CAPTULO 2.7.2.

ENFERMEDAD DE MAREK

RESUMEN
La enfermedad de Marek (EM) es una enfermedad linfomatosa y neuroptica de las aves domsticas causada por herpesvirus. El diagnstico se hace por los sntomas clnicos y por las lesiones mediante la observacin directa y microscpica. Los pollos pueden estar infectados de modo persistente con el virus de la EM (MDV) sin desarrollar enfermedad clnica. La infeccin por MDV se detecta mediante aislamiento del virus y la demostracin de antgenos vricos o de anticuerpos. La EM se evita por vacunacin con vacunas mono o polivalentes de virus vivos de varios tipos. La vacuna se inyecta in ovo o a la salida del huevo. En los pollos la EM ocurre a las 34 semanas de edad o ms tarde, y es ms corriente entre las 12 y las 30 semanas de edad. La parlisis de las patas y de las alas, con afeccin o engrosamiento de los nervios perifricos, es un signo patognomnico, aunque la implicacin nerviosa no se parece a veces, sobre todo en aves adultas. En funcin de la cepa de MDV, puede ocurrir linfomatosis, especialmente en el ovario, hgado, bazo, riones, pulmones, corazn, proventrculo y piel. A diferencia de las poblaciones celulares uniformes que se observan en los tumores causados por la leucosis linfoide, la infiltracin nerviosa y los linfomas causados por el MDV contienen clulas linfoides de varios tipos. La diferenciacin entre EM y la leucosis linfoide es importante. Las lesiones causadas por el virus de la reticuloendoteliosis tambin pueden confundirse con las de la EM. Identificacin del agente: En condiciones de campo, muchos pollos se infectan con el MDV en las primeras semanas de vida y luego son portadores de la infeccin a lo largo de toda la vida, a menudo sin presentar una enfermedad clara. La infeccin se suele detectar inoculando leucocitos en cultivos en monocapa de clulas de rin de pollo o de fibroblastos de embrin de pato, donde se desarrollan las tpicas placas vricas en cuestin de das. Se conocen dos serotipos de MDV 1 y 2 y un tercer serotipo est representado por el herpesvirus de pavos (HVT), que est relacionado. El serotipo 1 agrupa las cepas virulentas y el serotipo 2 las cepas avirulentas naturales. El antgeno vrico de la EM se puede detectar en el extremo de las plumas de las aves infectadas utilizando una prueba radial de precipitina. Pruebas serolgicas: Los anticuerpos contra MDV aparecen a las 12 semanas de la infeccin y se suelen reconocer por la prueba de inmunodifusin en medio slido, la prueba de inmunofluorescencia indirecta, y a veces por otras pruebas serolgicas como el enzimoinmunoensayo. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: La EM se evita vacunando in ovo o pollos de 1 da. Se utilizan vacunas con virus vivos. El usado con ms frecuencia es el HVT, en forma acelular (liofilizado) o en forma asociada con clulas (hmeda). Tambin se utilizan variantes atenuadas de cepas de serotipo 1 como vacunas, y cepas de serotipo 2, particularmente en las vacunas bivalentes, junto con el HTV (de serotipo 3). Las vacunas con serotipos 1 y 2 solo se presentan en la forma asociada con clulas. Tambin se utilizan vacunas bivalentes con los serotipos 1 y 3 o trivalentes con los serotipos 1,2 y 3. Las vacunas bivalentes y trivalentes se han introducido para combatir las cepas muy virulentas de MDV que no estn bien controladas por las vacunas monovalentes usuales. La vacunacin reduce mucho la enfermedad clnica, pero no la infeccin persistente por MDV. Los virus de la vacuna tambin permanecen en las aves durante toda la vida.

