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Estudo Comparativo in vitro da Atividade Antibacteriana de Produtos Fitoterápicos Sobre Bactérias Cariogênicas
Estudo Comparativo in vitro da Atividade Antibacteriana de Produtos Fitoterápicos Sobre Bactérias Cariogênicas
Estudo Comparativo in vitro da Atividade Antibacteriana de
Produtos Fitoterápicos Sobre Bactérias Cariogênicas

COMPARATIVE STUDY IN VITRO OF the antiBACTERIAL activity FROM phytotherapeutic products against CARIOGENIC BACTERIAS

Milana Ramos Santana DRUMOND* Ricardo Dias de CASTRO** Rossana Vanessa Dantas de ALMEIDA*** Maria do Socorro Vieira PEREIRA**** Wilton Wilney Nascimento PADILHA*****

RESUMO

O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antibacteriana de produtos fitoterápicos comerciais frente aos microrganismos cariogênicos: S. mutans (ATCC 2575); S. sobrinus (ATCC 27607); S. sanguis (ATCC 10557) e L. casei (ATCC 4646). Os produtos utilizados foram: Água Rabelo - (A); Malvatricin - (B); Mel Rosado - (C); Apis Flora - (D); Fitogargarejo - (E )e Óleo de Copahyba - (F). Empregou-se a técnica de Concentração Inibitória Mínima (CIM); cada linhagem bacteriana foi reativada em caldo Tryptic Soy Broth, incubada a 37 C por 24 horas em microaerofilia e semeadas em meio de cultura Ágar Mueller Hintön pela técnica de inundação. Os produtos fitoterápicos foram empregados em concentrações de 100% à 0,19% e os halos de inibição mensurados. Verificou-se para a linhagem S. mutans as CIMs de 0,19%; 12,5%; 1,56%; 3,12% e 0,78% para os produtos B, C, D, E e F respectivamente. Para a linhagem S. sanguis as CIMs observadas foram de 0,39%; 25%; 1,56%; 6,25% e 0,78% em B, C, D, E e F respectivamente. Sobre o S. sobrinus apenas o produto B mostrou atividade antibacteriana na concentração de 0,19%. Em relação ao L. casei os produtos B, D, E e F apresentaram respectivamente CIMs de 0,19%; 0,78%; 0,78% e 6,25%. O produto B apresentou os maiores halos frente a todas as linhagens. Concluiu-se que os produtos tiveram desempenhos variados, tendo o Malvatricin® obtido a melhor CIM frente a todas as linhagens, bem como os maiores espectros de inibição e Água Rabelo não apresentou atividade antibacteriana.

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0

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DESCRITORES Fitoterápicos; Microbiologia oral; Odontologia preventiva.

ABSTRACT

This study aimed at evaluating the antibacterial activity of commercial products made with phytotherapeutic products against the cariogenic bacterias: S. mutans (ATCC 2575); S.sobrinus (ATCC 27607); S.sanguis (ATCC 10557) and L. casei (ATCC 4646). The products used were: Água Rabelo - A;

®

Malvatricin - B; Mel Rosado - C; Apis Flora - D; Fitogargarejo

-

Minimum Inhibitory Concentration (MIC), where each bacteria

sort were reactivated in Tryptic Soy Broth soup, incubated to 37°C by 24 hours in microaerophily and seeded on Mueller Hintön Agar by inundation technique. The phytotherapeutic products were used pure and with the concentrations of 100% the 0,19% and measured inhibition halos. Were verificated for S. mutans the IMCs the 0,19%; 12,5%; 1,56%; 3,12% e 0,78%

for the products B, C, D, E and F respectively. For S. sanguis the MICs were observed: 0,39%; 25%; 1,56%; 6,25% e 0,78% for B, C, D, E and F respectively. About S. sobrinus just the product

B averaged antibacterial activity for the concentration 0,19%. In

relation to L. casei the products B, D, E and F presented respectively MICs the 0,19%; 0,78%; 0,78% e 6,25%.The product B averaged the best halos against all sorts. Were concluded that the products had different performances, having the product B obtained the best MIC against all bacteria sorts, as well as the biggest inhibition specteres and the product A

didn't present any antibacterial activity.

