelhagem requerida mais cara que a usada para secagem ou congelamento; h necessidade de condies bem controladas de congelamento e degelo, e ainda h o risco de exploso de ampolas. Tambm um mtodo menos interessante que a secagem, quando se usa o armazenamento para distribuio de culturas. A estocagem a temperaturas ultrabaixas reduz as trocas fsicas e qumicas e um bom mtodo para ser usado quando as culturas so de difcil liofilizao.

Micologia | 463

Nos fungos, faz-se uma suspenso de esporos em glicerol 10% e alquotas de 0,5mL so distribudas em ampolas de vidro-borosilicato ou criotubos de 1mLe marcadas com o nmero da cultura usando tinta permanente. As ampolas so seladas com maarico (quando criotubos, as tampas so bem fechadas) e colocadas num banho com corante em refrigerador de 4 a 8C por trinta minutos para pr-resfriamento. Este procedimento permite que o glicerol penetre e envolva o organismo. O corante indica qualquer falha no selamento das ampolas ou criotubos, caso o contedo fique colorido. Tal procedimento seguido pelo congelamento das ampolas a -35C por quarenta a sessenta minutos, e as ampolas so ento colocadas no nitrognio lquido e congeladas rapidamente a -196C. A reativao feita colocando-se as ampolas rapidamente em banho de gua a 37C at os cristais de gelo derreterem. As ampolas ento so abertas e o contedo dispensado em meio de cultura adequado ao crescimento. Para se fazer o controle da viabilidade e pureza das culturas congeladas, a reativao deve ser feita aps trs a quatro dias de estocagem no nitrognio lquido.
E. Mtodo do papel de filtro (preservao de fungos entomopatognicos)

Procedimento: Tiras de papel de filtro previamente esterilizadas (estufa 105C por 24h), so distribudas sobre o meio BDA (batata dextrose gar), em placas de Petri, pouco antes de endurecer. Culturas fngicas so transferidas para estas placas e incubadas por oito dias (dependendo do isolado) a 28C. As tiras de papel apresentando estruturas fngicas so retiradas das placas e transferidas para placas de Petri, para ento serem mantidas em dessecador contendo slica gel, onde devero permanecer por 48 horas temperatura ambiente.

464 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Aps este perodo de incubao, as tiras so acondicionadas em saquinhos de papel-manteiga, previamente esterilizados, e armazenadas em dessecador temperatura ambiente.
F Mtodo da slica gel .

Procedimento: Preparar recipientes (vidrinhos com tampa ou tubos Eppendorfs) parcialmente cheios com slica gel (6 a 22 meshs) sem indicador, seca e esterilizada com calor seco (180C/90 min). Cultivar os isolados em meio de cultura at a fase de esporulao. Preparar suspenso de esporos em leite em p desnatado (10%), esterilizado e esfriado a 4C. Adicionar a suspenso de esporos slica, resfriada a 4C, sendo 0,5 mL da suspenso para 4 g de slica. Incubar a 4C por trinta minutos. Armazenar temperatura ambiente por duas semanas e depois vedar as tampas. Transferir para geladeira (4 C) para longo perodo de armazenamento.
6. Tcnicas utilizadas em Micologia mdica

O diagnstico laboratorial das infeces fngicas requer a coleta de amostras apropriadas e procedimentos laboratoriais adequados, segundo indicao clnica do paciente. A qualidade da amostra disponvel para anlise laboratorial de fundamental importncia. Coleta, estocagem e processamento de espcimes inadequados podem levar a um diagnstico errneo. Dependendo da micose do paciente, uma srie de materiais podem ser enviados ao laboratrio para exame, como relacionado no quadro a seguir.

Micologia | 465

Tipos de micose Superficiais e cutneas Subcutneas Sistmicas e oportunistas

Tipos de material usualmente enviado ao laboratrio para exame Pele, pelos, unhas, exsudatos Pus, tecidos (bipisas), exsudatos Escarro, pus, tecidos (bipsias), exsudatos lquor,materiais brnquicos, medula ssea, sangue, urina

6.1. Coleta e processamento de espcimes clnicos


6.1.1. Pele

A. Coleta Limpar com lcool etlico ou ter (Em alguns casos nenhuma antissepsia pode ser feita). Se a leso for mida, limpar com gua destilada ou soluo salina estril. Lmpada de Wood pode ser usada para orientar a coleta e o diagnstico. Raspar com lmina de bistur estril ou cureta dermatolgica a borda das leses, evitar colher o material do centro da leso. Colocar o material em placa de Petri entre duas lminas ou em envelope (estreis). B. Processamento Exame microscpico direto - KOH 10% ou NaOH 4%. Cultivo.

466 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Meios Semeadura Incubao Observao Identificao

Sabouraud-gar com cloranfenicol Mycosel gar (contm cicloheximida e cloranfenicol)* Semear trs a cinco escamas de pele em cada tubo Incubar temperatura ambiente Observar o crescimento de fungos por at trs semanas Identificar os fungos isolados em geral pela morfologia

6.1.2. Pelos

A. Coleta Com pina estril coletar o mximo de pelos afetados. A lmpada de Wood pode ajudar na seleo. Colocar em placa de Petri, entre duas lminas ou em envelope (estreis). Procurar sempre colher, por raspagem, amostra de pele onde se implantam os pelos afetados, mesmo se tiverem aparncia sadia. B. Processamento realizado da mesma maneira que para amostras de pele.

6.1.3. Unhas

A. Coleta Limpar com lcool etlico ou ter. Raspar com lmina de bisturi estril ou com tesoura cirrgica de ponta reta grande quantidade da parte lesada da unha. Desprezar as primeiras raspagens. Excelente para exame e cultivo a parte da unha aparentemente so na borda da leso ungueal. Raspar o material sob a unha, em caso de leso na parte proximal e periungueal.

