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Universidade Federal de Viosa Campus de Rio Paranaba CBI 240 - Gentica

Jairo de Carvalho Filho - 292

Teoria da Totipotencialidade - Schleiden e Schwann (1839) - O que postulava essa teoria ???? Fisiologista vegetal alemo Haberlandt (1902) - Idia de cultivar celular isoladas - Materializar a teoria de Schleiden e Schwan - Muitos desafios para a poca...

Descobrir como uma clula madura e diferenciada, voltar ao estgio embrionrio.

Professor Steward e colaboradores (1958) - Obteno de embrio de plantas a partir de clulas maduras - Embriognese Somtica - CCI de raiz de cenoura. - Significado cientfico e potencial prtico

Uma das reas da biotecnologia hoje bastante estudada e aplicada, o cultivo de tecido vegetal melhoramento gentico e tcnicas de micropropagao.

O que micropropagao ?

- Tcnica atravs da qual se propaga plantas dentro de tubos de ensaios ou similares de vidro, sob condies adequadas de assepsia, nutrio e fatores ambientais, como luz, temperatura, O2 e CO2 (CID, 2001).

A micropropagao in vitro a aplicao mais prtica da cultura de tecido e aquela de maior impacto (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998). - Por qu ?

Como funcionar ? - Forma de reproduo assexuada - Utiliza explantes do vegetal - Divises celulares induzidas

Padres morfogenticos: Como se multiplica ??

A tcnica de clonagem in vitro de plantas tornou-se possvel mediante a cultura de tecidos.


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Obs.: Poder ser conduzido pela proliferao de gemas axilares ou induo de gemas adventcias
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Fatores que influenciam no xito do cultivo de tecidos origem e o tipo de material vegetal: 1) Idade da planta; 2) Tipo de explante (pices caulinares, segmentos foliares e razes); 3) posio que este explante ocupa na planta;

A lista de fatores vasta e dificilmente podero ser controlados

Embriognese Somtica

Consiste na produo de estruturas semelhantes ao embrio zigtico sem a fuso de gametas, que iro se desenvolver at a formao completa de uma planta.
Teoricamente a melhor opo para a propagao in vitro, em virtude de suas vantagens:

1) alta taxa de multiplicao comparada a qualquer outro processo de propagao; 2) escalonamento da produo pela manuteno da cultura em meio lquido; 3) plantio direto da muda obtida via ES, sem necessidade de enxertia; 4) possibilidade de transferncia de genes; 5) planta geneticamente igual planta-me.
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Direta: os embries se originam diretamente dos tecidos, sem a proliferao do calo. Indireta: o calo formado, mantido e proliferado antes do desenvolvimento dos embries. Em ambos os casos, os embries passam pelo estado globular, cordiforme e torpedo seguindo pela formao da planta (COLLIN & GROSSER, 1984).

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Rota da ES

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Procedimentos para ocorrncia do processo de ES:


As clulas diferenciadas devem ser desdiferenciadas depois da diviso celular Clula embriognica; Posteriormente sero rediferenciadas. As clulas somticas adquirem caractersticas embriognicas por meio de uma completa reorganizao do estdio celular

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Dividida em dois estdios:


Induo e Expresso
Depois de uma mudana nas condies de cultura, que os tecidos ou as clulas induzidas alcanam o estdio de expresso no qual as clulas indicam as suas competncias, diferenciandose em embries somticos.

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A importncia da composio do meio nutritivo: - Contm nutrientes necessrios sobrevivncia da planta - Favorece o crescimento e o desenvolvimento do material vegetal Constituio bsica: - Macronutrientes inorgnicos (N, K, Ca, Mg, P, S, Si) - Micronutrientes inorgnicos (Cl, Fe, B, Mn, Na, Zn, Cu, Ni, Mo) - Vitaminas (cido nicotnico, piridoxina e tiamina) - Fontes de nitrognio orgnico (glicina e inositol) - Acares (sacarose, glucose e monitol, entre outros) - Reguladores de crescimento (auxina, citocinina, cido giberlico) - Orgnicos opcionais (hidrolizado de casena e extrato de levedura) - Agente gelatinoso opcional (gar ou phytagel).
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Composio qumica natural dos vegetais (Hormnios): - Auxinas - Citocininas - Giberilinas - Etileno - c. abscsico

Tem o propsito de regular os processos metablicos envolvidos no crescimento e desenvolvimento No possui funo nutricional Ativas e com baixas [ ] nos tecidos

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Nvel de hormnios

potencial embriognico dos explantes

A auxina o hormnio mais importante na regulao da ES in vitro

- Estruturas das molculas:

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O que um fitorregulador ? - Substncias sintticas - Atividades fisiolgicas = aos hormnios naturais necessria a adio para induzir a ES

Auxinas e citocininas so fatores chaves na determinao da resposta da embriognese


Participam fortemente na regulao do ciclo e da diviso celular
Auxina Sinttica: 2,4-D

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Dendezeiro: primeiro projeto no qual plntulas originadas a partir de embriognese somtica foram cultivadas a campo, (Unilever, Malsia, 1975). Eucaliptos: organognese, embriognese somtica (EUA, Europa). Microestacas (Brasil): aumento de 135% na produtividade de polpa a partir de clones selecionados em comparao a populao base.