E and Óleo de Copahyba - F. The technique used was the

®

®

®

®

®

DESCRIPTORS Phytotherapic agents; Oral microbiology; Preventive dentistry.

* Aluna de Graduação do Curso de Odontologia da Universidade Federal da Paraíba. ** Aluno de Graduação do Curso de Odontologia da Universidade Federal da Paraíba. Bolsista PIBIC/CNPq/UFPB. *** Professora de Odontopediatria da FACIMP - MA. **** Professora Adjunta do Depto. de Biologia Molecular da UFPB. ***** Professor Titular de Clínica Integrada do Depto. de Clínica e Odontologia Social da UFPB.

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DRUMOND et al. - Estudo Comparativo in vitro da Atividade Antimicrobiana de Produtos Fitoterápicos

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INTRODUÇÃO

A necessidade de medicar e a disponibilidade de

plantas mescladas no processo civilizatório constituíram os primórdios do ato de curar, remontando à antiguidade

o uso de vegetais como medicamentos (LIMA, 1997). No Brasil estão localizadas cerca de 20% das 250 mil espécies medicinais catalogadas pela UNESCO,

facilitando o aproveitamento do potencial curativo dos vegetais para o tratamento de doenças, inclusive na área de odontologia (NUNES et al. 1999).

A cárie dentária é uma doença multifatorial, onde

se verifica a interação de quatro fatores principais:

hospedeiro, dieta, tempo e a microbiota (SOUSA; GIL, 1998). A formação do biofilme dental ocorre através da fixação de bactérias sobre as superfícies dentárias. Assim, o biofilme, devido a sua característica contínua de agressão, vai adquirindo novas espécies em cada etapa

do seu desenvolvimento. Dentre estes microorganismos pode-se citar: S. mitis, S. sagüis, S. sobrinus, S. mutans e L. casei (GEBARA et al., 1996). A remoção do biofilme dentário é um fator importante na prevenção da cárie e doença periodontal. Frente às limitações dos métodos mecânicos de higiene agentes antimicrobianos são estudados no controle do biofilme. Em face do exposto, diversas substâncias têm sido utilizadas, por meio de enxágüe bucal, na redução da microbiota cariogênica (JARDIM; JARDIM, 1998). Alguns produtos de origem vegetal são utilizados na higiene oral com a vantagem de não apresentarem efeitos colaterais, sendo relatados apenas uma pequena ardência com possibilidade de erosão na mucosa, quando comparados a produtos sintéticos (MORAN et al., 1992). Assim, com o estudo científico do uso de determinadas plantas nas doenças bucais, a odontologia poderá beneficiar a população ao aderir com a fitoterapia.

O óleo de copaíba vem sendo indicado, há mais

de quatro séculos, para diversos fins farmacológicos. Este óleo é exudato do tronco da copaibeira . Os estudos de atividade antibacteriana mostraram atividade bactericida e bacteriostática do óleo frente ao Streptococcus mutans (VEIGA; PINTO, 2002). A malva é uma planta herbácea, dispersa no continente europeu, africano e americano. Para fins farmacológicos utilizam-se suas folhas, flores, raízes. É utilizada para inflamações da pele, boca, garganta (laringite, faringite), tratamento de problemas respiratórios e irritações gastrintestinais (CORREA, 1984; MATOS, 1991; MARTINS, 1998). Weyne et al. (2003) avaliaram clinicamente a ação de dois enxaguatórios bucais - Malvatricin® e Flogoral®. Após 7 e 14 dias de tratamento foi observado que os pacientes do grupo do Malvatricin apresentaram uma redução dos índices de biofilme de 16,87% e