Micologia | 467

Colocar o material em placa de Petri, entre duas lminas ou envelope (estreis). B. Processamento realizado da mesma maneira que para amostras de pele.
6.1.4. Escarro

A. Coleta Quantidade: 5 a 10 mL so suficientes. Coletar, de preferncia em jejum, o primeiro da manh, aps escovar os dentes e bochechar com soluo antissptica. Colher em recipiente estril. Processar at duas horas aps a coleta. B. Processamento Fluidificao e concentrao de escarro: Adicionar ao escarro 10 mL de soluo de citrato de sdio 0,10 mol/L e 0,10g de N-acetil L-cistena. Agitar bastante, centrifugar e desprezar o sobrenadante. Exame microscpico direto: KOH 10% ou NaOH 4%. Cultivo:
Meios Semeadura Incubao Observao Identificao Sabouraud-gar com cloranfenicol e Mycosel gar Espalhar o material em pelo menos dois tubos de cada meio Incubar temperatura ambiente e a 37C Observar o crescimento de fungos at quatro a seis semanas Identificar os fungos isolados*

* Em geral realizada atravs de observao ao microscpio das colnias isoladas, em preparaes com lactofenol-azul de algodo, cultivo em lminas, demonstrao de termotolerncia e demonstrao do dimorfismo entre outras tcnicas.

468 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

7.1.5. Pus

A. Coleta Colher assepticamente, de preferncia atravs de puno (nesse caso o procedimento realizado por um mdico). Colocar em recipiente estril ou processar imediatamente. Processar o mais rpido possvel, caso o processamento no tenha sido realizado no momento da coleta. B. Processamento Exame microscpico direto: KOH 10% ou NaOH 4%. Cultivo:
Meios Semeadura Incubao Observao Identificao Sabouraud-gar com cloranfenicol e Mycosel gar Pelo menos dois tubos de cada, se houver material suficiente. Caso contrrio, semear em quantos tubos forem possveis Incubar temperatura ambiente e a 37C Observar o crescimento de fungos at quatro semanas Identificar os fungos isolados

Observao: Caso se observe gros no pus, deve-se limpar a leso com salina estril, cobri-la com gaze estril e, comprimir a regio ao redor da leso, a fim de que os gros fiquem retidos na gaze. Se houver dificuldade de se obter material, deixar a gaze sobre a leso do paciente at o dia seguinte. Observamos este material ao microscpio estereoscpico pescando os gros, com auxilio de uma agulha ala de platina e, colocando-os em uma placa com salina estril para lav-los. Aps a lavagem, processar: 1. Exame direto: NaOH 4% ou KOH 10%. 2. Cultivo:

Micologia | 469

Gros actinomicticos Semear em Caldo Tioglicolato e Sabouraud sem antibitico. Gros eumicticos Semear em Sabouraud com cloranfenicol, observar de trs a quatro semanas e identificar os isolados.
6.1.6. Aspirado de medula ssea

A. Coleta O mdico deve coletar por puno. Colocar em frasco estril com heparina. Evitar heparina de reuso, pois esta deve ser rigorosamente estril. Nunca colher em frascos com EDTA, pois esta substncia se combina com elementos da parede do fungo, diminuindo a sensibilidade do exame. Processar at duas horas aps a coleta. B. Processamento Exame direto geralmente no realizado. Mas se necessrio, corar lminas com Giemsa ou Gram. Cultivo:
Meios Sabouraud-gar com cloranfenicol Mycosel gar BHI gar (se possvel com sangue de carneiro 5%) Incubar temperatura ambiente e a 37C Observar o crescimento de fungos at seis semanas Identificar os fungos isolados

Incubao Observao Identificao

470 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

6.1.7. Tecidos (bipsia)

A. Coleta O procedimento de coleta realizado pelo mdico Colocar, preferencialmente em tubo estril, contendo 2 a 3 mL de soro fisiolgico tambm estril. Na ausncia de frascos estreis com salina, colocar entre duas gazes estreis umedecidas com soro fisiolgico, acondicionando em recipiente estril para transporte. Processar rapidamente, no mximo em duas a quatro horas. B. Processamento Pinando firmemente o tecido, cortar pequenos fragmentos e em seguida macerar (em gral, homogeneizador ou com tesoura cirrgica estril). Exame microscpico direto: KOH 10% ou NaOH 4%. Cultivo:
Meios Incubao Observao Identificao Sabouraud-gar com cloranfenicol e Mycosel gar Incubar temperatura ambiente e a 37C Observar o crescimento de fungos at quatro semanas Identificar os fungos isolados

* Para isolar Zigomicetos (Mucor, Rhizopus, Absidia etc) usar o meio: Po umedecido esterilizado em tubo ou placa. Acrescentar cloranfenicol na concentrao de 300mg/l no processamento. Fragmento de tecido deve ser cortado com bisturi em pequenos pedaos com cuidado, evitando a macerao. 6.1.8. Lquor A. Coleta (sempre realizada por um mdico). Quantidade ideal: 1,0 mL em tubo estril (s vezes vm menos material).

