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P. Aeruginosa Resistencia Silva, Keila de Cássia Ferreira de Almeida (Dissertação, 2016)
P. Aeruginosa Resistencia Silva, Keila de Cássia Ferreira de Almeida (Dissertação, 2016)
NITERÓI
2016
2
NITERÓI
2016
S586c Silva, Keila de Cássia Ferreira de Almeida
85 f.
Orientadora: Lenise Arneiro Teixeira
Co-orientadores: Luciana Maria Ramires Esper; Geraldo
Renato de Paula
BANCA EXAMINADORA
NITERÓI
2016
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Aos meus pais Josaphat e Zênia, pelo exemplo de amor, dedicação e ensinamentos de toda
uma vida;
Ao meu esposo Vander e minha filha Laura, pelo amor, paciência, compreensão e incentivo
em todos os momentos.
5
AGRADECIMENTOS
A Deus em primeiro lugar, por me capacitar a cada dia com seu Espírito Santo e me conduzir
a esta conquista;
À professora Dra. Lenise Arneiro Teixeira, que me acolheu após tantos anos afastada da vida
acadêmica, sendo sempre solícita, compreensiva e amiga durante esses dois anos de intenso
aprendizado;
Ao professor Dr. Geraldo Renato de Paula, por toda orientação, dedicação, paciência e
incentivo;
À professora Dra. Luciana Maria Ramires Esper, por toda orientação, recomendações e
sugestões;
Às queridas Bruna Barreto e Fernanda Pessanha, por serem sempre solícitas e parceiras;
À querida Gabriela Deutsch, por ter iniciado este estudo e me proporcionado dar continuidade
ao mesmo;
muito obrigada!!!!
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LISTA DE TABELAS
Tabela 3. Primers utilizados para detecção dos genes de resistência e virulência através da
PCR...........................................................................................................................................38
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE ABREVIATURAS
RESUMO
ABSTRACT
SUMÁRIO
1. Introdução …………………………………………………………………………... 15
3. Objetivo ……………………………………………………………………………. 35
5. Resultados .................................................................................................................. 47
6. Discussão ................................................................................................................... 54
7. Conclusão ................................................................................................................... 63
8. Anexos ........................................................................................................................ 64
1 INTRODUÇÃO
outros. Semelhante a outros bacilos Gram negativos, esta bactéria apresenta um sistema de
secreção tipo III (T3SS) que é considerado um determinante importante do processo de
invasão e citotoxicidade, na qual P. aeruginosa libera várias proteínas efetoras dentro do
citoplasma da célula hospedeira (MAÂTALLAH et al., 2013).
Esses fatos demonstram que vigilância contínua é necessária para a detecção e estudo
desses microrganismos, a fim de se prevenir colonizações-contaminações de pacientes
queimados evitando com isso infecção e impedindo propagação de genes de resistência e
virulência.
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2 REVISÃO DA LITERATURA
Sabe-se que este patógeno possui vários sistemas de secreção de proteínas, dos quais
o Sistema de Secreção Tipo II (T2SS) e o Sistema de Secreção Tipo III (T3SS) são
responsáveis pela secreção da maioria das toxinas descritas na literatura (SAWA et al, 2014).
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Dentre as toxinas secretadas pelo T2SS podemos citar: a) exotoxina A, a qual atua inibindo a
biossíntese de proteínas na célula eucariótica levando a necrose; b) protease LasA, a qual
possui fraca atividade elastolítica e tem como função tornar a elastina mais susceptível à
clivagem pela LasB; c) protease LasB, a qual possui atividade proteolítica sobre tecido
conectivo incluindo elastina, colágeno, bem como sobre moléculas relacionadas ao sistema
imunológico do hospedeiro como fibrina, mucina gástrica, transferrina, IgG, inibidores de α-1
proteinase, dentre outros (BRADBURY et al., 2010; JAFFAR-BANDJEE et al., 1995;
NIKBIN et al., 2012).
Além dos efeitos citotóxicos, isolados exoU positivos são mais propensos a
apresentarem multirresistência a antimicrobianos como cefepima, ceftazidima,
piperacilina/tazobactam, carbapenemas e gentamicina (GAREY et al., 2008), bem como a
fluoroquinolonas, exibindo tanto mutações em gyrA, quanto superexpressão de bombas de
efluxo (WONG-BERINGER et al., 2008).
Além dos fatores de virulência acima descritos, acredita-se que a capacidade desse
patógeno causar infecções está associada à sua habilidade de formar biofilmes (GOODMAN
et al., 2004; LASKOWSKI e KASMIERCZAK, 2006; PETROVA e SAUER, 2010;
PETROVA e SAUER, 2011; VENTRE et al., 2006).
Sabe-se que a formação de biofilme está sob controle de vários sinais ambientais
como temperatura e disponibilidade de nutrientes (KARATAN e WATNICK, 2009). Em P.
aeruginosa a percepção destes sinais ocorre através de reguladores de resposta/ sensor
quinase, tais como LadS, RetS e GacS, os quais regulam a expressão de exopolissacarídeos:
alginato, Pel (Pellicle Formation) e Psl (Polysaccharide Synthesis Locus) (HARMSEN et al.,
2010). Alginatos são exopolissacarídeos polianiônicos lineares compostos de ácidos urônicos
(REMMINGHORST, HAY e REHM, 2009) os quais encapsulam a célula bacteriana
contribuindo para diminuição da suscetibilidade da bactéria que constitui o biofilme a
tratamentos com antimicrobianos, e protegendo as mesmas dos mecanismos de defesa do
hospedeiro (NIVENS et al., 2001; PIER et al., 2001). Psl é um polissacarídeo rico em
manose, ramnose e glicose, e encontra-se envolvido na etapa de aderência inicial e maturação
do biofilme. Sua produção ocorre durante o crescimento planctônico, mediando aderência a
superfícies e contribuindo para formação de microcolônias (MA et al., 2009). Já o Pel é rico
em glicose e é essencial para formação de uma película na interface ar-líquido; aumenta a
estabilidade estrutural das microcolônias e desempenha um papel de grande importância na
proteção dos biofilmes contra agentes antimicrobianos (FRIEDMAN e KOLTER, 2004;
YANG et al., 2011).
sendo este responsável por até 60% das infecções em humanos (ABDI-ALI, MOHAMMADI-
MEHR e ALAEI, 2006; COSTERTON, MONTANARO e ARCIOLA, 2005).
