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Captulo 5
Cultivo celular
Emanuele Amorim Alves Anna Christina Rosa Guimares

1 . Histrico de desenvolvimento da tecnologia de cultura de tecidos 1.1. Histrico da cultura de clulas

O cultivo de clulas se iniciou no princpio do sculo XX com Harrison, em 1907, e Carrel, em 1912. Essa tcnica foi desenvolvida como um mtodo para estudar o comportamento de clulas animais fora do organismo, em um meio ambiente controlado. Essa tcnica ainda uma importante ferramenta de pesquisa nos laboratrios do mundo inteiro. Os primeiros experimentos consistiam em cultivo de tecidos fragmentados mecanicamente em frascos contendo fluidos dos animais de onde provinham os tecidos. Devido a essa forma de cultivo, durante mais de 50 anos essa tcnica foi chamada cultivo de tecidos do ingls tissue culture , sendo esse termo atualmente usado genericamente para denominar tanto o cultivo de clulas quanto o de tecidos e de rgos.

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Harrison foi um pioneiro no uso de cultura de clulas. Na poca, ainda havia dvidas da dinmica do desenvolvimento do tecido nervoso, pois somente observaes microscpicas no forneciam informaes sobre esse processo. Harrison queria provar que as fibras nervosas eram formadas a partir de clulas nervosas. Para isso ele necessitou observar essas clulas fora do organismo para comprovar sua teoria. Mas como seria possvel um tecido viver fora do organismo original? Harrison levou em considerao as necessidades bsicas de uma clula e desenvolveu um experimento no qual ele mimetizou tais condies. Assim, ele dissecou o tubo medular de um embrio de sapo e o mergulhou em sua linfa fresca. Esta linfa em instantes se coagulou e, logo em seguida, Harrison selou o frasco com parafina, observando a sua preparao ao microscpio todos os dias. Uma das vantagens desse experimento era a falta de necessidade de controle de temperatura, j que os anfbios so animais cuja temperatura varia com a temperatura ambiente. Harrison teve o cuidado de manter as condies asspticas, e suas consideraes sobre a possibilidade de se manter in vitro clulas vivas por mais de uma semana foram um marco para a cultura de clulas. Com esse experimento, Harrison confirmou a sua hiptese, provando que as fibras nervosas so formadas a partir das clulas nervosas. Com isso, muitos outros cientistas passaram a se interessar por esse modelo de experimento, introduzindo o uso de cultura de clulas em suas pesquisas. Em 1912, Alexis Carrel, utilizando informaes obtidas nas observaes de Harrison, desenvolveu um modelo a partir de clulas cardacas de embrio de galinha para o cultivo. Seus experimentos foram muito importantes, pois com Carrel descobriu-se a necessidade da troca de fonte de nutrientes contidos nos frascos. Essa renovao constante de nutrientes em cultivo permitiu que as clulas pudessem ser cultivadas por perodos ainda maiores do que os utilizados por Harrison. Em 1951, George Gey cultivou clulas de tecido tumoral humano estabelecendo a linhagem HeLa, utilizada at hoje em todo o mundo. O fato

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de que tumores humanos poderiam dar origem a clulas contnuas em linhagem aumentou o interesse pelo cultivo de tecidos. O avano na cultura de clulas ocorreu, em grande parte, por intermdio dos experimentos de Hayflick e Moorhead, em 1961, considerados clssicos, nos quais eles utilizaram clulas de vida finita. Em 1962, Nakamura e colaboradores, no Japo, estabeleceram a linhagem VERO, oriunda de rim de macaco-verde africano (Cercopithecus aethiops). Essa clula uma das poucas, na atualidade, aprovadas para uso em produo de vacinas pela Organizao Mundial da Saude (OMS), o que a torna um excelente modelo de pesquisas para o desenvolvimento de novas vacinas. Muitas outras linhagens foram estabelecidas pelos pesquisadores. Atualmente, a cultura de clulas no se limita ao estudo do comportamento de determinado tecido ou clula in vitro. Seu uso se estende medicina, pois clulas em cultivo tm importante papel no tratamento de doenas degenerativas. Para a terapia celular, as pesquisas com clulas-tronco so um marco nessa rea que, de ferramenta para outros estudos, tornou-se a protagonista do desenvolvimento tecnolgico mundial.
1.2. Tipos de culturas

Clulas em cultivo so um modelo de funo fisiolgica muito contraditrio, devido perda de caractersticas que ocorre durante o seu desenvolvimento em cultura. A proliferao in vitro difere daquela in vivo. Assim, por mais prximo que esse modelo esteja da realidade, o processo in vitro ainda causa problemas para o desenvolvimento celular. Sua adeso clula clula e clula matriz reduzida, no possui as caractersticas (heterogeneidade e arquitetura tridimensional) de um tecido in vivo, uma vez que seu meio nutricional e hormonal est modificado. Clulas que, num momento anterior, cresciam tridimensionalmente agora se encontram em um meio que favorece o espalhamento, a migrao e a proliferao de clulas no especializadas que expressem diferentes funes. A

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escolha do meio ideal um caminho a se seguir para a obteno de uma cultura que expresse uma funo especfica. Apesar disso, ainda existem muitas vantagens no uso de cultura de clulas como modelo experimental. O controle do ambiente, a homogeneidade da amostra, quando comparada ao uso de animais em experimentos, e a economia so as principais vantagens dessa tcnica. Atualmente, com a implementao das Comisses de tica de Uso de Animais em Pesquisa (CEUA), a cultura de clulas o principal modelo alternativo para a substituio dos animais em experimentos de pesquisa.
1.2.1. Clulas primrias, clulas estabelecidas e clulas transformadas

Uma cultura primria estabelecida a partir do crescimento de clulas oriundas de um fragmento de tecido obtido por desagregao mecnica ou enzimtica. As clulas que conseguirem sobreviver ao processo de desagregao e aderirem garrafa formaro a primeira monocamada de clulas daquele tecido. Essas clulas possuem as caractersticas do tecido de origem, podem crescer em cultura por um determinado perodo de tempo e so denominadas clulas primrias. Essa forma de cultivo a mais utilizada para estudar o comportamento de determinada clula in vitro devido presena de suas caractersticas genotpicas e fenotpicas. As clulas primrias que conseguem manter suas caractersticas originais possuem um tempo de vida curto. No organismo, a morte celular um mecanismo para renovao tecidual. Essa morte programada e no causa danos. Esse processo denominado apoptose. Na apoptose, a clula no rompida, ela simplesmente se autodigere, formando botes apoptticos que so degradados. medida que a cultura repicada, as clulas com uma maior capacidade de proliferao iro predominar na garrafa de cultivo em detrimento das clulas que no se adaptaram bem ao cultivo ou que, devido a traumas do processo de desagregao, no possuem uma taxa normal de proliferao.