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34

30,13% respectivamente e uma redução do índice gengival de 41,58% e 60,68% respectivamente. O grupo que fazia uso do Flogoral® apresentaram uma redução dos índices de biofilme ao final de 7 e 14 dias de 9,42% e 11,77% respectivamente e uma redução do índice gengival de 34,07% e 35,17% respectivamente. Em um estudo realizado por Monfrin, Ribeiro (2002) foi avaliada a eficácia de diversos anti-sépticos na redução da microbiota da saliva visualizando-se in vitro a sua atividade. Foram selecionadas 50 amostras de saliva de indivíduos com idade variando de 19 a 54 anos. Os anti-sépticos bucais utilizados foram: Kolynos®, Oral- B®, Cepacol®, Periogard®, Flogoral®, Fluordent®, Wash® Plax®, Listerine® e o Malvatricin®. Após o cultivo dos microorganismos das amostras, procedeu-se á inoculação dos dez diferentes anti-sépticos em três dosagens (10 ml, 20 ml, 25 ml). Os resultados mostraram que os produtos Listerine® e Flogoral® não apresentaram atividade antimicrobiana. Os demais produtos testados apresentaram capacidade de redução de microorganismos inferior ao Malvatricin® e ao Periogard®. Gebara et al. (1996) avaliaram a ação antibacteriana de tinturas de malva, cacau, salva, camomila, tomilho e própolis sobre S. mutans e S. sobrinus in vitro. As concentrações das tinturas variaram entre 0,05 e 0,16 mg/ml. AS Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) para S. mutans foram de 0,06; 0,10 e 0,04 mg/ml para tomilho, cacau e própolis respectivamente. Para S. sobrinus, as CIM foram de 0,04; 0,12 e 0,02 mg/ml para tomilho, cacau e própolis respectivamente. Malva, salva e camomila não apresentaram ação antimicrobiana. A hortelã graúda apresenta propriedade antibacteriana, atribuída às substâncias carvacrol e tenol (ALMEIDA, 1993; DINIZ, 1997). O Eucalipto é um dos remédios caseiros mais comuns. Oyedeji et al. (1999) descreveram a ação

antibacteriana e antifúngica de extratos de eucalipto. A própolis é uma substância com composição bastante complexa, variando de acordo com sua origem botânica, tendo sido isolados mais de 300 componentes químicos. Um dos seus principais efeitos biológicos é a atividade antimicrobiana (bacteriana, micótica e viral). As ações anti-sépticas, antiinflamatórias e cicatrizantes da própolis já estão comprovadas, tanto cientificamente ou popularmente (COSTA, 1992; DINIZ, 1997; MARTINS, 1998; MATOS, 1991). A ação da própolis sob forma de bochecho sobre o biofilme dentário e a gengivite foi testada por Duarte e Kfouri (1999), não encontrando diferença estatisticamente significante no mecanismo de formação

do biofilme e nos sinais clínicos da gengivite entre os grupos teste e controle.