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A. INTRODUCCIN
La enfermedad de Marek (EM) (22, 25, 33) es una enfermedad de las aves domsticas (pollos) causada por un herpesvirus. Aparece a las 34 semanas de edad, o despus, y es ms comn entre las 12 y 30 semanas. En la forma clsica de la enfermedad, que se caracteriza principalmente por complicaciones nerviosas, la mortalidad no suele superar el 1015% y puede durar de unas cuantas semanas a muchos meses. En la forma aguda, en la que normalmente hay formacin de linfomas en las vsceras, es corriente una incidencia del 1030% en las aves y pueden ocurrir brotes con hasta el 70%. La mortalidad puede aumentar rpidamente en unas cuantas semanas y luego cesar, o puede continuar de modo estabilizado o con un lento descenso durante varios meses. La forma aguda de la enfermedad, con linfomas viscerales extendidos, es la ms comn en la actualidad. En su forma clsica, el sntoma clnico ms corriente de la EM es la parlisis parcial o completa de las patas y las alas. En la forma aguda, las aves muestran a menudo una grave depresin y algunas pueden morir sin mostrar signos previos. En la forma clsica, resulta caracterstico el engrosamiento de uno o ms nervios perifricos. Los ms afectados normalmente y los mejor vistos en anlisis postmortem son los plexos braquiales y citicos, el plexo celaco, el vago abdominal y el nervio intercostal. Los nervios afectados suelen tener un grosor doble o triple del normal, con prdida de la estriacin cruzada normal y de su aspecto brillante, y pueden aparecer grises o amarillentos, y a veces edematosos. A veces se presentan linfomas en la forma clsica de la EM, con frecuencia como pequeos tumores grisceos y blandos en el ovario y, a veces, tambin en los pulmones, riones, corazn, hgado y otros tejidos. El ojo gris, que est causado por una iridociclitis que incapacita al ave para acomodar el iris en respuesta a la luz y origina una pupila distorsionada, es ms comn en aves viejas (1618 semanas), y puede ser el nico signo que se presente. En la forma aguda, el hallazgo tpico es una extensin linfomatosa difusa en el hgado, gnadas, bazo, riones, pulmones, proventrculo y corazn. A veces tambin aparecen linfomas en la piel rodeando los folculos de las plumas y en los msculos esquelticos. Las aves afectadas suelen tener afectados los nervios perifricos, como en la forma clsica. En aves jvenes el aumento del hgado suele ser moderada, pero en las adultas puede estar muy aumentado y con apariencia idntica a la que se presenta en la leucosis linfoide, de la que se debe distinguir. A menudo no hay lesiones nerviosas en aves adultas con EM. Tanto en la forma clsica de EM como en la aguda, la enfermedad comienza con la proliferacin de las clulas linfoides, que es progresiva en algunos casos y regresiva en otros. Los nervios perifricos pueden estar afectados por cambios proliferativos, inflamatorios o de infiltracin menor, que se denominan respectivamente lesiones de tipo A, B, y C. Las de tipo A comprenden infiltracin de linfoblastos proliferativos, de linfocitos pequeos y medianos, y de macrfagos, y parecen ser de naturaleza neoplsica. Las lesiones de tipo B se caracterizan por edema interneurtico, infiltracin de linfocitos mayoritariamente pequeos y clulas plasmticas, y por proliferacin de clulas de Schwann, y parecen ser inflamatorias. Las de tipo C comprenden una leve dispersin de linfocitos principalmente pequeos, y a menudo aparecen en aves que no muestran lesiones gruesas o sntomas clnicos. Se consideran lesiones inflamatorias regresivas. La desmielinizacin que ocurre con frecuencia en los nervios con lesiones de tipo A o B es la responsable de la parlisis clnica. Los linfomas en los rganos viscerales y en otros tejidos son citolgicamente similares a las proliferaciones linfoides en los nervios de las lesiones de tipo A. Normalmente, las clulas linfoides son de tipos mixtos, con una frecuencia mayor de linfocitos pequeos y medios, aunque a veces predominan los linfocitos grandes y los linfoblastos, particularmente en aves adultas con EM crnica. Las poblaciones heterogneas de linfocitos en los linfomas de la EM, como se observa en secciones teidas con hematoxilinaeosina o en frotis de linfomas por la tincin de MayGrnwaldGiemsa, es una caracterstica importante para diferenciar esta enfermedad de la de la leucosis linfoide, donde las infiltraciones linfomatosas comprenden linfoblastos uniformes. Otra diferencia importante es que en la leucosis linfoide ocurren linfomas grandes en la bolsa de Fabricio, y que los tumores tienen un origen y un modelo de proliferacin intrafolicular. Aunque en la EM la bolsa est en ocasiones implicada en la proliferacin linfoide, el tumor se localiza de modo difuso entre los folculos y es menos aparente. Las lesiones nerviosas perifricas no son caractersticas de la leucosis linfoide, como lo son en la EM. La mayor dificultad consiste en distinguir entre la leucosis linfoide y las formas de EM que se ven a veces en aves adultas, en las que el tumor es linfoblstico con una marcada inflamacin del hgado y ausencia de lesiones nerviosas. Entonces puede ser necesario acudir a tcnicas especializadas, como la deteccin por inmunofluorescencia de los antgenos de clulas T activadas presentes en la superficie de clulas tumorales de EM (antgeno superficial asociado a tumores de EM, o MATSA), o de antgenos de clulas B o IgM en las clulas tumorales de la leucosis linfoide. Sin embargo, se puede realizar normalmente un diagnstico basado en lesiones gruesas y en histopatologa cuando se examinan postmortem varias aves afectadas. Las lesiones nerviosas y las proliferaciones linfomatosas inducidas por algunas cepas del virus de la reticuloendoteliosis son similares alas que se presentan en la EM, tanto a nivel global como microscpico. Aunque el virus de la reticuloendoteliosis no es comn entre las aves de corral, debera tenerse en cuanta como una posible causa de tumores linfoides; su reconocimiento depende de pruebas virolgicas y serolgicas en las