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Essas clulas ainda no perderam as caractersticas do tecido de origem, mas possuem alta proliferao. Esse tipo de clula chamado linhagem celular contnua, e muito utilizado em pesquisa, pois pode ser mantido em cultura por um grande perodo de tempo (quando comparado s clulas primrias) e ainda guarda grande parte das caractersticas do tecido original. Muitas linhagens celulares contnuas podem ser propagadas sem perder suas caractersticas por at oitenta passagens, alm de serem euploides, ou seja, possuem um nmero de cromossomos mltiplo do nmero original da espcie. Essas clulas so muito utilizadas em pesquisa e na produo de vacinas, como o caso da linhagem MRC-5, oriunda de tecido de pulmo de feto humano e utilizada na produo da vacina de rubola. No momento em que as caractersticas genticas das clulas so modificadas, elas deixam de ser semelhantes morfologica e geneticamente ao tecido original e so ento chamadas clulas transformadas. Tais clulas podem ser transformadas em cultura utilizando-se substncias qumicas, vrus ou agentes fsicos como a luz ultravioleta. A transformao celular uma alterao gentica que permite mutaes em genes responsveis pelo controle do ciclo celular (proto-oncogenes e genes supressores de tumor). A mutao pode resultar de uma superexpresso de proto-oncogenes ou da inativao de genes supressores de tumor. O principal reflexo dessa mutao a presena da telomerase ativa. Durante a diviso, a clula perde um pedao da poro final de seus cromossomos o telmero. Esse processo um tipo de controle para que a clula, ao checar se h possibilidade de diviso (check point), realize apoptose ao perceber que seu DNA est danificado a ponto de alterar alguma transcrio. A telomerase repe o telmero perdido permitindo que a clula se divida indefinidamente sem que perca um pedao de seu DNA codante. A proliferao exacerbada est diretamente ligada ao processo de transformao.

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As clulas transformadas tambm podem ser obtidas diretamente de tecidos j mutados, como o caso de tecidos tumorais. O exemplo mais famoso desse tipo de clula so as clulas HeLa oriundas de um tumor de crvice uterina humana. As clulas HeLa so clulas gentica e morfologicamente diferentes do tecido original, e no possuem dependncia de ancoragem nem inibio por contato, alm de serem capazes de proliferar infinitamente quando em cultura. Essas clulas so muito utilizadas em estudos de citotoxicidade, controle de qualidade, entre outros. As clulas transformadas no so ainda amplamente utilizadas na produo de vacinas, em face do risco de o DNA alterado dessa clula alterar o DNA do indivduo que fez uso dessa vacina. A nica clula transformada usada na fabricao de vacinas a clula VERO. Porm, existem controles rgidos quanto quantidade de DNA celular residual presente em cada vial1 da vacina. A OMS estabelece um limite de 10 ng de DNA por vial.
1.2.2. Clulas aderentes e clulas no aderentes

As clulas em cultura possuem, inicialmente, caractersticas semelhantes aos seus tecidos de origem. Assim, clulas provenientes de tecidos epiteliais tero uma maior dependncia de interao clula clula, enquanto clulas hematopoiticas no necessitam de nenhuma interao. As clulas cultivadas podem apresentar dois aspectos distintos, isto , podem ser aderentes ou no aderentes, o que significa dizer que algumas clulas podero se ligar ao fundo da garrafa de cultura enquanto outras ficaro em suspenso no meio. As clulas aderentes so oriundas de tecidos duros e, por isso, so dependentes de ancoragem, ou seja, necessitam de adeso a uma superfcie de contato para que possam iniciar a sua proliferao. Para as clulas aderentes, as garrafas de cultura devem possuir uma carga negativa. Essa
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Frasco de vidro com volume variado utilizado no armazenamento de produtos biolgicos.

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carga medeia a produo de protenas de adeso e proteoglicanos que iro iniciar o processo de adeso da clula superfcie da garrafa. a matriz extracelular que interage com a carga negativa da garrafa e, ento, as clulas se ligam matriz por receptores especficos. Nas clulas epiteliais ainda h a interao clula clula mediada por molculas de adeso clula clula (CAMs) e pelas caderinas (dependentes de Ca+2). Quando em cultura, as clulas aderentes se espalham por todo o fundo da garrafa formando o que chamado monocamada celular. As clulas no aderentes podem ser cultivadas em suspenso no meio e so derivadas de tecidos que no necessitam de ancoragem para proliferar e sobreviver. Essa capacidade est restrita s clulas hematopoiticas, s linhagens transformadas ou s clulas de tecido tumoral. Figura 1. Linhagem MA 104 (rim de macaco-verde africano). Linhagem aderente. Figura 2. Linhagem MM6 (monoctica leucmica humana). Linhagem no aderente.

Fonte: Fotos cedidas pelo Setor de Cultura de Clulas do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade (INCQS), Fiocruz.

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2. Biossegurana aplicada a laboratrios de cultivo celular

Como em qualquer atividade laboratorial, antes do incio do cultivo celular, deve-se planejar o trabalho a ser realizado de modo a execut-lo com segurana. Deve ser preparado um procedimento com as especificaes das atividades realizadas e todo pessoal deve ser orientado sobre os possveis riscos e para a necessidade de seguir as especificaes de cada rotina de trabalho, os procedimentos de biossegurana e prticas de segurana. H, pelo menos, 24 casos documentados de infeco em funcionrios de laboratrio que manipulam culturas de clulas primrias (por exemplo, clulas de macaco Rhesus) nos ltimos 30 anos. Embora um nmero limitado de infeces adquiridas em laboratrios tenha sido relatado como resultado da manipulao de clulas humanas e de outros primatas, h um risco significativamente maior em adquirir uma infeco pelo HIV ou pelo HBV por meio da exposio ao sangue humano e a outros lquidos corporais. Os riscos potenciais associados s clulas e tecidos humanos incluem os patgenos do sangue HBV e HIV, bem como agentes presentes nos tecidos humanos, como Mycobacterium tuberculosis, que pode estar presente nos tecidos pulmonares. Outros riscos potenciais aos trabalhadores so representados pelo uso de clulas transformadas por agentes virais, como o SV-40, assim como as clulas que carregam material gentico viral. As clulas humanas tumorognicas tambm podem oferecer riscos potenciais como resultado de uma autoinoculao. Alm do risco biolgico, um laboratrio de cultivo celular possui os riscos:

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qumicos lquidos combustveis, corantes txicos (azul de Tripan,

MTT, bis-benzimida), gases txicos;

fsicos calor, radiao, vibrao e frio. 2.1. Barreiras de conteno no trabalho em cultura de clulas

Antes de iniciar os procedimentos de manipulao, o pesquisador, ou tcnico, deve usar guarda-p limpo ou descartvel, gorro, mscara cirrgica e sapatilha, como conteno primria. Lavar as mos e a parte anterior do antebrao com gua e sabo, preferencialmente antissptico, realizar antissepsia das mos com lcool 70% (v/v) e calar luvas cirrgicas. Tais procedimentos so muito importantes para a manipulao de clulas. O profissional no deve usar anis, pulseiras, relgios ou outros ornamentos durante as manipulaes. Clulas animais devem ser manipuladas usando-se as prticas e a conteno do nvel de biossegurana 2. O trabalho deve ser realizado em cabine de segurana biolgica, e todo o material dever ser descontaminado antes do descarte. A conteno secundria obtida mediante a combinao de elementos relacionados infraestrutura laboratorial.
2.2. Infraestrutura laboratorial

A organizao de um laboratrio voltado pesquisa com clulas depende da sua finalidade e do nmero de pessoas que nele vo trabalhar. De maneira geral, o laboratrio necessita dos seguintes espaos:
rea para lavagem e esterilizao; rea para preparo de meios; rea para incubao e observao das culturas; rea para manipulao assptica das culturas.