A atividade dos biocidas contra os biofilmes está associada a diversos fatores dentre
os quais podemos destacar: a concentração, o tempo de contato, a temperatura, e o pH. Um
aumento na concentração do biocida e no tempo de contato, normalmente aumenta a eficácia
dos desinfetantes (GROBE, ZAHLLER e STEWART, 2002; SURDEAU et al., 2006).
A alta tolerância das células sésseis aos biocidas aumenta mais o risco de falhas no
processo de desinfecção, se tornando um grande obstáculo no controle da infecção hospitalar,
ocasionando sérios problemas de saúde e perdas econômicas.
23
As porinas de membrana externa são proteínas que formam canais que permitem a
difusão passiva de solutos hidrofílicos (inclusive antibióticos) para o interior da célula
bacteriana (NIKAIDO, 1994). Diferentes porinas podem ser encontradas em P. aeruginosa,
porém a de maior relevância clínica é a OprD, também denominada D2, uma vez que sua
ausência e/ou expressão reduzida está relacionada à resistência aos carbapenemas, em
especial ao imipenem (LIVERMORE, 2001; NEVES et al., 2011).
As ESBL relatadas para P. aeruginosa são do tipo: SHV, TEM, PER, VEB, BEL,
GES, OXA e mais recentemente CTX-M (AL NAIEMI, DUIM e BART, 2006; DUBOIS et
al., 2002, 2005; FARSHADZADEH et al., 2014; NAAS et al., 1999; PELLEGRINO et al,
2006; POIREL et al., 1999, 2005). Entretanto, as enzimas tipo GES, a partir do momento que
sofrem alterações em sítios ativos de aminoácidos, podem estender sua atividade hidrolítica
aos carbapenemas (POIREL et al., 2001; VOURLI et al., 2004).
Além das MBL, carbapenemases como KPC apresentam atividade hidrolítica sobre
antibióticos carbapenemas. A presença de KPC em P. aeruginosa é rara e ocorre
principalmente no continente Americano (CORREA et al., 2012; CUZON et al., 2011;
GARCIA RAMÍREZ et al., 2013; JÁCOME et al., 2012; MARTÍNEZ et al., 2012). O
primeiro relato de KPC em P. aeruginosa no Brasil ocorreu em 2010, na cidade de Recife,
Pernambuco. O gene blaKPC foi detectado em duas cepas de P. aeruginosa, isoladas de dois
pacientes distintos da unidade de tratamento intensivo (UTI) de um hospital terciário. Estas
cepas apresentavam o mesmo perfil molecular e eram resistentes à amicacina, ciprofloxacino,
ticarcilina-clavulanato, aztreonam, cefems, ceftazidima, imipenem e meropenem. Sendo
susceptível somente à gentamicina e polimixina B (JÁCOME et al., 2012).
28
Prevention and Control (ECDC) e Centers for Disease Control and Prevention (CDC),
organizaram um encontro com especialistas da área a fim de criar definições para bactérias
altamente resistentes e multidroga resistentes, associadas a infecções relacionadas à saúde.
Magiorakos e colaboradores (2012) definiram como: (i) cepas multirresistentes a drogas
(multidrug-resistant - MDR) como sendo aquelas não susceptíveis a um ou mais agente
antimicrobiano em três ou mais categorias testadas; (ii) cepas de resistência extensiva
(extensively drug resistant - XDR), como aqueles não susceptíveis a um ou mais agente
antimicrobiano em todas as categorias, mas sensíveis a duas ou menos categorias de
antimicrobianos (ou seja, a cepa permanece susceptível a somente uma ou duas categorias); e
(iii) cepas pan-resistentes (pandrug resistant - PDR) - não susceptíveis a todos os agentes em
todas as categorias antimicrobianas (tabela 1).
Pseudomonas aeruginosa tem sido uma das bactérias Gram negativas mais
frequentes em infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) estando entre as principais
causa de morbidade e mortalidade em pacientes imunologicamente comprometidos, como é o
caso de pacientes queimados, com câncer, submetidos a procedimentos invasivos, entre
outros. Sendo assim, esta bactéria assume importante papel como patógeno oportunista na
etiologia das IRAS (JAPONI et al, 2014; PIRES et al., 2009).
Nas últimas quatro décadas, este microrganismo foi responsável por 10% de todos
os casos de infecções nosocomiais relatados (ANDRADE, LEOPOLDO e HAAS, 2006;
FIGUEIREDO-MENDES et al., 2005; HOBAN et al., 2003).
Desde então, várias técnicas moleculares têm sido desenvolvidas para análise de
patógenos bacterianos, a fim de fornecer informações importantes para o estabelecimento de
relação genética entre isolados, com o propósito de estudos epidemiológicos de longo prazo
e/ou investigação de surtos. O estabelecimento da inter-relação genética entre cepas permite:
identificar a fonte de contaminação (ambiental/ pessoal), detectar disseminação local, regional
e global, além de distinguir entre falha terapêutica e reinfecção (PFALLER, 2001).
(STRUELENS, 1996; VAN BELKUN et al., 2007). Neste caso o método mais utilizado e
considerado padrão ouro é o PFGE (TOSH et al., 2011; YU et al., 2012).
O sequenciamento dos sete genes e em alguns casos até oito genes, produzem
aproximadamente 3.500 a 4.000 pb para serem analisados para cada cepa, o que levaria a um
resultado demorado. Porém com avanços da bioinformática, a qual dispõe de programas que
realizam o alinhamento das sequências de nucleotídeos, este tempo é reduzido. Estes
programas baseiam-se na análise do alinhamento da sequência de nucleotídeos, para realizar
um agrupamento (clusters).
Tabela 2. Funções dos sete genes utilizados na tipificação de P. aeruginosa por MLST
Gene Função
acsA Acetil coenzima A sintetase
aroE Siquimato desidrogenase
guaA GMP sintetase
mutL Proteína de reparo de erros no DNA
nuoD Cadeia C,D da NADH desidrogenase I
ppsA Fosfoenolpiruvato sintetase
trpE Componente I da antralinato sintetase
Fonte: CURRAN et al., 2004.