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aves. El virus de la reticuloendoteliosis tambin puede causar una enfermedad neoplsica en pavos, patos, codornices y otras especies. Tambin los retrovirus pueden originar una enfermedad proliferativa linfoide en los pavos. Aunque los pollos pueden ser seropositivos para el virus de la reticuloendoteliosis, la enfermedad neoplsica es rara. Las principales caractersticas para un diagnstico diferencial entre EM, leucosis linfoide y reticuloendoteliosis, se muestran en el Cuadro 1. No existen riesgos sanitarios conocidos para la salud humana cuando se trabaja con el virus de la MD (MDV) o con el herpesvirus relacionado de pavos (HVT).

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1. Identificacin del agente
La infeccin de una poblacin por MDV puede detectarse aislando el virus de tejidos de pollos infectados. Las fuentes ms usadas son leucocitos de muestras de sangre con heparina o suspensiones de clulas de linfoma o de bazo. Se sugiere que, cuando estas muestras se toman en el campo, se transporten al laboratorio en condiciones refrigeradas. Como el MDV est muy asociado a clulas, es importante que estas suspensiones contengan clulas viables. Las suspensiones se inoculan en cultivos celulares en monocapa de clulas de rin de pollo o fibroblastos de embrin de pato (los fibroblastos de embrin de pollo son menos sensibles para el aislamiento primario del virus). Los virus de serotipo 2 y 3 (ver Seccin C.1.a) son ms fciles de aislar en fibroblastos de embrin de pollo que en clulas de rin de pollo. Normalmente se inoculan 0,2 ml de una suspensin que contenga 106107 clulas vivas en monocapas duplicadas crecidas en placas de plstico para cultivo celular (de 60 mm de dimetro). Los cultivos inoculados y los no inoculados como control, se incuban a 38.5C en un incubador con humedad que contenga 5% de CO2. Alternativamente, se pueden utilizar recipientes de cultivo cerrados. El medio se reemplaza cada dos das. Las reas con efecto citoptico, denominadas placas, aparecen a los 35 das y se pueden contar a los 710 das. Cuadro 1. Caractersticas tiles para diferenciar la enfermedad de Marek, la leucosis linfoide y la reticuloendoteliosis
Carcter Edad Signos Incidencia Enfermedad de Marek Cualquiera. Normalmente 6 o ms semanas Frecuentemente parlisis Con frecuencia ms de 5% en aves no vacunadas. Rara en aves vacunadas Frecuente Aumento difuso o atrofia Puede estar presente Leucosis linfoide No menos de 16 semanas No especfica Raramente por encima de 5% Reticuloendoteliosis* No menos de 16 semanas No especfica Rara

Lesiones macroscpicas Implicacin neural Bolsa de Fabricio Tumores en piel, msculo y proventrculo, ojo gris Lesiones microscpicas Implicacin neuronal Tumores del hgado Bazo Bolsa de Fabricio Sistema nervioso central Proliferacin linfoide en la piel y folculos de las plumas Citologa de los tumores S A menudo perivasculares Difusos Tumores interfoliculares y/o atrofia de los folculos S S No Focales o difusos A menudo focales Tumor intrafolicular No No NO frecuente Focales Focales o difusos Tumor intrafolicular No No Ausente Tumores nodulares Normalmente ausente No frecuente Tumores nodulares Ausente

Clulas linfoides pleomrficas, incluyendo linfoblastos, linfocitos pequeos, medios y grandes y clulas reticulares. Raramente solo linfoblastos Clula T

Linfoblastos

Linfoblastos

Categora de clula linfoide neoplsica

Clula B

Clula B

* El virus de la reticuloendoteliosis puede causar varios sndromes diferentes. El sndrome del linfoma bursal es el ms probable en el campo y el que se describe aqu.