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As diversas reas devem estar funcionalmente distribudas, facilitando o deslocamento de pessoal e o fluxo de materiais, com a menor circulao possvel nas reas de manipulao assptica das culturas. A rea destinada a manipulaes, onde se localizam as cabines de fluxo, deve ser preferencialmente fechada e muito limpa. Deve-se trabalhar com avental limpo, exclusivo para uso nessa sala. A superfcie das bancadas deve ser impermevel gua e resistente a cidos, lcalis, solventes orgnicos e a calor moderado. As instalaes devem ser desenhadas de modo a permitir espaos entre as bancadas, equipamentos e cabines, que devem permitir fcil limpeza. Os equipamentos necessrios tambm dependem das finalidades do laboratrio. Em geral, o laboratrio necessita de:
estufa incubadora com atmosfera de CO2; autoclave; deionizador de gua; estufa para secagem de material; cabine de segurana biolgica (cmara de fluxo de ar laminar estril); medidor de pH; balana analtica; geladeira; freezer; microscpio invertido; agitador magntico; centrfuga refrigerada; banho-maria; bomba de vcuo.

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Para trabalhos com culturas de clulas, inmeros instrumentos so necessrios, tais como: cmara para contagem, pipetador automtico, micropipetas, estante para tubos, alm de uma variedade de vidrarias e reagentes necessrios para preparo de meios de cultura e solues. As salas devem ser sinalizadas com smbolo universal de risco biolgico, com acesso restrito equipe tcnica de apoio.
2.3. Limpeza, desinfeco e esterilizao

A superfcie da rea de trabalho deve sempre ser limpa, utilizando-se lcool a 70% (v/v), uma vez por dia ou aps cada atividade. O lcool etlico a 70% (v/v) um excelente desinfetante por sua ao de limpeza ou detergente, sendo eficaz tambm na reduo da flora bacteriana da pele. Suas propriedades desidratante e desnaturante de protenas podem ser responsveis por sua ao antimicrobiana. A gua sanitria comercial (2% a 5% de cloro) , tambm, um bom desinfetante quando diluda de 5 a 10 vezes, por ser um agente oxidante e agir sobre os constituintes da membrana, levando os microrganismos morte. Todo material aquecido no banho-maria, como meios de cultura e solues, deve ter processo prvio de assepsia antes de sua introduo na cabine de segurana biolgica. Deve-se, ao retirar o material do banho-maria, remover o excesso de umidade com auxlio de uma gaze e posterior limpeza com lcool 70% (v/v). Antes de se iniciarem os procedimentos, a cmara interna do fluxo deve ser limpa com gaze embebida em lcool etlico 70% (v/v). O fluxo de ar, assim como a lmpada de ultravioleta devem ser ligados trinta minutos antes do uso. Todo material deve ser limpo com lcool etlico a 70% (v/v) antes de ser introduzido na cmara. Aps o trmino dos procedimentos, deve-se realizar a limpeza da cmara interna, removendo possveis sujidades. Manter o intervalo

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de pelo menos vinte minutos, com o fluxo de ar e a lmpada de ultravioleta ligados, antes de iniciar outro procedimento ou encerrar as atividades. Realizar avaliao e monitoramento ambiental da cabine pelo mtodo de exposio de placas, tal como descrito no item controle microbiolgico de ambientes e processos.
2.4. Controle microbiolgico de ambientes e processos

O trabalho com cultivos celulares exige uma srie de cuidados para se reduzirem os riscos de contaminao. As tcnicas asspticas reduzem a probabilidade de infeco, sendo importante que sejam mantidas a todo momento: antes, durante e ao trmino do experimento. A necessidade de manuteno da assepsia inclui uma srie de procedimentos que vo desde a esterilizao dos meios de cultura e instrumentos, at a adoo de quarentena para os cultivos novos. Isso porque as clulas so cultivadas em meios ricos em nutrientes e a possibilidade de ocorrer propagao de microrganismos contaminantes alta. As culturas, assim como todos os resduos da manipulao, devem ser descontaminadas, antes do descarte, em autoclave durante uma hora a 121C. Culturas contaminadas no devem ser abertas para lavagem antes da descontaminao. Esse material deve ser retirado do laboratrio imediatamente em recipientes rgidos e prova de vazamentos. Deve-se controlar a temperatura e a umidade para evitar o crescimento de microrganismos no ambiente. A climatizao de uma sala de 15m 2 (45m3) pode ser feita por um aparelho de ar condicionado de 15.000 BTUs, levando-se em conta que existe o aquecimento produzido pelos equipamentos. O monitoramento microbiolgico da sala, bem como das cabines de segurana biolgica para o cultivo de clulas, pode ser realizado pela pesquisa de microrganismos, como fungos e bactrias. Um procedimento rotineiro indicado para controle ambiental o mtodo de exposio de placas com meios

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nutritivos gar casena de soja (trypticase soy agar-TSA) e gar sabouraud 4% de glicose (Sab4). O laboratrio deve possuir um programa rotineiro adequado de controle de insetos e roedores. Todas as reas que permitam ventilao devero conter barreiras fsicas para impedir a passagem de insetos ou outros animais.
3. Tcnicas/conceitos para cultivo celular 3.1. Lavagem e preparo do material para cultura de clulas

A vidraria utilizada para cultura de clulas deve ser exclusiva e processada separadamente das demais. A vidraria deve ser lavada imergindo-a em gua com detergente neutro a 5%, durante 12 horas, e enxaguando-a 3 a 4 vezes em gua comum, e 2 a 3 vezes em gua destilada. O material limpo deve apresentar uma pelcula uniforme de lquido nas paredes aps o ltimo enxgue. Caso no haja a formao desta pelcula, o material dever ser submetido a novo processo de lavagem, pois significa que h traos de gordura ou qualquer sujidade no material. Frascos muitos sujos, com resduos aderidos, devem ser lavados com soluo sulfocrmica (soluo de bicromato de potssio a 3% em cido sulfrico concentrado1:9), que requer muito cuidado no uso devido presena do cromo IV (Cr+4). Muitos materiais necessitam de uma lavagem prvia, sob agitao durante 5 a 10 minutos, em soluo detergente. A secagem do material deve ocorrer em estufa de secagem a 120C, por aproximadamente 6 horas. O material limpo e seco no deve conter qualquer tipo de resduo, mancha, colorao e/ou opacidade; caso contrrio, o material deve ser submetido a um novo processo de lavagem. A montagem e embalo podem ser realizados com envelopes e/ou bolsas prprios para esterilizao, ou ainda material do tipo no tecido. Deve ser evitado o uso de papel Kraft por gerar aerossis.

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A esterilizao da vidraria em geral realizada por autoclavao sob presso a 121C por 20 minutos. Outros materiais podem ser esterilizados por mais tempo se necessrio. Toda vidraria estril tambm deve ser mantida livre de poeira em armrios bem fechados. Pipetas graduadas e tubos de centrfuga so preferencialmente descartveis.
3.2. Manuteno das culturas: propagao e criopreservao
3.2.1. Propagao celular

Para manter as clulas em cultura necessrio utilizar tcnicas bsicas que evitem a morte celular dentro da garrafa de cultivo. As clulas normalmente possuem inibio por contato e, quando em uma garrafa de cultivo, se a quantidade de clulas exceder um nmero tal que impossibilite o crescimento normal da monocamada, as clulas se inibiro e haver morte. Assim, extremamente importante que se retire quantidades de clulas periodicamente da garrafa de modo a manter a populao sempre com um nmero ideal. O processo de renovao de clulas de uma garrafa para outra chamado passagem. O nmero de passagens se refere ao nmero de vezes que essa cultura foi subcultivada. Muitas linhagens contnuas so capazes de manter as caractersticas iniciais do tecido original com algumas passagens, enquanto as clulas transformadas no mantm as caractersticas originais e so capazes de permanecer em cultura por um grande nmero passagens (chegando at virtualmente ao infinito nmero de passagens). Para as clulas no aderentes, o procedimento de passagem se assemelha a uma diluio e basta retirar clulas da garrafa de cultivo, adicionando novo meio ao seu lugar. Isso ocorre porque estas clulas se encontram em suspenso no meio, sendo possvel retir-las sem que seja necessrio um procedimento especfico.