Micologia | 471

Processar rapidamente; Se for preciso conservar: guardar sob refrigerao (4C). Observao: Cryptococcus tolera bem a refrigerao. B. Processamento Centrifugar o lquor; Exame microscpio direto do sedimento com tinta nanquim (OBRIGATRIO) e esfregaos corados com Gram e Giemsa (caso necessrio). Cultivo:
Meios Semeadura Incubao Observao Identificao Sabouraud-gar com cloranfenicol e BHI - NUNCA Mycosel Semear o sedimento em pelo menos dois tubos de cada meio Incubar temperatura ambiente e a 37C Observar o crescimento de fungos at quatro a seis semanas Identificar todos os fungos isolados

6.1.9. Exsudatos (Pleura, pericrdio, peritnio, articulaes, etc)

A. Coleta Colher em tubo estril com heparina estril. O ideal j ter heparina na seringa. Processar rapidamente. B. Processamento Centrifugar e desprezar o sobrenadante. Exame microscpico direto do sedimento com KOH 10% ou NaOH 4% e tinta nanquim. Cultivo: realizado da mesma forma que escarro (item 6.1.4 deste captulo)

472 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

6.1.10. Material brnquico (aspirado, escovado, lavado e outros)

A Colheita (sempre realizada pelo mdico do paciente) Colher em frasco estril. B. Processamento Centrifugar e desprezar o sobrenadante. Realizar exame microscpico do sedimento com KOH 10% e tinta nanquim. Cultivo do sedimento damesma forma que para amostra de escarro.
6.1.11. Urina

A. Coleta Quantidade 25 a 50 mL em frasco estril; Recomendar: Primeira urina da manh. Cuidados de higiene local. Desprezar o primeiro jato. Processar no mximo em duas a quatro horas. Conservar sob refrigerao (4C), excepcionalmente. B. Processamento Exame microscpico direto do sedimento com KOH 10% ou NaOH 4% e tinta nanquim. Cultivo:
Meios Semeadura Incubao Observao Identificao Sabouraud-gar com cloranfenicol e Mycosel gar Semear o sedimento em pelo menos dois tubos de cada meio de cultura Incubar temperatura ambiente e a 37C Observar o crescimento de fungos at seis semanas Identificar os fungos isolados*

Micologia | 473

Nota: Para investigao da etiologia fngica, recomenda-se coleta de uma amostra matinal diria, por trs dias consecutivos. * A ANVISA tambm recomenda que seja realizada cultura quantitativa da urina para contagem de unidades formadoras de colnia, atravs da semeadura da urina no centrifugada em uma placa de Sabouraud gar com ala calibrada.
6.1.12 Sangue (para hemocultura)

A. Coleta Fazer assepsia local com lcool iodado. Quantidade: 4 a 5 mL de sangue (utilizando escalpe e seringa descartvel). Colocar diretamente em frasco de hemocultura contendo meio de BHI lquido ou liquoid. Manter o frasco (j inoculado) em temperatura ambiente, invertido em estantes apropriadas. Processar em 48 horas aps a colheita; dez dias aps a primeira semeadura e dez dias aps a segunda semeadura. Se forem utilizados frascos de sistemas automatizados, seguir instrues do fabricante. B. Processamento Exame direto em geral no realizado, se necessrio, corar lminas pelo Gram ou Giemsa. Cultivo:
Meios Semeadura Observao Incubao Identificao BHI gar com cloranfenicol Retirar o hemocultivo (com seringa descartvel) e inocular cerca de 1 mL em cada tubo de cultura, espalhando o sangue por toda superfcie do meio Observar as subculturas (tubos) por at seis semanas Incubar temperatura ambiente e observar de quatro a seis semanas Identificar todos os fungos isolados

474 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

6.2. Coleta de sangue: separao, conservao e estocagem do soro

Cerca de 10 mL de sangue devero ser colhidos atravs de puno venosa, em tubo de ensaio estril sem adio de anticoagulantes. O soro separado aps retrao do cogulo, segundo os preceitos tcnicos, a fim de evitar hemlise. Adicionar ao soro, mertiolato na concentrao final de 1:10.000, a partir de soluo estoque 1:100. Distribuir em alquotas de 1 mL em pequenos tubos e ensaio ou frascos, identific-los corretamente e armazenar em congelador at o momento do uso ou envio ao laboratrio de referncia.
6.3. Preparo e padronizao dos antgenos utilizados nas provas sorolgicas e reaes intradrmicas
6.3.1. Polissacride de Paracoccidioides brasiliensis

O antgeno obtido a partir de clulas de Paracoccidioides brasiliensis em sua fase leveduriforme, segundo tcnica de FAVA NETTO, de natureza qumica quase que exclusivamente polissacardica. O antgeno utilizado nas reaes de fixao de complemento, precipitao em meio lquido e nas provas intradrmicas de leitura tardia.
a) Preparar o meio de cultura - Fava Netto; b) No preparo do antgeno, utilizar no mnimo trs amostras diferentes de

P brasiliensis, que so mantidas em sua forma leveduriforme em estufa a . 35C , no meio acima descrito e, com repiques a cada vinte dias.
c) Preparar suspenso em soluo fisiolgica estril das clulas

leveduriformes do fungo.

Micologia | 475

d) Com auxlio de pipeta estril, espalhar a suspenso sobre a superfcie

do meio de cultura contido em garrafas de Roux.


e) Incubar a 35C durante vinte dias. f) Decorrido o prazo estipulado, colher as clulas do fungo, com auxlio

de esptula e fazer suspenso em soluo tampo Veronal, contida em frascos apropriados para centrifugao.
g) Homogeneizar a suspenso com auxlio de basto de vidro e centrifugar

a 2.000 rpm durante dez minutos.


h) Desprezar o sobrenadante ( conveniente, antes, autoclavar o

sobrenadante, pois ele pode conter clulas viveis, ou adicionar formalina).


i) Fazer suspenso do sedimento em aproximadamente cinco volumes de

acetona. Homogeneizar a suspenso com auxlio de basto de vidro (estril).


j) Centrifugar a 2.000 rpm durante dez minutos. Desprezar o

sobrenadante.
k) Repetir as operaes i e j por mais duas vezes. l) Repetir as operaes i, j e k, com ter sulfrico. m) Anotar o volume do sedimento e deix-lo em frasco aberto em

geladeira at o dia seguinte, quando as clulas estaro secas.


n) Fazer suspenso a 15% em soluo tampo veronal, levando em

considerao o volume das clulas anotado no item m.


o) Autoclavar a suspenso a 115C durante quinze minutos.

