1

Produção por fermentação

Penicillium notatum
P. chrysogenum

Substância produzida por microrganismo ou substância similar

produzida total ou parcialmente por síntese química que em
pequenas doses inibe o crescimento de outro microrganismo.
 2

Antibióticos atuais
Características dos antibióticos
Classificação quanto à Produção
Classificação quanto aos microrganismos produtores
Antibióticos e principais microrganismos
Classificação quanto à estrutura química
Antibióticos β-lactâmicos
Penicilinas Naturais
Metabolismo primário e intermédio do Penicillium
chrysogenum
Processo fermentativo para produção das penicilinas naturais
e do núcleo 6-APA
Etapas da recuperação da penicilina
Penicilinas semi-sintéticas
 3
Linha do tempo
1938
 4

We developed several methods to

grow uncultured organisms by
cultivation in situ or by using
specific growth factors. Here we
report a new antibiotic that we term
teixobactin, discovered in a screen
of uncultured bacteria. Teixobactin
inhibits cell wall synthesis by
binding to a highly conserved motif
of lipid II (precursor of
peptidoglycan) and lipid III
(precursor of cell wall teichoic acid).
We did not obtain any mutants
of Staphylococcus
aureus or Mycobacterium
tuberculosis resistant to teixobactin.
The properties of this compound
suggest a path towards developing
antibiotics that are likely to avoid
development of resistance.
 5

Metabólitos secundários que inibem os processos de

crescimento de outros organismos, sem função
especifica identificada para o microrganismo produtor;
A produção em altas concentrações é conseqüência
de uma série de erros inatos em certos organismos;.
Freqüentemente os antibióticos inibem o crescimento
vegetativo de seus produtores durante a esporulação;
Esporulação e síntese de antibióticos são induzidas
pela depleção de alguns nutrientes essenciais;
Geralmente são produzidas misturas de substâncias
correlatas: Ex. cepa de Streptomyces produz 32
antraciclinas diferentes.
 6

Antibióticos Antibióticos Antibióticos Antibióticos

naturais semi- sintetizados de síntese
sintéticos

Penicilina Amoxilina Cloranfenicol Sulfamídicos

Cefalosporinas Ampicilia Fosfomicina
Rifamicina Cefalexina Pirrolinitrina
Tetraciclina Rifampicina
Bacitracina
Cloranfenicol
Estreptomicina
Kanamicina
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Características gerais
GRUPO TAXONÔMICO Antibi •Crescimento rápido/substrato
óticos econômico (30%)
Actinomicetos (Micromonospora 4.600 •Reprodução das
e Streptomyces) características biossintéticas
Bactérias diferentes dos 950 sem risco de variação
Actinomicetos (Bacillus) •Boas características
Fungos (Penicillium sp.; 1.600 secundárias.
Cephalosporium) Antibiótico Microrganismo
Cloranfenicol S. venezuelae
Cicloheximida S. griseus
Higromicina S. hygromyces
Estreptomicina S. griseus
Tetraciclina(s) S. aurofaciens
Vancomicina S. orientalis
Bacitracina Bacillus subtilis
Cefalosporina(s) Cephalosporium sp.
Penicilina P. chrysogenum
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 9

Causa: A resistência microbiana:

• Staphilococcus aureus resistente à meticillina
• Enterococos resistentes à vancomicina
• Streptococcus pneumoniae resistente à penicillina
• Mycobacterium tubercolosis multi-resistente.

Conseqüência:
Procura de Antibióticos com estruturas básicas
inteiramente novas: “screening”

Modificação de compostos conhecidos:

Modificações por método químico Semi-sintéticos
Modificações por métodos genéticos:
• Mutagênese;
Produção
• Fusão de protoplastos;
relacionada de
• Tecnologia do DNA recombinante. 10 a 30 genes
Aminoácidos e antibióticos peptídicos
Derivados de aminoácidos Ciclosserina
Antibióticos β-lactâmicos Penicilina
Antibióticos peptídicos Bacitracina
Cromopeptídeos Actinomicinas
Depsipeptídeos Valinolicina
Peptídeos quelantes Bleomicina
Antibióticos heterocíclicos que contém nitrogênio
Antibióticos nucleosídicos Polioxinas
Antibióticos heterocíclicos que contém oxigênio
Antibiótico poliéter Monensina
Derivados alicíclicos
Derivados cicloalcanos Cicloheximida
Antibióticos esteróis Ácido fusídico
Antibióticos aromáticos
Derivados benzênicos Cloranfenicol
Antibióticos aromáticos condensados Griseofulvina
Éteres aromáticos Novobicina
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São uma classe bastante ampla que contém o

núcleo β-lactâmico:

1. Penicilinas

2. Cefalosporinas
Clavamas
Carbapenos
Monobactanos e
Inibidores de β-lactamase
(ác. clavulônico)
Estrutura Básica Antibiótico Cepas produtoras

•Penicillium chrysogenum
•Aspergillus nidulans
Penicilinas •Cephalosporium
acremonium
•Streptomyces clavuligerus

Cefalosporinas •Cephalosporium
acremonium

7-metoxicefalosporinas •Nocardia lactamburans

•Streptomyces clavuligerus

Ácido clavulânico •Streptomyces clavuligerus

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Características
•É muito sensível aos ácidos;
•Ineficiente contra bactérias G-
•Rapidamente eliminada;
•Provoca hipersensibilidade
•Sensível às β-lactamases
produzidas por alguns
microrganismos;

Ácido 6-aminopenicilânico-APA

•anel de tiazolidina (vermelho)

•grupo ß-lactamato (azul)
•Radical: ácido fenilacético
(verde).
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1º Antibiótico: Penicillium notatum

Produção de penicilina por Penicillium chrysogenum

NRRL-1951 100 unidades/ml (P. notatum) 1929

espontâneo
B25 250 unidades/ml
(P.chrysogenum) 1943
Raios-X
X-1612 500 unidades/ml
UV
Q-176 900 unidades/ml 0,0012g/L
UV ↓
50g/L
B13-D10 sem produção penicilina
~16 etapas, 5 espontâneas, 1 UV, 10 mostarda nitrogenada Hoje
Cepa comercial >85.000 unidades/ml

R ̶ Penicilinas Naturais Propriedades
Benzilpenicilina (penicilina G)
Natural: obtida em grande
quantidade no caldo de
fermentação
Fenoximetilpenicilina
(penicilina V)
Biossíntética (produzida se o
radical for adicionado)
Alilmercaptometilpenicilina
(penicilina O)
Biossíntética (produzida se o
radical for adicionado)
6-APA
Ácido lábil, sensível à β-
lactamase, baixa atividade
contra bactérias G-
Resistente aos ácidos,
demais propriedades
semelhantes penicilina G
Propriedades alérgicas
reduzidas
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 Ciclo α-cetoglutarato 17
de Ácido L-α-aminoadípico (α-AAA)
Krebs

Produção
Bioquímica Lisina
α
↑ PO4 = crescimento celular
baixa produção
↑ Glicose = repressão catabólica

α
PRECURSORES: Núcleo do (6-APA)
Naturalmente
produzidos, porém Ác.fenilacético
se adicionados α
ativado
incrementam a
produção
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Alimentação: Todo
Ác fenilacético processo
Glicose ocorre em
Amônia esterilidade
Tampões

1 ml Biorreatores:
Suspensão 120.000 L
a
esporos
400.000 L
4 dias

100 ml 10 L
500mL Fermentador 180.000 L
100 L e 1000 L
Frascos em planta Pré-fermentadores
agitados piloto
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Preparação do
inóculo
Preservação dos esporos:
Preparação e solo seco,
esterilização do meio liofilizados ou
esporos inertes
Inoculação do meio no Reativação de muito pequena
fermentador quantidade de esporos usando ágar
inclinado;
Fermentação em 2 Aumento gradativo do volume
etapas
Aeração forçada com ar •Final: 105 a 107 esporos
estéril durante a
•Aprox.:10% volume do fermentador
incubação
•Após adição: 5x103 esporos/mL
Remoção do micélio •Resulta:~3-5 ton. micélio seco em
após a fermentação fermentador de 50.000 L).