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As clulas aderentes possuem um mtodo especfico para efetuar a sua passagem, por se encontrarem aderidas ao fundo da garrafa de cultivo. Para que as clulas aderentes possam se ligar ao fundo da garrafa necessrio que o fundo tenha uma carga negativa. Superfcies como vidro e metal, que possuem uma carga lquida negativa, so excelentes superfcies para a adeso celular. Plsticos so muito utilizados em cultivo celular, mas para que o plstico desenvolva carga negativa necessrio um tratamento prvio com agentes qumicos, como agentes oxidantes, ou fsicos, como a luz ultravioleta e a radiao. A carga negativa necessria, pois a adeso celular ocorre por meio de foras eletrostticas e da interao dessas cargas com glicoprotenas de adeso e com ctions divalentes, como Ca+2 e Mg+2. Esta interao, ento, desencadeia uma sinalizao intracitoplasmtica que acarretar na produo e liberao de protenas da matriz extracelular pela prpria clula, onde a clula ir aderir, espraiar e iniciar sua proliferao. A matriz extracelular de um tecido uma mistura complexa de protenas, glicoprotenas, lipdeos, glicolipdeos e mucopolissacardeos. As macromolculas que constituem a matriz so secretadas por clulas locais, especialmente fibroblastos. Essa matriz contm trs importantes protenas fibrosas colgeno, elastina e fibronectina contidas em um gel hidratado formado por uma rede de cadeias de glicosaminoglicanos. Todas essas macromolculas so secretadas localmente por clulas em contato com a matriz. Linhagens macrofgicas so uma exceo, pois sua adeso mediada por proteoglicanos, um processo diferente do descrito.

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Figura 3. Adeso celular medida por protenas de adeso.

Os mtodos de dissociao celular so classificados em mecnicos ou enzimticos. No mecnico ocorre a desagregao da monocamada fisicamente com a ajuda do rubber policeman, um dispositivo semelhante a um rodo estril que retira as clulas do fundo da garrafa de cultivo. Na desagregao enzimtica ocorre a digesto das protenas de adeso por proteases especficas ou no. A dissociao de tecidos envolve a dissociao da matriz e a quebra dos contatos clula clula, sem comprometer a membrana ou danificar a superfcie celular. A dissociao mecnica utilizada principalmente para clulas macrofgicas devido sua adeso diferenciada. Esse mtodo consiste na retirada das clulas por meio de agentes fsicos, o que muito danoso para as culturas. A dissociao enzimtica uma das principais aplicaes das enzimas na cultura de clulas. Proteases so necessrias para romper a matriz extracelular e, assim, obter clulas individualizadas com a finalidade de transferir as culturas para um novo substrato. A enzima proteoltica inespecfica mais utilizada a tripsina, que hidrolisa cadeias polipeptdicas nos radicais lisil-arginil formando

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terminaes de clivagem, ster e amida. Essa reao desestrutura a matriz, impossibilitando a ligao dos receptores da superfcie celular, ligados ao citoesqueleto e matriz, obrigando as clulas a rearrajarem seu citoesqueleto. Devido inespecificidade da enzima, no se deve deixar a clula muito tempo em sua presena, para no haver lise celular.
3.2.2. Congelamento

Na natureza muito comum que os indivduos se adaptem cada vez mais ao meio ambiente por meio de mutaes genticas. Esse procedimento evolutivo descrito por Darwin ocorre em todos os seres vivos e no seria diferente pensar que tambm ocorreria em clulas cultivadas. A partir do momento em que uma clula se encontra em uma cultura primria ocorrem adaptaes para o seu estabelecimento como uma linhagem. Clulas em cultura por longos perodos acabam perdendo suas caractersticas fenotpicas, pois aps vrias divises, h grande probabilidade de ocorrerem alteraes demasiadas em seu DNA. Manter clulas congeladas significa atrasar, em anos, quaisquer alteraes que poderiam ocorrer quando em cultura. Tais alteraes so dispensveis para os laboratrios de cultura de clulas e os grandes bancos mundiais fornecedores de linhagens. As clulas em cultura geralmente so congeladas em nitrognio lquido em uma temperatura de -196C. Nessa temperatura, todas as reaes bioqumicas nas clulas ficam paralisadas impedindo qualquer alterao na cultura criopreservada. O procedimento mais utilizado no congelamento celular o lento. Nesse processo h diminuio da temperatura, vagarosamente acarretando a solidificao da gua que se encontra no meio de cultura. Isso aumenta a concentrao de soluto fora da clula e faz com que a gua saia atravs do processo de osmose. A sada da gua da clula faz com que ela murche.

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Assim, medida que a gua sai, ela se congela no exterior, deixando a clula desidratada. Nesse processo, a gua do meio externo congelada formando cristais que podem se reorganizar no exterior da clula. A formao de cristais e reorganizao dentro da clula leva ao rompimento da membrana celular, matando as clulas. Isso impedido com o processo lento de congelamento. Figura 4. Esquema do congelamento lento.

Quando o congelamento lento, a viabilidade das clulas descongeladas maior do que a das congeladas pelo mtodo rpido, ou seja, quando imersas diretamente no nitrognio lquido. Mesmo controlando-se a velocidade de congelamento em 1 a 2C por minuto e tendo o cuidado com a formao dos cristais, a clula sofrer muitos danos nesse processo. Assim, para aumentar a viabilidade celular, utilizam-se crioprotetores. Crioprotetores so substncias que, sob diferentes mecanismos moleculares, tornam a membrana das clulas protegidas dos cristais. Os crioprotetores mais utilizados so o glicerol e o dimetilsufrido (DMSO). O efeito protetor do glicerol se relaciona com a sua capacidade de ligao com a gua e sua baixa dissociao com sais, diminuindo a osmolaridade

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do meio de congelamento. Alm disso, suas hidroxilas so capazes de se ligar aos oxignios do grupo fosfato dos fosfolipdeos de membrana, estabilizandoa no momento do congelamento. O DMSO uma molcula sem carga real, mas que possui um momento dipolar. Sua ao est relacionada interao da molcula com as membranas fosfolipdicas e com o ambiente externo membrana. Assim, durante um congelamento, a molcula impede fases de transmisso dos lipdeos de membrana que chegam a promover a fuso de vrias membranas. Tanto o DMSO quanto o glicerol so txicos para as clulas e devem ser utilizados somente no momento do congelamento, sendo indispensvel a sua retirada do meio aps o descongelamento da cultura.
3.2.3. Descongelamento celular

O descongelamento geralmente ocorre de forma rpida. Simplesmente retira-se a ampola do tanque de nitrognio lquido e coloca-se ela em gua a 37 C imediatamente. Figura 5. Esquema de descongelamento lento.