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A efectos de diagnstico, otra fuente menos comn de MDV son los extremos de las plumas, de las que se puede extraer el MDV libre de clulas. Los extremos de 5 mm de largo, o trozos de piel cortados que contengan los extremos de las plumas, se suspenden en un tampn SPGA/EDTA (sacarosa, fosfato, glutamato y albmina/ cido etiln diamino tetraactico) para la extraccin y titulacin del MDV libre de clulas (6). El tampn se hace as: 0,2180 M de sacarosa (7.462 g), 0,0038 M de fosfato monopotsico (0,052 g), 0,0072 M de fosfato dipotsico (0,125 g); 0,0049 M de Lglutamato monosdico (0,083 g); 1% de albmina bovina en polvo (1 g); 0,2% de EDTA (0,2 g); y agua destilada (100 ml). El tampn se esteriliza por filtracin y debe tener un pH aproximado de 6,5 Esta solucin se somete a ultrasonicacin y se filtra por filtros de membrana de 0,45 m para inoculacin en una monocapa de clulas de rin de pollo desecada durante 24 horas. Despus de una absorcin de 45 minutos, se aade medio y el cultivo se incuba como antes durante 710 das. Utilizando estos mtodos, se pueden aislar los serotipos 1 y 2 de MDV, junto con el HVT (serotipo 3), si est presente a consecuencia de una vacunacin. Con experiencia, se pueden diferenciar de modo muy ajustado las placas causadas por los diferentes serotipos de virus teniendo en cuenta el tiempo de aparicin, la velocidad de desarrollo y la morfologa de las placas. Las placas de HTV aparecen antes y son mayores que las de serotipo 1, mientras que las placas de serotipo 2 aparecen ms tarde y son ms pequeas que las de serotipo 1. Las placas causadas por el MDV y el HVT pueden identificarse como tales utilizando anticuerpos fluorescente especficos obtenidos en pollos. Tambin se pueden utilizar anticuerpos monoclonales para diferenciar los serotipos (16,28).

Reaccin en cadena de la polimerasa

Se han secuenciado los genomas de los tres serotipos (1, 15, 17). Se han descrito pruebas mediante la reaccin en cadena de la polimerasa que permiten distinguir algunas cepas oncognicas y no oncognicas de MDV de serotipo 1, y de cepas vacunales de los serotipos 2 y 3 (2, 3, 27, 34). Tambin se puede utilizar la PCR para cuantificar la concentracin de virus en los tejidos (3, 4, 24) o para la deteccin diferencial de MDV y HVT en la sangre o en el extremo de las plumas (11, 13).

2.

Pruebas serolgicas

La presencia de anticuerpos contra el MDV en pollos no vacunados de unas dos semanas de edad constituye una indicacin de infeccin. Antes de esa edad tales anticuerpos pueden representar una transmisin materna de anticuerpos a travs de la yema vitelnica y no constituyen una prueba de infeccin activa. Normalmente los virus, los antgenos y los antisueros estn disponibles en los laboratorios de referencia de la OIE para la Enfermedad de Marek (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual), pero an no se han fabricado reactivos estandarizados internacionalmente.

a)

