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UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO PR-REITORIA DE PESQUISA E PS-GRADUAO INSTITUTO DE PS-GRADUAO QUALITTAS CURSO DE PS-GRADUAO LATO SENSU EM HIGIENE E INSPEO

DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL

PATOLOGIA E DIAGNSTICO DA TUBERCULOSE BOVINA: UMA REVISO

Renan Gomes Sabadini

Cachoeiro de Itapemirim, mar. 2009

RENAN GOMES SABADINI Aluno do Curso de Especializao Lato Sensu em Higiene e Inspeo de Produtos de Origem Animal

PATOLOGIA E DIAGNSTICO DA TUBERCULOSE BOVINA: UMA REVISO

Trabalho monogrfico de concluso do curso de psgraduao Lato Sensu de Higiene e Inspeo de Produtos de Origem Animal, apresentado ao Instituto Brasileiro de Ps-Graduao Qualittas como requisito parcial para a obteno do ttulo de especialista em Higiene e Inspeo de Produtos de Origem Animal, sob a orientao do Prof Marcos Santos Zanini.

Cachoeiro de Itapemirim, mar. 2009

PATOLOGIA E DIAGNSTICO DA TUBERCULOSE BOVINA: UMA REVISO

Elaborado por Renan Gomes Sabadini Aluno do Curso de Ps-Graduao Lato Sensu em Higiene e Inspeo de Produtos de Origem Animal

Foi analisado e aprovado com Grau:...................................

Cachoeiro de Itapemirim, ____ de ________________ de _______. ____________________________ Membro ____________________________ Membro ____________________________ Professor Orientador Presidente

Cachoeiro de Itapemirim, mar. 2009

RESUMO SABADINI, Renan Gomes. Instituto Brasileiro de Ps-Graduao Qualittas, Maro de 2009. PATOLOGIA E DIAGNSTICO DA TUBERCULOSE BOVINA: UMA REVISO. Orientador: Marcos Santos Zanini. Este trabalho constitudo por uma reviso de literatura sobre a tuberculose bovina, histrico da enfermidade, importncia econmica, patologia e discusso sobre a diversidade de mtodos de diagnstico. Tambm foram citados os principais agentes etiolgicos da doena, sua distribuio no Brasil e no mundo, suas possveis fontes de infeco juntamente com os meios de transmisso, informando como a enfermidade se instala, se desenvolve, e manifesta os sinais clnicos, e, esclarecendo como so diagnosticadas as leses da doena, tanto histologicamente, bacteriologicamente como molecularmente. Desta forma, este trabalho contribui para a vigilncia sanitria, evitando o consumo de produtos de origem bovina contaminadas pelo microorganismo, e reduzir as perdas por falsos diagnsticos. Palavras-chave: Tuberculose, diagnsticos, doena.

ABSTRACT SABADINI, Renan Gomes. Brazilian Institut of Qualittas Post Graduation, March 2009. PATHOLOGY AND DIAGNOSIS OF TUBERCULOSIS BOVINE: A REVIEW. Guiding: Marcos Santos Zanini. This job is constituted by a literature review about bovine tuberculosis, nursing historical, economic importance, pathology and discussion about the diversity of diagnosis methods. It also mentioned here the main ethiological agents, its distribution in Brazil and in the world, its possible infections means as well as the transmissions means. This article informs how the injury sets in, develops and manifests the clinical signs. Besides, it clarifies how the illness injuries are diagnosed, either histologically and bacteriologically or molecularly. In doing so, this project contributes for the sanitary vigilance, in which avoids the consumption of cattle meat products infected by microorganism, and reduces the lost for false diagnosis. Key words: tuberculosis, diagnosis, disease.

SUMRIO Resumo .................................................................................................................iv Abstract ................................................................................................................v 1- INTRODUO ...............................................................................................7 2- REVISO DE LITERATURA .......................................................................9 2.1- DEFINIO .......................................................................................9 2.2- HISTRICO .......................................................................................9 2.3- DISTRIBUIO ...............................................................................14 2.4- IMPORTNCIA ECONMICA ......................................................16 2.5- AGENTE ETIOLGICO ..................................................................18 2.6- TRANSMISSO ...............................................................................19 2.7- PATOLOGIA ....................................................................................20 2.8- PATOGENIA ....................................................................................21 2.9- SINAIS CLNICOS ..........................................................................23 2.10- DIAGNSTICOS DIFERENCIAIS ...............................................24 2.11- DIAGNSTICO .............................................................................25 2.11.1- Diagnstico clnico ..........................................................26 2.11.2- Diagnstico alrgico-cutneo ..........................................27 2.11.3- Diagnstico anatomopatolgico ......................................29 2.11.4- Isolamento de Mycobacterium bovis ...............................31 2.11.4.1- Eliminao de contaminao secundria ..........31 2.11.4.2- Meios de cultura ...............................................32 2.11.5- Protocolos de processamento de amostras: histopatolgico e bacteriolgico ......................................33 2.11.6- Testes baseados na resposta celular e humoral ...............35 2.11.6.1- IFN- (resposta celular)....................................35 2.11.6.2- ELISA (resposta humoral)................................37 2.11.7- Provas bioqumicas .........................................................39 2.11.8- Diagnsticos moleculares ...............................................39 2.11.8.1- Sondas moleculares...........................................40 2.11.8.2- PCR (Reao de Polimerase em Cadeia) .........41 2.12- CONTROLE ..................................................................................45 3- CONCLUSO ...............................................................................................47 Referncias Bibliogrficas ................................................................................48

1- INTRODUO

O Brasil um pas privilegiado no que se refere s condies para produo de protenas de origem animal. Clima, solo, tecnologia e recursos humanos h muito deixaram de serem obstculos e passaram a constituir vantagens comparativas, que somadas a imensa extenso territorial, possibilitam ao pas produzir protena animal com preos competitivos, em quantidades crescentes e com a qualidade desejada pelos consumidores. No caso especfico da carne bovina, o progresso ocorrido nas ltimas trs dcadas, especialmente nos anos de 1990, nas reas de formao de pastagem, produo e conservao de forragem, suplementao mineral, melhoramento gentico, sanidade animal, abate, e processamento e comercializao da carne, bastante significativo (Felcio 2001). Atualmente o Brasil possui o maior rebanho bovino do planeta e o maior exportador de carne bovina, entretanto, o maior produtor de carne bovina continua sendo os Estados Unidos devido a melhor taxa de desfrute. Dados recentes confirmam o crescimento desse importante setor do agronegcio no Brasil. Segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica (IBGE), onde as pesquisas so oriundas nos estabelecimentos sob inspeo federal, estadual ou municipal, s no primeiro semestre de 2008 foram abatidas cerca de 14,8 milhes de cabeas bovinas, num peso total de carcaas de aproximadamente 3,3 bilhes (kg).

Entretanto, perdemos quantidade considerveis de carne por condenaes devido a tuberculose. Os ndices oficiais esto em 1,3% do rebanho nacional infectado (1989-1998), que representaria um nmero elevado, na ordem de 2,5 milhes de animais. Pesquisas recentes confirmam que a infeco se concentra em bovinos leiteiros, mas principalmente naqueles rebanhos com algum grau de tecnificao, onde as taxas de infeco podem chegar a 15% de rebanhos com pelo menos um animal infectado (Brasil, 2006). Essas perdas se do em grande parte pela falta de entrosamento e informao entre os diversos setores envolvidos nesta cadeia produtiva. Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo principal ordenar informaes para minimizar dvidas relacionadas a tuberculose bovina, dando nfase aos meios diagnsticos utilizados para detectar as micobacterioses.

2- REVISO DE LITERATURA

2.1- DEFINIO

A tuberculose bovina classicamente causada pelo Mycobacterium bovis uma zoonose de evoluo crnica que acomete principalmente bovinos e bubalinos. Caracteriza-se pelo desenvolvimento progressivo de leses nodulares denominadas tubrculos, que podem localizar-se em qualquer rgo ou tecido (Brasil, 2006). A tuberculose bovina classificada como uma doena da lista B pela Organizao Internacional de Epizootias (OIE, 2000), com importantes efeitos socioeconmicos e em sade pblica nos pases afetados, com um impacto potencial significante no comrcio internacional de animais vivos e seus produtos (Wedlock et al., 2002).