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Apesar de todo o cuidado durante o congelamento, o processo de criopreservao danoso para as clulas e, portanto, aps o seu congelamento as clulas devem ser colocadas em meio de cultivo com uma concentrao de 20% de soro fetal bovino. As clulas aderentes devem ser lavadas aps 24 horas de adeso para a retirada de clulas mortas. Os procedimentos de congelamento e descongelamento so os mesmos para as clulas aderentes e para as no aderentes.
3.3. Quantificao celular

Quando se trabalha com experimentos que necessitam do uso de clulas em cultura necessria a avaliao constante das clulas. Umas das formas de se avaliar o crescimento celular utilizando-se mtodos de quantificao celular. Quantificar uma cultura significa dizer quantas clulas se encontram em determinada garrafa de cultivo. A quantificao utilizada para definir a viabilidade celular, as condies de crescimento e o incio de experimentos nos quais o nmero de clulas utilizado deve ser preciso. Existem duas maneiras de se quantificar clulas em cultura. Na forma direta, conta-se diretamente o nmero de clulas presente na garrafa de cultivo; a forma indireta feita por meio da quantificao de determinadas estruturas celulares, como protenas, ou pela medio do metabolismo celular. Como forma de quantificao direta, o mtodo mais utilizado a contagem em cmara de Neubauer. No mtodo indireto existem muitas tcnicas baseadas no metabolismo celular ou at mesmo na dosagem de macromolculas presentes na clula, como as protenas ou o DNA. Para a contagem em cmara de Neubauer, as clulas devem estar totalmente individualizadas. Para clulas aderentes, necessrio fazer uma tripsinizao prvia, o que no feito no caso de clulas no aderentes.

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A cmara de Neubauer uma lmina de vidro com divises que auxiliam na contagem, possuindo 9 quadrados que medem 1 mm2 de rea. O esquema de uma cmara ao microscpio tico se encontra na Figura 6. Somente os quatro quadrados externos so utilizados na contagem de clulas animais. Cada quadrado externo formado por mais 16 quadrados menores que auxiliam a contagem. Figura 6. Esquema da cmara de Neubauer.

Para a contagem, necessrio colocar uma lamnula de vidro sobre a cmara, que servir para conter a suspenso celular. O espao formado entre a lamnula e a cmara de 0,1 mm. Dessa forma, o volume determinado por cada quadrado equivalente a 0,1 mm3. As clulas contadas em um quadrado contidas em 1 mL equivalem ao valor de clulas contado multiplicado por 104 (fator de correo da cmara). O nmero de clulas por mL de uma suspenso quando contado em cmara de Neubauer obtido pela equao:
Q1+Q2+Q3+Q4 4 X104 X faror de diluio=n de clulas / mL

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Para no ocorrer a contagem de uma clula mais de uma vez, deve-se fazer uma marcao em forma de L nos quadrados, para que, ao aparecerem clulas em cima das linhas, se contem somente as que estiverem sobre a marcao. Para a anlise de viabilidade celular utiliza-se o corante azul de Trypan, que no atravessa membranas ntegras. Assim, clulas vivas no permitem a passagem do corante e, logo, no adquirem nenhuma colorao. Como as clulas mortas tm suas membranas danificadas, ocorre o fluxo de corante para o interior da clula fornecendo uma colorao azul. Entre os mtodos de contagem indireta mais utilizados esto o teste de brometo 3 - [4,5-dimetil-tiazol - 2-il] - 2,5 - difenil-tetrazlio (MTT) e o ensaio de colorao por Coomassie Brillant Blue R-250 (CBBR 250). A colorao por CCBR-250 se baseia na capacidade do corante de corar protenas celulares. Assim, faz-se uma curva padro com concentraes celulares conhecidas e tambm as leituras das amostras de cultura. Para isso, deve-se corar a cultura e depois eluir a soluo corante, sendo lida em espectrofotmetro. O ensaio do MTT se baseia na reduo do MTT, um sal tetrazlico, pela desidrogenase mitocondrial de clulas viveis para formar como produto o azul de Formazan. O ensaio mede a respirao celular, que proporcional quantidade de Formazan produzida, e ao nmero de clulas viveis em cultura. A vantagem desse mtodo a contagem somente do nmero das clulas viveis, o que no ocorre com o mtodo de CBBR 250.
3.4. Conceitos bsicos e controle da qualidade de cultivos celulares

Para a caracterizao de clulas em cultivo necessria a observao de vrios aspectos, como a descrio do histrico da clula, incluindo sua origem (rgo, tecido, idade, sexo e espcie do doador), e a metodologia utilizada para obt-la, histrico de passagens, meios de cultura usados e passagem em animais.

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Testes como cariotipagem, anlise de isoenzimas e DNA fingerprinting (impresso digital gentica) servem como identificadores da espcie da linhagem celular, alm de indicarem se h contaminao daquela cultura por outra clula humana ou animal. importante enfatizar que a autenticao celular uma parte essencial no controle de qualidade de um cultivo, tanto para fins de pesquisa quanto para fins comerciais, devendo ser uma preocupao contnua e importante para qualquer laboratrio de cultura de clulas. Alm de identific-la, importante avaliar se a clula est contaminada por fungos, bactrias, micoplasmas ou vrus.
3.4.1. Cariotipagem

A anlise cromossmica de uma clula um dos principais critrios utilizados na identificao de uma linhagem, pois relaciona a linhagem em cultivo a uma determinada espcie e sexo. O mtodo de cariotipagem um exame citogentico que verifica o estado do caritipo das clulas. Sua anlise feita por meio de vrias coloraes que evidenciam partes dos cromossomos. Por meio de anlises visuais destes cromossomos e com auxlio de atlas de caritipos possvel associar determinado mapa cromossomial de uma linhagem a uma espcie e ao sexo do indivduo. Para a cariotipagem, necessria a interrupo da proliferao celular das clulas em cultivo no momento da metfase utilizando-se a colchicina. A colchicina uma substncia que inibe a polimerizao das protenas do fuso mittico, parando a diviso celular em metfase, fase em que os cromossomos se encontram mais condensados, facilitando a sua observao ao microscpio e a anlise do caritipo. A cariotipagem ainda permite verificar se a clula normal ou transformada, j que o perfil gentico de uma clula transformada muito alterado quando comparado ao perfil gentico do indivduo de origem.

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3.4.2. Anlise de isoenzimas

O termo isoenzima define um grupo de vrias formas moleculares da mesma enzima originrio de uma espcie, resultante da presena de mais de um gene codificando cada uma das enzimas. Assim, para utilizar isoenzimas como forma de identificao celular, devese obter um perfil enzimtico chamado zimograma, no qual as enzimas correm em um gel de eletroforese e seu perfil de corrida avaliado por tcnicas histoqumicas. Diferenas na mobilidade de isoenzimas em um campo eltrico resultam de diferenas em nvel de sequncias de DNA, que codificam tais enzimas, e de sua estrutura molecular. Assim, se os padres de bandas de dois indivduos diferem, assume-se que estas diferenas tenham base gentica e sejam herdveis. A anlise de isoenzimas em culturas de clulas de tecido humano pode ser utilizada para a identificao entre dois indivduos, devido ao polimorfismo do genoma humano, pois cada indivduo ter o seu prprio perfil isoenzimtico. As principais enzimas utilizadas na caracterizao de clulas humanas em cultura so a purina nucleosdeo fosforilase (NP), a glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) e a lactato desidrogenase (LDH).
3.4.3. DNA fingerprinting

O DNA contm regies que no so aparentemente transcritas. A funo dessas regies ainda no est descrita, mas acredita-se que existam regies que possam ser utilizadas pelo DNA, caso houvesse algum tipo de evoluo do indivduo. Essas regies no so conservadas e possuem uma alta variabilidade entre os indivduos, podendo ser utilizadas como marcadores de identificao individual, pois so especficas de um determinado indivduo e diferem entre si na mesma espcie.