3 OBJETIVO
O objetivo geral desse estudo foi avaliar 35 cepas de P. aeruginosa obtidas do Centro
de Tratamento de Queimados (CTQ) do Hospital Federal do Andaraí (HFA) determinando os
fatores genéticos relacionados à virulência e resistência a antimicrobianos; a capacidade de
produzir biofilme e ação de biocidas sobre eles e realizar tipificação molecular das cepas
envolvidas.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
A cepa de P. aeruginosa ATCC 27853 foi utilizada como controle para este teste.
O DNA bacteriano foi extraído através de lise térmica, onde uma colônia obtida de
cultura de 24h/36°C em TSA de cada cepa foi transferida para um Eppendorf® contendo
100μL de água Milli-Q estéril e submetida a banho-maria fervente por 10 minutos. Após este
período, cada tubo contendo a solução foi acondicionado em banho de gelo por 5 minutos
para posterior centrifugação (20x100 g) por 5 minutos. Cinquenta microlitros do sobrenadante
contendo o material genético foram transferidos para novos tubos e armazenados a -20o C para
uso como template (DNA molde) na pesquisa dos genes procurados.
Os primers específicos para detecção dos genes avaliados, bem como as condições
das reações de PCR, estão descritos na tabela 3. A amplificação por PCR destes genes foi
realizada em 25µL de mistura de reação contendo 0,2 mM de dNTP, 0,8µM de cada primer
(gene alvo), 0,8µM de cada primer 16SrRNA (controle interno da reação), 1X Tampão
contendo MgCl2 (1,6mM), 1,5U de Taq DNA polymerase e 3,0 µL de DNA template obtido
conforme descrito no item 5.4.1. Cada gene foi amplificado separadamente em termociclador
(Veriti®; Applied Biosystems; Massachusetts, EUA).
Os produtos das reações de PCR foram submetidos à eletroforese com gel de agarose
1% em solução tampão TBE (TRIS 0,89M; Ácido Bórico 0,89M; EDTA 0,25M, pH 8,0)
0,5X, a 90V por 1 hora e 30 minutos. Posteriormente o gel foi impregnado com brometo de
38
Tabela 3. Primers utilizados para detecção dos genes de resistência e virulência através de PCR.
Gene Sequência dos primers (5’-3’) Condições das reações Tamanho do Referência
alvo de PCR amplicon
(pb)
blaCTX-M F: CGCTTTGCGATGTGCAG Di=95°C/ 5min; D= 94°C/ 552 Farshadzadeh et
R: ACCGCGATATCGTTGGT 1min; A = 55° C/ 1min; E= al, 2014
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 5min; 30
ciclos
blaOXA-10 F: TCAACAAATCGCCAGAGAAG Di=95°C/ 5min; D= 95°C/ 276 Neyestanaki et
R: TCCCACACCAGAAAAACCAG 1min; A = 56° C/ 1min; E= al, 2014
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 5min; 30
ciclos
blaPER-1 F: ATGAATGTCATTATAAAAGC Di=95°C/ 5min; D= 94°C/ 927 Farshadzadeh et
R: TTAATTTGGGCTTAGGG 1min; A = 48° C/ 1min; E= al, 2014
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 5min; 30
ciclos
blaGES-1 F: ATGCGCTTCATTCACGCAC Di=95°C/ 5min; D= 95°C/ 864 Poirel et al.,
R: CTATTTGTCCGTGCTCAGG 1min; A = 50° C/ 1min; E= 2000
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 5min; 35
ciclos
blaIMP F: GTTTGAAGAAGTTAACGGGTGG Di=94°C/ 4min; D= 94°C/ 459 Aghamiri
R : ATAATTTGGCGGACTTTGGC 1min; A = 61° C/ 1min; E= et al, 2014
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 10min;
35 ciclos
blaSPM-1 F: CCTACAATCTAACGGCGACC Di=94°C/ 5min; D= 94°C/ 648 Toleman et al.,
R: TCGCCGTGTCCAGGTATAAC 1min; A = 42° C/ 1min; E= 2002
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 7min; 30
ciclos
blaVIM F: TGGTGTTTGGTCGCATATCG Di=94°C/ 4min; D= 94°C/ 595 Aghamiri
R: GAGCAAGTCTAGACCGCCCG 1min; A = 62° C/ 1min; E= et al, 2014
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 10min;
35 ciclos
blaKPC F: ATGTCACTGTATCGCCGTCT Di=95°C/ 5min; D= 95°C/ 892 Bradford et al.,
R: TTTTCAGAGCCTTACTGCCC 1min; A = 55° C/ 1min; E= 2004
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 5min; 35
ciclos
blaNDM F: GGTTTGGCGATCTGGTTTTC Di=95°C/ 5min; D= 95°C/ 620 Neyestanaki et
R: CGGAATGGCTCATCACGATC 1min; A = 58° C/ 1min; E= al, 2014
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 5min; 30
ciclos
blaSIM F: TACAAGGGATTCGGCATCG Di=95°C/ 5min; D= 95°C/ 570 Neyestanaki et
R: TAATGGCCTGTTCCCATGTG 1min; A = 61° C/ 1min; E= al, 2014
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 5min; 30
ciclos
exoS F:TCAGGTACCCGGCATTCACTACGCGG Di=94°C/ 3min; D= 94°C/ 40 572 Jabalameli et al,
R:TCACTGCAGGTTCGTGACGTCTTTCTTTTA seg; A = 55° C/ 30 seg; E= 2012
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 5min; 40
ciclos
exoU F: CCTTAGCCATCTCAACGGTAGTC Di=94°C/ 3min; D= 94°C/ 40 911 Jabalameli et al,
R: GAGGGCGAAGCTGGGGAGGTA seg; A = 64° C/ 30 seg; E= 2012
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 5min; 40
ciclos
16SrRNA F: ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT Di=94°C/ 1min; D= 94°C/ 30 180 Clifford et al,
R: TATTACCGCGGCTGCTGGC seg; A = 63° C/ 30 seg; E= 2012
72°C/ 30 seg; Ef= 72°C/ 1min;
40 ciclos
Desnaturação inicial = Di; Desnaturação = D; Anelamento = A; Extensão = E; Extensão final = E f
39
VF + Imipenem + EDTA
VF + Imipenem + ZnSo4
VF + ZnSO4
amostra 2 Metalo-β-lactamase
controle -
A cultura obtida foi diluída 1:100 em TSB. Em seguida, 100µL de cada cultura
diluída foram transferidos para um poço da placa para microtitulação (Nunclon®; Nunc) e
incubadas a 36 ºC por 4 e 24 horas. O teste foi realizado em quadriplicata para cada cepa,
utilizando uma placa para cada tempo de incubação (MERRIT, KADOURI e O’TOOLE,
2011 modificado).