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Um estudo duplo-cego realizado por Panzeri et al. (1999) mostrou que um dentifrício fluoretado contendo própolis a 3% foi mais eficiente que outro dentifrício semelhante, porém, sem própolis no controle do índice gengival. Na análise microbiológica, o dentifrício contendo própolis foi eficiente, entre outras bactérias, contra cocos gram-positivos e, os bastonetes gram-negativos foram os mais resistentes. Plantas da família das Punicáceas, a romã tem apresentado ação bactericida e bacteriostática sobre bactérias Gram-positivas e Gram-negativas constituintes do biofilme dental (PEREIRA, 2002). Pereira (1998) estudou ação antibacteriana do extrato hidroalcoólico da casca da romã (Punica granatum Linn.), frente aos S. mitis, S. mutans e S. sanguis. Esta ação antibacteriana foi ainda comparada à atividade antibacteriana da clorexidina. Foi verificado que todas as linhagens bacterianas se mostraram sensíveis ao extrato ativo de romã. Para S.mutans a concentração inibitória mínima (CIM) foi 1:32. Em relação ao S. sanguis o extrato da romã apresentou CIM de 1:128. Sobre S. mitis a CIM foi de 1:64. As linhagens bacterianas também se mostraram sensíveis à ação do gluconato de clorexidina a 0,12%. Desse modo, observou-se que o extrato hidroalcoólico do epicarpo da Punica granatum Linn. pode ser utilizado na inibição da formação de placa supragengival com a mesma eficiência da clorexidina. Em 2002, Pereira avaliou a CIM do extrato da romã em cinco linhagens bacterianas predominantes do biofilme dental: S. mitis, S. mutans, S. sanguis, S.sobrinus e L.casei. Observou-se que a linhagem de S.sobrinus foi a mais sensível apresentando halos de inibição até a diluiçaõ 1:512. A escala de sensibilidade foi seguida pelo L.casei com halo de inibição até a diluição 1:128; S.mitis 1:32; S.mutans e S.sanguis apresentaram sensibilidade até a diluição 1:8. Foi observado também que o gluconato de clorexidina a 0,12% demonstrou potencial ação inibitória sobre estes microorganismos. Baseado no exposto, este trabalho teve como objetivo avaliar a ação antibacteriana de produtos fitoterápicos comerciais frente aos microorganismos formadores de biofilme dentário.

MATERIAIS E MÉTODOS

A metodologia foi constituída de três etapas descritas a seguir:

Produtos Utilizados Utilizaram-se seis produtos comerciais disponíveis no mercado nacional que apresentam em sua formulação os seguintes componentes descritos no Quadro 1 e mostrados na Figura 1.

Quadro 1 - Produtos comerciais utilizados no estudo.

 

Produtos

PrincípioAtivo

A

ÁguaRabelo /Lab.RabeloLTDA

®

Eucaliptol, Hortelãdafolha graúda,Aroeira

B

®

Malvatricin /Lab.DaudtOliveiraLTDA

Malva,Quinosol,Tirotricina

C

®

MelRosado /LabADV.

Melitoderosarubra

D

®

ApisFlora /LabIBRAN

Própolis

E

®

Fitogargarejo /FarmáciaHomeopática

Gengibre,Romã,Própolis

F

ÓleodeCopahyba /Lab.IBRAN

®

ÓleodeCopaíba

F ÓleodeCopahyba /Lab.IBRAN ® ÓleodeCopaíba Figura 1 - Produtos comerciais utilizados no estudo.

Figura 1 - Produtos comerciais utilizados no estudo.

Seleção das cepas As linhagens bacterianas formadoras de biofilme dentário utilizadas foram: S. mutans ATCC 2575; S. sobrinus ATCC 27607; S. sanguis ATCC 10557 e L. casei ATCC 4646. Cada linhagem bacteriana foi reativada em caldo nutritivo Tryptic Soy Broth (TSB), incubada a 37ºC por 24 horas em microaerofilia. A leitura foi realizada através da observação visual da turvação do meio e em seguida semeada em placas de petri contendo o meio de cultura Ágar Müller Hinton (DIFCO ) pela técnica de inundação.

®

Preparação das escalas Para cada produto testado foram preparados escalas com tubos de ensaio numerados de 1 a 10 conforme as diluições. No tubo 1 foi colocado 2ml do produto puro e nos demais tubos (2 a 10) 1ml de água destilada estéril adicionado à 1ml do tubo anterior. Assim, os produtos fitoterápicos foram empregados na concentrações de 100% à 0,19%. Confecção dos poços Foram confeccionados cinco poços de aproximadamente 6 mm de diâmetro, para receber 50l dos produtos nas diferentes concentrações. A CIM foi considerada como a menor concentração do produto testado capaz de inibir o

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desenvolvimento bacteriano. A ação antibacteriana dos produtos foi quantificada em mm de diâmetro dos halos de inibição.