2.2- HISTRICO

Casos de tuberculose so relatados desde as primeiras civilizaes e so inmeras as referncias que datam anteriormente a era bacteriana sobre a ingesto de carne dos animais enfermos como possvel fonte de transmisso da tuberculose. O Mycobacterium bovis j provocava, antes da ocupao humana, a tuberculose em animais das regies que atualmente correspondem Europa. No entanto, somente aps o processo de domesticao dos bovdeos, ocorrido entre 8000-4000 a.C. que surgem evidncias arqueolgicas de infeco humana por M. bovis atravs da observao de leses tuberculosas em mmias de indivduos que viveram durante o perodo neoltico, encontradas na Alemanha. A origem de tais leses foi atribuda, provavelmente, interao ambiental dos humanos com animais infectados e ao consumo de leite contaminado (Dormandy, 2002; Reichman & Tanne, 2003). A denominao tuberculose apareceu pela primeira vez em 1840. Detalhando que mmias da dinastia de Ramss reinante h 3000 anos apresentavam leses de tuberculose ssea. As primeiras descries dessa micobacteriose em animais se devem a Aristteles (384-322 a.C.), sendo que, na poca, as leses em bovinos eram atribudas a outras infeces. A orientao da conduta para sacrifcio ritualstico e do matadouro sugere que os judeus antigos conheciam as leses da tuberculose em ruminantes (Corra e Corra , 1992). No Tamuld, codificado em fim do sculo II, os rabinos proibiam ao povo hebreu utilizar-se carne de bovinos em cujos pulmes fossem encontrados leses ulcerativas

(Feldman, 1955). J em Munique, por volta de 1307, foi promulgada uma lei semelhante ao Tamuld assim como em Leipzg (1788) devido a morte de 12 estudantes atribuda ao consumo de carne de animal tuberculoso (Feldman 1955). Na Europa do sculo XVI at o final do XVIII, acreditava-se que o mal perlceo das serosas dos bovinos, era sfilis, transmitida aos animais por pessoas doentes que mantinham relaes sodmicas com vacas. Hoje se conhece como tuberculose perlada ou miliar (Matthias, 1988) Em meados do sculo XIX, aproximadamente metade da populao tuberculosa inglesa tinha tuberculose nodular ou escrofulose, de ossos e articulaes, cuja origem era bovina (Corra e Corra,1992). Em 1810, a tuberculose comeou a ser compreendida quando Carmichael observou uma ligao entre (linfadenite cervical) e o consumo de leite de vaca por crianas, o que erroneamente levou a crer que a tuberculose era desencadeada por fatores nutricionais. Em 1843, Klencke descreve, pela primeira vez, seu sucesso em transmitir a tuberculose bovina a coelhos, e, em 1846, observou uma maior incidncia de linfadenite tuberculosa entre crianas alimentadas com leite de vaca do que naquelas amamentadas com leite materno (Grange & Yates, 1994; Ferreira Neto & Bernardi, 1997). Villemin, em 1868, aps uma srie de experimentos, demonstrou que a tuberculose humana e a dos bovinos podiam ser transmitidas a coelhos e cobaias por inoculao de material (Grange, 2001).

De acordo com Feldman (1955), Koch, ao apresentar em 1882 a sua comunicao sobre a identificao do agente causal da tuberculose, aponta o escarro do doente tuberculoso como a principal origem de material infectante e acrescenta que outra fonte de infeco da tuberculose constitui, indubitavelmente, a tuberculose dos animais domsticos, estando em primeiro lugar a tuberculose bovina. Koch, identificou o agente tuberculoso, corando-o pela fucsina-anilina e isolando-o em meio de cultura elaborado a partir de humor vtreo de bovinos de abatedouros, denominando-o, em 1884, tuberkelbacillen ou bacilo da tuberculose. Eufrico com sua descoberta, Koch tentou produzir uma vacina anti-tuberculose utilizando extrato glicrico de bacilos, ao qual denominou old tuberculin, ou tuberculina velha. Os resultados foram ineficazes, mas a tentativa no foi em vo, permitindo-lhe a descoberta do fenmeno alrgico em pessoas que haviam tido contato prvio com o bacilo. Esta reao foi melhorada por Charles Mantoux em 1908, tornando-se universal (Grange & Yates, 1994; Michalany, 1995). A vacina anti-tuberculose utilizada hodiernamente em humanos, foi desenvolvida entre 1908 e 1919 por dois cientistas franceses, Calmette e Grin, a partir de cultura de M. bovis com virulncia atenuada ou Bacilo de Calmette e Gurin (BCG). Naquela poca, o tratamento preconizado para tuberculose em humanos limitava-se ao isolamento do paciente associado ao repouso, ar livre e boa alimentao. Algumas vezes estas medidas eram reforadas com a administrao de quinino, clcio, creosoto, enxofre, ouro e bismuto. Neste nterim, havia a crena generalizada no meio cientfico, inclusive compartilhada por

Koch, de que existia apenas um tipo de bacilo da tuberculose acometendo os humanos e os animais. Poucos se atreviam a discordar dessa ideia, tamanho o prestgio e credibilidade de Koch a poca. Entre os que se opunham a esse conceito, haviam celebridades contemporneas da medicina veterinria, a exemplo de Ravanel, MFadyean e Bang

(Grange e Yates, 1994; Michalany, 1995; Roxo, 1997). Voltando ao ano de 1891, Strauss e Gamalia demonstraram que o bacilo avirio era diferente do bacilo do tipo humano e bovino, contradizendo Paulicki que observou semelhana entre a tuberculose humana, bovina e aviria. Theobald Smith, nos EUA, em 1896, verificou que havia diferenas culturais e patognicas entre os agentes de tuberculose bovina e humana e, no ano de 1898, isolou o M. bovis (Corra e Corra, 1992; Roxo, 1997; Souza et al., 1999). Foi ento criada a Royal Comission on Tuberculosis, que ao invs de limitar-se as opinies de especialistas, resolveu desenvolver um extenso programa de pesquisa, visando a gerao de conhecimentos que esclarecessem definitivamente as dvidas sobre a tuberculose em bovinos e sua relao com a doena em humanos. Essa Comisso trabalhou de 1901 a 1911, dispondo de um laboratrio e uma fazenda experimental, e chegou a concluso de que bovinos tuberculosos representavam risco para a sade pblica e que algo deveria ser feito, pois a ocorrncia da doena nesses animais era em nmero alarmante (Pritchard, 1988; Corra & Corra, 1992). A primeira prova definitiva da transmisso da tuberculose bovina no homem, decorre da ingesto de alimentos, ficou evidente quando Ravenel, em 1902, isolou, em

uma cultura pura, os bacilos presentes em gnglios mesentricos de uma criana falecida de meningite tuberculosa, no Hospital Infantil da Filadufia, EUA. Tais bacilos foram inoculados em 3 bovinos, os quais em menos de 30 dias vieram a bito. Os resultados da necropsia destes animais demonstraram que a causa da morte foi tuberculose (Souza et al., 1999). Clemente Ferreira (1902), descreveu a adoo dos primeiros dispositivos legais de mbito municipal instituindo obrigatrio o teste de tuberculina nas vacas leiteiras e o abate dos animais com diagnstico positivo em 1897 no Rio de Janeiro, e em 1898, em So Paulo. Tambm em So Paulo, em 1903 e 1904, novos dispositivos legais reforaram a obrigatoriedade do teste e determinaram que as vacas com reao positiva fossem marcadas a ferro com a letra T, retiradas dos estbulos e encaminhadas para abate em matadouro municipal. Determinavam, ainda, a realizao de exames necroscpicos (Antunes et. al, 2002). Kuhnaus, em 1931, verificou que a carne poderia transmitir a doena ao homem, quando o animal era afetado por uma tuberculose generalizada e, neste caso, a carcaa seria condenada durante a inspeo realizada nos matadouros. Alguns fabricantes de salsichas utilizavam este material condenado para o preparo de seu produto que, quando consumidos sem o tratamento trmico prvio, oferecia um grande risco s pessoas (Feldman, 1955). Tendo em vista a dimenso do problema e sua importncia para a sade pblica, muitos pases adotaram programas de controle da doena, tais como: rotina de

inspeo de carnes, pasteurizao do leite e medidas de controle da doena nas populaes animais. Torres e Pacheco, em 1938, informaram sobre o isolamento do bacilo do tipo bovino de leses humanas, tratando-se da primeira publicao da literatura mdica nacional (Souza et al., 1999). At 1970, o bacilo bovino foi considerado uma variante do M. tuberculosis e denominado M. tuberculosis variante bovis ou M. tuberculosis subespcie bovis. Neste mesmo ano, Karlson e Lessel propuseram sua classificao como espcie individual, denominada M. bovis (Ferreira Neto & Bernardi, 1997).

2.3- DISTRIBUIO

A tuberculose bovina tem distribuio mundial e concentra-se onde os animais so criados de forma intensiva, e, em menor intensidade, nos pases onde a criao extensiva e as aes de controle sanitrio so ainda recentes (Roxo, 1997). A enfermidade vem sendo alvo de intensas campanhas de erradicao e controle em vrios pases do mundo, desde a dcada de 50 e 60. No entanto, alguns pases apresentam atualmente situao bastante confortvel em relao a doena, enquanto em outras regies do globo a prevalncia bastante alta. Na Europa, a enfermidade se encontra controlada em quase todos os pases membros da Comunidade Europia (Benet, 1994). Pases que iniciaram precocemente programas de controle e erradicao da tuberculose bovina,

baseado em aes sanitrias como a tuberculinizao e sacrifcio de animais infectados, erradicaram (Dinamarca, Holanda e Luxemburgo) ou reduziram (Alemanha, Blgica, Inglaterra, Frana, Grcia e Portugal) a incidncia da enfermidade (Caffrey, 1994). Nos Estados Unidos, embora a doena no possa mais ser considerada como problema sanitrio, a erradicao completa da enfermidade ainda no foi atingida (Essey & Koller, 1994). Na frica embora informaes sobre a prevalncia da enfermidade sejam bastante escassas, algumas comunicaes sugerem que essa se encontra plenamente distribuda por todo o continente africano (Daborn et al., 1996). Na Amrica Latina e Caribe existem reas com prevalncia que ultrapassa 1%. No Brasil, estado de Minas Gerais, um estudo realizado pelo Instituto Mineiro de Agropecuria (IMA) em 1999, envolvendo aproximadamente 1.600 propriedades e 23.000 animais, estimou uma prevalncia de 0,85% de animais reagentes ao teste de tuberculinizao. No mesmo estudo, foram detectados 5% de propriedades com animais reagentes (Brasil, 2006). Ainda no estado de Minas Gerais foi realizado um estudo pra avaliar a prevalncia da tuberculose em bovinos abatidos em 11 matadouros sob Inspeo Federal no ano de 1993 a 1997. Nesse perodo foram abatidos 954.640 bovinos, foram diagnosticados 681 casos de tuberculose e constatou-se que a prevalncia da enfermidade foi de 0,8% (Baptista et al., 2004).