476 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

p) Centrifugar a 2.000 rpm, durante trinta minutos, tendo o cuidado

em manter condies de esterilidade.


q) Deixar o frasco em geladeira at o dia seguinte. r) Repetir a operao p. s) Separar cuidadosamente o sobrenadante e adicionar mertiolato na

concentrao final de 1:10.000.


t) Distribuir o antgeno em alquotas de 1 a 5ml, em frascos ou tubos

estreis. Identificar e datar.


u) Realizar controle de esterilidade. v) A estabilidade do antgeno superior a dois anos, quando esto-

cado a 4C. A padronizao do antgeno polissacardico para emprego na reao de fixao de complemento se faz atravs da titulao desse antgeno ante o soro de paciente portador de paracoccidioidomicose e, que reconhecidamente seja positivo em tal reao diante do antgeno padro. Nas reaes intradrmicas, o antgeno deve ser padronizado em pacientes portadores de paracoccidioidomicose, ou em animais experimentalmente infectados. Atravs da utilizao de antgeno padro, chega-se diluio tima que dever ser utilizada para o novo antgeno. Fava Netto, atravs de sua experincia pessoal, verificou que a diluio do antgeno a ser utilizado nas provas intradrmicas corresponde a 1/10 daquela que representa a dose tima de antgeno para fixar unidades de complemento 50% de hemlise, na prova de fixao de complemento. Geralmente a diluio tima do antgeno para utilizao nas reaes intradrmicas est em torno de 1:10.

Micologia | 477

6.3.2. Filtrado de cultura de Paracoccidioides brasiliensis

O antgeno obtido por essa tcnica, constitui-se em excelente reagente para ser utilizado nas reaes de fixao do complemento e precipitao em gel. Sua natureza qumica glicoproteica.
Preparar o meio de cultura - Negroni (item 4.1 deste captulo) Inocular os frascos com pelo menos trs amostras diferentes de P.

brasiliensis, a partir de cultivos mantidos a 35C.


Incubar a 35C durante quatro semanas sob agitao constante.

Observao: Se no houver disponibilidade de manter os cultivos sob agitao constante, os mesmos podero ser mantidos estticos a 35C durante 12 semanas.
Decorrido o tempo de cultivo, adicionar mertiolato na concentrao

final de 1:10.000, agitar e incubar a 35C durante uma semana.


Realizar controle de esterilidade. Filtrar as culturas em papel de filtro. Colocar o filtrado em placas de Petri limpas e deixar em estufa a

37C, at que o volume seja reduzido a 1/20 do volume original, ou utilizar polietilenoglicol (concentrando vinte vezes).
Centrifugar a 2.500 rpm por trinta minutos. Distribuir o filtrado, que constitui o antgeno em alquotas de 1 a 5 mL

em frascos tipo penicilina, identificar, datar e estocar a 4C.


6.3.3. Filtrado de cultura de Histoplasma capsulatum (HISTOPLASMINA)

Preparar o meio de cultura - Smith-Asparagina (item 4.1 deste captulo). Semear de trs a cinco amostras diferentes de Histoplasma capsulatum

nos bales contendo o meio de cultura.

478 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Deixar as culturas temperatura ambiente e no escuro, durante quatro

a seis semanas, sob agitao.


Decorrido o prazo estabelecido, adicionar mertiolato na concentrao

final de 1:10.000. Agitar para submergir os filamentos e deixar temperatura ambiente durante uma semana.
Realizar controle de esterilidade. Filtrar em papel de filtro. Dependendo do emprego da histoplasmina, temos dois caminhos a

seguir:
Utilizao em reaes sorolgicas (Reaes de fixao de com-

plemento e precipitao em gel de gar)


Colocar o antgeno em placas de Petri limpas, deixar a 37C

at que o volume seja reduzido para 1/20 do volume original.


Centrifugar a 2.500 rpm durante trinta minutos. Distribuir o antgeno em frascos tipo penicilina. Identificar, datar e conservar a 4C. Para padronizao nas provas sorolgicas, consultar o item

6.5 deste captulo.


Utilizao em provas intradrmicas Aps filtrar em papel de filtro a histoplasmina filtrada em

membrana esterilizante (poro de 0,22 mm).


Distribuir em frascos tipo penicilina e estocar a 4C. Realizar controle de esterilidade.

Micologia | 479

A histoplasmina a ser utilizada nas reaes intradrmicas

geralmente diluda a 1:1000, em soluo fisiolgica estril. Devero ser realizadas provas em indivduos sensveis ao antgeno, ou animais previamente sensibilizados, diante de H. capsulatum, utilizando-se histoplasmina padro para fins de comparao.
6.3.4. Filtrado de cultura de Aspergillus fumigatus

Cultivar A. fumigatus (mnimo de trs amostras diferentes) em

caldo Sabouraud por quatro semanas temperatura ambiente.


Decorrido o prazo estipulado, adicionar mertiolato na concentrao

final de 1:5.000. Agitar para submergir os filamentos.


Deixar as culturas temperatura ambiente durante uma semana. Realizar controle de esterilidade. Filtrar em papel de filtro. Colocar o filtrado em placas de Petri limpas e deixar em estufa a

37C, at que o volume seja reduzido para 1/20 do volume original, ou utilizar polietilenoglicol para concentrar.
Centrifugar a 2.500 rpm durante trinta minutos. Distribuir o antgeno em alquotas de 1-5 mL, em frascos tipo

penicilina., Identificar, datar e conservar a 4C. O filtrado de cultura de A. fumigatus utilizado nas reaes de fixao de complemento e precipitao em gel de gar. conveniente preparar pela mesma tcnica, filtrados de culturas de A. flavus, A. terreus e A. niger. Para a padronizao do antgeno, consultar o item 6.5 deste captulo.

