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IMUNOENSAIOS:

IMUNOENSAIOS

IMUNOPRECIPITAO IMUNOENSAIOS DE AGLUTINAO RADIOIMUNOENSAIO (RIA) ENZIMOIMUNOENSAIO

MODELOS DE TESTES

IMUNOENSAIOS FLUORESCENTES IMUNOENSAIO QUIMIOLUMINESCENTE

Natalia Witzke Testoni estagiria Laboratrio Verner Willrich

IMUNOPRECIPITAO
n

IMUNOPRECIPITAO

NEFELOMETRIA:
Segundo o princpio da nefelometria, as reaes de precipitao entre antgeno e anticorpo em solues diludas produzem um aumento da reflexo da luz, que pode ser diretamente medida pela disperso da luz incidente. Princpio de Tyndall:
Sensor

As tcnicas de imunoprecipitao permitem identificar e at quantificar precipitados resultantes da interao antgeno- anticorpo. Entre os principais interferentes, entre fsicos-qumicos e imunolgicos, o que mais interfere na quantidade de precipitado formado so as concentraes relativas de antgeno e e de anticorpos.

Feixe de Luz

Sensor

Estrutura da malha quando h excesso de Ac

Sensor Equivalncia Estrutura da malha quando h excesso de Ag VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicaes. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.

VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicaes. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.

IMUNOENSAIOS DE AGLUTINAO

IMUNOENSAIOS DE AGLUTINAO

n Fatores que diferem a formao dos

agregados:
Classe do anticorpo envolvido Concentrao inica e pH do meio Presena de macromolculas, ons, enzimas e

A caracterstica principal da imunoaglutinao que um dos componentes apresentado na forma insolvel em suspenso, de forma natural em clulas ou adsorvido artificialmente em micropartculas ou clulas.

conservantes.
Tempo e temperatura Padronizao adequada da suspenso de

micropartculas ou clulas.
Concentrao tima de antgeno ou Ac a ser fixado

nas micropartculas ou clulas.

Estabilidade da ligao do Ag/Ac e acessibilidade

dessa molcula nas micropartculas ou clulas.

VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicaes. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007. VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicaes. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.

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IMUNOENSAIOS DE AGLUTINAO
n AGLUTINAO DIRETA:
Neste teste, o antgeno faz parte naturalmente da clula, e haver aglutinao dessas clulas promovida por anticorpo contra esses antgenos (antgeno naturalmente insolvel).

IMUNOENSAIOS DE AGLUTINAO
AGLUTINAO INDIRETA: Esse mtodo emprega a absoro de anticorpos ou antgenos proticos solveis na superfcie de micropartculas inertes (suporte).

Anticorpo conjugado

Antgeno

Complexo precipitado

As principais partculas usadas como suporte so o ltex, hemcias e gelatina.

VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicaes. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.

Ex: Identificao de antgenos eritrocitrios na tipagem sangunea, reao de Widal

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IMUNOAGLUTINAO
INDIRETA

IMUNOENSAIOS DE AGLUTINAO
Vantagens da tcnica de imunoaglutinao: Baixo custo Elevada sensibilidade Leitura visual Facilidade de execuo
Complexo precipitado

Antgeno Anticorpo conjugado

A aglutinao ocorre quando h formao de agregados suficientemente grandes de micropartculas ou clulas interligados por pontes moleculares de anticorpos

Desvantagens da tcnica de imunoaglutinao:

Reprodutibilidade dos lotes de reagentes. Acessibilidade molecular para interao Ag-Ac Estabilidade da ligao do Ag/Ac no suporte

Antgeno conjugado HENRY

Anticorpo

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RADIOIMUNOENSAIO (RIA)
Os

RADIOIMUNOENSAIO (RIA)
1 MTODO: Uma quantidade conhecida de antgenos marcados e Antgenos da amostras so misturadas e reagem competitivamente com uma quantidade fixa de Anticorpos fixos na fase slida. Depois que a reao imune atinge o equilbrio, a mistura lavada para remover os conjugados no reativos, que so separados do complexo imune preso na fase slida. A concentrao do analito inversamente proporcional ao sinal emitido.

