Rev Cubana Farm 1998;32(2):106-12

Empresa de Productos Biolgicos "Carlos J. Finlay"

VALIDACIN DE TCNICAS ANALTICAS UTILIZADAS EN EL CONTROL DE LA CALIDAD

Miriam Daz de Armas,1 Idania Hernndez Oramas,2 Marcia Martnez de Santelices Cuervo,3 Ma. Victoria Licea Torns,4 Lidaila Gmez Baobre,5 Gloria Louro Gonzlez,6 Yelina Morera Fernndez7 y Esther Gonzlez Hernndez8

RESUMEN
Se seleccion una metodologa y se elabor un procedimiento normativo operacional para la validacin de mtodos analticos, utilizados en la evaluacin de las producciones actuales para los requerimientos de calidad. Se comprob la utilidad de dicho procedimiento mediante la validacin de los mtodos volumtricos y espectrofotomtricos que intervienen en el control de la calidad del juego de reactivos para determinacin de hemoglobina en sangre. Se demostr mediante el diseo experimental y los procedimientos estadsticos empledos que dichos mtodos son lineales (r2>0,98), exactos (Fexp.< Ftab. y texp. < ttab.), precisos (CV3 %) y especficos (respuesta no significativa), por lo cual son confiables para ser utilizados en la comprobacin de las especificaciones de calidad del juego de reactivos. Descriptores DeCS: JUEGO DE REACTIVOS PARA DIAGNOSTICO; HEMOGLOBINA/ anlisis; CONTROL DE CALIDAD.

La validacin de un mtodo analtico es el proceso por el cual queda establecido por estudios experimentales que la capacidad del mtodo satisface los requisitos para la aplicacin analtica deseada.1 sta se fundamenta en la determinacin de diversos parmetros que se aplican de acuerdo con la categora a la que pertenezcan.2 Para el desarrollo de un nuevo produc1 2 3 4 5 6 7 8

to es necesario la utilizacin de mtodos analticos que permitan cuantificar el producto en forma de materia prima o como principio activo de la formulacin con un alto grado de confiabilidad.3 En la actualidad los laboratorios de control de la calidad de la Industria Mdico-Farmacutica no slo se ocupan de analizar si un producto cumple o no con sus requisitos de calidad mediante la utiliza-

Master en Ciencias. Licenciada en Farmacia. Investigadora Agregada. Licenciada en Farmacia. Aspirante a Investigadora. Licenciada en Qumica. Investigadora Agregrada. Licenciada en Qumica. Aspirante a Investigadora. Licenciada en Matemtica. Tcnica en Productos Biolgicos. Tcnica en Qumica Industrial. Tcnica en Metrologa.

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cin de mtodos analticos establecidos para cada uno de ellos, sino tambin se esfuerzan para validar cada mtodo analtico utilizado en el control de la calidad de sus productos. Basado en este criterio el laboratorio de control qumico inici la validacin de sus mtodos analticos con la que interviene en el control de la calidad de un juego de reactivos que se encuentra en fase de desarrollo, y posteriormente ser sometido a un estudio de estabilidad. En este trabajo se muestran los resultados obtenidos en la validacin de las tcnicas utilizadas en el control de la calidad del juego de reactivos para la determinacin de hemoglobina en sangre, compuesto por reactivo 1 (solucin de cianuro de potasio 1g/100 mL) y reactivo 2 (tabletas de ferricianuro de potasio 200 mg/tab),4 as como los resultados de la validacin del mtodo de anlisis de la cianometaglobulina utilizado en el ensayo funcional del juego de reactivos.5

concentracin del principio activo en la solucin de cianuro de potasio 1 % y en las tabletas de ferricianuro de potasio,4 y de la tcnica utilizada para el anlisis de la cianometahemoglobina en el ensayo funcional del juego de reactivos,5 se escogieron los parmetros adecuados segn los criterios de validacin que aparecen reportados en el Procedimiento Normativo Operacional 3.09.001.96 de la Empresa de Productos Biolgicos " Carlos J Finlay". Validacin de mtodos volumtricos Los mtodos de valoracin del cianuro de potasio y el ferricianuro de potasio, fueron validados mediante la evaluacin de los parmetros siguientes:

- Linealidad: Se prepararon 6 soluciones

de concentraciones entre 70 y 120 %, incluyendo el 100 %. Las concentraciones fueron las siguientes: cianuro de potasio (7,0; 8,0; 9,0; 10,0; 11,0; 12,0 mg/mL); ferricianuro de potasio (4,6; 5,3; 6,0; 6,6; 7,3; 8,0 mg/mL). Se realizaron 3 rplicas de cada una. Se determin la recta de regresin lineal, as como los coeficientes r y r2. Para el test de linealidad se consider el coeficiente de variacin para el factor de respuesta f (CVf), la desviacin estndar relativa de la pendiente (Sbrel) y la t de Students prctica (Tp) y la F de Fisher prctica (Fp) para p= 0,01. Precisin (repetibilidad, reproducibilidad y robustez) Repetibilidad y reproducibilidad: Se evaluaron las muestras durante 10 d. La concentracin terica del cianuro de potasio fue de 1,0 mg/mL y la del ferricianuro de potasio 6,6 mg/mL. Se realizaron 4 rplicas por la maana y 4 rplicas por la tarde, y se analizaron estadsticamente los resultados obteni-

MTODOS
1. Requisitos previos a la validacin. Para garantizar la confiabilidad de los resultados se asegur el cumplimiento de los requisitos siguientes:6

- Calificacin del personal en el uso de

los mtodos a validar.

- Calibracin de los instrumentos de 2. medicin y las medidas de capacidad de vidrio utilizado. Utilizacin de reactivos apropiados y soluciones de trabajo valoradas. Observacin de las medidas de seguridad. Seleccin de los parmetros apropiados de acuerdo con la clasificacin del mtodo analtico y el tipo de validacin a realizar: Para validar las tcnicas analticas utilizadas para la evaluacin de la

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- dos en el da y entre das. Se determin

el coeficiente de variacin (CV) y se aplic la prueba Anova de clasificacin simple. Robustez: Se analiz mediante un diseo factorial 23, segn la tabla de Yourden y Steiner,6 considerando las variables: reactivo recin preparado, reactivo con das de preparado, temperaturas de trabajo diferentes (4 C y temperatura ambiente) y 2 analistas; se realiz cada determinacin por triplicado. Exactitud: Para el mtodo del ferricianuro de potasio se realiz un ensayo de recuperacin, analizando 3 muestras de concentraciones diferentes (5,3; 6,6 y 8,0 mg/mL) por triplicado, preparadas a partir de un placebo.

- Linealidad: Se evalu la linealidad del

sistema instrumental al estudiar 6 soluciones por triplicado en un rango de concentraciones de 20 a 200 % (4,2; 8,5; 12,6; 16,8; 18,2; 21,0 g/dL). Se comprob estadsticamente sta y se evalu la linealidad del mtodo al analizar 6 soluciones por triplicado en un rango de concentraciones de 80 a 120 % (6,2; 8,2; 10,2; 12,6; 16,4; 18,2 g/dL). Se determin la recta de regresin lineal y se calcularon los coeficientes de r y r2. Para el test de linealidad se hallaron el coeficiente de variacin (CVf) para el factor de respuesta f; la desviacin estndar relativa de la pendiente (Sbrel) y la F de Fisher prctica (Fp) para p = 0,05. Precisin (repetibilidad, reproducibilidad y robustez). Repetibilidad y reproducibilidad: Se consideraron muestras de concentrac i o n e s a l t a s ( 1 8 , 0 g / d L ) , medias (12,0 g/dL) y bajas (4,8 g/ dL) de hemolizados de produccin nacional y se estudiaron por el mtodo propuesto durante 10 d, maana y tarde, realizando 4 repeticiones en cada sesin. Se determin el coeficiente de variacin (CV) y se aplic la prueba Anova de clasificacin simple. Robustez: Se analiz mediante un diseo factorial 23 segn la tabla de Yourden y Steiner,6 considerando las variables: 2 tiempos de incubacin de la reaccin (15 y 40 min), 2 temperaturas de trabajo (temperatura ambiente y 37 C) y 2 analistas; se realiz cada determinacin por triplicado. Exactitud: Se compar el juego de reactivos diseado con un juego de reactivos de la firma comercial Wiener, en un total de 100 muestras de pacientes en paralelo y por duplicado. Los resultados obtenidos por ambos mtodos se compararon mediante un anlisis de regresin lineal.