480 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

6.5. Tcnicas de padronizao dos antgenos utilizados nas provas sorolgicas


a) Reao de fixao de complemento

Os antgenos utilizados nas reaes de fixao de complemento so padronizados atravs da titulao cruzada perante soro positivo para o antgeno em estudo. Utiliza-se, para tal propsito, antgeno padronizado com finalidades de controle da reao. A diluio tima do antgeno no dever demonstrar atividade anticomplementar.
b) Imunodifuso dupla de Ouchterlony

So feitas diluies do antgeno (1:2, 1:4, 1:8 etc), as quais so colocadas para difundir no gel, contra soro reconhecidamente positivo para o antgeno em questo. Decorrido o tempo necessrio para formao dos precipitados, procede-se leitura da reao. O ttulo do antgeno ser aquele correspondente sua mais alta diluio que se d positividade ntida com o soro e o mesmo nmero de bandas de precipitao, quando comparado ao antgeno padro.
6.6. Tcnica de imunodifuso radial dupla em gel de gar (Ouchterlony)
REAGENTES

Reagente 1 gar noble ...............0,5 g gua destilada..........100 mL (Estocar em erlermayer a 4 C)

Micologia | 481

Reagente 2 gar noble ...............1,0 g Azida sdica .............0,1 g PBS 7.2 ................100 mL *Aquecer em banho-maria at o gar dissolver * Colocar 3,5 mL em tubo de ensaio e estocar a 4 C Reagente 3 PBS (Tampo fosfato 0,01 mol/L , NaCl 0,15 mol/L) pH 7.2-7.4 Soluo A: NaH2PO4 0,2 M (Fosfato de sdio monobsico) Soluo B: Na2HPO4 0,2 M (Fosfato de sdio dibsico) *Tampo fosfato 0,01mol/L Adicionar 280 mL da soluo A a 720 mL da soluo B PBS: 50 mL do tampo fosfato + 50 mL de NaCl 3 mol/L. Completar para 1000 mL com gua destilada. Reagente 4 Citrato de sdio 5 g ................100 mL de gua destilada

482 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Reagente 5 SOLUO CORANTE Coomassie brilliant blue ..............0,5 g cido actico .........................10 mL Etanol ...................................45 mL gua destilada ........................45 mL Reagente 6 SOLUO DESCORANTE Metanol ...............................400 mL cido actico .........................100 mL gua destilada ........................500 mL 1 Etapa (filmagem das lminas):
Mergulhar as lminas de microscia, devidamente limpas, no reagente

1; com auxlio de uma pina, retir-las em seguida, deixando o tempo suficiente para umedec-las.
Sec-las em estufa de aproximadamente 60C. Aps a secagem, estoc-las em caixas para posterior utilizao.

2 Etapa:
Utilizando uma mesa nivelada, colocar a lmina previamente filma-

da com o reagente 1.

Micologia | 483

Colocar em banho-maria os tubos com 3,5 mL de gar (reagente

2) estocados, esperar liquifazer.


Verter sobre a lmina o reagente 2 liquefeito, deixando solidificar

por cinco minutos.


Coloc-las em cmara mida na geladeira.

Observao: Pode permanecer em geladeira na cmara mida at sete dias (margem de segurana).
Aps dez minutos em geladeira, a lmina j pode ser perfurada

segundo esquema a seguir.

3 Etapa
Colocar o soro - 10 mL em cada orifcio - respeitando o esquema

acima. Nas extremidades superiores e inferiores adicionar soro padro. Nos poos 1, 2, 3 e 4, adicionar os soros a serem testados.
Aps a colocao dos soros, aguardar uma hora para adicionar os

antgenos nos orifcios centrais. 4 Etapa


Difuso em estufa a 37C ou temperatura ambiente, por 48

horas.

484 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

5 Etapa
Iniciar os banhos Colocar as lminas (aps 48 horas) em uma

cuba e verter sobre elas citrato de sdio 5 % (reagente 4) por duas horas, com objetivo de retirar precipitados inespecficos.
Aps o banho de citrato Adicionar soluo salina 0,9 % por

48 horas, trocando vrias vezes. 6 Etapa


Usando o papel de filtro (umedec-lo previamente em gua desti-

lada), embrulhar as lminas e coloc-las em estufa de secagem a 60 C, at atingir completa secagem.


Mergulhar as lminas em gua destilada, e retirar o papel cuidado-

samente. Lavar em gua corrente para retirar resduos de papel de filtro e sec-las em estufa. 7 etapa
Corar por dez minutos utilizando o reagente 5. Colocar em cuba de colorao vrias lminas e verter o corante.

Aps dez minutos, retirar as lminas e estocar novamente o corante ( possvel reaproveit-lo). Periodicamente deve-se filtr-lo novamente. 8 Etapa
Aps o processo de colorao, retirar o excesso de corante com

soluo descorante (reagente 6) at que as linhas de precipitao fiquem bem ntidas. Observao: Se descorar muito ou totalmente pode corar novamente.