Conforme Lilenbaum (1998) no estado do Rio de Janeiro foi feito um estudo epidemiolgico em treze propriedades de diferentes sistemas de produo na Regio dos Lagos, durante o estudo foram testados 1.632 animais, realizando-se o teste intradrmico simples. O nvel de reatividade observada foi de 12,7% dos animais testados, sendo extremamente alto, e permite confirmar estimativas no oficiais de que 10 % do rebanho nacional estaria infectado. Esse dado tambm similar aos achados de Langenegger et al. (1981) que, ao trabalharem com 24 rebanhos leiteiros da regio Sudeste do Brasil, verificaram ndices de 9,7%. Tambm concordantes com Andrade et al. (1991), que relataram no Rio Grande do Sul um total de 11,63% de reatividade intradermoreao, somando-se os resultados positivos e duvidosos, alm de 12,71% de animais reatores, quando estudada uma regio especfica desse estado, devendo considerar-se que este ndices mais expressivos aplicam-se somente a criaes de gado de leite ou mistas (leitecarne), no sendo a realidade para as criaes de gado de corte.

2.4- IMPORTNCIA ECONMICA

A tuberculose constitui uma significativa causa de condenao de animais em matadouros e de mortalidade animal, resultando em grande perda econmica (Grance & Yates, 1994). A importncia econmica atribuda doena bovina est baseada nas perdas diretas resultantes da morte de animais, da queda no ganho de peso e diminuio da produo de

leite, do descarte precoce e eliminao de animais de alto valor zootcnico e condenao de carcaas no abate. Estima-se que os animais infectados percam de 10% a 25% de sua eficincia produtiva. Existe ainda a perda de prestgio e credibilidade da unidade de criao onde a doena constatada (Brasil, 2006). Esta enfermidade foi erradicada de muitos rebanhos dos EUA usando um programa de testes e abates combinados com a inspeo de carnes, que durou 50 anos e custou US$ 450 milhes ao pas. Como no existem vacinas eficientes, bem como servios de vigilncia e programas de erradicao eficazes da tuberculose bovina, as medidas de controle ficam prejudicadas e, por isso, sempre so onerosas (Nelson, 1999). As exigncias crescentes no que diz respeito a segurana alimentar, faz com que a inspeo sanitria de produtos de origem animal situe-se na vanguarda da vigilncia sanitria visando a proteo da sade dos consumidores. Por isso a globalizao da economia tem implementado o rigor da inspeo de alimentos em respeito ao mercado interno, E principalmente em atendimento a mercados externos, extremamente exigentes no que tange qualidade sanitria dos produtos por eles importados. Tais exigncias so amparadas por organismos internacionais, como por exemplo, a Organizao Mundial do Comrcio (World Trade Organization- WTO). Este comportamento do mercado motivou os pases exportadores a revisarem suas polticas de segurana alimentar e adotarem as normas do Codex Alimentarius, criado em 1963, como base tcnico-cientfica para garantir que os alimentos consumidos pela populao tenham condies sanitrias e higinicas apropriadas. A situao de segurana e inocuidade alimentar no mundo foi amplamente

discutida na 53 Assemblia da Organizao Mundial de Sade (World Health Organization- WHO) em maio de 2000. A partir dessa discusso foi emitida uma resoluo, estabelecendo que a segurana e inocuidade alimentar so prioridades globais, recomendando aos Estados Membros, entre eles o Brasil, que revisem suas polticas de sade pblica (World Health Organization, 2000). Pressionados pelas perdas econmicas causadas pela tuberculose e com o propsito de assegurar o mercado de exportaes, e se posicionar no mercado internacional, os pases da Amrica Latina esto sendo sensibilizados a atender as exigncias relacionadas ao manejo sanitrio do rebanho e a adotar medidas para o controle de zoonoses de relevncia para a sade pblica, estabelecendo e mantendo reas livres de enfermidades (Kantor & Ritacco, 1994; Usabiaga, 2001).

2.5- AGENTE ETIOLGICO

As bactrias causadoras de tuberculose pertencem famlia Mycobacteriaceae, gnero Mycobacterium. So bastonetes curtos aerbicos, imveis, no capsulados, no flagelados, apresentando aspecto granular quando corados, medindo de 0,5 a 7,0 m de comprimento por 0,3 m de largura. (Brasil 2006). A principal caracterstica das micobactrias so a lcool-cido resistncia (BAAR), o que significa que, durante os procedimentos de colorao pela fucsina, no se deixam corar por uma mistura de lcool e cido clordrico. Essa propriedade parece decorrer da

firme fixao da fucsina a certos lipdeos da parede. A colorao para verificao de BAAR a de Ziehl-Neelsen. Este mtodo consiste em tratar o esfregao com fucsina a quente e, em seguida, com uma mistura de lcool (95%) e cido clordrico (3%). Depois de lavado com gua, o esfregao corado com azul de metileno. As bactrias que retm a fucsina (BAAR) adquirem essa cor (vermelho), e as que no retm a fucsina se coram pelo azul de metileno. Tal caracterstica tambm est presente nas bactrias Nocardia, Rhodococcus e Corynebacterium (Corra & Corra, 1992; Roxo, 1997). As principais espcies de importncia epidemiolgica para o homem pertencem ao complexo M. tuberculosis, que so as principais causadoras de tuberculose nos mamferos, e compreende: o Mycobacterium tuberculosis, o Mycobacterium bovis, Mycobacterium microti (patognico apenas para a ratazana Microtis agrestis), o Mycobacterium africanum (ainda no isolado no Brasil) e o Mycobacterium canetti, no patognico para o homem (Abraho, 1998; Ducati et al., 2004; Brosch et al., 2002; Corner, 1994). Outro grupo de micobactrias genotipicamente diferentes formam o complexo Mycobacterium avium- intracellulare, o qual inclui duas espcies (M. avium e M. intracellulare). O M. avium subdividido em quatro subespcies (ssp.): ssp. avium, ssp. paratuberculosis, ssp. silvaticum e recentemente ssp. hominissuis. So bactrias que, em bovinos, provoca reao cruzada nos testes de hipersensibilidade a derivados proticos purificados (Dvorska et al., 2004). Nos casos de leses macroscpicas tpicas de tuberculose em bovinos, o agente mais frequentemente isolado o M. bovis (Castro & Nemoto, 1972; Corra & Corra,

1982). O M. bovis tem um amplo espectro de patogenicidade para as espcies domsticas e silvestres, principalmente bovinos e bubalinos, e pode participar da etiologia da tuberculose humana. A doena humana causada pelo M. bovis tambm denominada tuberculose zoontica (Brasil, 2006).

2.6- TRANSMISSO

A principal porta de entrada do M. bovis a via respiratria; a transmisso, em aproximadamente em 90% dos casos, ocorre pela inalao de aerossis contaminados com microorganismo. O trato digestivo tambm porta de entrada da tuberculose bovina, principalmente em bezerros alimentados com leite proveniente de vacas com mastite tuberculosa e em animais que ingerem a gua ou forragens contaminadas. Nesse caso, o complexo primrio localizar-se- nos rgos digestivos e linfonodos regionais (Brasil, 2006). Alm da disseminao pela respirao, o bacilo pode ser eliminado pelo corrimento nasal, leite, fezes e urina (Ruggiero et al., 2007). Outras vias menos comuns tambm podem ocorrer, como a via cutnea, que usualmente requer uma leso primria como pr-condio para instalao do processo infeccioso ou a via genital, que, embora rara, pode ocorrer de um animal para o outro, tanto na transmisso macho-fmea quanto na fmea-macho. Em casos de tuberculose no tero, a

transmisso congnita atravs dos vasos do cordo umbilical possvel. (Neill et al., 1994).

2.7- PATOLOGIA

A leso caracterstica da tuberculose o tubrculo, um granuloma clssico composto de uma coleo de clulas epiteliides circundadas por uma orla de fibroblastos com linfcitos entremeados. Frequentemente o centro do granuloma est necrosado e calcificado. Comparvel com leses de muitas outras molstias infecciosas, a leso representada pelo tubrculo a reao do hospedeiro aos microorganismos invasores, e sua patognese, depende de uma resposta imunolgica (Jones et al., 2000) J Cheville (2004) define o incio dos tubrculos como pequenos agregados de neutrfilos e macrfagos que sequestram e ingerem os bacilos. Se os macrfagos capturam bactrias, mas no as matam, eles prprios so mortos. Os focos de clulas necrticas ficam circundados por uma camada de macrfagos novos. A leso se expande progressivamente devido a entrada contnua de moncitos imunes. Estas clulas fagocitam macrfagos mortos e suas bactrias viveis, sendo, por sua vez, destrudas. Na periferia da leso, a atividade dos moncitos mais intensa, sendo proeminentes grandes macrfagos arredondados conhecidos como clulas epiteliides. Essas clulas possuem a superfcie com projees intensamente ondulantes e entrecruzadas e a fuso das suas membranas plasmticas leva a formao das clulas gigantes que caracterizam a tuberculose. A

necrose macia e a cavitao na tuberculose pulmonar, em alguns mamferos, se devem menos a virulncia das bactrias que hipersensibilidade dos macrfagos naquele hospedeiro particular.