Se hall la varianza, la G de Cochran y la t de Student experimental para p = 0,05 en el ensayo de recuperacin. Para el mtodo del cianuro de potasio se prepar un patrn de analito al 100 % de concentracin (1g/100 mL) y una solucin placebo a la cual se aadi la cantidad necesaria de analito para obtener la concentracin al 100 %; ambas soluciones se valoraron utilizando el mismo mtodo analtico. Se determin la F de Fisher y la t de Student para p = 0,05. - Especificidad: Considerando el factor degradante, previamente seleccionado, se evaluaron conjuntamente una solucin de producto degradado y una solucin patrn al 100 % de concentracin, utilizando el mismo mtodo analtico. Validacin de un mtodo espectrofotomtrico

El mtodo de la cianometahemoglobina utilizado en el ensayo funcional del juego de reactivos para determinacin de hemoglobina en sangre, se valid de acuerdo con los criterios establecidos segn bibliografa consultada.7 Los parmetros son los siguientes:

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- Sensibilidad: Los lmites de deteccin y cuantificacin se calcularon tericamente utilizando el valor de la ordenada en el origen obtenida para la recta de calibracin en el ensayo de linealidad. Los lmites calculados se comprobaron experimentalmente mediante el anlisis repetitivo de 10 muestras de 2 soluciones preparadas a las concentraciones obtenidas y los resultados fueron evaluados por un Anova de clasificacin simple.

RESULTADOS
En la tabla 1 se presentan los resultados obtenidos en la validacin de 2 mtodos volumtricos. Como se puede observar en esta tabla, las tcnicas analticas em-

pleadas en la cuantificacin de los principios activos cianuro de potasio y ferricianuro de potasio, cumplen con los rangos de aceptacin de acuerdo con el estudio estadstico realizado para los parmetros estudiados (linealidad, precisin, exactitud y especificidad), en las concentraciones seleccionadas y las condiciones de trabajo establecidas. En la tabla 2 se observan los valores obtenidos para el ensayo funcional del juego de reactivos desarrollado, considerando para su evaluacin los parmetros de linealidad, precisin a concentraciones bajas, medias y altas del analito (como se recomienda en la bibliografa consultada); adems de exactitud y sensibilidad del mtodo, los cuales se encuentran dentro de los rangos de aceptacin establecidos.

TABLA 1. Resultados de la validacin de mtodos volumtricos

Parmetro Linealidad

Procesamiento estadstico . Coeficientes de correlacin y determinacin . Test de linealidad

Valoracin del cianuro de potasio r2 = 0,9989 r = 0,9994 CVf = 0,63 % Sbrel = 0,84 % texp = 118,50 Fexp = 14092,62 FAexp = 2,64 a = -0,15 IC(a) = (-0,32; 0,10) texp = 1,95 CVrepet=0,40 % CVReprod = 1,83 % Diferencias no significativas Fexp =1,43 Diferencias no significativas para cada factor Fexp = 1,35 texp = 0,51

Valoracin del ferri- Criterios de cianuro de potasio aceptacin r2 = 0,9925 r = 0,9962 CVf = 1,89 % Sbrel = 1,98 % texp = 46,05 Fexp = 2120,78 FAexp = 4,17 a = -0,18 IC(a) = (-0,17; 0,29) texp = 1,27 CVRepet = 0,28 % CVReprod = 1,60 % r2 ,98 r 0,99 CVf 5 % Sbrel 2 % texp t(16; 0,01) =2,92 Fexp F(1; 16; 0,01) = 8,53 FAexpFA (4; 12; 0,01)=5,41 a 0 IC(a) incluye el 0 texp < t(16; 0,05) = 2,12 CVRepet 3 %

. Test de proporcionalidad

Precisin

. Coeficientes de . Repetibilidad y variacin . Test de Anova de clasificacin simple . Factorizacin

Reproducibilidad

. Robustez

Exactitud

. . . .