Inmunodifusin en medio slido

No hay ninguna prueba prescrita para comercializacin, pero para detectar anticuerpos normalmente se emplea la prueba de inmunodifusin en gel de agar (IGDA). La prueba se hace en portas de vidrio que contienen agar al 1% en solucin salina tamponada con fosfato que contiene 8% de cloruro sdico. Se llenan pocillos adyacentes con antgeno o suero y se incuban a 37C durante 24 horas en un incubador con humedad para que tenga lugar la difusin; los sueros positivos muestran reacciones de identidad con muestras conocidas de suero positivo y antgeno. El antgeno usado en esta prueba consiste en clulas rotas de cultivos celulares infectados por el MDV o un extracto de extremos de plumas, o piel de animales infectados por MDV que contenga zonas plumosas. El antgeno del cultivo celular se prepara propagando el MDV en clulas de rin de pollo o fibroblastos de embrin de pollo. Cuando el efecto citoptico muestra confluencia, las clulas se separan del recipiente del cultivo y se suspenden en medio de cultivo o en solucin salina tamponada con fosfato sin caldo de triptosa fosfato (la presencia de caldo de triptosa fosfato puede producir lneas inespecficas de precipitacin a una concentracin aproximada de 1 x 107 clulas/ml. Luego esta suspensin se congela y descongela tres veces y se usa como antgeno. i) ii) iii) Procedimiento de la prueba Hacer una solucin de Bactoagar de Difco al 1% en cloruro sdico al 8%, poniendo la mezcla al bao mara. Pipetear 4 ml de la solucin de agar sobre portas para microscopio de 7.5 cm x 2,5 cm y dejar reposar. Cortar agujeros sobre al agar utilizando un molde y un agujereador de corcho No.1. El dimetro de los pocillos debe ser 5 mm., y los pocillos deben estar separados 2 mm. Eliminar los bloques de agar resultantes con un palito de algodn o una plumilla.

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iv) v)

Pipetear los sueros problema en los pocillos de las filas de abajo y de arriba, y suero estndar positivo y antgeno alternativamente en la fila central. Incubar el porta 24 horas a 37C en un recipiente con humedad y leer los resultados sobre una lmpara en una habitacin a oscuras.

Se puede utilizar una variacin de la prueba IGDA para detectar el antgeno MDV en extremos de plumas como una indicacin de infeccin por MDV. Se preparan portas de vidrio con agarosa al 0.7% (por ejemplo, A37) en cloruro sdico al 8%, que contengan el antisuero contra MDV. Se toman los extremos de pequeas plumas de los pjaros a examinar y se insertan verticalmente en el agar, mantenindose los portas como se ha indicado antes. El desarrollo de zonas radiales de precipitacin alrededor de los extremos de las plumas denota la presencia de antgeno NDV en la pluma y, por lo tanto, la infeccin del ave.

b)

Otras pruebas
Otras pruebas para detectar anticuerpos contra MDV son las pruebas de inmunofluorescencia directa e indirecta. stas demuestran la capacidad de un determinado antisuero para marcar las placas de MDV en cultivos celulares (16, 29). Estas pruebas son especficas para cada grupo y ms sensibles que la prueba IGDA. Tambin se puede emplear una prueba de neutralizacin para ver la capacidad que tiene un suero para neutralizar la propiedad del MDV de formar placas (5). Sin embargo, esta prueba es ms adecuada para propsitos de investigacin que para el diagnstico rutinario. Hay disponible un enzimoinmunoensayo (ELISA) para detectar anticuerpos contra MDV (7, 12). En la preparacin de antgeno para la prueba ELISA, se recubren los pocillos de una placa de microtitulacin de 96 pocillos con fibroblastos de embrin de pollo infectados por MDV. Se han publicado los detalles del procedimiento (7, 25).

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNSTICO

Los productos biolgicos comercializados para controlar la EM son virus vivos MVD o HVT respectivamente (11) asociados a clulas o libres de clulas (liofilizados) (ver ms adelante). Aunque se han desarrollado vacunas recombinantes por ingeniera gentica (20,23), no estn en uso comercial en la actualidad. Las vacunas contra la enfermedad de Marek se inyectan in ovo el da 17 o 18 de la embriognesis (26) o subcutneamente despus del nacimiento. Los requisitos para producir vacunas se sealan a continuacin y en el Captulo I.1.7. Principios de produccin de vacunas veterinarias, pero para ms informacin se deben consultar otras fuentes sobre los procedimientos (810, 14, 18, 19, 21, 30, 32). Los protocolos se encuentran en la Monografa 589 de la British Pharmacopoeia, y en el Volumen 9, parte 113 del US Code of Federal Regulations (31). Las directrices de este Manual intentan ser de naturaleza general y pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales.