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Enzimas de restries so utilizadas para cortar segmentos que podem ser hibridizados com sondas e analisados por eletroforese. O perfil obtido especfico de um indivduo, assim como sua impresso digital. Devido especificidade dessa tcnica, idealizada por Jeffreys e colaboradores em 1985. Ela foi denominada DNA fingerprinting e atualmente a principal ferramenta utilizada para a identificao exata e precisa de determinada linhagem celular. uma tcnica muito utilizada para detectar a contaminao cruzada entre duas clulas em cultura.
3.5. Ciclo celular e fases de crescimento celular
3.5.1. Ciclo celular

A anlise do ciclo celular o primeiro passo para a compreenso das vias de ativao e proliferao das clulas, sendo necessrio o conhecimento das fases do ciclo celular. A sequncia ordenada de eventos, durante a qual o DNA replicado e protenas so sintetizadas e depois dividem a clula em duas, constitui um ciclo conhecido como ciclo celular. O ciclo celular eucaritico tradicionalmente compreendido em dois perodos principais: a interfase e a mitose (M). Um ciclo de 16 horas em clulas de mamfero em cultura dividido nos perodos (G 1, S, G2 interfase): G1(durao de 5 horas): crescimento e preparao para a replicao dos cromossomos; S (durao de 7 horas): sntese de DNA (replicao); G2 (durao de 3 horas): preparao para a diviso mittica; M (durao de uma hora): separao das cromtides e constituio de dois ncleos idnticos.

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Aps a mitose as clulas filhas podem:

iniciar nova fase de sntese aps uma fase ps-mittica de durao

normal; ou
entrar numa fase ps-mittica prolongada permanecendo num estado

de quiescncia e, se devidamente estimuladas, podem mais tarde ingressar em ciclo no fim de G1. A regulao adequada do ciclo celular, com o controle correto da sntese de substncias reguladoras (ciclinas dependentes de quixases - CDK) e inibidoras (inibidores de CDK), fundamental para o desenvolvimento normal dos organismos multicelulares. Uma falha nesse controle pode acarretar uma superproduo desnecessria de clulas, frequentemente com resultados malficos, como a formao de tumores (cncer). A dinmica do processo de diviso celular muito complexa. Ela ocorre por meio de uma srie de eventos e processos nucleares e citoplasmticos de forma coordenada e possui mecanismos de controle rigoroso envolvendo genes e protenas regulatrias que atuam em diferentes etapas do ciclo celular. Em cultura, as clulas de uma populao normalmente apresentam-se em diferentes fases de ciclo celular. Se todas as clulas de determinada populao estivessem na mesma etapa do ciclo celular, essa populao estaria em sincronismo celular. Uma variedade de tcnicas e substncias pode sincronizar clulas em fases especficas do ciclo celular. Por exemplo, o arraste reversvel de clulas em G1 pode ser obtido com a deduo de soro ou aminocido isoleucina; e o inibidor de microtbulos, o nocodazol, empregado para sincronizar clulas na mitose.

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Figura 7. Grfico da quantidade de DNA variando ao longo do ciclo celular.

3.5.2. Fases do crescimento celular

Clulas normais em cultura possuem um padro de crescimento representado por uma curva sigmoidal (Figura 8) denominada curva de crescimento. Essa curva reflete as fases de adaptao das clulas s condies ambientais, disponibilidade de nutrientes e ao suporte de ancoragem necessrios para promover a produo de novas clulas. A determinao da curva de crescimento importante para a caracterizao de uma cultura de clulas. A biologia celular modifica-se em cada fase da curva, sendo importante o controle do estgio em que as clulas sero coletadas, quando ser realizado o repique da cultura, ou quando novos nutrientes sero adicionados.

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Figura 8. Curva de crescimento celular padro de clulas normais

A curva de crescimento de clulas em cultura dividida nas seguintes fases de crescimento: Fase lag perodo de adaptao no qual no ocorre proliferao aps adio das clulas ao meio de cultivo. A durao da fase lag depende da densidade celular e do estgio de crescimento da cultura, podendo se estender de horas a alguns dias. Nesse perodo h produo de protenas estruturais e enzimas, com aumento na sntese de DNA. Nesse perodo ocorre intensa atividade metablica. cao celular mxima e constante. a fase de maior viabilidade e atividade metablica das clulas e, por isso, o melhor perodo para estudo e experimentao. Nesta fase determinado o tempo de duplicao, sendo a velocidade de proliferao caracterstica para cada linhagem.
Fase log fase logartmica ou exponencial, perodo no qual a multipli-

nmero de morte celular tende a ser equivalente ao nmero de clulas novas, e a atividade metablica decresce. Para algumas linhagens, a fase estacionria pode ser estendida se o meio for renovado.

Fase estacionria ou plateau a velocidade de crescimento diminui, o

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Fase de declnio ou morte celular h reduo drstica do nmero de

clulas e o nmero de clulas mortas excede o de clulas novas. A construo da curva de crescimento importante para a manuteno da rotina e para saber o nmero de clulas depois de determinado o intervalo de tempo. Permite a caracterizao de certos parmetros prprios de uma populao sob determinadas condies de cultivo. Linhagens primrias e permanentes possuem curvas de crescimento diferentes; as linhagens permanentes podem ser mantidas indefinidamente, enquanto as linhagens primrias morrem aps algumas geraes.
3.6. Principais agentes contaminantes em cultura de clulas

Manter a assepsia em cultura algo muito difcil. O material esterilizado erroneamente, a manipulao sem cuidado e, principalmente, a falta de higiene e de vestimenta correta dos manipuladores podem causar contaminao de uma cultura. Bactrias, fungos, leveduras e micoplasmas so os principais contaminantes das culturas celulares. Em casos de contaminao, importante avaliar onde a clula foi cultivada, quais os meios e solues utilizados e qual tcnico fez a manipulao. Isso impede que, em caso de contaminao pontual, esta se espalhe para outras culturas do laboratrio, alm permitir a investigao dos principais motivos da contaminao, a fim de elimin-la.
3.6.1. Contaminao bacteriana

As bactrias so organismos procariontes com capacidade de proliferao muito rpida e que, na maioria das vezes, conseguem crescer em qualquer condio. Elas esto presentes no ar, nas superfcies, no trato digestivo humano etc.