Test Test Test Test

de Fisher de Student de Cochran de Student

Especificidad

No significativa

CVReprod 3 % CVReprod < 2 CVRepet Diferencias no sigDiferencias no significativas nificativas Fexp = 1,31 Fexp < F(9; 70; 0,01) = 2,82 Diferencias no signi- Diferencias no sigficativas para nificativas cada factor Fexp < F(9; 9; 0,05) = 3,18 texp < t(18; 0,05) = 2,10 Gexp = 0,30 Gexp < G(3; 3; 0,05) = 0,87 texp = 0,13 texp < t(8; 0,05) = 2,30 No hay respuesta Respuesta no significativa

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TABLA 2. Resultados de la validacin del mtodo espectrofotomtrico

Parmetro

Procesamiento estadstico

Resultados

Criterios de aceptacin

Linealidad

Coeficientes de correlacin y determinacin Test de linealidad

Sistema instrumental r2 = 0,9990 r = 0,9995

CVf = 0,61 % Sbrel = 0,25 % texp = 399,86 Fexp = 159887,55 FAexp = 3,68

Mtodo r 2 =0,9997 r = 0,9998

CVf = 0,45 % Sbrel = 0,41 % texp = 242,64 Fexp = 58876,97 FAexp = 4,98

r2 0,98 r 0,99

CVf 5 % Sbrel 2 % texp t(16; 0,01) = 2,92 Fexp F(1;16; 0,01) = 8,53 FAexp FA(4;12; 0,01) = 5,41

Test de proporcionalidad

a = 0,15 a0 IC(a) = (-0,20; 0,50) IC(a) incluye el 0 texp = 0,009 texp < t(16; 0,05) = 2,12

Precisin Repetibilidad y Coeficientes de Reproducibilidad variacin

C onc. bajas Conc. medias Conc. Altas CVRepet = 0,43 % 0,16 % 0,14 % CVReprod = 0,11 % 0,22 % 0,02 %
Diferencias no significativas Fexp = 0,31 1,21 Diferencias no significativas r2 = Fexp IC(b) IC(a) b = a = b = 0,9960 = 8856,66 = (0,96; 1,01) = (-0,09; 0,43) 0,9859 0,15 2,88

CVRepet 3 % CVReprod 3 % CVReprod < 2 CVRepet Diferencias no significativas Fexp < F(9; 70; 0,01) = 2,82 Diferencias no significativas para cada factor r2 >0, 98 Fexp > F(1;98;0,01) = 6,85 IC(b) incluye el 1 IC(a) incluye el 0 b 1 a 3 LD = b CV = 0,52 % CV 3 % CV = 0,62 % 10 a LC = b

Test de Anova de clasificacin simple

Robustez Exactitud Factorizacin Anlisis de regresin lineal

0,68

Sensibilidad

Coeficiente de variacin

LD = 0,16 g/dL LC = 0,52 g/dL

DISCUSIN
Al evaluar estadsticamente la linealidad de los mtodos analticos validados y del sistema instrumental para el mtodo espectrofotomtrico, se obtuvieron coeficientes de correlacin (r) y de determinacin (r2) que demuestran que existe regresin entre las variables concentraciones y las respuestas medidas. Para confirmar que dicha regresin era lineal se aplicaron diferentes test de linealidad, considerando el anlisis de la

varianza (FAexp) el tests ms riguroso que corrobor la linealidad de los mtodos y del sistema instrumental. De igual forma se comprob que se cumple la condicin de proporcionalidad y el error sistemtico de cada mtodo es despreciable. Por otra parte, el estudio de precisin mostr una buena repetibilidad y reproducibilidad de los resultados de acuerdo con los criterios de aceptacin, mientras que los factores estudiados para cada mtodo en el ensayo de robustez no influyeron significativamente en los