1.
a)

Control del inculo

Caractersticas del inculo
Los virus del grupo MDV se clasifican en tres serotipos 1, 2 y 3 por su relacin antignica. Serotipo 1: ste incluye todas las cepas patgenas del virus, desde las cepas que son muy muy virulentas (por ejemplo, la 648A), hasta las muy virulentas (Md/5, Md/11, Ala8, RB1B), las virulentas (HPRS16, JM GA), las de virulencia media (HPRSB14, Conn A), y finalmente las dbilmente virulentas (CU2, CVI988). Estas cepas se pueden atenuar por pases en cultivos celulares, perdiendo las propiedades patognicas pero con retencin de la inmunogenicidad, originando cepas que se han usado como vacunas. Entre las usadas comercialmente se encuentran las cepas atenuadas HPRS16 y CVI988 (Rispens). Las variantes atenuadas de las cepas muy virulentas se han usado como vacunas experimentales para proteger contra la forma aguda de EM causada por las cepas muy virulentas, y la cepa vacunal R2/23 derivada de la Md/5 est autorizada en los Estados Unidos de Amrica. Las vacunas contra el serotipo 1 se preparan en forma asociada a clulas (mojadas) y deben mantenerse en nitrgeno lquido. Serotipo 2: ste incluye cepas naturales avirulentas de MDV (como por ejemplo, SB1, HPRS24, 301B/1, HN1) y se ha visto que algunas de stas confieren proteccin contra las cepas virulentas. Las cepas SB1 y 301B/1 se utilizan comercialmente, en particular con HVT, en forma de vacunas bivalentes para proteccin contra las cepas muy virulentas. Las vacunas de serotipo 2 solo existen en forma asociada a clulas. Serotipo 3: ste contiene las cepas de HVT naturales avirulentas (como la FC126, PB1) que se utilizan mucho como vacuna monovalente, y tambin en combinacin con cepas de serotipo 1 y 2 como vacunas bivalentes o trivalentes contra las cepas muy virulentas de MDV. Se puede preparar HVT en forma libre de clulas como una vacuna liofilizada o bien en forma asociada a clulas (mojada).

b)

Mtodo de cultivo
Los substratos usados para la produccin comercial de vacuna son fundamentalmente fibroblastos primarios de embrin de pollo (CEF) derivados de aves libres del patgeno especfico (SPF) o fibroblastos

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de embrin de pato. Los CEF de aves SPF son preferibles a las clulas de pato porque se conoce ms sobre de los patgenos transmitidos por el embrin de pollo y sobre los mtodos de su deteccin.

c)