Radioimunoensaios utilizam anticorpos conjugados com radioistopos para quantificar os ensaios. Os radioistopos podem ser: Iodo 125 ou 131, Cobalto, Trcio.
Devido a meia-vida dos reagentes utilizados, o risco

operacional e a necessidade de medidas especiais e de elevado custo de biossegurana e descarte de material levam a laboratrios optarem por tcnicas que empregam reagentes de maior estabilidade.
http://www.dpcmedlab.com.br/areacientifica/metodologias.asp VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicaes. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007. MAPHERSON, R.A., PINCUS, M. R. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods

Lavagem

Antgeno da amostra

Antgeno conjugado

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RADIOIMUNOENSAIO (RIA)
2 MANEIRA: Mtodo do sanduche, onde um anticorpo ligado a fase slida forma um imunocomplexo. Um segundo Anticorpo conjugado se liga ao imunocomplexo. feito uma lavagem para retirar os anticorpos conjugados no reativos. E em seguida feita a lavagem

RADIOIMUNOENSAIO (RIA)
Vantagens: Alta sensibilidade Permite medidas rpidas e precisas Limiar de deteco em nanogramas e picogramas. Desvantagens: Custo Vida mdia dos reagentes Risco operacional (radiao)

A concentrao do analito diretamente proporcional ao sinal emitido.

Quantificao

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Tnicas imunolgicas -

ENZIMOIMUNOENSAIO (EIA)
similar a RIA, exceto que a atividade

ENZIMOIMUNOENSAIO
Enzima

enzimtica que quantificada e no a radioatividade.

Ensaio competitivo

Enzima

Ensaio No-competitivo (sanduche)

O EIA requer um processo secundrio para

obter o sinal atravs das reaes catalticas das enzimas.

Ensaio Antgeno
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Enzima

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ENZIMOIMUNOENSAIO (EIA)
ENZIMA ENZIMA

ENZIMOIMUNOENSAIO (EIA)
Vantagens: Reagentes so relativamente baratos e tem uma longa estabilidade

Desvantagens: A quantificao da enzima pode ser mais complexa que a de alguns radioistopos. Atividade enzimtica pode ser afetada por constituintes do plasma Ensaios homogneos no so to sensveis quanto os RIA. EIA para molculas proticas grandes necessitam de reagentes imunoqumicos complexos

ENZIMA

Podem ser desenvolvidos mltiplos ensaios simultneos O equipamento barato e facilmente disponvel No h riscos de radiao durante a marcao ou descarte do teste

ENZIMA ENZIMA

Forma ativa da enzima

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ENZIMOIMUNOENSAIO (EIA)
ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) Baseia-se na imobilizao de um dos componentes, em fase slida, e na utilizao de um conjugado ligado a uma enzima. Como o substrato forma um produto colorido, a alterao de cor monitorada visualmente ou por meio de espectrofotmetro que relaciona a quantidade de substncia dosada intensidade de cor.
MAPHERSON, R.A., PINCUS, M. R. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods
n

Variao nos tons

httpwww.microvet.arizona.educoursesmic419ToolBoxelisa3.jpg

ENZIMOIMUNOENSAIO (EIA)
Ele apresenta:

MEIA Microparticle Enzyme Immuno Assay

n Depois do ELISA, nasceu o MEIA. A tecnologia MEIA

Elevada sensibilidade Rapidez e baixo custo Objetividade na leitura Possibilidade de adaptao a diferentes graus de automao. utiliza reagentes estveis no trabalha com radioistopos No depende de formao de precipitado, aglutinado, etc.

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tem como princpio o uso de micropartculas sensibilizadas com anticorpos ou antgenos (dependendo da finalidade do produto), sendo sua tcnica utilizada para testes qualitativos e quantitativos.
n O fato de utilizar micropartculas como fase slida

aumenta a superfcie de contato entre as partes da soluo, aumentando a sensibilidade e a especificidade do mtodo e diminuindo o seu tempo de incubao.