Extração e purificação
da penicilina
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1a. Etapa: Processo em batelada:

etapa de crescimento celular
25 -27oC
pH 6,5 a 7,0
Tempo: 6h + 30 – 40 h
Aeração: alta conc. O2
Agitação: (120-150 rpm)

2ª. Etapa: Processo em batelada

alimentada:
etapa de produção de antibiótico.
120 -160 h
•Glicose (alimentação):
1,0 a 2,5 kg.m-3.h-1

Alimentação contínua
•Amonia
•Ác. fenilacético ou fenoxi
Fermentador 50 a
200.000 L 2 etapas
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Fonte de carbono: glicose, sacarose, Exemplo de Mosto utilizado

lactose comercialmente
65% energia Meio de Jarvis e Johnson
25% crescimento Água de milho 2-4%
10% antibióticos (precursores)
Farinha de soja 2-3%
Fonte de Nitrogênio: água de milho, farinha *lactose 2-4%
de soja, amônia e sulfato de amônio CaCO3 0,5-1,0%
Ác fenilacético 0,5-0,8%
(precursor)
Precursores: Tampão pH 6,5
PENICLINA G Temperatura 23 – 28°C
Ácido fenilacético (para batelada alimentada
e/ou Fontes de elementos do anel β-
lactâmico: valina e cisteina
 23

Alimentação de ác. Fenilacético

Alimentação
de glicose
Alimentação de
Nitrogênio

Lactose Penicilina

Batelada Batelada alimentada

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manter baixa a concentração de fontes-C facilmente

metabolizáveis (repressão catabólica pela glicose)
terminar a fase de crescimento com limitação pela fonte de
N;
manter adição constante do precursor da cadeia lateral (ou
do próprio ácido fenilacético) (0.5-1.0 g/l-caldo);
aumentar gradualmente a velocidade de agitação durante a
fermentação;
manter a concentração de O2 dissolvido no caldo elevada
(>40%sat);
manter a concentração de CO2 no ar de saída baixa
(<10%sat);
manter pH em torno de 6.5; manter T próxima de 25ºC;
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 26

O caldo é retirado do fermentador, resfriado a 5-10oC e filtrado

Adição de ácido sulfúrico até pH 2,0 – 2,5; Extração com solvente
A penicilina é então extraída do acetato de butila para um tampão aquoso com pH 7,0 em centrífuga extratora em contracorrente.
Ë feito tratamento com carbono da fase aquosa;
É adicionado acetato de potássio em excesso ao solvente extrator em tanque de cristalização para cristalização dos sais K;
As cristais são recuperados por filtração; Os cristais são secos.
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Antibióticos semissintéticos: desenvolvimento

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R1 R2 = H
Núcleo 6-aminopenicilânico

Propicilina: estável à acidez, sensível à β-lactamase

Meticilina: estável à acidez, resistente à β-lactamase

Oxacilina: estável à acidez, resistente à β-lactamase

Ampicilina: amplo-espectro (especialmente G-),

resistente à acidez, sensível à β-lactamase
Carbenecilina: amplo espectro (especialmente frente
à Pseudomonas aeruginosa), resistente à acidez,
sensível à β-lactamase
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ETAPAS DE PRODUÇÃO
1. Biossíntese e extração da penicilina natural por
fermentação como visto anteriormente:
2. Hidrólise enzimática da penicilina, obtenção do
núcleo 6-APA;
3. Adição do radical específico por síntese química
ou por Biotransformação
CARACTERÍSTICAS
Maior Resistencia aos ácidos do estômago;
Aumento da estabilidade da substância;
Diferentes graus de resistência à penicilinase
(Gram+);
Maior ação contra Gram-
Mais seletiva;
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Penicilina
acilase

Ác. fenilacético Ác. 6-aminopenicilänico

Penicilina G 6APA
Enzima penicilina acilase
(ou penicilina amidase) Recuperação e Uso do 6-APA na produção
Bactérias G- reutilização do de novas penicilinas semi-
•E.Coli (Bayer) ác. fenilacético sintéticas
•Bacillus megaterium (Squibb)
•Proteus rettgeri (Pfizer)
Adição de novos grupos acil
•Método de produção da enzima por
•Cultivo do microrganismo produtor SÍNTESE QUÍMICA
a 37°C
•Isolada e normalmente
imobilizada;
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 32
2ª Etapa: Síntese química ou
síntese enzimática
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2ª Etapa: Síntese enzimática
termodinamicamente controlada
Também por Biotransformação
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