Após incubação, o conteúdo de cada poço foi aspirado com pipeta de microdiluição e
descartado. Cada poço foi lavado com 100 µL de solução tampão salina fosfato (PBS; pH 7,4)
por três vezes, a fim de remover as células planctônicas. Após última lavagem, a solução foi
aspirada e a placa foi seca a temperatura ambiente. Foram adicionados 100 µL de cristal de
violeta (CV) 0,1% em cada poço, deixando corar por 10 minutos a temperatura ambiente.
Após este período, o corante foi removido e cada poço foi lavado novamente com 100 µL de
PBS por três vezes. A placa foi seca a temperatura ambiente e 200 µL de etanol 95% foi
adicionado a cada poço a fim de solubilizar o CV impregnado na biomassa formada. A placa
foi submetida a um espectrofotômetro (UV-2600-UV-VIS-Spectrophotometer, SHIMADZU;
Kyoto, Japão) e a absorbância da solução etanólica foi medida em 570 nm e expressa em
densidade óptica (DO).
As cepas cuja DO570 foi superior à DO570 da cepa controle (ATCC 27853) foram
consideradas formadoras de biofilme, enquanto as cepas que apresentaram DO570 inferior à
cepa controle foram consideradas não formadoras (SANCHEZ et al., 2013).
42
Foram utilizados neste teste, cupons de aço inoxidável American Iron and Steel
Institute (AISI) 304 com acabamento número 4 (#4) e rugosidade de 0,36 μm com 1,0 cm x
1,0 cm. A limpeza dos cupons foi realizada manualmente com auxílio de esponja de
poliuretano, água e detergente neutro, seguida de enxágue com água destilada. Após enxágue,
os mesmos foram imersos em álcool etílico 70% (v/v) por 1 hora a temperatura ambiente e
esterilizados em autoclave (Spectru – Instrumental Científica Ltda; Brasil) a 121ºC por 15
minutos.
mesa, resistente aos carbapenemas) cepa 31 (clone C, coletada de paciente, resistente aos
carbapenemas) e cepa 32 (não tipada, coletada de paciente, resistente aos carbapenemas).
As soluções biocidas foram obtidas através de diluições com água MilliQ estéril das
seguintes soluções obtidas comercialmente: Hipoclorito de sódio 44,99% (Sigma-Aldrich®),
Peróxido de hidrogênio 30% (Isofar®) e Clorexidina 20% (Sigma-Aldrich®), a fim de se
obter uma concentração final de hipoclorito de sódio 1%, peróxido de hidrogênio 5% (TOTÉ
et al., 2010) e clorexidina 4%, que embora estudos tenham relatado sua pouca eficácia contra
biofilmes, continua sendo amplamente utilizada em ambientes hospitalares (BONEZ et al.,
2013; SMITH e HUNTER, 2008).
PBS, tiossulfato de sódio a 1% e para inativar a clorexidina 4% foi utilizado Tween 80 a 1%.
A solução de peróxido de hidrogênio 5% não precisa ser inativada, pois se degrada
rapidamente. Os tubos foram agitados em vortex por 2 minutos para remoção das células
sésseis (PARIZZI et al., 2004 modificado). As soluções de PBS pós-vortex, foram diluídas
em série (1:10) em água peptonada 0,1%. Alíquotas de 0,1 mL das diluições seriadas foram
transferidas para placas de Petri contendo TSA, a fim de se determinar o número de unidades
formadoras de colônia (UFC)/cm2. Todo o experimento foi realizado em triplicata. Neste
ensaio foram analisadas as mesmas nove cepas clínicas utilizadas no ensaio anterior. O
cálculo do nº de UFC/cm2 foi realizado conforme descrito no item 4.6.2.
fabricantes. A sequência de nucleotídeos foi determinada pelo uso de 1,2 µL de cada um dos
primers (tabela 4) a 3,0 pmol, 6,3 µL de DNA na faixa de 10-100 ng/µL (dosado previamente
45
aroE
amplificação TGGGGCTATGACTGGAAACC TAACCCGGTTTTGTGATTCCTACA 825
guaA
amplificação CGGCCTCGACGTGTGGATGA GAACGCCTGGCTGGTCTTGTGGTA 940
mutL
amplificação CCAGATCGCCGCCGGTGAGGTG CAGGGTGCCATAGAGGAAGTC 940
nuoD
amplificação ACCGCCACCCGTACTG TCTCGCCCATCTTGACCA 1042
ppsA
amplificação GGTCGCTCGGTCAAGGTAGTGG GGGTTCTCTTCTTCCGGCTCGTAG 989
trpE
amplificação GCGGCCCAGGGTCGTGAG CCCGGCGCTTGTTGATGGTT 811
5 RESULTADOS
O gene de virulência exoS foi o mais prevalente, estando presente em 71,4% (25/35)
das cepas analisadas, enquanto o gene exoU foi detectado em 14,3% (5/35) das cepas. Este
mesmo percentual, ou seja, 14,3% das cepas não abrigavam nem o gene exoS, nem o exoU.
48
Das 25 cepas que carregavam o gene exoS, 18 (72%) pertenciam ao clone A e seus
subtipos. O gene exoU estava distribuído em clones distintos: C, D e E (tabela 5). Porém, foi
observado que todas as cepas que continham este gene também eram resistentes aos
carbapenemas.
neste resultado a cepa 32 foi considerada maior formadora de biofilme, seguida das cepas 2 e
4 ambas com contagem de 5,8 log10 UFC/cm2 e da cepa 24 com 5,7 log10 UFC/cm2.
Não houve contagens de células viáveis após contato com os 3 biocidas testados
(hipoclorito de sódio 1%, peróxido de hidrogênio 5% e clorexidina 4%).
P= paciente; M= mesa onde era realizada a balneoterapia; CAZ= ceftazidima; ATM= aztreonam; GEN=
gentamicina; IMP= imipenem; MER= meropenem; CIP= ciprofloxacino; --------- = suscetível a todos os agentes
antimicrobianos; MDR= multidrug resistant; não-MDR= não multidrug resistant; - = negativo; F= formadora de
biofilme; NF= não formadora de biofilme; NT= não tipado.