PAULA, T. B. C.; MORONI, A. F.; GUAZZELLI, C.; NONOYAMA, K.; SALZONE, C. M. Efeitos dos contraceptivos hormonais orais de baixa dosagem estrognica nas taxas de folato intra-eritrocitrio MAPHERSON, R.A., PINCUS, M. R. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods

ENSAIOS IMUNOFLUORESCENTES
n Nos

IMUNOFLUORESCENTES
Os testes de imunofluorescncia podem ser classificados de acordo com o componente marcado (antgeno ou anticorpo), pelo mtodo (competitivo ou no competitivo), por serem homogneos ou heterogneos, ou ainda pela realizao em fase slida ou lquida. A principal aplicao da imunofluorescncia direta na imunocitoqumica (doenas imunolgicas renais e de pele). A imunofluorescncia indireta amplifica o sinal e aumenta a sensibilidade do teste. Alm disso, pode ser empregado na pesquisa de antgenos (plasmdio em hemcia) e de anticorpos (sfilis, toxoplasmose, rubola, citomegalovrus, vrus do herpes simples, doena de Chagas, malria, etc).
Tcnica imunolgicas -

testes de imunofluorescncia so empregados anticorpos ou antgenos conjugados a molculas reveladoras chamadas fluorocromos. fluorocromos.

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IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA

IMUNOFLUORESCENTES
As VANTAGENS da imunofluorescncia indireta: Sensibilidade Especificidade Reprodutibilidade De simples padronizao e execuo

As DESVANTAGENS da imunofluorescncia indireta: Necessidade de microscpio de fluorescncia Subjetividade na leitura No-automao

http://www.labsaluti.com.br/img/fotoifichagas.png

IMUNOENSAIO QUIMIOLUMINESCENTE
Esses teste utilizam como conjugados molculas geradoras de quimioluminescncia como os derivados do luminol, steres acridinium, derivados de nitrofenil oxalato ou rutenium tri-bipridyl com tripropilamina(TPA). Esta reao hidrolisa o substrato quimiluminescente gerando um produto instvel o qual aps estabilizao gera emisso de ftons de luz (amplificados) que medida atravs de um fotomultiplicador, que tem a funo de transformar a luz emitida pelos ftons em impulsos eltricos. Estes impulsos so lidos em contagens de luz por segundo (cps).
http://www.dpcmedlab.com.br/areacientifica/metodologias.asp Manual Elecsys 2010 Roche Diagnostics

Vantagens sobre o ELISA e MEIA

n O sinal da quimioluminescncia um sinal que

permite verificar muito mais variaes que o sinal colorimtrico emitido pelo ELISA ou MEIA.

n Devido elevada sensibilidade, os ensaios de

quimiluminescentes so muito usados para a determinao quantitativa de hormnios, marcadores tumorais, peptdeos e drogas.

ELETROQUIMIOLUMINESCENCIA

ECLIA
A eletroquimioluminescncia ocorre quando aplicada uma corrente eltrica em um eletrodo de platina, cria um campo eltrico que fazendo com que todos os materiais nesse campo reajam. Complexo que gera a luminescncia: Rutnio(II)tri(bipiridil) + Tripropilamina [Ru(bpi)3]2 (TPA) O rutnio e o TPA so estveis quando no aplicada a voltagem.

ELETROQUIMIOLUMINESCENCIA

Leitura:
1.

Utilizando um m as micropartculas que se encontram revestidas com complexos de antgeno - anticorpo so uniformemente depositadas no eletrodo de trabalho. O m removido e depois aplicada a voltagem ao eletrodo onde esto depositadas as micropartculas. A emisso de luz medida com um fotomultiplicador. Depois da medio as micropartculas so limpas da superfcie do eletrodo usando o Clean Cell

2.

3. 4.

Manual Elecsys 2010 Roche Diagnostics

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-Mtodo sanduche

Primeira etapa

Segunda etapa

Manual Elecsys 2010 Roche Diagnostics

Terceira etapa

ELETROQUIMIOLUMINESCENCIA

VANTAGENS
Marcao estvel permite utilizar reagentes lquidos. Tem alta sensibilidade com um perodo curto de

incubao (Elecsys: 18 minutos)

No existem grandes necessidades de diluio. aplicvel na deteco de todos os analitos

(mtodos)
A vantagem de iniciar a reao quimioluminescente

eletricamente reside no fato de se possvel controlar, com rigor, toda a reao.

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