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Uma contaminao bacteriana na cultura inviabiliza a sua utilizao, visto que elas competem pelos nutrientes do meio fazendo com que as clulas morram pela falta de alimento. Alm disso, metabolizam o meio de forma a torn-lo excessivamente cido para determinadas linhagens. As bactrias, por crescerem muito mais rpido que as clulas animais em cultura, especialmente em meios muito ricos, como os de cultivo de clulas animais, tm sua visualizao ao microscpio tico facilitada, e a contaminao facilmente detectada. Para isso, necessrio que o cultivo ocorra em meio livre de antibiticos, para no haver mascaramento do crescimento da contaminao em cultura. A esterilidade deve ser garantida pela qualidade das solues e do material utilizado e pelo bom treinamento dos tcnicos.
3.6.2. Contaminao por micoplasma

Micoplasmas so contaminantes comuns de culturas de clulas, microorganismos procariotos desprovidos de parede celular que possuem uma membrana lipdica em bicamadas, imperceptveis na visualizao por microscpio tico invertido. De difcil localizao por se aderir membrana da clula, o micoplasma prejudicial, pois retira do meio os nutrientes necessrios, em particular a arginina. O metabolismo dos micoplasmas , em parte, dependente do metabolismo celular. Para detectar micoplasmas, pode-se utilizar o teste de colorao fluorescente Hoescht 33258, que cora DNA. Assim, ao observarmos uma cultura contaminada em microscopia de fluorescncia possvel visualizar o ncleo da clula e o seu contorno, que formado pelo material gentico dos micoplasmas aderidos membrana. Contaminar uma cultura com micoplasmas muito fcil, pois eles se encontram na via respiratria humana; porm, a descontaminao envolve a

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utilizao de antibiticos, como ciprofloxacin e kanamicina associada tetraciclina, extremamente prejudiciais clula, e, havendo posterior febre, com o aumento da temperatura de 37 C para 41 C. Isso diminui o nmero de clulas viveis, e o processo nem sempre um sucesso.
3.6.3. Contaminao por leveduras

Leveduras so fungos unicelulares muito comuns em cultura. Caracterizam-se por serem menores do que as clulas animais. Multiplicam-se principalmente por brotamento, formando na cultura estruturas caractersticas na forma de esferas menores anexadas a esferas maiores.
4. Meios de cultura e solues utilizadas em cultivos celulares

Os meios nutritivos (meios de cultura ou de cultivo) utilizados para a cultura de clulas, tecidos e rgos fornecem as substncias essenciais para o crescimento e controlam o crescimento in vitro. As mesmas vias metablicas e bioqumicas bsicas no organismo so consideradas nas clulas cultivadas. Complementando as substncias biossintetizadas pelas clulas, vrios compostos orgnicos so adicionados ao meio para suprir as necessidades metablicas, energticas e estruturais especficas das clulas. Sendo assim, os meios de cultura devem apresentar em sua formulao sais minerais, hidratos de carbono, aminocidos, vitaminas, protenas, peptdeos, lipdeos e cidos graxos (ver Tabela 1). Costuma-se adicionar tambm soros, tampes, antibiticos e indicadores de pH. Os meios de cultivo foram estabelecidos a partir de 1950, com vrias formulaes de meios que proporcionassem o crescimento celular in vitro. Os meios de cultura, tais como o meio 199 de Morgan e colaboradores de 1950, o meio CMRL, de Parker e colaboradores de 1957, e os meios basais de Eagle de 1955 e 1959, so utilizados hoje.

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Foram elaborados, tambm a partir de 1950, alguns meios de cultura mais complexos, com o intuito de eliminar a utilizao de fluidos animais, como o meio NCTC 109, desenvolvido por Evans e colaboradores a partir 1956. Esses meios livres de soro devem fornecer todos os fatores que as clulas em cultura necessitam, tais como: metais trao, vrios suplementos e fatores de crescimento, insulina, transferrina, hormnios, dentre outros. A exigncia desses fatores e a complexidade do meio variam de acordo com o tipo celular a que se destina e, por ser altamente especfico, em muitos casos precisa ser adaptado para cada tipo celular. Devido sua complexidade, esses meios so muito dispendiosos, e utilizados apenas para fins especficos. Tabela 1. Tabela de componentes bsicos de um meio tpico.
protenas (necessrias em meios sem soro quimicamente definidos)

aminocidos vitaminas

sais

outros

Arginina Cistina Glutamina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Treonina Triptofano Tirosina Valina

Biotina Colina Folato Nicotinamida Pantotenato Piridoxal Tiamina Riboflavina

Glicose Penicilina KCl Estreptomicina Vermelho de NaH2PO4 fenol Soro NaHCO3 CaCl2 MgCl2

NaCl

Insulina Transferrina Factores especficos de crescimento

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Para escolher o meio de cultivo adequado ao de uma determinada linhagem, consulta-se primeiro a literatura e as referncias de bancos oficiais. No sistema de cultivo de clulas, importante o controle do pH timo (7,0-7,6), utilizando para isso tampo e o suplemento do meio de cultivo que resiste s variaes do pH, principalmente na fase lag do crescimento celular. Na fase lag do crescimento celular, ou em baixa densidade celular, a tenso de CO2 deve ser mantida para controle do pH e, por isso, as culturas so mantidas em atmosfera de 5-10% de CO2. Para compensar a diminuio do pH gerado pelos metablitos do consumo da glicose, h a suplementao do meio com bicarbonato de sdio e manuteno do nvel de CO2. O CO2 dissolvido em equilbrio com ons bicarbonato gera um sistema de tamponamento no meio, como mostra a equao abaixo: H2O + CO2 + NaHCO3 H+ + Na+ + 2HCO3-

O composto HEPES (N-(2-hidroxietil) piperazina-N-(2-cido etanosulfnico) e outros tampes orgnicos podem ser utilizados em culturas em que o tampo bicarbonato no adequado. A sensibilidade da cultura pelo tampo varia, podendo at ser txica para as clulas. Portanto, deve-se ser criterioso na escolha do melhor tampo e da sua concentrao. Antibiticos e fungicidas so utilizados nos meios nutritivos para controle da contaminao microbiolgica. Com essa finalidade, os compostos mais utilizados so a gentamicina, a estreptomicina, a penicilina e a anfotericina. importante rotular, imediatamente, qualquer reagente ou soluo preparada com etiquetas com as seguintes informaes: nome da soluo preparada, lote, data do preparo, prazo de validade, nome dos tcnicos responsveis e temperatura de estocagem. A temperatura adequada para os meios de cultura de +4-8 C.

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4.1. Controle da qualidade da gua e reagentes

A gua o componente predominante na preparao dos meios e solues, mas uma fonte potencial de impurezas que podem afetar o crescimento de culturas in vitro. Para evitar contaminao por compostos orgnicos volteis, que permanecem aps a destilao e que inibem o crescimento das culturas, deve-se utilizar gua classificada como ultrapura, que consiste num sistema de purificao por filtrao com carvo ativo, colunas de troca inica e filtros de acetato de celulose. Embora de custo elevado, a gua produzida com alto grau de pureza. No entanto, a gua deionizada pode ser aplicada para o preparo da maioria das solues. Devem-se utilizar substncias testadas para culturas de clulas e com alto grau de pureza. No rtulo, sempre que possvel, deve constar o nmero do lote, o prazo de validade e as condies de estocagem. Deve-se utilizar tripsina na diluio 1:250, obtida de pncreas suno e testada em cultura de clulas. A L-glutamina um aminocido essencial e suplemento fundamental dos meios de cultura. Como a L-glutamina degradada a 36,5 oC, ela deve ser adicionada a meios de cultura suplementados a mais de 15 dias.
4.2. Soro fetal

Apesar da sua constituio qumica, os meios de cultivo so usualmente suplementados com 5% a 20% de soro, pois as clulas em cultura tambm necessitam de fatores de crescimento, hormnios, protenas e peptdeos, nucleosdeos, lipdeos e inibidores que podem ser supridos por esse fluido animal. Deve-se utilizar um soro fetal certificado, estril, inativado a 56 oC por 30 minutos, livre de micoplasmas e sem endotoxinas. Atualmente, os soros esto disponveis comercialmente e os mais utilizados em cultivos celulares so os soros de origem bovina, de cavalo e humano. O soro obtido do plasma,

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sob condies asspticas e estreis, por puno cardaca ou venosa. A coleta, a manipulao, o processamento e a estocagem so realizados visando-se manter as propriedades e qualidades do soro. A escolha do soro depende de requisitos de cada tipo celular, e um dos mais utilizados o soro fetal bovino. No caso do soro fetal bovino, cada procedimento corresponde a uma partida, ou lote diferente. As variaes qualitativas e quantitativas dos componentes do soro podem interferir no crescimento das clulas em cultura. Dessa forma, a capacidade de possibilitar o crescimento celular deve ser avaliada para cada lote de soro adquirido. Cada lote deve ter um certificado com todos os dados dos testes bioqumicos e microbiolgicos realizados, devendo ser testados para deteco de bactrias, fungos, Mycoplasma e agentes virais.