2.8- PATOGENIA

Quando a infeco se d pelo trato respiratrio (aerossis), o pulmo o rgo primeiramente atingido, assim como os linfonodos regionais. J quando a infeco pela via digestiva, a leso se d no stio de entrada, principalmente nos linfonodos farngeos e mesentricos. No entanto, pode atingir praticamente todos os rgos quando da generalizao do processo. Em uma primo infeco pulmonar, os bacilos vo se alojar no tecido, promovendo uma reao inflamatria, caracterizada como uma pneumonia. A doena se instala basicamente nos pulmes, formando ndulos caseosos, de tamanhos variados, em muitos casos confluentes tomando todo o parnquima pulmonar e formando leses cavitrias, com expectorao de material bacilfero. Atravs de uma reinfeco exgena ou endgena, pela recrudescncia da leso, esta se torna necrosada, podendo atingir os tecidos vizinhos e se disseminar por todo indivduo. Quando a resistncia orgnica baixa acontece a disseminao do agente pelo parnquima pulmonar pela via area ou pela via hematgena, indo atingir o linfonodo regional. Ocorre no foco inicial uma infiltrao celular, necrose de caseificao e circunscrio da leso, que pode evoluir para resoluo e calcificao. A presena de um ndulo calcificado, predominantemente no

tero distal do lobo caudal, e/ou aumento de volume do linfonodo regional denomina-se Complexo Primrio. Os bacilos podem permanecer nos linfonodos ou nos ndulos tubrculos por longos perodos, se multiplicando ou sob a forma dormente (Youmans, 1979; Pritchard, 1988; Oreilly & Daborn, 1995). De acordo com Tortora et al. (1998), os animais saudveis iro combater uma infeco potencial com macrfagos ativados, especialmente se a dose infectante for baixa. Se os bacilos no so destrudos, os fagcitos tendem a proteg-los dos anticorpos e outras defesas imunes, e muitos sobrevivem e se multiplicam dentro dos fagcitos. Os macrfagos e outras clulas defensivas se acumulam no stio de infeco, formando uma camada circundante. Isto leva a uma leso fechada, denominada tubrculo (significando protruso ou massa), uma caracterstica que d a doena seu nome. A maioria dos macrfagos circundantes no so muito bem sucedidos em destruir as bactrias, mas liberam enzimas e citocinas que causam uma inflamao lesiva ao pulmo. Aps vrias semanas, o interior do tubrculo torna-se caseoso (de consistncia semelhante ao queijo). Os bacilos da tuberculose, altamente aerbicos, no crescem bem nessa localizao. Contudo muitos permanecem dormentes durante anos, e servem como base para a reativao posterior da doena. Se as defesas do corpo interrompem a doena neste ponto, as leses caseosas lentamente cicatrizam, tornando-se calcificadas. Elas so mostradas claramente nos raios X, e so denominadas de complexos de Ghon. Em alguns casos, contudo, a leso caseosa aumenta lentamente e torna-se menos pastosa e mais lquida, um processo denominado liquefao. Ela eventualmente forma uma cavidade tuberculosa

cheia de ar. As condies dentro da cavidade comeam a favorecer a proliferao dos bacilos da tuberculose, os quais comeam ento a se multiplicar pela primeira vez fora dos macrfagos. A doena agora torna-se altamente contagiosa; o lquido produz eficiente gotculas em aerossol quando tossido, e as bactrias comeam a escapar do tubrculo. Estes microorganismos comeam a penetrar nas vias areas do pulmo, e ento no sistema circulatrio e linftico. Sobre a generalizao da infeco, ela pode assumir duas formas. 1) miliar, quando ocorre de maneira abrupta e macia, com entrada de um grande nmero de bacilos na circulao; 2) protrada, mais comum, que se d por via linftica ou sangunea, acometendo o prprio pulmo, linfonodos, fgado, bao, bere, ossos, rins, sistema nervoso central, disseminando-se por, praticamente, todos tecidos (Brasil, 2006).

2.9- SINAIS CLNICOS

A sintomatologia da tuberculose se caracteriza por evoluo lenta, febre intermitente, tosse seca improdutiva, queda de peso e astenia. Pode ainda ocorrer a forma intestinal, com diarria crnica que leva o animal a caquexia, em cerca de 10-20% dos casos, e uma forma ganglionar difusa (Lillenbaum, 1998).. Por ser uma doena de evoluo lenta, os sinais clnicos so pouco frequentes em bovinos e bubalinos. Em estgios avanados, e dependendo da localizao das leses, os

bovinos podem apresentar caquexia progressiva, hiperplasia de linfonodos superficiais e/ou profundos, linfadenomegalia, dispnia, mastite, infertilidade, entre outros (Brasil, 2006). Os animais tuberculosos podem desenvolver leses em rgos, tecidos e ossos. Esses animais, quando submetidos ao trabalho, no acompanham os outros animais e demonstram cansao e baixa capacidade respiratria. A dificuldade em se ganhar ou manter o peso e quedas na produo de leite tambm so relatados (Brasil, 2003; Olmstead & Rhode, 2004).

2.10- DIAGNSTICOS DIFERENCIAIS

As caractersticas de colorao do agente etiolgico da tuberculose bovina se assemelham com microorganismos dos gneros Corynebacterium, Nocardia e

Rhodococcus (Roxo, 1997). Alm destes, a tuberculose pode ter como diagnsticos diferenciais as seguintes patologias: cstodos (Taenia solium); hepatite focal necrtica; linfadenite purulenta inespecfica; quistos nos gnglios linfticos retrofarngeos mdios; metstase de neoplasia no gnglio linftico external; actinogranulomatose na mama, gnglios linfticos, bao, pulmo, fgado; metsteses de neoplasia no bao; esplenite inespecfica; granulomas inespecficos no bao; neoplasia do bao; metsteses de neoplasia no pulmo; abcesso

inespecfico no pulmo; carcinoma alveolar; adenocarcinomas

com metstases

ganglionares no pulmo; metstese de neoplasia na pleura; metstase de neoplasia no pulmo; enfisema bolhoso; bronquiectasias no tuberculosas; nefrite intersticial focal; metstases de adenocarcinoma renal; granulomas inespecficos no intestino; granulomas parasitrios no intestino; neoplasia no intestino e gnglio linftico mesentrico; orquite bruclica; orquite inespecfica; epididimite crnica; pericardite crnica inespecfica; neoplasia do pericrdio; metrite inespecfica; abcessos piomicos no fgado; necrobacilose no fgado; metstases de neoplasia no fgado; actinobacilose no fgado; hepatite parasitria (calicose nodular); granulomas parasitrios no intestino; enterite necrtico-difteride; peritonite crnica; mesotelioma no peritneo; mesotelioma; granulomas no tero e ovrio; mastite necro-purulenta (Gil, 2000).

2.11- DIAGNSTICO

O diagnstico da tuberculose bovina pode ser efetuado por mtodos diretos e indiretos. Os diretos envolvem a deteco e identificao do agente etiolgico no material biolgico. Os indiretos pesquisam uma resposta imunolgica do hospedeiro ao agente etiolgico, que pode ser humoral (produo de anticorpos circulantes) ou celular (mediada por linfcitos e macrfagos). A tuberculinizao uma medida da imunidade celular contra o M. bovis por uma reao de hipersensibilidade retardada (tipo IV) (Brasil, 2006).

A reao tuberculnica, a bacteriologia e a histopatologia so os mtodos mais utilizados para o diagnstico da tuberculose bovina e bubalina. A grande inespecificidade dos sinais clnicos, a dificuldade do isolamento do M. bovis do animal vivo e o baixo nvel de anticorpos durante o perodo inicial de infeco fazem com que os diagnsticos clnico, bacteriolgico, e sorolgico tenham um valor relativo (Brasil, 2006). O diagnstico clnico, associado a tuberculinizao, possibilita a identificao de animais com tuberculose avanada, os quais geralmente apresenta um decrscimo da sensibilizao alrgica, podendo, por vezes, chegar anergia. Pode-se afirmar que existem mtodos diagnsticos adequados para o desenvolvimento de programas de controle e erradicao de tuberculose bovina; entretanto, no existe um mtodo diagnstico da tuberculose bovina que tenha uma eficcia absoluta. A prova tuberculnica, a vigilncia epidemiolgica em matadouros, os controles sanitrios, o diagnstico de laboratrio, so todos elementos bsicos que devem ser empregados com critrio e de modo adequado a cada situao epidemiolgica. Independentemente dos mtodos de diagnsticos utilizados, fundamental que os animais positivos sejam abatidos, evitando-se, assim, a disseminao da tuberculose (Brasil, 2006). Segundo Lilenbaum (2000), o mtodo de diagnstico mais confivel para doenas determinadas por microorganismos sem dvida o isolamento e identificao do agente etiolgico a partir de leses oriundas dos animais doentes. No entanto, em tuberculose bovina, embora a cultura bacteriolgica ainda represente o padro-ouro do diagnstico, a dificuldade de obteno de amostras torna pouco vivel sua utilizao rotineira. Uma vez

que impossvel a obteno de escarro bovino e a obteno de lavados bronco-alveolares difcil em grandes rebanhos. J Ruggiero et al. (2007) afirma que, para que os programas de controle de tuberculose assegurem uma rpida deciso de extrema importncia a existncia de uma rede laboratorial que disponibilize o suporte tcnico e um diagnstico rpido, especfico e sensvel. Apesar de nos recentes anos vrios mtodos bacteriolgicos terem sidos desenvolvidos para o diagnstico da tuberculose, nenhum deles podem ser empregado isoladamente (Cosivi et al., 1998), havendo sempre a necessidade do uso de tcnicas complementares para o alcance de uma informao eficaz e completa. Vrios mtodos esto atualmente disponveis e consiste em recentes avanos para o controle da tuberculose, porm, os resultados laboratoriais obtidos devem ser sempre interpretados em conjunto com os achados clnicos.