RESULTADOS

Os resultados obtidos são apresentados nos Quadros e Figuras que se seguem.

Quadro 2. Distribuição em milímetros de halo de inibição da ação antibacteriana dos produtos fitoterápicos testados sobre a linhagem de Streptococcus mutans, segundo a escala de diluição.

Escala

 

Produtos Testados

 

A

B

C

D

E

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100%

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45

28

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25%

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30

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18

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27

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16

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6,25%

0

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0

14

14

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3,12%

0

15

0

12

12

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1,56%

0

13

0

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0

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0,78%

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10

0

0

0

10

0,39%

0

9

0

0

0

0

0,19%

0

8

0

0

0

0

Quadro 3. Distribuição em milímetros de halo de inibição da ação antibacteriana dos produtos fitoterápicos testados sobre a linhagem de Streptococcus sobrinus, segundo a escala de diluição.

Escala

 

Produtos Testados

 

A

B

C

D

E

F

100%

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x

0

0

0

0

50%

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x

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0

0

25%

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x

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0

12,5%

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40

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0

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6,25%

0

33

0

0

0

0

3,12%

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21

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0

0

0

1,56%

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0

0,78%

0

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0

0

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0,39%

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15

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0

0

0,19%

0

12

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0

0

0

x - superposição dos halos impossibilitando a mensuração.

Quadro 4. Distribuição em milímetros de halo de inibição da ação antibacteriana dos produtos fitoterápicos testados sobre a linhagem de Streptococcus sanguis, segundo a escala de diluição.

E s c a la

 

P ro d u to s Te s ta d o s

 

A

B

C

D

E

F

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0 %

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3

5

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2

1 4

1 9

1 5

 

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2

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1 5

1 6

1 5

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2 ,5 %

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8

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1 4

1 3

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,2 5 %

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1

4

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1 2

11

1 2

3

,1 2 %

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1

3

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,5 6 %

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0

9

0

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,7 8 %

0

8

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0

0

9

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,3 9 %

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7

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,1 9 %

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0

0

0

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Quadro 5. Distribuição em milímetros de halo de inibição da ação antibacteriana dos produtos fitoterápicos testados sobre a linhagem de Lactobacilus casei, segundo a escala de diluição.

   

Produtos Testados

 

Escala

A

B

C

D

E

F

100%

0

40

0

26

25

16

50%

0

34

0

25

22

18

25%

0

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0

23

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12,5%

0

25

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24

19

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6,25%

0

20

0

22

18

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3,12%

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0

20

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0

1,56%

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15

0

17

1 4

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0,78%

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0

17

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0,39%

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0

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0

0,19%

0

10

0

0

0

0

0 0 0 0 0,19% 0 10 0 0 0 0 Figura 2 - Ausência de

Figura 2 - Ausência de halos de inibição do produto A sobre

S. mutans nas concentrações 100% a 6,25%.

produto A sobre S. mutans nas concentrações 100% a 6,25%. Figura 3 - Halos de inibição

Figura 3 - Halos de inibição do produto B sobre S. mutans

nas concentrações 100% a 6,25%.

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vitro da Atividade Antimicrobiana de Produtos Fitoterápicos Figura 4 - Halos de inibição do produto C

Figura 4 - Halos de inibição do produto C sobre S. mutans nas concentrações 100% a 6,25%.

C sobre S. mutans nas concentrações 100% a 6,25%. Figura 5 - Halos de inibição do

Figura 5 - Halos de inibição do produto B sobre S. sobrinus nas concentrações 100% a 6,25%.