Micologia | 485

9 Etapa
Leitura: considera-se reao positiva (soro reagente) quando hou-

ver a presena de linhas de precipitao apresentando identidade total com o soro padro. Exemplo:

6.7. Identificao de leveduras de importncia clnica

As leveduras so um grupo de fungos heterogneos que superficialmente aparentam ser homogneas. A identificao desses fungos baseada nas caractersticas morfofisiolgicas e bioqumicas. A morfologia primariamente usada para estabelecer o gnero, entretanto, as provas bioqumicas (Teste de reduo do nitrato e hidrolise da ureia), e de assimilao e fermentao de acares so usadas para diferenciar vrias espcies.
6.7.1. Provas morfolgicas

Dentre as provas morfolgicas disponveis para identificar espcies do gnero Candida temos a tcnica de Dalmau e o tubo germinativo. A tcnica de Dalmau baseada no fato de que C. albicans, quando cultivada em meio de cultura pobre em nutrientes, como o gar arroz ou gar fub, produz uma estrutura de resistncia denominada clamidocondio. Dentre todas as espcies do gnero Candida, somente C. albicans e C. dubliniensis so capazes de formar clamidocondios, sendo que esta ltima forma clamidocondios em cachos, apresentando trs ou mais clamidocondios por hifa. Alm disso, esta uma espcie rara e altamente relacionada a C. albicans.

486 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

O teste do tubo germinativo baseia-se no fato de que C. albicans, quando incubada a 37C por duas a trs horas, em soro bovino ou de coelho, forma, a partir de suas leveduras, uma estrutura denominada tubo germinativo que dar origem s hifas e pseudo-hifas caractersticas desta espcie. Teste do tubo germinativo
Rotular os tubos testes com o nmero da amostra. Usando uma pipeta, dispensar 0,5 mL de soro bovino ou de

coelho em cada tubo.


Com uma ala flambada, tocar levemente a colnia de levedura e

coloc-la no soro dentro do tubo.


Agitar para homogeneizar as clulas leveduriformes no soro. Incu-

bar os tubos a 37C por duas a trs horas.


Aps a incubao, colocar uma gota da suspenso numa lmina de

microscopia lisa e cortada e cobrir a preparao com uma lamnula.


Examinar ao microscpio para detectar a presena ou ausncia de

tubo germinativo nas clulas da levedura estudada. Teste de Dalmau


Usar uma placa de Petri com corn meal gar adicionado de 1%

Tween 80.
Com um bisturi estril, fazer um sulco no meio de cultura, aproxi-

madamente 1 cm esquerda do meio da placa.


Com auxlio de uma ala de platina esterilizada, retirar uma peque-

na quantidade da cultura leveduriforme em estudo e semear no sul-

Micologia | 487

co. Fazer trs furos no meio de cultivo com a mesma ala direita do sulco, formando um pequeno tringulo.
Colocar uma lamnula (24 mm x 24 mm) estril sobre o meio de

cultura, cobrindo o sulco e sobre os furos.


Incubar a temperatura ambiente por 72 horas. Observar no microscpio ptico, em objetiva de 10X, a presen-

a ou ausncia de clamidocondios, diariamente at completar cinco dias.

6.7.2. Provas de assimilao

Para estudo de assimilao de fontes de carbono por leveduras podem ser utilizados meios cromognicos, bem como kits comerciais de identificao.
Meio CHROMagar Candida

O meio cromognico CRHOMagar Cndida para diferenciao de Candida albicans, C. krusei e C. tropicalis e outras espcies permite a identificao do microrganismo de acordo com a colorao que este apresenta no meio semeado. A interpretao dos resultados feita com base na cor e no aspecto tpico das colnias, conforme apresenta a tabela a seguir:
Cor e aspecto tpico da colnia Verde Azul-metlico Rosa, rugosa Branco violeta Microrganismo pr-identificado

Candida albicans Candida tropicalis Candida krusei


Outras espcies

488 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Galeria API 20C Aux

A galeria API 20 C AUX engloba vinte cpulas que contm substratos desidratados para efetuar 19 testes de assimilao. As cpulas so inoculadas com um meio mnimo semigelosado e as leveduras crescem apenas se forem capazes de utilizar o substrato correspondente. A leitura dessas reaes faz-se por comparao com os controles de crescimento (presena ou ausncia de turvao) e a identificao possvel consultando o catlogo analtico ou um sistema de identificao disponvel na internet (Api Web).
Mtodo Vitek YBC (Carto de Bioqumica para levedura)

O carto YBC contm 30 poos. Destes 30, 26 contm caldos bioqumicos e quatro contm caldos de controle negativo. O carto necessita de 24 horas, e em alguns casos de 48 horas, de incubao a 30C em uma estufa e, em seguida, de uma nica leitura depois de decorridas 24 horas, e em alguns casos de uma segunda leitura depois de 48 horas, no leitor/incubadora VITEK para uma anlise dos dados. O carto baseia-se nos mtodos bioqumicos estabelecidos de Wickerham e Burton. Estes testes incluem a assimilao de hidratos de carbono, hidrlise da ureia, resistncia a ciclo-heximida e reduo de nitrato, que foram adaptados para serem utilizados no sistema VITEK.
6.8. Testes de sensibilidade aos antifngicos

Entre os testes preconizados para detectar resistncia a antifgicos, apenas alguns deles foram at agora suficientemante avaliados em estudos amplos e bem conduzidos, a fim de comprovar boa reprodutibilidade intra e interlaboratorial, alm de correlao com a evoluo clinica dos pacientes. Os mais conhecidos e difundidos so os do National Commitee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), denominado, desde 2005, Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), publicado a partir de 1985, sob a forma de