51
94,3
% de cepas resistentes
100 88,6
90
80
70 54,3 57,1
60
50
40
30 20 20
20
10 0 0
0
Antimicrobianos testados
VF + Imipenem + EDTA
VF + Imipenem + EDTA
VF + Imipenem + ZnSo4
VF + Imipenem + ZnSo4
VF + ZnSO4
VF + ZnSO4
1 2 3 4 5 6
Os demais poços não mencionados acima, referem-se a cepas que não fazem parte deste estudo.
53
7
6,1
5,8 5,8 5,7
6 5,4 5,4 5,5
5,3
4,7
log10 UFC/cm2
0
PA1 PA2 PA3 PA4 PA5 PA9 PA24 PA31 PA32
cepas de P. aeruginosa (PA)
6. DISCUSSÃO
Este fato ainda se torna mais agravante quando se trata de pacientes queimados, os
quais apresentam sua imunidade comprometida e são geralmente submetidos à hospitalização
prolongada e terapias invasivas.
2008), sendo considerados um dos últimos recursos terapêuticos para tratamento de infecções
causadas por P. aeruginosa multirresistentes (POIREL, COLLET e NORDMANN, 2000;
SAAVEDRA et al., 2014).
A alta prevalência de cepas MDR (25/35) encontradas neste estudo, induz à pesquisa
de mecanismos que justifiquem tal resistência. Por isso, a pesquisa de genes que codifiquem
β-lactamases, foi a escolha para este trabalho. Estes genes estão em sua maioria presentes em
elementos genéticos móveis, o que promove a disseminação da resistência por transmissão
horizontal (VIEDMA et al., 2012), além do fato dos β-lactâmicos, os quais são alvos das β-
lactamases, constituírem uma das principais classes de antimicrobianos utilizados em
infecções nosocomiais, incluindo os carbapenemas.
O gene blaGES-1, por sua vez estava associado ao clone A e seus subtipos. Dez cepas
das doze que abrigavam este gene pertenciam ao clone A. Assim sendo, a prevalência deste
clone em pacientes e na mesa onde a balneoterapia era realizada pode ser explicada também
pela capacidade que estas cepas têm de expressar este gene, conferindo resistência das
mesmas aos antimicrobianos β-lactâmicos, com exceção dos carbapenemas.
prevalência do gene exoS em relação ao exoU, vem sendo descrita em alguns estudos
(BRADBURY et al., 2010; FERREIRA et al., 2015; GAREY et al., 2008). Os genes exoT,
exoY e exoS, são cromossomiais, enquanto o gene exoU apareceu posteriormente adquirido
via transmissão horizontal através de plasmídeos e integrado ao genoma bacteriano. Este fato,
justifica a baixa prevalência do gene exoU no genoma da P. aeruginosa, quando comparado
aos outros genes de virulência (BRADBURY et al., 2010; KULASEKARA et al., 2006).
A coexistência dos genes exoS e exoU em uma mesma cepa, não foi observada neste
estudo. Tal ocorrência vem a confirmar relatos de estudos anteriores, que demonstraram que
estes genes aparentam ser mutuamente exclusivos na maioria dos isolados (AGNELLO e
WONG-BERINGER, 2012; LEE et al., 2005).
Um estudo realizado por Cho e colaboradores (2014) demonstrou que 93% de cepas
exoU positivas estavam associadas à resistência a fluoroquinolona, enquanto 45% de cepas
exoS positivas apresentaram este perfil de resistência. Wong-Beringer e colaboradores (2008),
também relataram que cepas exoU positivas eram mais propensas a serem resistentes a
fluoroquinolonas. No presente estudo, a resistência à fluoroquinolona, representada pelo
agente antimicrobiano ciprofloxacino, foi verificada em 100% das cepas exoU positivas, e
92% das cepas exoS positivas; não demonstrando muita diferença deste fenótipo de resistência
entre os genes de virulência estudados.
desfecho clínico ruim para os pacientes internados nesta unidade hospitalar, devido à redução
de opções terapêuticas para estes pacientes, uma vez que o presente estudo demosntrou que as
cepas exoU positivas, também são multirresistentes, inclusive aos carbapenemas.
Outro tópico abordado neste estudo foi a capacidade de formação de biofilme entre
as cepas analisadas. A formação de biofilme é um mecanismo de defesa do próprio
microrganismo contra o ambiente, o que aumenta sua resistência aos antimicrobianos. Sua
formação pode ocorrer em superfícies bióticas e abióticas (GANDER, 1996; GILBERT,
ALLISON e MCBAIN, 2002; O’TOOLE, 2002). Muitas bactérias patogênicas existem
predominantemente sob a forma de biofilme em ambientes naturais e dentro de tecidos
infectados como comunidades polimicrobianas. Em pacientes queimados, fatores como
desvitalização da pele e dos tecidos, comprometimento da circulação e consequente
diminuição da resposta imune, favorecem a colonização e infecção das feridas por bactérias.
Em nosso estudo foi observado que das 11 cepas formadoras de biofilme, 6 (54,5%)
eram MDR, e 5 (45,5%) não-MDR. Este resultado contraria os descritos anteriormente, onde
é relatado que a produção de biofilmes é significantemente maior em isolados MDR.
Entretanto, as cepas produtoras de biofilme, segundo a tipificação por PFGE, pertenciam em
sua maioria ao clone A, o qual era o mais prevalente, incluindo isolados de pacientes e
isolados da mesa de balneoterapia. Das 11 cepas formadoras de biofilme, 09 (81,8%)
pertenciam ao clone A e seus subtipos. Destas 09 cepas (formadoras de biofilme e clone A),
06 (66,7%) eram MDR. O que pode por sua vez, justificar a prevalência deste clone nos
pacientes e no ambiente.
Foram selecionadas 9 cepas para este teste das quais 8 eram carbapenemas
resistentes. Todas as cepas formaram biofilme, com pouca variação entre os resultados. A
resistência à carbapenemas, e a presença e/ou ausência de genes de virulência, foi analisada
concomitantemente à produção de biofilme, sendo observado um discreto aumento na
capacidade de formação de biofilme, nas cepas carbapenemas resistentes que carreavam um
dos genes de virulência: exoS ou exoU (figura 4).