DISCUSSÃO

Os métodos de controle químico do biofilme dentário são amplamente aceitos (DEAN; HUGHES, 1995), principalmente quando utilizados em pacientes com alto risco a cárie dentária, incluindo os usuários de aparelho ortodôntico fixo, e aqueles com distúrbios de coordenação mecânica impossibilitados de realizar uma satisfatória higiene bucal através da escovação dentária. Em nosso estudo foram utilizados produtos comerciais contendo em suas formulações um único extrato de planta, combinações de extratos, e associação entre extratos e fármacos sintéticos. Foi verificado que o produto B, constituído de malva, quinosol e tirotricina, apresentou os maiores halos de inibição frente a todas as linhagens, como mostram os quadros de 2 à 5. Este resultado concorda com aquele

descrito por Monfrin e Ribeiro (2000), ao comparar a ação antibacteriana deste produto com diversos anti-sépticos comerciais tradicionais, em

estudo in vitro sobre um pool bacteriano obtido da saliva.

É importante ressaltar que ambos os trabalhos não

podem afirmar sobre a ação antibacteriana de cada componente específico existente na composição. Uma avaliação clínica do produto B foi relatada por Weyne et al. (2003), seus resultados mostraram que seu emprego como enxaguatório bucal resultou ao final de 07 e 14 dias numa significante redução dos índices

gengivais e de placa visível em comparação a outro anti- séptico. Esta superioridade também foi relatada no estudo in vitro de Monfrim e Ribeiro (2000). Sabe-se, entretanto, que os componentes quinosol e tirotricina possuem ação antibacteriana, assim, a superioridade do produto B sobre os demais fitoterápicos testados pode estar baseada na ação desses componentes. Em 1996, Gebara et al. avaliaram in vitro a ação antibacteriana de substâncias naturais sobre S. mutans e S. sobrinus e constataram que a tintura de malva não exerceu atividade antibacteriana sobre o S. mutans. Dentre os produtos que contém apenas um constituinte vegetal, o melhor desempenho foi apresentado pelos produtos D e F, visto que o C não apresentou atividade antibacteriana sobre L. casei. Em relação à própolis, Gebara et al. (1996) encontraram CIM de 0,04 mg/ml sobre S. mutans, em nosso estudo, o produto D, que contém própolis em sua composição, obteve uma CIM de 1,56% (quadro 2) em relação a esta mesma bactéria. Sobre S. sobrinus a CIM obtida foi de 0,02 mg/ml para o extrato da própolis, enquanto que o produto D não apresentou atividade antibacteriana sobre esta linhagem, como pode ser visto

no quadro 3. Nos produtos com mais de um constituinte

vegetal o melhor resultado foi do produto E constituído de gengibre, romã e própolis. O produto A, que apresenta em sua formulação eucaliptol, hortelã da folha graúda e aroeira, não apresentou atividade antibacteriana sobre

as linhagens estudadas.

O produto E possui a romã na sua constituição e, como mostra o quadro 3, não apresentou atividade antibacteriana sobre o S. sobrinus, diferentemente do relatado por Pereira (2002) que descreveu a presença de sensibilidade ao extrato ativo de romã para as mesmas linhagens bacterianas. Estudos que testam a efetividade de produtos comerciais devem considerar, se possível, além dos constituintes farmacêuticos, as concentrações de cada

princípio ativo presente, visando, dessa forma, identificar

a ação de cada componente, de modo a permitir a comparação e análise dos resultados.

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CONCLUSÕES

Nas condições do estudo foi possível concluir

que:

1) Os produtos tiveram desempenho variado; 2) O produto B obteve os maiores espectros de inibição, bem como a melhor CIM frente a todas as linhagens; 3) O produto A não apresentou atividade antibacteriana.

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Recebido para publicação: 19/11/2003 Enviado para reformulação:15/12/2003 Aceito para publicação: 16/01/2004

Correspondência:

Milana Ramos Santana Drumond

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João Pessoa - PB

E-mail: mildrumond@hotmail.com Telefone: (83) 225 4880/(088)92717246

CEP: 58080-020

Pesq Bras Odontoped Clin Integr, João Pessoa, v. 4, n. 1, p. 33-38, jan./abr. 2004