4.3. Sistema de filtrao

Para substncias orgnicas que no resistem ao processo de esterilizao por autoclave, convm dispor-se de dispositivo para filtrao por membranas. Algumas substncias orgnicas so degradadas pelo calor, sendo lbeis autoclavao, precisando ser esterilizadas com um filtro especial de acetato de celulose com porosidade inferior a 0,22 mm. Uma reao que pode ocorrer durante a autoclavao a caramelizao (reao entre acares e aminocidos) e a hidrlise da sacarose. Essas reaes se intensificam com o aumento do tempo da autoclavao. Assim, utiliza-se o processo de filtrao, que consiste na passagem de lquido por membrana filtrante com pequenos poros que impedem a passagem de microrganismos. Filtros reutilizveis podem ser esterilizados por autoclavao, sendo os descartveis tambm muito utilizados e, apesar de mais caros, o processo mais rpido e mais seguro.

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A maioria das solues estreis de uso em cultura de clulas preparada por filtrao em membrana esterilizante de 0,22 m. Contudo, algumas solues podem ser esterilizadas por autoclavao a 121oC por 15 minutos. Utilizam-se tambm membranas de 0,45 m, como pr-filtro para clarificar solues menos lmpidas. Em cmara de fluxo laminar, a filtragem realizada com um sistema para filtrao sob presso com filtro de 0,22 mm em volumes maiores que 10 L; para volumes entre 0,1 e 10 L esterilizam-se em sistema de filtrao a vcuo com filtro de 0,22 mm e, para at 100 mL, sistema de filtrao por seringa com filtro de 0,20 mm. Aps a realizao da filtrao, fundamental testar o material filtrado para verificar a eficincia do procedimento, por meio da realizao de teste de esterilidade por inoculao direta do filtrado em meio de cultivo.
5. Aplicaes dos cultivos celulares 5.1. Produo de imunolgicos

Existem muitas aplicaes para a cultura de clulas. As primeiras aplicaes se relacionam com a produo de anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais tm sua maior aplicao nos imunoensaios, como o ELISA. Alm disso, esses anticorpos tambm so muito utilizados associados a marcadores radioativos em imunocintilografia. Os anticorpos monoclonais so produzidos em clulas denominadas hibridomas, que resultam da fuso de clulas de mieloma murino com linfcitos B produtores de um determinado anticorpo. As clulas do hibridoma so imortais e produzem anticorpos, assim como a sua precursora. Vrias protenas diferentes de anticorpos comercializadas so produzidas a partir de cultura de clulas. Eritropoietina humana, fator VIII para hemofilia, dentre outras, so produzidas em clulas cultivadas, pois necessi-

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tam de maquinrio complexo para a sua produo que no encontrado em clulas procariontes. Uma aplicao importante da cultura de clulas em imunobiolgicos se relaciona com a produo de vacinas. Para crescimento viral, necessrio o seu cultivo em clulas, pois os vrus se replicam em hospedeiros. A vacina de sarampo produzida em culturas primrias de fibroblastos de embrio de galinha, enquanto a vacina de poliomelite, fabricada na Frana, em clulas de rim de macaco-verde africano (cercopithecus aethiops). Um dos grandes desafios da atualidade a produo de vacinas em clulas de linhagens transformadas sem afetar o indivduo que ir utiliz-las. Essas pesquisas esto em desenvolvimento e, em muitos casos, j esto sendo aplicadas. No Brasil, ainda no existem vacinas fabricadas em clulas transformadas, mas a clula Vero alvo de pesquisas de muitas instituies.
5.2. Virologia

Na virologia, a cultura de clulas muito utilizada para a obteno viral. Como os vrus necessitam de hospedeiros, na cultura de clulas que possvel cultiv-los. A cultura de clulas permite o isolamento do vrus para avaliar o seu efeito em determinados tipos celulares, alm de verificar quais clulas so suscetveis a determinados vrus.
5.3. Terapia celular

O termo terapia celular identifica uma tcnica com o objetivo de restabelecer a funo ou a estrutura de um tecido por meio da utilizao de clulas, e vem sendo utilizada no caso de traumas, doenas degenerativas ou agresses aos tecidos do corpo. Para a terapia celular, necessrio ressaltar a importncia do conhecimento da clula em seu ambiente original, pois informaes sobre a estrutura do

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microambiente celular so necessrias para a reproduo desses elementos em cultura. Na bioengenharia, a estrutura tecidual reproduzida o mais fiel possvel quela do tecido original, tanto em contedo de material presente quanto como ao comportamento das clulas presentes. Dessa forma, seria possvel a substituio dos tecidos danificados por novos tecidos formados em cultura, substituindo-se aquele que sofreu algum dano em determinado momento da vida do indivduo. Uma aplicabilidade da bioengenharia obteno de clulas do prprio paciente para o cultivo e formao de tecido. Esse tecido cultivado em laboratrio, acrescido de fatores e do microambiente necessrio diferenciao e formao tridimensional da clula, mimetizando o tecido original que, aps um determinado perodo, reimplantado no paciente, substituindo o tecido lesado. Outro avano na terapia celular o uso de clulas-tronco no tratamento de doenas degenerativas. Clulas-tronco possuem alta capacidade de diferenciao e de proliferao sendo possvel formar a partir delas clulas diferenciadas que exeram funes especficas. As clulas-tronco podem ser de origem embrionria (clulas-tronco embrionrias) ou de tecidos adultos (clulas-tronco adultas). As clulastronco embrionrias tm alta capacidade de replicao e de diferenciao; no embrio todo o organismo complexo ser formado a partir destas clulas. As clulas-tronco adultas so clulas de proliferao modulada, quiescentes, que se mobilizam para estabelecer a reposio de clulas que morreram ou que se ativam e proliferam intensamente no momento necessrio regenerao de um tecido danificado.
Para saber mais:
MORAES, A. M.; AUGUSTO, E. F. P CASTILHO, L. R. Tecnologia do cultivo de .; clulas animais: de biofrmacos terapia gnica. So Paulo: Rocca, 2007. 503 p.

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MANUTENO de linhagens de clulas animais. In: FUNDAO OSWALDO CRUZ. Manual da qualidade. Rio de Janeiro: INCQS/Fiocruz, 2008. PERES, C. M.; CURI, R. Como cultivar clulas. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005. 283 p. FRESHNEY, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 4. ed. Nova York: Wiley-Liss, 1994. 397 p. VREMEULEN, K. The Cell Cycle: A Review of Regulation, Deregulation and Therapeutic Targents in Cancer. Cell Proliferation, n. 36, p. 131-149, 2003.