A desinfecção é uma etapa crucial no controle das IRAS, as quais têm sido
responsáveis por significantes morbidades e mortalidades em ambientes hospitalares. O
aumento do uso de desinfetantes a baixas concentrações, menores do que as recomendadas
pelo fabricante, compromete a eficácia do processo de desinfecção, bem como favorece o
surgimento de resistência microbiana aos biocidas. Além disso, o ambiente hospitalar
constitui um reservatório de bactérias que apresentam alta tolerância a produtos desinfetantes,
devido à má utilização dos mesmos (MARINO et al., 2011; ROMAO et al., 2005).
Já está estabelecido, que a matriz EPS é a parte do biofilme que confere resistência
aos biocidas (ABDALLAH et al., 2014). Sendo assim, mesmo que o desinfetante reduza
completamente a contagem de células sésseis viáveis, muitos biocidas deixam a matriz
intacta, podendo esta vir a ser recolonizada (TOTÉ et al.,2010).
Outro biocida que teve sua atividade avaliada neste estudo foi a clorexidina 4%.
Alguns relatos sobre este biocida confirmaram sua eficácia sobre células planctônicas, porém
não sobre biofilmes (BONEZ et al., 2013; SMITH e HUNTER, 2008). O amplo uso deste
agente em ambientes hospitalares, fez com que este também fosse selecionado para o estudo.
7. CONCLUSÃO
8. ANEXOS
Anexo I – ST 2236 gerado de acordo com novo perfil alélico obtido através da técnica de MLST.
Anexo II - ST 2237 gerado de acordo com novo perfil alélico obtido através da técnica de MLST.
65
9. REFERÊNCIAS
ABDALLAH, M.; BENOLIEL, C.; DRIDER, D.; DHULSTER P.; CHIHIB N. E. Biofilm
formation and persistence on abiotic surfaces in the context of food and medical
environments. Arch Microbiol, v. 196, p. 453–472, 2014.
ABIDI, S.H.; SHERWANI, S.K.; SIDDIQUI, T.R.; BASHIR, A.; KAZMI, S.U. Drug
resistance profile and biofilm forming potential of Pseudomonas aeruginosa isolated from
contact lenses in Karachi-Pakistan. BMC Ophthalmol, v.13, p. 1-6, 2013.
AMBLER, R.P. The structure of β-lactamase. Phil Trans R Soc Lond B Sci, v.289, n.36,
p.321-331, 1980.
66
ANDRADE, S. S.; SADER, H. S.; JONES, R. N.; PEREIRA, A. S.; PIGNATARI, A. C.;
GALES, A. C. Increased resistance to first-line agents among bacterial pathogens isolated
from urinary tract infections in Latin America: time for local guidelines? Mem Inst Oswaldo
Cruz, v. 101, p. 741–748, 2006.
BONE, RC. Gran-negative sepsis: a dilemma of modern medicine. Clin Microbiol Rev, v.6,
p. 57-68, 1993.
BONEZ, P. C.; DOS SANTOS ALVES, C. F.; DALMOLIN, T. V.; ARGETT, V. A.;
MIZDAL, C. R.; FLORES, V. C.; MARQUES, J. B.; SANTOS, R. C.; ANRAKU, C. M. M.
Chlorhexidine activity against bacterial biofilms. Am J Infect Control, v.4, p.119-122, 2013.
BRADFORD, P.A.; BRATU, C.; URBAN, C.; VISALLI, M.; MARIANO, N.; LANDMAN,
D.; RAHAL, J.J.; BROOKS, S.; CEBULAR, S.; QUALE, J. Emergence of carbapenem-
resistant Klebsiella species possessing the class A carbanem hydrolyzing KPC-2 and
Inhibithor-resitant TEM30 β-lactamases in New York. Clin Infect Dis, v.39, p.55–60, 2004.
BUSH, K. New β-lactamases in gram-negative bacteria: diversity and impact on the selection
of antimicrobial therapy. Clin Infect Dis, v.32, p.1085-1089, 2001.
BUSH, K.; JACOBI, G.A.; MEDEIROS, A.A. A functional classification scheme for β-
lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob Agents Chemother,
v.39, p.1211-1233, 1995.
67
CERF, O.; CARPENTIER, B.; SANDERS, P. Tests for determining in-use concentrations of
antibiotics and disinfectants are based on entirely different concepts: “resistance” has different
meanings. Int J Food Microbiol, v.136, p.247–254, 2010.
CHO, H. H.; KWON, K. C.; KIM, S.; KOO, S. H. Correlation between virulence genotype
and fluoroquinolone resistance in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa. Ann Lab
Med, v.34, p. 286-292, 2014.
CIANCIOTTO, N.P. Type II secretion: a protein secretion system for all seasons. Trends
Microbiol, v.13, p.581–588, 2005.
CLIFFORD, R. J.; MILILLO, M.; PRESTWOOD, J.; QUINTERO, R.; ZURAWSKI, D. V.;
KWAK, Y. I.; WATERMAN, P. E.; LESHO, E. P.; Mc GANN, P. Detection of
bacterial 16S rRNA and identification of four clinically important bacteria by real-time PCR.
PLoS ONE, v.7, e48558, 2012.
CORREA, A.; MONTEALEGRE, M. C.; MOJICA, M. F.; MAYA, J. J.; ROJAS, L.J.; DE
LA CADENA, E. P.; RUIZ, S. J.; RECALDE, M.; ROSSO, F.; QUINN, J. P.; VILLEGAS,
M. V. First report of a Pseudomonas aeruginosa isolate co-harboring KPC and VIM
carbapenemases. Antimicrob Agents Chemother, v.56, p.5422–5423, 2012.
CURRAN, B.; JONAS, D.; GRUNDMANN, H.; PITT, T.; DOWSON, C. G. Development of
a Multilocus Sequence Typing scheme for the opportunist pathogen Pseudomonas
aeruginosa. J Clin Microbiol, v.42, p.5644-5649, 2004.
CUZON, G.; NAAS, T.; VILLEGAS, M. V.; CORREA, A.; QUINN, J. P.; NORDMANN, P.
Wide dissemination of Pseudomonas aeruginosa producing beta-lactamase blaKPC-2 gene in
Colombia. Antimicrob Agents Chemother, v.55, p.5350–5353, 2011.
DIAZ, M. H.; SHAVER, C. M.; KING, J. D.; MUSUNURI, S.; KAZZAZ, J. A.; HAUSER,
A. R. Pseudomonas aeruginosa induces localized immunosuppression during pneumonia.
Infect Immun, v. 76, p. 4414-4421, 2008.