Micologia | 489

documento. No Brasil, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA) adquiriu os direitos autorais para a lngua portuguesa dos documentos CLSI/ NCCLSI M27- A3 e M38-A e tornou-os disponveis atravs do site: http:/ www.anvisa.gov.br M27-A3. Mtodo de Referncia para Testes de Diluio em Caldo para a Determinao da Sensibilidade de Leveduras; Terapia Antifngica Norma Aprovada - Terceira edio do NCCLS:D e s creve a metodologia de um teste de sensibilidade aos agentes antimicrobianos das leveduras que causam infeces fngicas invasivas, incluindo as espcies de Candida e Cryptococcus neoformans. O M27-A3 o mtodo mais bem estudado e o documento pertinente contm tcnicas de diluio em meio liquido, macrodiluio em tubos de ensaios e microdiluio em placas de micro titulao, para determinar a CIM. As leveduras so testadas ante as drogas (anfotericina B, 5-fluorocitosina e azlicos, incluindo cetoconazol, fluconazol, itraconazol, voriconazol, alm de posaconazol e ravuconazol). O meio usado o RPMI-1640 lquido, inculo inicial de 1 a 5 x 106 cel/mL, ajustando em espectrofotmetro a 530 nm, incubao a 35 C. Utilizam-se cepas-controle ATCC em todos os testes realizados. M38-A. Mtodo de Referncia para Testes de Diluio em Caldo para Determinao da Sensibilidade Terapia Antifngica de Fungos Filamentosos; Norma Aprovada do NCCLS. Descreve um mtodo para testar a sensibilidade dos fungos filamentosos que causam infeces invasivas, incluindo espcies de Aspergillus, espcies de Fusarium, Rhizopus arrhizus, Pseudallescheria boydii (Scedosporium apiospermum) e Sporothrix schenckii, assim como outros fungos patognicos oportunistas, aos agentes antifngicos. O

490 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

meio de cultura recomendado mesmo indicado no documento M27-A2 e o inculo deve ser ajustado, com auxilio de espectrofotmetro, para conter 0,4 x 104 a 5 x 104 UFC/mL. Entretanto, a densidade ptica (DO) a 530 nm, requerida no ensaio, depende do tamanho do condio ou esporangiosporos do fungo em estudo. H necessidade de adio de Tween 20, como agente surfactante, para preparar inculo de Aspergillus spp. M44-A. esse mtodo descreve uma prova sensvel e prtica, validada para teste de sensibilidade em Candida spp.; utilizando discos impregnados com fluconazol ou com voriconazol. Este mtodo ainda no foi validado para provas com outros gneros de leveduras e recentemente foi proposto um novo mtodo para uso com fungos filamentosos. O documento inclui critrio de interpretao para os dimetros de halos obtidos com discos de fluconazol e valores esperados para cepas padro. EUCAST. ensaio recomendado para avaliao da atividade antifngica de substncias puras pela tcnica da microdiluio em caldo, pela organizao europia Antifungal Susceptibility Testing Subcommit-tee of the European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (AFSTEUCAST), baseado nos procedimentos da referncia CLSI M27A2, mas com algumas modificaes, a fim de se obter maior exatido na determinao dos valores de CIM. Estudos tm confirmado que a modificao do documento CLSI M27-A2, com a suplementao do meio RPMI 1640 e com 2% de glicose no meio de cultura, tornou a metodologia mais vantajosa. Isso se deu devido a reduo do tempo de incubao necessrio (24 horas) para se obter um crescimento suficiente para a determinao dos valores de CIM.

Micologia | 491

Sistemas comerciais: Existem vrios sistemas comerciais para realizar testes de sensibilidade aos antifgicos, incluindo, entre outros, Asty, Atb Fungus 3, Candifast, E-Test, Fungitest, Integral Systems Yest, Mycototal E Sensitrite Yeast One. Apenas o E-Test, o Atb Fungus 3 e o Candifast tm distribuidores no Brasil.

492 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Resumo do captulo

Os fungos so organismos que convivem conosco todos os dias. So importantes, tanto do ponto de vista ecolgico, quanto econmico. A Micologia a rea da Biologia destinada ao estudo dos fungos, que teve o seu grupo reconhecido como um reino a partir da descrio de cinco reinos por Whittaker, em 1969. Os organismos foram alocados em reinos com base na morfologia e no modo de nutrio dos seres vivos, sendo criado, ento, o reino Fungi. Todos os fungos conhecidos, com poucas excees, tm origem dos esporos (reproduo sexuada) ou condios (reproduo assexuada), corpsculos que podem ser comparados s sementes das plantas superiores, embora no sejam morfologicamente semelhantes a estas. Na maioria dos casos, o sistema vegetativo encontra-se no interior dos tecidos parasitados, no solo ou na matria orgnica em decomposio. Com a formao dos esporos ou condios, necessrio que estes tenham acesso livre ao ar, para assegurar sua disseminao. O ciclo de vida dos fungos compreende duas fases. Uma somtica, caracterizada por atividades alimentares, e outra reprodutiva, onde os fungos podem realizar reproduo sexuada ou assexuada. Por causa da rigidez da parede celular, sua nutrio por absoro de nutrientes solveis simples. Os fungos so considerados seres cosmopolitas, pois esto presentes em qualquer parte do planeta. A temperatura ideal para o crescimento dos fungos fica entre 0 a 350C, mas o timo para a maioria fica entre 20 a 300C, e a umidade ideal fica em torno da saturao. Os fungos so usados como alimento propriamente dito; na indstria alimentcia, na produo de pes, queijos, cervejas e vinhos; na indstria farmacutica e biotecnolgica, para a fabricao de antibiticos, cidos, pigmentos, enzimas, pesticidas biolgicos, entre outros usos.
Os fungos podem parasitar o homem e outros animais, causando

um grupo de doenas conhecidas como micoses.

Micologia | 493

As micoses podem ser classificadas em cinco grupos, de acordo

com suas manifestaes clnicas.