2.11.1- Diagnstico clnico

Possui valor relativo, porque o animal pode estar infectado com um foco localizado - e apresentar-se aparentemente sadio. O diagnstico clnico torna-se importante para os animais com tuberculose avanada, para os quais o teste tuberculnico perde seu valor pela possibilidade do fenmeno da anergia tuberculina (Brasil, 2006).

Um dos mtodos de diagnsticos in vivo preconizados para bovinos o exame clnico, que apresenta como restrio a dificuldade para sua utilizao e o fato dos sintomas ocorrerem em estgios avanados da doena (Ruggiero et al., 2007). O exame clnico inclui a auscultao, a percusso, a termometria e a palpao de glndulas mamrias e linfonodos superficiais. Neste ltimo caso, so avaliados principalmente a exarcebao da sensibilidade dolorosa e a presena de linfadenomegalia. Tambm so sinais clnicos que devem ser levados em considerao a manifestao intensa de cansao, a ocorrncia de tosse seca no produtiva, a eliminao de secreo nasal e a manifestao de dispnia (Roxo, 1997).

2.11.2- Diagnstico alrgico-cutneo

O diagnstico alrgico-cutneo com tuberculina o instrumento bsico para programas de controle e erradicao da tuberculose bovina em todo mundo. Pode revelar infeces incipientes a partir de 3 a 8 semanas da exposio ao Mycobacterium, alcanando boa sensibilidade e especificidade, sendo considerado pela OIE (Organizao Internacional de Epizootias) como tcnica de referncia. Para que realmente funcione como ferramenta diagnstica em um programa de controle, indispensvel que o procedimento seja padronizado quanto produo das tuberculinas, equipamentos para realizao das provas, tipos de provas e critrios de leitura (Brasil, 2006).

A reao da tuberculina caracteriza-se por ser um infiltrado de clulas mononucleares no local da aplicao, com formao de edema mais ou menos pronunciado. Esta uma reao de hipersensibilidade tardia mediada por linfcitos T sensibilizados (Neil et al., 1994). No teste, uma protena purificada derivada da bactria da tuberculose, obtida por precipitao de culturas em meio ricos em protenas, injetada cutaneamente. Se o animal injetado foi infectado com tuberculose no passado, as clulas T sensibilizadas reagem com estas protenas e ocorre uma reao de hipersensibilidade tardia, em cerca de 48-72 horas. Esta reao surge como um endurecimento e avermelhamento da rea em torno do stio de injeo (Tortora et al., 1998). Na prtica, o teste intradrmico simples consiste na injeo intradrmica de 0,1 ml de PPD (derivado de protena purificada) bovino, produzida a partir de M. bovis (amostras AN5 ou Vale, 1 mg protena/ml) no pescoo do animal ou na prega ano-caudal. J o teste intradrmico comparativo consiste na inoculao simultnea de 0,1 ml de tuberculina aviria (25.000 U.I./ml) produzida a partir de M. avium (Amostras D4ER ou TB56) e de 0,1 ml de tuberculina bovina (50.000 U.I./ml) na regio do pescoo do animal e a cerca de 15 cm de distncia entre si. Este utilizado para reduzir a ocorrncia de reaes cruzadas com outras micobactrias, usualmente como teste suplementar. A leitura e ambos os teste realizada aps 72 horas e baseada na avaliao de hipersensibilidade cutnea, sendo alguns dos mais antigos testes imunolgicos ainda em uso mundialmente. Os maiores problemas do mtodo da tuberculinizao consistem na ocorrncia de reaes falsonegativas, ou animais anrgicos; dificuldade na leitura, que exige tcnico especializado;

perodo de leitura de 72 horas, o que obriga um segundo deslocamento do veterinrio at a propriedade; dificuldade de padronizao dos resultados; grande nmero de reaes duvidosas e, devido a alterao posterior do estado imunolgico do animal, necessidade de 60 ou 90 dias para realizao de novas provas (Monaghan et al., 1994).

2.11.3- Diagnstico anatomopatolgico

Na inspeo post-mortem, atravs do exame macroscpico, so detectadas as leses que vo servir de subsdio a formulao do diagnstico e posterior julgamento, no caso em tela, de acordo com as disposies emanadas do Regulamento de Inspeo Industrial e Sanitria de Produtos de Origem Animal RIISPOA,1962 (Miranda et al., 1998). O exame post-mortem, realizado pela inspeo sanitria, uma etapa essencial para o diagnstico da tuberculose bovina. No entanto, o resultado s pode ser dado como suspeita diagnstica, j que se trata apenas da anlise macroscpica da leso encontrada (Brasil,1997) O tempo destinado para a inspeo de abate pode ser insuficiente para detectar todas as leses, o que dificulta o exame mais detalhado, alm das leses no visveis relatadas por outros autores. A rotina de inspeo de carnes pode ser inadequada para identificar leses discretas e esse fato comprovado quando no se identificam leses de

abate de animais reagente. A inspeo atenta de pelo menos seis pares de linfonodos entre os da cabea, torcicos, mesentricos e da carcaa e em outros rgos como o pulmo, fgado, bao, rim, bere e rgos genitais pode identificar at 95% dos animais com leses macroscpicas (Corner, 1994; Morris et al., 1994; Menzies & Neill, 2000). Estas leses provocadas pelo M. bovis no so patognomnicas de tuberculose bovina. E apresentam colorao amarelada em bovinos, e ligeiramente esbranquiadas em bfalos. So ndulos de 1 a 3 cm de dimetro ou mais, que podem ser confluentes, de aspecto purulento ou caseoso, com presena de cpsula fibrosa, podendo apresentar necrose de caseificao no centro da leso, ou, ainda, calcificao nos casos mais avanados. Sobre a incidncia das leses: em 70% a 90% dos casos, encontram-se em linfonodos da cabea e trax; e 66% dos animais necropsiados apresentam apenas uma nica leso visvel. Mas em 95% dos casos, as leses esto localizadas em linfonodos (mediastnicos, retrofarngeos, bronquiais, parotdeos, cervicais, inguinais superficiais e mesentricos), pulmo e fgado. Com menor freqncia, podem estar presentes em intestino e tecido mamrio, ou em qualquer outro rgo ou tecido do animal (Brasil, 2006). Habitualmente, ao aspecto macroscpico de um tubrculo, esteja ele situado profundamente no tecido mole como fgado e os pulmes, estejam salientando-se de uma superfcie serosa ou mucosa, o de um ndulo firme ou duro, branco, cinzento ou amarelo. Nas seces de corte, seu centro necrosado e caseoso, de cor amarelada, est seco e slido, contrastando com o pus que ocorre num abcesso. A calcificao comum em muitos

animais, e ao seccionar um tubrculo, uma sensao arenosa e rangente indica a presena de material calcrio (Jones et al., 2000). Usualmente, nas atividades de inspeo, no exame post-mortem, para a comprovao e controle do diagnstico realizado a campo e para avaliao da eficcia das provas de tuberculina, as amostras provenientes de animais que apresentam leses suspeitas so adequadamente coletadas e rapidamente encaminhadas para os exames bacteriolgicos e histopatolgicos (Centro Panamericano de Zoonoses, 1988;

Organizacin Panamericana de La Salud, 1995). Os animais reagentes ao teste tuberculnico podem no apresentar leses visveis a olho nu; isso no significa, porm, que se trata de reao falso-positiva. As leses podem estar em estgios iniciais de evoluo, ou simplesmente no terem sido encontradas pela necropsia (Brasil, 2006).

2.11.4- Isolamento de Mycobacterium bovis

2.11.4.1- Eliminao de contaminao secundria

As micobactrias so altamente exigentes no que se refere a nutrientes, quando comparadas com outras bactrias patognicas. Essas caractersticas facilitam a multiplicao de contaminantes menos exigentes, o que torna indispensvel a

descontaminao das amostras previamente tentativa de isolamento (Balian et al., 2002). Para tanto, preciso selecionar os descontaminantes e a sua concentrao, alm de considerar o efeito adverso que a maioria dos reagentes tem sobre o M. bovis. Podem ser utilizados como descontaminantes o cloreto de hexadecilpiridinio, cido oxlico, cloreto de benzalcnio e hidrxido de sdio (Jorge et al, 2002). Outra substncia descontaminante que pode ser utilizada o descontaminante de Petroff que contm NaOH a 2% em sua frmula (Corner, 1994). De acordo com pesquisa realizada por Holanda et al. (2002), foram testados quatro diferentes descontaminantes, avaliando-se seu efeito txico sobre Mycobacterium bovis e sua capacidade de descontaminao em linfonodos de bovinos. A amostra utilizada foi M. bovis (AN5) e os descontaminantes foram cloreto de cetilpiridnio 0,75%, cloreto de banzalcnio 0,25%, cido oxlico 5% e cido sulfrico 6%. A eficincia dos testes de descontaminao e toxicidade foi verificada por meio de cultivo em meio de Lwenstein Jensen. O descontaminante que se mostrou mais eficiente e menos txico para M. bovis, foi o cido sulfrico 6% em curto espao de tratamento e o mais txico cloreto de benzalcnio 0,25%.