DUBOIS, V.; ARPIN, C.; NOURY, P.; ANDRÉ, C.; COULANGE, L.; QUENTIN, C.
Prolonged outbreak of infection due to TEM-21-producing strains of Pseudomonas
aeruginosa and enterobacteria in a nursing home. J Clin Microbiol, v. 43, p.4129–4138,
2005.
DUBOIS, V.; POIREL, L.; MARIE, C.; ARPIN, C.; NORDMANN, P.; QUENTIN, C.
Molecular characterization of a novel class 1 integron containing blaGES-1 and a fused
product of aac3-Ib/aac6_-Ib_ gene cassettes in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob
Agents Chemother, v. 46, p.638–645, 2002.
69
DUNNE, W. M. Jr. Bacterial adhesion: seen any good biofilms lately? Clin Microbiol Rev,
v.15, p.155–166, 2002.
FEIL, E. J.; LI, B. C.; AANENSEN, D. M.; HANAGE, W. P.; SPRATT, B. G. Eburst:
Inferring patterns of evolucionary descent among clusters of related bacterial genotypes from
Multi Locus Sequence Typing data. J Bacteriol, v.8, p.1518-1530, 2004.
FELTMAN, H.; Schulert, G.; Khan, S.; Jain, M.; Peterson, L.; Hauser, A. R. Prevalence of
type III secretion genes in clinical and environmental isolates of Pseudomonas aeruginosa.
Microbiology, v.147, p.2659-2669, 2001.
FIN-BARBANÇON, V.; GORANSON, J.; ZHU, L.; SAWA, T.; WIENER-KRONISH, J. P.;
FLEISZIG, S. M. J.; WU, C.; MENDE-MUELLER, L.; FRANK, D. W. ExoU expression by
Pseudomonas aeruginosa correlates with acute cytotoxicity and epithelial injury. Mol
Microbiol, v. 25, p. 547-557, 1997.
FLEMMING, H. C.; WINGENDER, J. The biofilm matrix. Nat Ver Microbiol, v. 8, p.623–
633, 2010.
GALLE, M.; CARPENTIER, I.; BEYAERT, R. Structure and function of the type III
secretion system of Pseudomonas aeruginosa. Curr Protein Pept Sci, v.13, p. 831-842,
2012.
GARCÍA RAMIREZ, D.; NICOLA, F.; ZARATE, S.; RELLOSO, S.; SMAYEVSKY, J.;
ARDUINO, S. Emergence of Pseudomonas aeruginosa with KPC-type carbapenemase in a
teaching hospital: an 8-year study. J Med Microbiol, v.6, p.1565–1570, 2013.
GAREY, K.W.; VO, Q. P.; LAROCCO, M. T.; GENTRY, L. O.; TAM, V. H. Prevalence of
type III secretion protein exoenzymes and antimicrobial susceptibility patterns from
bloodstream isolates of patients with Pseudomonas aeruginosa Bacteremia. J Chemother, v.
20, p.714-720, 2008.
71
GILBERT, P.; ALLISON, D. G.; McBAIN, A. J. Biofilms in vitro and in vivo: do singular
mechanisms imply cross-resistance? J Appl Microbiol, v.92, p.98S–110S, 2002.
GOODMAN, A. L.; KULASEKARA, B.; RIETSCH, A.; BOYD, D.; SMITH, R. S.;
LORRY, S. A signaling network reciprocally regulates genes associated with acute infection
and chronic persistence in Pseudomonas aeruginosa. Dev Cell, v.7, p.745–754, 2004.
HERMES, D.M.; PITT, C. P; LUTZ, L.; TEIXEIRA, A. B.; RIBEIRO, V. B.; NETTO, B.;
MARTINS, A. F.; ZAVASCKI, A. P.; BARTH, A. L. Evaluation of heteroresistance to
polymyxin B among carbapenem-susceptible and -resistant Pseudomonas aeruginosa. J Med
Microbiol, v.62, p.1184–1189, 2013.
72
H , N.; BJAMSHOLT, T.; GIVSKOV, M.; MOLIN, S.; CIOFU, O. Antibiotic resistance
JACOBY, G. A.; MUNOZ-PRICE, L. S. The new b-lactamases. New Engl J Med, v.352,
p.380–391, 2005.
JÁCOME, P. R.; ALVES, L.R.; CABRAL, A. B.; LOPES, A. C.; MACIEL, M. A. First
report of KPC-producing Pseudomonas aeruginosa in Brazil. Antimicrob Agents
Chemother, v. 56, p.4990, 2012.
KARATAN, E.; WATNICK, P. Signals, regulatory networks, and materials that build and
break bacterial biofilms. Microbiol Mol Biol Rev, v.73, p.310–347, 2009.
KOHLER, T.; MICHEA-HAMZEHPOUR, M.; HENZ, U.; GOTOH, N.; CURTY, L. K.;
PECHERE, J. C. Characterization of MexE-MexF-OprN, a positively regulated multidrug
efflux system of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol, v.23, p.345–354, 1997.
LEE, J. K.; LEE, Y. S.; PARK, Y. K.; KIM, B. S. Alterations in the GyrA and GyrB subunits
of topoisomerase II and the ParC and ParE subunits of topoisomerase IV in ciprofloxacin-
resistant clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Int J Antimicrob Agents, v.25,
p.290–295, 2005.
LI, X. Z.; BARRE, N.; POOLE, K. Influence of MexA-MexB-OprM multidrug efflux system
on expression of the MexC-MexD-OprJ and MexEMexF- OprN multidrug efflux systems in
Pseudomonas aeruginosa. J Antimicrob Chemother, v.46, p.885–893, 2000.
LUCENA, A.; DALLA COSTA, L. M.; NOGUEIRA, K. S.; MATOS, A. P.; GALES, A. C.;
PAGANINI, M. C.; CASTRO, M. E. S.; RABONI, S. M. Nosocomial infections with
metallo-beta-lactamase-producing Pseudomonas aeruginosa: molecular epidemiology, risk
factors, clinical features and outcomes. J Hosp Infect, v.87, p.234-240, 2014.
MA, L.; CONOVER, M.; LU, H.; PARSEK, M. R.; BAYLES, K.; WOZNIAK, D. J.
Assembly and development of the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. PLoS Pathog,
v.5, e1000354, 2009.
