BIOLOGIA MOLECULAR

Prof. Dr. Jos Luis da C. Silva

BIOLOGIA MOLECULAR

A Biologia Molecular o estudo da Biologia em nvel molecular, com especial foco no estudo da estrutura e funo do material gentico e seus produtos de expresso, as protenas. Mais concretamente, a Biologia Molecular investiga as interaes entre os diversos sistemas celulares, incluindo a relao entre DNA, RNA e sntese protica.

Relao com outras cincias biolgicas de nvel molecular.

Programa (Ementa)
Viso histrica do gene 11/06 Estrutura e funo do DNA e RNA 11/06 Replicao, transcrio e traduo 11/06 Regulao da Expresso gnica 12/06 Tecnologia do DNA recombinante 12/06 Genmica e Bioinformtica 09/07 PCR e Marcadores moleculares 09/07 Aplicaes da Biologia molecular 10/07 (Seminrios) Eletroforese em gel 10/07 (prtica)

Evoluo do conceito de gene

O conceito de gene no esttico, ele se desenvolveu atravs de vrias fases, desde que Wilhelm Johansen criou o termo em 1909, e continua evoluindo 1866 Mendel definiu como carter ou fator unitrio que controlava uma caracterstica fenotpica, tal como a cor das flor em ervilhas. 1900 Garrod definiu como um gene mutante-um bloqueio metablico 1939 Beadle e Tatum definiram como um gene uma enzima 1960 Yanofsky e Brenner redefiniram um gene um polipeptdeo Refinando o conceito: O gene uma unidade de informao gentica que controla a sntese de um polipeptdeo ou uma molcula de RNA estrutural

Do gene ao efeito no organismo

Estrutura e funo dos cidos nuclicos

Estrutura dos cidos nuclicos

Nucleotdeos

Ribonucleotdeo

Estrutura dos cidos nuclicos

Bases Nitrogenadas

Estrutura dos cidos nuclicos

Fosfato 5

Estrutura 1ria covalente

3 OH

Polmero de nucleotdeos

Estrutura dos cidos nuclicos

As cadeias polinucleotdicas adotam estruturas em Hlice

Estrutura dos cidos nuclicos

Dupla hlice do DNA Watson e Crick (1953)

DNA B a forma mais estvel em condies fisiolgicas

Estrutura dos cidos nuclicos

Formas de DNA
Formas A e Z so encontradas em cristais de DNA. A forma A favorecida em solues mais concentradas. A forma Z pode gnica estar e

associada com a regulao da expresso recombinao in vivo.

Dogma central da Biologia molecular

A replicao semiconservativa

Processo semiconservativo: Durante a replicao, as duas fitas do DNA parenteral so copiados, originando molculas filhas com somente uma das fitas novas sintetizadas. (Meselson e Stahl, 1958)

Replicao do DNA
O mecanismo de replicao est baseado no pareamento das bases da dupla hlice do DNA. A estrutura do DNA contm a informao necessria para perpetuar sua sequncia de bases

Genoma procaritico

O genoma bacteriano circular constitue um nico replicon

Um nica origem de replicao em E.coli (OriC, 245 pb)

DNA-POLIMERASES
DNA-polimerase a enzima que faz a sntese de uma nova fita de DNA. Possui a capacidade de adicionar nucleotdeos na extremidade 3OH de uma regio pareada do DNA 5 3.

Movimento da forquilha de replicao: A partir da origem, a replicao prossegue ao longo da fita de DNA, em uma ou ambas as direes, seqencialmente at o termino. Direo da replicao A adio dos nucleotdeos para o crescimento da cadeia sempre no sentido 5 3.

Forquilha de replicao Fita contnua (lder)

Fita descontnua

DNA polimerases de E. coli

PROTENAS NA FORQUILHA DE REPLICAO DA E. coli

Animao replicao

A transcrio realizada por um sistema enzimtico que converte a informao gentica de um segmento de DNA (gene) em uma fita de RNA complementar fita molde.

Transcrio

Fita molde (anti-senso) e codificadora (senso)

A transcrio de procariotos e de eucariotos possui trs eventos principais: Iniciao - A RNA polimerase se liga a dupla fita do DNA na regio denominada promotor. A iniciao um passo muito importante na expresso gnica!!! Elongamento - adio covalente de nucleotdeos a extremidade 3' da cadeia polinucleotdica crescente; isto envolve o desenvolvimento transitrio de um curto trecho de DNA fita simples. Trmino - Reconhecimento da sequncia de trmino e liberao da RNA polimerase. Embora a transcrio seja realizada pela RNA polimerase, outras enzimas so necessrias para produzir o transcrito, alm de outras protenas. Estes fatores ou se associam diretamente com a RNA polimerase ou auxiliam na formao do aparato transcricional. O termo utilizado para descrever estas protenas fatores de Transcrio.