2.11.4.2- Meios de cultura

No laboratrio, os principais fatores que influenciam no sucesso do isolamento de Mycobacterium bovis so a escolha do meio de cultura, os procedimentos de

descontaminao da amostra e as condies de incubao do agente. M. bovis uma bactria que requer meios ricos em nutrientes para o seu crescimento e isolamento. Os meios de cultura de Stonebrink e o Lwenstein Jensen so base de ovo e piruvato, e o primeiro mais recomendado ao cultivo do M. bovis, podendo ser utilizado Lwenstein Jensen sem glicerol e acrescido de piruvato de sdio. Meios de cultura a base de gar enriquecidos com soro ou sangue, a exemplo do Middlebrook modificado ou 7H11 e o meio tuberculose gar sangue ou B83, tambm so indicados para o cultivo (Salazar, 2005). Nos meios de cultura a base de gar, o crescimento bacteriano mais rpido, sendo que a primeira colnia de bactria reconhecvel aparece em torno de 27 dias no B83 e com 28 dias no 7H11. J quando se utiliza o meio de Stonebrink este tempo de 36 dias. Entretanto, os meios a base de gar so mais susceptveis ao crescimento de microorganismos contaminantes, mesmo se a amostra cultivada tenha sido previamente descontaminada (Salazar, 2005). Estudos anteriores, mostraram que o 7H11 foi contaminado duas vezes mais que o Stonebrink, 8,3% comparados a 4,7% respectivamente (Corner 1994, Jorge, 2001). Outros autores afirmam que o meio de cultura mais recomendado para o primo isolamento de M. bovis de Stonebrink isento de glicerina e contendo piruvato de sdio (Lesslie, 1959, Roxo, 1996). Ovos so empregados nesses meios de cultura porque as micobactrias so exigentes em lipdeos disponveis na gema (Centro Panamericano de Zoonosis, 1988).

J Cousins et al (1989) comparou a eficincia de cinco meios de cultura para o isolamento de M. bovis de cento e dezesseis amostras. Foram cultivadas nos meios B83, Middlebrook, Lwentein Jensen, Stonebrink, e Stonebrink com menor concentrao de verde malaquita, sendo que o B83 e Stonebrink modificado, quando usados em conjunto, detectaram 95,2% dos animais com M. bovis, o que permitiu aos autores recomendar esses dois meios para cultura de rotina.

2.11.5- Protocolos de processamento de amostras: histopatolgico e bacteriolgico

Fragmentos de tecidos com leses sugestivas de tuberculose (ndulos caseosos em linfonodos, pulmo, fgado, etc.) podem ser enviados para exame histopatolgico em frasco de boca larga (plstico ou vidro), hermeticamente fechado, imersos em soluo de formaldedo a 10%, observando-se a proporo de uma parte de amostra a ser fixada para 10 de formaldedo (Brasil, 2006). Depois de serem fixados, incluindo a parafina e microtomizados, os cortes histolgicos dos tecidos lesado podem ser submetidos colorao de hematoxilina-eosina (HE), e examinados sob microscopia de luz. Isto permite a observao da morfologia e organizao do granuloma caracterstico da tuberculose, revelando seu envolvimento por uma cpsula conjuntiva; adjacente a ele h presena de infiltrado inflamatrio mononuclear, predominantemente constitudos por macrfagos e poucos linfcitos; tambm so observadas clulas epiteliides, clulas gigantes tipo Langhans delimitando a

rea de necrose de caseificao que no seu interior pode conter material amorfo basoflico, resultado da calcificao distrfica (Cassidy et al., 1999). No corte histolgico tambm pode ser empregada colorao especial para micobactrias, utilizando fucsina modificada (mtodo de Kinyoun), onde possvel identificar a presena de BAAR (Ameni, 2000; Jorge, 2001). Amostras frescas podem ser fixadas em lminas e coradas pelo mtodo de ZiehlNeelsen para a pesquisa de bacilos lcool-cido resistentes (BAAR), contudo a sensibilidade do mtodo baixa, e um resultado positivo sugere fortemente tratar-se de micobactria, mas no informa a espcie. Essa mesma colocao pode ser empregada para colnias isoladas em meios de cultura. Muitas caractersticas, inclusive a propriedade tintorial, superpe-se nos gneros Mycobacterium e Nocardia, tornando difcil, em alguns casos, a diferenciao de ambos (Brasil, 2006). J para o diagnstico bacteriolgico por isolamento requer um longo perodo de incubao (30 a 90 dias), pois o M. bovis cresce lentamente em meios de cultura artificiais. Para permitir o isolamentos de qualquer bactria do gnero Mycobacterium sp, recomendase a semeadura concomitante nos meios de cultura Lwenstein Jensen e Stonebrink Lesslie (Brasil, 2006), como citado anteriormente. Na comparao entre os dois processamentos, Arajo et al. (2004), realizou estudo anatomopatolgico e microbiolgico de 72 amostras teciduais provenientes da inspeo post-mortem de bovinos em matadouros-frigorficos de Mato Grosso do Sul. As leses sugestivas de tuberculose concentravam-se em linfonodos da regio torcica. O exame

histopatolgico utilizado foi o mtodo hematoxilina-eosina (HE) no qual revelou granuloma em 74% das amostras, abscesso em 17,5% e diagnstico inconclusivo em 7,9%. No exame microbiolgico, 23,6% das amostras cultivadas em meio de Stonebrink apresentaram crescimento de bacilos lcool cido resistentes em at 23 dias de incubao. Esses resultados reforam a necessidade de que as leses sugestivas de tuberculose sejam avaliadas simultaneamente atravs de mais de um recurso diagnstico. Embora o diagnstico definitivo da tuberculose esteja fundamentado no isolamento e identificao do agente, esta metodologia apresenta aspectos restritivos para uso em larga escala. Isso porque, as tcnicas bacteriolgicas empregadas apresentam baixa sensibilidade, necessitam de uma grande quantidade de bacilos viveis e consomem muito tempo para crescimento em meios de cultura apropriados (que pode variar entre 4 a 6 semanas). Essas exigncias nem sempre so atendidas em razo dos mtodos drsticos de descontaminao do material, tambm podem inativar alguns bacilos, que compromete o isolamento (Corner, 1994; Haagsma, 1995; Wards et al., 1995; Zanini et al., 2001).

2.11.6- Testes baseados na resposta celular e humoral

2.11.6.1- IFN- (resposta celular)

Sabe-se que a resposta imune de infeces micobacterianas de natureza predominantemente celular e, desta forma, as tcnicas de diagnstico devem basear-se

preferencialmente na mediao das respostas dos linfcitos T. Esta resposta pode ser detectada atravs de ensaios celulares in vitro baseados na dosagem do IFN- produzidos em amostras sanguneas de animais infectados aps estimulao com PPD bovino. Testes preliminares demonstraram que este teste rpido (24 horas) mais sensvel do que o teste intradrmico de tuberculinizao e tambm bastante especfico (>96%). Este teste requer apenas um manuseio do animal, e, uma vez que a estimulao dos linfcitos realizada in vitro, no necessrio aguardar 60 ou 90 dias para repetir o teste, quando os resultados forem inconclusivos. Na realidade, este teste pode ser repetido quantas vezes forem necessrias a qualquer intervalo, uma vez que o animal no inoculado com PPD (Whiple et al., 1995). A interpretao dos resultados baseada em valores numricos, o que torna o teste mais objetivo do que a observao do edemaciamento da pele. Alm dessas vantagens, o teste se mostrou mais sensvel e mais precoce do que o teste intradrmico simples quando testados em rebanho leiteiros na Espanha (Domingo et al., 1995) e no Brasil (Lilenbaum et al., 1999). Este autor tambm afirma que suas maiores desvantagens so o custo e o curto perodo (8 horas) entre a coleta das amostras e o incio do teste. O custo unitrio do teste mais alto do que a tuberculinizao simples e a amostra deve ser processada em um laboratrio equipado com alguns instrumentos que nem sempre esto disponveis no Brasil. O curto intervalo pode ser um impedimento para seu uso em regies distantes dos grandes centros. O veterinrio que colhe a amostra deve traz-la ao laboratrio no mesmo dia, o

que limita o potencial deste teste para rebanhos em propriedades localizadas a mais do que 200 km do laboratrio. Almeida et al. (2006), em ensaio de deteco de IFN- identificou como positivo todos os animais sensibilizados com Mycobacterium bovis, em diferentes momentos, indicando a eficincia do mtodo. Esse resultado est de acordo com Wairavens et al. (2002), que, ao avaliarem animais infectados experimentalmente com M. bovis, detectaram resposta ao teste de IFN- 2 a 4 semanas aps a inoculao. Em condies de campo, o uso estratgico desse teste pode fornecer meios para identificao precoce de bovinos infectados com M. bovis, assegurando assim sua remoo do rebanho (Ryan et al., 2000, Gormley et al., 2004). A identificao de um animal reagente para M. avium no teste de IFN-, antes da inoculao experimental, sugere tratar-se de infeco por micobactrias ambientais ou do complexo MAC, responsveis por reaes inespecficas (OIE, 1992, Inderlied et al., 1993, Roxo et al., 1998, Brasil, 2003, Waters et al., 2003).