Validacin como vacuna

Hay mtodos disponibles para ensayar las aves SPF en cuanto a ausencia de infeccin (19,39). Los pollos de aves SPF deben estar libres de adenovirus aviares, incluyendo el virus 76 del sndrome de la puesta, del virus de la encefalomielitis aviar, los virus de la leucosis aviar (subgrupos A, B y J), el virus de la nefritis aviar, los reovirus y rotavirus aviares, el virus de la anemia del pollo, el poxvirus de la gallina, el virus de la bronquitis infecciosa, el virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa, el virus de la laringotraqueitis infecciosa, el virus de la gripe tipo A, MDV, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la reticuloendoteliosis, Salmonella spp, y virus de la rinotraqueitis del pavo. Las poblaciones de patos SPF deben carecer de adenovirus aviares, reovirus aviares, Chlamydia, virus de la enteritis del pato, virus tipo I y II de la hepatitis del pato, virus de la gripe tipo A, virus de la enfermedad de Newcastle, Pasteurella (ahora Riemerella) anatipestifer, virus de la reticuloendoteliosis, e infecciones por Salmonella. Tambin puede ser necesario determinar la ausencia de otras infecciones a medida que se vayan reconociendo. Para comprobar que el inculo primario del virus no es patgeno para los pollos, se inocula diez veces la dosis de campo en pollos SPF de 1 da susceptibles a la EM, para asegurar que no causa lesiones globales o microscpicas significativas debidas a la EM cuando tengan 120 das de edad. Debe advertirse que algunas cepas vacunales de MDV y HTV pueden producir lesiones nerviosas microscpicas leves y transitorias en estas circunstancias. No debe ocurrir un aumento de la virulencia despus de seis pases seriados de la cepa vacunal en pollos SPF de 1 da susceptibles a la EM. Primero se inocula diez veces la dosis de campo y luego se hacen los pases inoculando sangre con heparina a intervalos de 57 das, y realizando pruebas de viremia para comprobar que el virus se transfiere en cada pase. Las aves que reciben el ltimo pase se mantienen durante 120 das y deben carecer de lesiones de la EM. No obstante, algunas cepas como la de Rispens, pueden originar lesiones leves de EM. La cuestin clave es que la virulencia no debe variar. sta es una prueba difcil porque la resistencia gentica de los pollos influye fundamentalmente en la virulencia aparente de los virus, y, por tanto, en el tipo de inculo. Despus de superar con xito las pruebas de inocuidad de laboratorio, se debe confirmar la inocuidad de la cepa en numerosos ensayos de campo. El virus de inculo debe estar libre de los agentes sealados para poblaciones SPF y de otros contaminantes que se puedan adquirir en el laboratorio. Una cepa vacunal que derive de pavos debe carecer tambin del virus de la enfermedad linfoproliferativa y del virus de la enteritis hemorrgica. Se debe determinar la capacidad del virus del inculo primario y de los virus derivados despus de los pases usados para producir el virus vacunal (por lo general, no ms de cinco pases en cultivo de tejidos) para proteger contra la EM. Se han publicado pruebas de proteccin estandarizadas. Implican la vacunacin de pollos SPF de 1 da susceptibles a la EM y reinoculacin de desafo 8 das despus con suficiente MDV como para causar al menos un 70% de incidencia de EM en pollos no vacunados. Se utilizan dos tipos de prueba. En la prueba del ndice de proteccin, se vacuna con una sola dosis de campo (1000 PFU) (unidades formadoras de placas) y se compara la aparicin de EM en aves vacunadas y no vacunadas. Los ndices de proteccin deben ser superiores a 80, es decir, las aves vacunadas deben mostrar al menos un 80% de reduccin en la aparicin de EM en comparacin con los controles no vacunados. Tambin se usa una prueba PD50 (dosis media de proteccin), que supone la inoculacin de cinco diluciones seriadas de vacuna, a un cuarto cada dilucin, elegidas para dar proteccin por encima y por debajo del 50%, y luego proceder a un inculo de desafo 8 das despus para determinar el valor PD50. Los ensayos se realizan utilizando una vacuna estndar de referencia como comparacin. La PD50 puede ser tan baja como 4 PFU, pero se pueden obtener valores superiores dependiendo de la cepa vacunal, de si libre de clulas o est asociada a clulas, y de la presencia o ausencia de anticuerpos maternos en los pollos de ensayo. Con los datos de la prueba PD50, se ha sugerido que la dosis mnima de vacuna en condiciones de campo debe ser superior a dos valores: 103 PFU, o, 100 PD50. Se deben hacer numerosos ensayos de campo en presencia del virus natural de desafo, utilizando diferentes razas de aves con un estado variable en cuanto a anticuerpos maternos contra el MDV, para asegurar la eficacia y duracin de la inmunidad. La experiencia indica que la inmunidad por vacunacin, una vez adquirida, dura toda la vida.

2.

Mtodo de fabricacin

Las clulas usadas como substrato se siembran en recipientes de fondo liso para incubacin estacionaria o en recipientes cilndricos para incubacin rotatoria. Los medios ms usados son el medio mnimo de Eagle, o el

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medio 199, tamponado con bicarbonato sdico y suplementado con 5% de suero de ternero. La incubacin se hace a 3839C durante 48 horas. Para vacunas asociadas con clulas, los cultivos se infectan con stock del virus de siembra HVT o MDV para produccin, en forma asociada a clulas, que por lo general tiene dos pases adicionales ms que el stock primario de virus. Los cultivos se incuban 48 horas y luego se recogen las clulas tratando la monocapa celular lavada con una solucin de EDTA/tripsina para favorecer que las clulas se despeguen. Los recipientes se devuelven al incubador (38.5C) para permitir la liberacin completa. Las clulas se someten a centrifugacin a baja velocidad y despus se resuspenden en una mezcla de congelacin formada por medio de crecimiento con 7.515% de dimetil sulfxido, y se mantienen a 4C o se distribuyen de inmediato en los recipientes para la vacuna final, que suelen ser ampollas de vidrio, que se cierran a la llama y se congelan en nitrgeno lquido. Las vacunas liofilizadas, sin clulas, se pueden preparar de cepas de HTV, pero no de cepas de MDV. Para la produccin de esta forma de vacuna, los cultivos infectados por HTV se incuban 72 horas, las clulas infectadas se separan del recipiente como se indica arriba, o se raspan de las paredes del recipiente. Las clulas se suspenden en un volumen pequeo de medio de crecimiento, se centrifugan, y se resuspenden en una solucin tamponada con estabilizador que contenga sacarosa al 8%, pero que est libre de protena para impedir la formacin de espuma. La suspensin se sonica para liberar el virus y los restos celulares se eliminan: luego, se diluye la suspensin con un estabilizador completo como SPGA aadido en los recipientes finales, y se liofiliza. Las diluciones para las vacunas asociadas a clulas o para las libres de clulas se basan en la experiencia previa, como el nmero de dosis necesario por recipiente, ya que el contenido en virus del material recogido no se puede ensayar antes del llenado de los recipientes. La carga de virus del producto final se puede consignar luego en la etiqueta.