Iniciao: Reconhecimento dos promotores

Reconhecimento dos promotores pela subunidade 70 da RNA polimerase em E. coli. Em condies fisiolgicas a RNA pol est provavelmente ligada ao DNA, mas o reconhecimento depende da subunidade sigma.
ATG

Extremidade 5 do gene (Montante)

Sequncias consenso Regies -35 e -10 (TATA box ou Pribnow box)

Essas sequncias so reconhecidas pela subunidade sigma70. Outros promotores apresentam alguma variao nas sequncias consenso. Aps a ligao ao promotor e incio da sntese, a subunidade sigma liberada e funciona como um catalisador para outra RNAP ligada um outro promotor ou ao mesmo promotor.

O reconhecimento do promotor depende de seqncias consensuais. Um promotor tpico possui trs componentes, sendo formado pelas seqncias consensuais em 10 e 35 e pelo stio de incio da transcrio.

A comparao com mais de 100 genes de E. coli, chegou-se as seguintes concluses: 1) 2) O primeiro nucleotdeo a ser transcrito (+1) geralmente uma purina (A ou G). Duas seqncias so altamente conservada nos genes comparados: uma localizada na regio 10, que tem como consenso a seqncia TATAAT (TATA box ou Pribnow box), e outra localizada na regio 35, que tem como consenso a seqncia TTGACA, Que as regies 10 e 35 so separados por 171 nucleotdeos (equivale a duas voltas da hlice).

3)

Os fatores sigma de E. coli reconhecem promotores com diferentes seqncias consensuais

Complexo de Iniciao

Complexo fechado

Complexo aberto e iniciao

Liberao do sigma

Complexo aberto bolha de transcrio

Fase: Alongamento
Aps o desligamento da subunidade sigma ocorre uma alterao conformacional na RNAP tornando-a mais esfrica e ativa durante o processo de alongamento. O processo no contnuo em algumas regies, principalmente porque ocorre traduo simultnea do mRNA em bactrias. Ocorrem paradas rpidas e retomadas da transcrio. A processividade alta e a transcrio tem um ndice de erro de 10-5.

Ao da toposiomerases no relaxamento dos supercoil positivo

Fase: Trmino da transcrio

O RNA sintetizado participa ativamente do trmino de sua sntese, formando estruturas secundrias ou ligando-se a outros fatores. Em E. coli: Terminao dependente de rho () Terminao independente de rho ()

Terminao independente de rho ()

Este tipo de terminao responsvel pelo trmino da transcrio de 90% dos genes bacterianos. Uma sequncia na regio 3 do gene, sinaliza o final da sntese do RNA. uma sequncia repetida de As na fita molde (Us no RNA) que ocasiona uma longa pausa no alongamento da cadeia. Nessa pausa ocorre o pareamento A:U entre a fita molde e o RNA desestabilizando o hbrido RNA/DNA. Este processo auxiliado por uma protena denominada NusA. 15-20 nucleotdeos antes do trmino rico em As formado por sequncias autocomplematares que formaro grampo de RNA.

Terminao dependente de rho ()

No existem sequncias ricas em As especficas, mas podem haver sequncias autocomplementares. A protena Rho migra at encontrar a RNA pol parada e sua atividade helicase DNA/RNA dependente de ATP auxilia no desligamento do RNA sintetizado.

Transcrio em Eucariotos
RNA - POLIMERASES

RNA - Polimerase I: rRNA RNA - Polimerase II: mRNA RNA - Polimerase III: tRNA e outros RNAs nucleares pequenos

Um gene tipo transcrito pela RNA-polimerase II possui um promotor que se estende a montante a partir do stio onde a transcrio iniciada. O promotor contm vrios elemento de seqncias curtos (<10pb), aos quais se ligam os fatores de transcrio, espalhados por >200pb. Um reforador (enhancer), contendo elementos mais compactamente organizados, ao qual tambm se ligam fatores de transcrio, freqentemente so alvos para a regulao tecidoespecfica ou temporal.

Etapas so similares na transcrio, contudo o processo muito mais complexo e regulado

Animao da transcrio

Sntese de protenas

Cdigo Gentico

Traduo - poliribossomos

Animao da traduo