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resultados, por lo cual podemos considerar que dichos mtodos son precisos. Para evaluar la exactitud se aplicaron diferentes procedimientos experimentales y estadsticos que responden a las caractersticas propias del mtodo analtico validado. En el caso del mtodo de valoracin del ferricianuro de potasio se comprob que el rango de concentraciones estudiado no influye en la variabilidad de los resultados, ya que se cumpli con el criterio del test de Cochran (G exp), adems no se obtuvieron diferencias significativas entre la recuperacin media y el 100 % al aplicar el test de Student (texp), confirmando la buena exactitud del mtodo. Se determin igualmente que el mtodo de valoracin del cianuro de potasio es exacto, ya que no existen diferencias significativas entre los resultados, ni por su varianza (test de Fisher) ni por la diferencia de medias (test de Student); mientras que para el mtodo de determinacin de la cianometahemoglobina se obtuvo un 98 % de equivalencia con el mtodo de referencia de la firma comercial Wiener y una recta de regresin lineal: y=0,9859 x + 0,1754, que garantiza la exactitud del mtodo. Adems, se comprob que ambos mtodos volumtricos son especficos, ya que los productos de degradacin en un caso no interfieren en la valoracin, mientras

que en el otro la respuesta es insignificante. Los lmites de deteccin (LD) y cuantificacin (LC) calculados para el mtodo de determinacin de la cianometahemoglobina, fueron corroborados experimentalmente. El mtodo es sensible, ya que no se encontraron diferencias significativas entre los resultados obtenidos para cada lmite y los coeficientes de variacin para cada uno de ellos fueron menores que el coeficiente de variacin permitido para el mtodo. Todos los resultados obtenidos en la validacin de los mtodos volumtricos y espectrofotomtrico permiten asegurar que son confiables, ya que cumplen los criterios de validacin reportados por Castro y otros en 1989 y por Aguilar y otros en 1992. Adems ambos mtodos pueden ser utilizados tanto en el control de la calidad como en el estudio del juego de reactivos para determinacin de hemoglobina en sangre. De esta manera se comprob experimentalmente la utilidad del procedimiento establecido para la validacin de mtodos analticos; y queda abierto el camino a la validacin de todos los mtodos analticos en el control de la calidad.
AGRADECIMIENTOS Agradecemos a la licenciada Yaim Farias Domnguez por su desinteresada colaboracin y sus sabios consejos en la interpretacin estadstica de los resultados.

SUMMARY
A methodology was selected and a normative operative procedure was prepared for the validation of analytical methods used in the evaluation of the present productions for quality requirements. The usefulness of this procedure was proved by the validation of the volumetric and spectrophotometric methods taking part in the quality control of the reagent kits for determining haemoglobin in blood. It was demostrated by the experimental design and the statistical procedures used that such methods are lineal (r2 > 0.98), exact (Fexp < Ftab and Texp < ttab), precise (CV 3 %) and specific (no significative response). Therefore, they are reliable and may be used in the checking of the quality specifications of the reagent kits. Subject headings: REAGENT KITS, DIAGNOSTIC; HEMOGLOBINS/analysis; QUALITY CONTROL.

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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1. Aguilar G, Alcntara A, Chrvel A, Garca JL, Garzn A, Guerrero ME, et al. Validacin de mtodos analticos. Comit de Elaboracin de Guas Oficiales de Validacin de la Direccin General de Control de Insumos para la Salud, SSA. Colegio Nacional de Qumicos Farmacuticos Biolgicos. Mxico AC, 1992. 2. United States Pharmacopoeial Convention. USP XXII. United States Pharmacopoeia. 22 ed. Easton: Mark Printing; 1990:1225,1710. 3. Rampazoo P. Standardisation and Validation of Analytical Methods in the Pharmaceutical Industry. II Farmaco 1990;45:807-15. 4. Analar. Standards for Laboratory Chemicals. 6 ed. London: Analar Standards LTD; 1967:390-1, 395. 5. Beal PJ, Cook LP, Lovric VA. Hemoglobin. Pathology 1974;6:251-4. 6. Castro M, Gascn S, Pujol M, Sans JM, Vicente L. Validacin de mtodos analticos. Asociacin Espaola de Farmacuticos de la Industria. Monografa AEFI. Seccin Catalana. Comisin de Normas de Buena Fabricacin y Control de la Calidad. Edicin Hewlett Packard, 1989. 7. Calpena AC, Escribano E, Fernndez C. Validacin de los mtodos analticos. Farm Clin 1991;7(9):749-58. Recibido: 24 de noviembre de 1997. Aprobado: 31 de enero de 1998. Lic. Miriam Daz de Armas. Empresa de Productos Biolgicos "Carlos J. Finlay". Infanta No. 1162, municipio Centro Habana, Ciudad de La Habana, Cuba.

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