2.11.6.2- ELISA (resposta humoral)

Sabe-se que uma parcela da populao tende, por razes provavelmente genticas, a responder atravs de estmulos dos linfcitos B e, consequentemente, da produo de altos ttulos de anticorpos. Os animais que apresentam uma fraca resposta celular, denominados no reativos ou anrgicos ao teste intradrmico, de uma forma geral apresentam uma evoluo mais rpida e grave da enfermidade, j que a produo de anticorpos

normalmente no suficiente para impedir o desenvolvimento e multiplicao do bacilo. Alm destes, tambm os animais que, na fase inicial da infeco respondiam favoravelmente aos testes celulares tendem a se tornar anticorpos responsivos na medida que a doena progride, devido a uma maior carga antignica representada pela multiplicao bacteriana em seu organismo. Uma vez que a infeco nestes animais nem sempre pode ser detectada pelos testes celulares acima citados, faz-se necessrio um sistema complementar de diagnstico que seja capaz de identific-los. importante ressaltar que, devido a sua forma progressiva da doena, estes animais tendem a ser altamente bacilferos e a eliminar formas viveis de M. bovis pelas vias respiratrias, contaminando assim todo o rebanho (Lilenbaum, 1999). Dessa forma, o teste imunoenzimtico ELISA (Enzime Linked Immuno Sorbent Assay) para os antgenos micobacterianos imaturos apresenta valor limitado, mas um teste de ELISA que pesquise anticorpos, para definir o antgeno do M. bovis antes e aps o teste cutneo, parece ser til para detectar os reagentes no especficos (Radostits et al., 2002). Nesse caso, seriam necessrios ao menos dois testes, um deles baseado na avaliao da resposta celular, como os testes da tuberculinizao e um outro capaz de identificar os animais anrgicos, que respondem a infeco atravs da produo de anticorpos. Estes tendem a ser complementares entre si, e, em uma populao, sua aplicao conjunta tende a identificar cerca de 100% dos animais infectados, permitindo dessa forma um controle mais rpido e eficiente da enfermidade (Lilenbaum, 1999).

O uso de ELISA para o diagnstico de tuberculose bovina foi realizada experimentalmente por Lilenbaum et al. 2001, que verificaram valores de 86,7% para sensibilidade e 90,6% para a especificidade do teste. Alm de demonstrar que o teste pode ser til e perfeitamente realizvel em nosso meio este estudo identificou 13 animais (de um total de 220 5,9%) no reativos aos testes intradrmicos de tuberculinizao e, entretanto reativos aos testes de ELISA. Estes animais se mostraram em uma etapa posterior como infectados de acordo com os padres previamente estabelecidos no protocolo do estudo. Assim, os autores alertam que, sem a utilizao de ELISA, estes animais seriam considerados como no infectados e permaneceriam no rebanho, atrasando ou mesmo comprometendo o sucesso do programa de controle da doena. Embora o diagnstico de animais com tuberculose que apresenta em estgios avanados possa ser satisfatoriamente realizado com ELISA, continua a haver uma necessidade para detectar animais infectados com Mycobacterium bovis, com uma boa margem de sensibilidade, especificidade, reprodutibilidade e ampla aplicao em diferentes espcies animais (Sudgen et al., 1997).

2.11.7- Provas bioqumicas

M. tuberculosis e M. bovis podem ser diferenciados usando-se testes fenotpicos como os testes de niacina e produo de nitratos e as provas de crescimento na presena de TCH (hidrazida do cido tio-feno-2-carboxlico) e pirazinamida (Euzby, 2003).

Outros testes bioqumicos so utilizados para identificao das espcies de micobactrias. O acmulo de niacina, reduo de nitrato e nitrito e produo de catalase, permitem uma seleo prvia da micobactria. Provas bioqumicas complementares podem refinar a identificao. A hidrlise de Tween separa o complexo MAIS (M. aviumintracellulare) de outras micobactrias ambientais; a prova de reduo do telurito de potssio separa o complexo MAIS da maioria das outras espcies no cromognicas; (Brasil, 1994; Jorge, 2001). De acordo com Grange et al. (1996), urease, e preferncia de piruvato como fonte de carbono podem ser usados como testes bioqumicos.

2.11.8- Diagnsticos moleculares

Nos ltimos anos, os avanos da biologia molecular e a evoluo dos conhecimentos sobre a imunidade contra as micobactrias levaram ao aparecimento de novos mtodos diretos e indiretos para o diagnstico da tuberculose bovina (Brasil, 2006). Estudo de hibridizao DNA-DNA, sequenciamento de 16SrDNA, das seqncias intergnicas 16S-23S e do gene que codifica para a protena de choque trmico hsp65 evidenciam que os membros deste complexo constituem, de fato, uma nica espcie. Por razes essencialmente ligadas importncia mdica e veterinria do grupo, tais como poder patognico e espectro de hospedeiros de cada espcie, a nomenclatura permanece (Euzby, 2003).

A reao em cadeia de polimerase (PCR polymerase chain reaction) tem sido introduzida na rotina de muitos laboratrios como alternativa para o diagnstico rpido, sensvel e especfico. Esta tcnica permite diferenciar M. tuberculosis de M. bovis por amplificao diferencial de fragmentos dos genes pncA e oxyR (Espinosa de los Monteros et al., 1998), por anlise de restrio enzimtica do gene gyrB amplificado por PCR (Chimara et al., 2004), por amplificao mltipla (multiplex-PCR) de regies do fragmento DR, da sequncia IS6110 e do gene hsp65 (Yeboa-Manu et al., 2001), e pela amplificao do fragmento mtp40, exclusivo de M. tuberculosis (ausente do genoma de M. bovis) (Del Portillo et al., 1991).

2.11.8.1- Sondas moleculares

Embora a utilizao de sondas de DNA tenha se tornado uma ferramenta indispensvel para o laboratrio de Microbiologia, atualmente, estas no so sensveis o bastante para detectar bacilos lcool-cidos resistentes diretamente no espcime clnico do paciente, uma vez que 103 a 104 microorganismos so necessrios, o que lhe confere uma sensibilidade prxima a baciloscopia corada pelo mtodo de Ziehl-Neelsen. Vrios mtodos rpidos vem sendo desenvolvidos, incluindo a utilizao de sondas genticas para a identificao dos complexos M. tuberculosis e M. avium - M. intracellulare. Infelizmente essas tcnicas no so suficientemente sensveis para o diagnstico, com limitada aplicao para o uso diretamente na amostra clnica (Wards et al., 1995).

2.11.8.2- PCR (Reao de Polimerase em Cadeia)

Os mtodos diretos passaram por uma verdadeira revoluo em virtude do desenvolvimento do mtodo molecular denominado reao da polimerase em cadeia (PCR), que tem como princpio bsico a deteco de um fragmento de DNA especfico do gnero ou ento do complexo. Mtodos de biologia molecular esto sendo desenvolvidos para detectar diretamente o agente em amostras clnicas, para identificar o agente isolado pelos mtodos clssicos de bacteriologia e para avaliar a variao gentica dentro de uma espcie de micobactria (Brasil, 2006). A maior parte das pesquisas no campo do diagnstico da tuberculose bovina tem se voltado para a aplicao de provas de DNA para a deteco e identificao dos microorganismos, principalmente o teste de PCR. um mtodo rpido, simples e extremamente sensvel, capaz de detectar at 10 fragmentos DNA de micobactria, o equivalente a 5 organismos (Collins et al., 1994). A tcnica do PCR baseia-se na amplificao exponencial de uma sequncia genmica alvo, pela utilizao, em geral, de um par de iniciadores, conhecido como primers, que flanqueiam a regio genmica que se pretende amplificar pela ao de uma DNA polimerase termo-resistente, em geral a Taq DNA polimerase. Os passos envolvidos nesse processo so automaticamente executados em uma mquina chamada de termociclo ou termociclador, e resumem-se nas seguintes etapas: 1) desnaturao: o DNA molde

aquecido at 94-95 C, fazendo com que o DNA, originalmente fita dupla, seja desnaturado em duas fitas simples; 2) anelamento: a temperatura abaixa at aquela considerada tima para os iniciadores que esto sendo usados no experimento, podendo ficar entre 30-40 C para iniciadores aleatrios, no especficos, ou entre 50-70 C, para experimentos geneespecficos. Nesta etapa, os iniciadores se anelam a regies homlogas do genoma. 3) polimerizao: esta etapa executada a 72 C, que a temperatura tima para a enzima Taq polimerase, que procede ento, a partir das sequncias a polimerizao das fitas complementares, transformando o que era a princpio uma fita dupla de DNA em duas fitas duplas. Deste modo, ao final de 30 ciclos, ter-se- mais de 1 bilho de cpias da sequncia alvo, permitindo que a partir de quantidades nfimas de DNA genmico possa se proceder a anlise completa dos mais diversos sistemas gnicos (Pereira, 2001). Usando esta tcnica, Arajo et al. (2004), identificou o M. bovis isolados de amostras provenientes de carcaas de bovinos com leses sugestivas de tuberculose selecionadas durante a inspeo sanitria de abate em matadouros-frigorficos de Mato Grosso do Sul a partir de colnias sugestivas de micobactrias. Inicialmente, foram confirmadas como bacilos lcool-cido resistentes (BAAR) pela colorao de ZiehlNelseen e identificadas pela tcnica de PCR, empregando-se iniciadores especficos para o M. bovis. Das 72 amostras cultivadas em meio de Stonebrink, verificou-se presena de BAAR em 17 (23,6%), sendo a espcie M. bovis confirmada em 13 (76,5%). As sequncias de oligonucleotdeos, que constituem os iniciadores, agem como sondas e so consideradas elementos chaves para garantir a especificidade da reao, uma