Cacau e caf: embriognese somtica para a propagao massal de variedades melhoradas e resistentes a molstias (EUA e Costa Rica)

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1) Planta Matriz: Planta de maior vigor e com caracterstica interesse

No campo: multiplicao por estacas estoque! - Brotos ortotrpicos - Estacas com um par de folhas retirar 1/3 do limbo foliar - Casa de Vegetao controle da UR - Plantar em leitos de areia - Transferir mudas bem enraizadas para vasos maiores

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Clones Acau enxertado em conilon aos 30 dias

Clones Acau para enraizamento aos 30 dias

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Clones no canaleto para propagao

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2) Coleta de folha, desinfestao e inoculao: Coleta Folhas bem desenvolvidas terceiro par Coletar no inicio da manh Conduzir p/ laboratrio aguardar 30 min. (estmato) Desinfestao Capela de fluxo laminar desinsfestao parcial (lcool) Corta folhas em 1/2 tratar c/ hipoclorito de sdio Trplice lavagem em gua destilada
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2) Coleta de folha, desinfestao e inoculao: Inoculao Corta as folha com bisturi pequenos seguimentos (Fig. 1) Transferir para placa de Petri (Fig. 2 e 3) Inoculao meio de cultura gelificada (Fig. 4) Parte adaxial deve ficar em contato com o meio Manter as placas no escuro, sob 24 a 27 C

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3) Meio de cultura de induo de calos embriognicos:


Induo de calo primrio Composio:

- Macronutrientes inorgnicos - Micronutrientes inorgnicos - Vitaminas (cido nicotnico, piridoxina e tiamina) - Fontes de nitrognio orgnico (glicina e inositol) - Acares (sacarose, glucose e monitol, entre outros) - Reguladores de crescimento (auxina, citocinina, cido giberlico) - Orgnicos opcionais (hidrolizado de casena e extrato de levedura) - Agente gelatinoso opcional (gar ou phytagel).
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4) Formao de calos primrios e calos embriognicos:


Aps 1 ms de cultivo:

- Intensa proliferao celular - Clulas do cmbio vascular


100 dias de cultivo:

bordos dos explantes (Fig. 5 e 6) calos primrios

- Formao de calos amarelados sobre os primrios (Fig. 7) - Inicio da formao de setores embriognicos - Em 4 meses possvel observar a olho nu

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5) Multiplicao celular:
Aps 4 a 6 meses:

- Isolar setores embriognicos - Subcultivar em meio lquido

Multiplicao

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6) Diferenciao, maturao e germinao de embries: Diferenciao:


Conduzido em meio gelificado

Avaliar a capacidade embriognica Os setores embriognicos de cada explante isolados (Fig. A) Cada um constitui uma linhagem embriognica Processo final dos embries 2 meses (Fig. B)

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6) Diferenciao, maturao e germinao de embries: Maturao/geminao: Modificao da composio do meio transferir Boa maturao ajusta a densidade dos embries Aps 2 meses embries na forma de cotildones Estdio final prontos p/ germinao (Fig. 9) 1 faze a ser conduzida na presena de luz Inicio do desenvolvimento radicular ( Fig. 10, 11 e 12)

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7) Crescimento:
Transferncia das plntulas p/ crescimento e enraizamento:

- Tubos de ensaio (Fig. A) - Frascos Magenta Melhor resultado (Fig. B) Encaminhar plntulas p/ casa de vegetao aclimatao

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8) Aclimatao:
Conduzida em tubetes

substrato tipo PlantMax (peneirado) Ps plantio irrigao diria + soluo macro e micro (semanal) Plantas mantidas em casa de vegetao - Sombreadas 40 a 50% da luz solar - UR de 70 a 90 % - Temperatura entre 20 a 30 C Aps 2 meses e mudas c/ 3 ou mais pares de folhas (Fig. C) 5 meses prontos para plantio em condies de campo (Fig. D)

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Multiplicao massal de um gentipo superior em qualquer estgio Genes desejveis de clones selecionados podem ser mantidos em um banco gentico Eficiente na produo em larga escala 20 mil embries por grama de clula em mdia

Custo elevado Necessidade de laboratrio Fora do alcance do produtores Dificuldade na aplicao de biofbricas.

Vantagens

Limitaes
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Obrigado !!

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