3.

Control interno

Para tener ptimos resultados en la preparacin de la vacuna asociada a clulas, es esencial una velocidad lenta de congelacin (15C por minuto) y una rpida descongelacin. El ttulo de infectividad de las clulas infectadas, y por tanto el nmero de dosis por ampolla, se determina despus del llenado de las ampollas. De modo similar, el contenido en virus de la suspensin final de las vacunas liofilizadas, y por tanto el nmero de dosis por recipiente, se determinan tras el llenado.

4.
a)

Control de lotes
Identidad
Utilizando un suero neutralizante monoespecfico, se debe comprobar que el producto es de la misma especificidad que el virus de inculo. Esto se realiza mejor utilizando anticuerpos monoclonales.

b)

Inocuidad y esterilidad
Se requiere realizar muchas pruebas sobre los materiales utilizados para producir la vacuna y sobre el producto final. Las clulas de substrato deben proceder de una poblacin de aves SPF que estn libres de agentes transmitidos verticalmente. Las substancias de origen animal usadas en la preparacin de vacunas, como el suero, tripsina y seroalbmina bovina, deben carecer de agentes indeseables. Los lotes de vacuna final producida deben probarse para ausencia de bacterias contaminantes, hongos, micoplasmas, y los virus indicados para poblaciones SPF; tambin deben realizarse pruebas de pureza de los diluyentes. Varias instituciones oficiales recomiendan pruebas adecuadas para la deteccin de agentes indeseables en todas las etapas de produccin de vacunas (19, 21, 30) y tambin aparecen en el Captulo I.1.5. Se debe inocular diez veces la dosis vacunal, o una cantidad de diluyente equivalente a dos veces la dosis vacunal, en pollos SPF de 1 da. No deberan ocurrir reacciones adversas durante un perodo de observacin de 21 das.

c)

Potencia
La dosis estndar de cada tipo de vacuna es 1000 PFU por pollo o por huevo. Los ensayos sobre contenido vrico se realizan en lotes de vacuna para confirmar que se alcanzar la dosis correcta de vacuna por ave.

d)

Duracin de la inmunidad
Para la duracin de la inmunidad slo se realiza una prueba con el virus de inculo. En apariencia, tal inmunidad es duradera para toda la vida.

e)

Estabilidad
Las pruebas de estabilidad se hacen con seis lotes representativos de la vacuna para demostrar que se mantiene el ttulo de virus durante la caducidad indicada para la vacuna. Estas pruebas deben realizarse

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Captulo 2.7.2. Enfermedad de Marek

bajo las condiciones de almacenamiento de la vacuna. El producto liofilizado debe tener una caducidad de 12 meses cuando se mantiene a 28C. Los fabricantes pueden doblar el contenido de virus para compensar alguna prdida en la titulacin durante el almacenamiento. Se suministran lquidos adecuados para dilucin con las vacunas asociadas a clulas y con las liofilizadas. Se debe probar la estabilidad de la vacuna reconstituida en un perodo superior a 2 horas.

f) g)

Conservantes
No se incluyen conservantes en la vacuna o los diluyentes.

Precauciones (riesgos)
Con las vacunas asociadas a clulas, es necesario evitar daos en las ampollas, que pueden explotar al retirarlas del nitrgeno lquido. Se debe utilizar proteccin ocular. Durante el uso, las vacunas reconstituidas se deben mantener en fro, y las asociadas a clulas deben agitarse para mantener las clulas en suspensin.

5.
a) b)

Pruebas sobre el producto final

Inocuidad
Ver seccin C.4.b.

Potencia
Ver Seccin C.4.c.

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* * *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Enfermedad de Marek (vase Cuadro de la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consltese la pgina Web de la OIE para conseguir la relacin ms actualizada: www.oie.int).

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