As micoses superficiais so infeces causadas por fungos que

invadem as camadas mais superficiais da capa crnea da pele ou a haste livre dos pelos.
As micoses cutneas se caracterizam por serem causadas por fungos

que invadem toda a espessura da capa crnea da pele, a parte queratinizada intrafolicular dos pelos ou a lmina ungueal.
As micoses subcutneas se caracterizam por resultar da inoculao

de um fungo patognico por ocasio de um traumatismo, em geral cortes por plantas ou pela manipulao do solo, manifestando-se como tumefao ou leso supurada da pele ou do tecido subcutneo, produto da disseminao do fungo por contiguidade ou por via linftica.
As micoses sistmicas so caracterizadas por serem adquiridas atra-

vs de inalao de propgulos fngicos, causando, consequentemente a leso primria pulmonar. Desta forma, o fungo pode se disseminar pelo corpo atravs da corrente sangunea, originando leses extrapulmonares nos pacientes.
As micoses oportunsticas so causadas por fungos termotolerantes

de baixa virulncia que determinam doenas em hospedeiros com graves deficincias do sistema imunolgico.
O diagnstico das micoses realizado atravs da visualizao do

fungo nos espcimes clnicos (exame microscpico direto) e do seu cultivo em meios adequados. Provas imunolgicas podem auxiliar no diagnstico, fornecendo resultado presuntivo das infecces.

494 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Questes

1) Cite as tcnicas mais importantes para o isolamento de fungos de solo e de ar. 2) Em que situaes podemos usar a tcnica de diluio seriada? 3) Paciente portador do HIV fazendo uso de corticosteroides e que teve tuberculose pulmonar h trs anos apresenta imagens radiolgicas de trax sugestivas de bola fngica. Foi colhida uma amostra de escarro, a qual foi processada adequadamente. O exame microscpico direto apresentou hifas septadas e hialinas, ramificadas dicotomicamente. No cultivo, houve crescimento de uma colnia esverdeada, a qual, quando corada pelo lactofenol azul de algodo, apresentou conidiforo com vescula alongada e filides distribudas a partir da metade da vescula, dando origem a longas cadeias de condios globosos e equinulados. Com base nisso, responda: a) Explique como deve ser realizado o processamento do espcime clnico em questo, antes que sejam realizados o exame direto e o cultivo do material. b) Qual o agente etiolgico desta micose? c) Que testes imunolgicos poderiam ser aplicados doena que o paciente possui? d) Uma pessoa saudvel, sem uso de medicamentos, poderia adquirir esta infeco? Comente.

Micologia | 495

Referncias Bibliogrficas
ALEXOPOULOS, C. J. ; MIMS, C. W. ; BLACKWELL, M. Introductory Mycology. New York: John Wiley & Sons, Inc., 1996. ALMEIDA-PAES, R. et al. Immunoglobulins G, M, and A against Sporothrix schenckii exoantigens in patients with sporotrichosis before and during treatment with itraconazole. Clinical and Vaccine Immunology. v. 14, n. 9, p. 1149-1157, 2007. ALVES, S. B. Fungos entomopatognicos. In. Alves, S.B. Controle Microbiano de insetos. Piracicaba: FEALQ, 1998. ATTLI, S. D. Importncia e sistemtica de fungos filamentosos. Campinas: Fundao Tropical de PesquisaTecnolgia Andr Tosello, 1990. CRESPO-ERCHIGA, V. ; GMEZ-MOYANO, E. ; CRESPO, M. La pitiriasis versicolor y las levaduras del gnero Malassezia. Actas Dermo-Sifilogrficas. v. 99, n. 10, p. 764-771, 2008. CRUZ, L. C. H. Micologia Veterinria. Itagua: Imprensa Universitria, 1985. HAMILTON, A. J. Serodiagnosis of histoplasmosis, paracoccidioidomycosis and penicilliosis marneffei: current status and future trends. Medical Mycology. v. 36, n. 6, p. 351-364, 1998. HIBBETT, D. S. et al. A higher-level phylogenetic classification of the Fungi. Mycological Research. Londres, v.111, 2007. KIRK, P M. et al. (eds). Ainsworth &Bisbys Dictionary of the Fungi. 9. ed. Wallingford: . CABI Publishing, 2001. LATG, J. P Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Riews. v. 12, . n. 2, p. 310-350, 1999. LAZRA, M. S. et al. Criptococose. In: Coura, J.R. Dinmica das doenas infecciosas e parasitrias. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005. LOPES-BEZERRA, L. M. ; SCHUBACH, A. O. ; COSTA, R. O. Sporothrix schenckii and sporotrichosis. Anais da Academia Brasileira de Cincias. v. 78, n. 2, p. 293-308, 2006. MOORE-LANDECKER, E. Fundamentals of the Fungi. 4. ed., New Jersey: PrenticeHall, Inc., 1996. PUTZKE, J. ; PUTZKE, M. T. L. Os Reinos dos Fungos. Vol. I. Santa Cruz do Sul: EDUNISC, 1998. RIPPON, J. Medical Mycology: The pathogenic fungus and the pathogenic actinomycetes . Philadelphia: WB Saunders, 1988.

496 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

SILVEIRA, V. D. Micologia. 5. ed., Rio de Janeiro: mbito Cultural Edies Ltda., 1995. VALLE, A. C. F. et al. Micoses superficiais e cutneas. In: COURA, J. R. Dinmica das doenas infecciosas e parasitrias. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005. WANKE, B. et al. Investigation of an outbreak of endemic coccidioidomycosis in Brazils Northeastern State of Piau with a review of the occurrence and distribution of Coccidioides immitis in three other Brazilian states. Mycopathologia. v. 148, n. 2, p. 57-67, 1999. WEITZMAN, I; SUMMERBELL, R. C. The dermatophytes. Clinical Microbiology Reviews. v. 8, n. 2, p. 240-259, 1995. ZANCOP-OLIVEIRA, R. M. ; MUNIZ, M. M. ; WANKE, B. Histoplasmose. In: Coura, J.R. Dinmica das doenas infecciosas e parasitrias . Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005.