vez que a amplificao do DNA s ser possvel se houver a hibridizao do iniciador com a sequncia alvo do DNA da amostra. Os fragmentos amplificados podem ser evidenciados em gel de eletroforese corado com brometo de etdio, ou por iniciadores marcados com istopos radioativos, ou fluorescentes ainda empregando-se mtodos enzimticos ou de quimiluminescncia (Abraho, 1998; Andrade, 1993; Collins et al.; 1994). Comparada ao diagnstico bacteriolgico e bioqumico, a tcnica de PCR, assim como outros mtodos moleculares, so considerados um avano promissor no diagnstico rpido da tuberculose, tanto por reduzirem o tempo de diagnstico de meses para poucos dias, como por apresentarem a vantagem de elevada especificidade e sensibilidade, alm da capacidade de detectar quantidades muito pequenas de bacilos vivos ou mortos na amostra (Abraho, 1998; Kocagoz et al., 1993; Beige et al., 1995). Todavia, o sucesso do mtodo do PCR na rotina de diagnstico da tuberculose est na dependncia de uma srie de parmetros, tais como: a qualidade do DNA, que deve estar livre de contaminantes (os quais interferem na amplificao) principalmente enzimas proteoliticas; na escolha correta dos iniciadores para amplificao do material, assim como no emprego de mtodos de extrao de cidos nuclicos adequados, especialmente para amostras paucibacilares (Klaster et al., 1998; Roring et al., 2000; Zanini et al., 2001). Outra alternativa para a identificao rpida de vrias espcies de micobactrias encontradas em amostras clnicas ou em isolados que crescem em meio lquido ou slido consiste no estudo de protenas de choque trmico (heat shock) empregando-se anticorpos especficos (Telenti et al., 1993; Taylor et al., 1997).

Em pesquisa de Salazar (2005), no qual foram examinados 57.641 animais abatidos entre novembro de 2004 e agosto de 2005 em trs matadouros-frigorficos sob Inspeo Estadual, 27 (0,05%) foram condenados por apresentarem linfonodos com leses sugestivas de tuberculoses. Essas leses, foram avaliadas por meio histopatolgico e bacteriolgico, e, seis (22,2%) amostras apresentaram isolamento de colnias com morfologia compatvel com Mycobacterium bovis. Estas amostras, em seguida, foram avaliadas por diagnstico molecular. A reao em cadeia polimerase (PCR) e anlise de PCR por enzimas de restrio (PRA) possibilitaram identificar o gnero Mycobacterium ssp em todas as seis amostras isoladas, sendo quatro (66,7%) amostras, a espcie Mycobacterium bovis, e uma, a subespcie Mycobacterium paratuberculosis. J Furlanetto et al., (2007), utilizou variantes da tcnica convencional de PCR. Um rebanho bovino leiteiro de 50 animais da cidade de Maca (RJ) com histrico clnico de tuberculose foi testado por tuberculinizao intradrmica, dos quais 34 animais foram considerados reativos e ento abatidos. Durante a necropsia, 91 amostras que apresentaram leses foram coletadas. As amostras foram descontaminadas por Petroff, inoculadas em meio Lwenstein Jensen com piruvato de sdio e incubadas por 90 dias a 37 C. Aps crescimento, os bacilos lcool-cido resistentes (BAAR) foram submetidos a mltipla PCR. Dois pares de oligonucleotdeos foram usados para amplificao simultnea de duas regies internas das sequncias IS6110 (245 pb) e RvD1Rv2031c (500 pb). Das 91 amostras coletadas, 17 colnias foram isoladas e as duas regies alvo foram amplificadas

em 15 colnias (88,24%). As duas amostras negativas (11,76%) foram confirmadas como micobactrias no tuberculosas por PCR-RFLP. Dando continuidade ao assunto, ultimamente, tem sido utilizados diversos iniciadores para amplificar a sequncia de RNAr 16S-23S, correspondentes as sequncias de insero em cromossomo de micobactrias, IS6110 e IS1081, como tambm genes codificadores para protenas, tais como, a MPB70 de 24 KDa, o Antgeno B de 38 KDa e a HSP de 65 KDa (Fisanotti et al., 1998; Perumalla et al., 1999; Zanini et al., 2001; Leite et al., 2003). A tcnica fingerprinting, tambm tem sido utilizada por alguns laboratrios de diagnstico, com o intuito de distinguir diferentes espcies do complexo MTB e algumas amostras pertencentes ao M. bovis, e o mtodo mais utilizado o mtodo de oligotipos espaadores ou spacer oligotyping ou Spoligotyping. Tambm seguem o padro de corte fingerprinting as tcnicas PGRS (Polymorphic GC Rich Repeat Sequence), DR (Direct Repeat), RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorph analysis) e VNTR (Variable Number Tandem Repeat) ( Zanini et al., 2001). Somando-se as tcnicas mencionadas, a reao em cadeia da polimerase em tempo real (PCR-real time), MIRU (Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit) e SNP (Synonymous Single Nucleotide Polymorphisms) tambm vem sendo implementadas, como as demais tcnicas, na metodologia de diagnstico rpido de Mycobacterium bovis, tornando-se ferramentas para estudos epidemiolgicos da transmisso de tuberculose bovina, dando notoriedade a um moderno campo de pesquisa, a epidemiologia molecular,

onde a agilidade e rapidez na deteco do M. bovis podem ser determinantes na escolha desses mtodos, que diferenciam as espcies e amostras diferentes de uma espcie, ao nvel do DNA (Salazar, 2005).

2.12- CONTROLE

Programas de controle e erradicao da tuberculose bovina esto sendo aplicados em diversos pases, especialmente nas Amricas, baseando-se no uso do teste tuberculnico e no sacrifcio dos animais reagentes, como preconizado por normas internacionais. Alguns pases adotaram alm da capacitao e credenciamento de mdicos veterinrios para o diagnstico da tuberculose bovina, a certificao de rebanhos livres, a fim de estimular as medidas de controle e erradicao da doena (Dobbelaer et al., 1983; Organizacion Panamericana de la Salud, 1992; Caffrey, 1994; Kantor & Ritacco, 1994; Tweddle & Livingstone, 1994; Haagsma, 1995). Um dos benefcios dos programas de erradicao da tuberculose bovina, alm de diminuir as perdas econmicas e os entraves para o comrcio exterior de animais e seus produtos, a preveno da doena na populao humana (Organizacin Panamericana de la Salude, 1992; Haagsma, 1995). Pode ser adotado como medida de controle instalaes adequadas, que permitem boa ventilao e exposio direta luz solar, contribuindo para prevenir a contaminao do ambiente. Recomenda-se higienizar e desinfetar periodicamente todas as instalaes,

especialmente os bebedouros e os cochos (hipoclorito de sdio 5%, fenol 5%, formaldedo 3%, cresol 5%). Constituem medidas importantes o monitoramento dos rebanhos pela deteco de leses tuberculosas realizado pelo servio de inspeo de carcaas quando do abate dos animais - e o controle de trnsito e de participao em exposies, feiras e leiles. Tambm, a inspeo sanitria dos produtos de origem animal destinados ao consumo humano e a pasteurizao ou esterilizao do leite e derivados diminuem os riscos de transmisso do M. bovis ao homem (Brasil, 2006). Medidas gerais de higiene, cuidado na introduo de novos animais no rebanho (com testes negativos provenientes de rebanhos livres, quarentenrio e isolamento de animais suspeitos) tambm so importantes para evitar que a doena se instale na propriedade (Roxo, 1995). Apesar de diversos estudos sobre vacinao e tratamento da tuberculose bovina, at o presente, os resultados obtidos no justificam a adoo dessas medidas como forma de controle da enfermidade, uma que testes para diferenciar animais vacinados e enfermos so complexos e onerosos. Alm disso, em pases que alcanaram grande sucesso com programas implementados para o combate a tuberculose bovina, a vacinao no foi utilizada e, portanto, no foram contempladas na estratgia de ao do Programa Nacional de Controle e Erradicao da Brucelose e Tuberculose - PNCEBT (Brasil, 2006).

3- CONCLUSO

Aps esta reviso bibliogrfica conclui-se que a tuberculose bovina uma enfermidade de importncia mundial por ser uma zoonose que afeta animais e o homem, causando perdas econmicas em diversos nveis da cadeia produtiva. Entretanto, devido a complexidade da patologia e diagnstico no existe um consenso mundial estabelecido quanto ao melhor mtodo para diagnstico das micobacterioses, indicando a necessidade da continuidade dos estudos.

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