75
MAÂTALLAH, M.; CHERIAA, J.; BACKHROUF, A.; IVERSEN, A.; GRUNDMANN, H.;
DO, T.; LANOTTE, P.; MASTOURI, M.; ELGHMATI, M. S.; ROJO, F.; MEJDIL, S.;
GISKE, C. G. Population structure of Pseudomonas aeruginosa from five mediterranean
countries: evidence for frequent recombination and epidemic occurrence of CC235. PLoS
ONE, v.6, e25617, 2011.
MASUDA, N.; GOTOH, N.; OHYA, S.; NISHINO, T. Quantitative correlation between
susceptibility and OprJ production in NfxB mutants of Pseudomonas aeruginosa.
Antimicrob Agents Chemother, v.40, p.909–913, 1996.
MIKKELSEN, H.; BOND, N. J.; SKINDERSOE, M. E.; GIVSKOV, M.; LILLEY, K. S.;
WELCH, M. Biofilms and type III secretion are not mutually exclusive in Pseudomonas
aeruginosa. Microbiology, v.155, p.687–698, 2009.
MOON, S. Y.; ZHENG, Y. Rho GTPase- activating proteins in cell regulation. Trends Cell
Biol, v.3, p.13-22, 2003.
NAAS, T.; PHILIPPON, L.; POIREL, L.; RONCO, E.; NORDMANN, P. An SHV-derived
NIKAIDO, H. Porins and specific diffusion channels in bacterial outer membranes. J Biol
Chem, v.269, p.3905-3908, 1994.
NIVENS, D. E.; OHMAN, D. E.; WILLIAMS, J.; FRANKLIN, M. J. Role of alginate and its
O acetylation in formation of Pseudomonas aeruginosa microcolonies and biofilms. J
Bacteriol, v.183, p.1047–1057, 2001.
PETROVA, O. E.; SAUER, K. The novel two-component regulatory system BfiSR regulates
biofilm development by controlling the small RNA rsmZ through CafA. J Bacteriol, v.192, p.
5275–5288, 2010.
PETROVA, O. E.; SAUER, K. SagS contributes to the motile-sessile switch and acts in
concert with BfiSR to enable Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. J Bacteriol, v.193,
p.614–6628, 2011.
PIER, G. B.; COLEMAN, F.; GROUT, M.; FRANKLIN, M.; OHMAN, D. E. Role of
alginate O acetylation in resistance of mucoid Pseudomonas aeruginosa to opsonic
phagocytosis. Infect Immun, v.69, p.1895–1901, 2001.
79
PIRES, E. J. V. C.; SILVA JÚNIOR, V. V.; LOPES, A. C. S.; VERAS, D. L.; LEITE, L. E.;
MACIEL, M. A. V. Análise Epidemiológica de isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa
provenientes de hospital universitário. Rev Bras Ter Intensiva, v.21, p.384-390, 2009.
POIREL, L.; THOMAS, I. L.; NAAS, T.; KARIM, A.; NORDMANN, P. Biochemical
sequence analyses of GES-1, a novel class A extended-spectrum betalactamase, and the class
1 integron In52 from Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother, v.44, p.622-
632, 2000.
POIREL, L.; WELDHAGEN, G. F.; NAAS, T.; De CHAMPS, C.; DOVE, M. G.;
NORDMANN, P. GES-2, a class A β-lactamase from Pseudomonas aeruginosa with
increased hydrolysis of imipenem. Antimicrob Agents Chemother, v.45, p.2598–2603,
2001.
POIREL, L.; BRINAS, L.; VERLINDE, A.; IDE, L.; NORDMANN, P. BEL-1, a novel
clavulanic acid-inhibited extended-spectrum β-lactamase, and the class 1 integron In120 in
Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother, v.49, p.3743–3748, 2005.
POIREL, L.; NAAS, T.; GUIBERT, M.; CHAIBI, E. B.; LABIA, R.; NORDMANN, P.
POOLE, K. Outer membranes and efflux: the path to multidrug resistance in gram-negative
bacteria. Curr Pharm Biotechnol, v. 3, p.77–98, 2002.
POOLE, K. Resistance to beta-lactam antibiotics. Cell Mol Life Sci, v. 61, p. 2200-222,
2004.
POOLE, K.; GOTOH, N.; TSUJIMOTO, H.; ZHAO, Q.; WADA, A.; YAMASAKI, T.;
NESHAT, S.; YAMAGISHI, J,; LI, X. Z.; NISHINO, T. Overexpression of the mexC-mexD-
oprJ efflux operon in nfxB-type multidrug resistant strains of Pseudomonas aeruginosa. Mol
Microbiol, v.21, p.713–724, 1996.
RIZEK, C.; FU, L.; DOS SANTOS, L. C.; LEITE, G.; RAMOS, J.; ROSSI, F.;
GUIMARAES, T.; LEVIN, A. S; FIGUEIREDO, C. S. Characterization of carbapenem-
resistant Pseudomonas aeruginosa clinical isolates, carrying multiple genes coding for this
antibiotic resistance. Ann Clin Microbiol, v.13, p.1-5, 2014.
SABAT, A. J,; BUDIMIR, A.; NASHEV, D.; SÁ-LEÃO, R.; VAN DIJL, J. M.; LAURENT,
F.; GRUNDMANN, H.; FRIEDRICH, A. W.; on behalf of the ESCMID Study Group of
Epidemiological Markers (ESGEM). Overview of molecular typing methods for outbreak
detection and epidemiological surveillance. Euro Surveill, v.18, p.1-15, 2013.
SACHA, P.; WIECZOREK, P.; HAUSCHILD, T.; ZÓRAWSKI, M.; OLSZANSKA, D.;
TRYNISZEWSKA, E. Metallo- β-lactamases of Pseudomonas aeruginosa – a novel
mechanism resistance to β-lactam antibiotics. Folia Histochem Cytobiol, v.46, p.137-142,
2008.
SADER, H. S.; GALES, A. C.; PFALLER, M. A.; MENDES, R. E.; ZOCCOLI, C.; BARTH,
A.; JONES, R. N. Pathogen frequency and resistance patterns in Brazilian hospitals: summary
of results from three years of the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program. Braz J
Infect Dis, v.5, p.200–214, 2001.
82
SADER, H. S.; REIS, A. O.; SILBERT, S.; GALES, A. C. IMPs, VIMs and SPMs: the
diversity of metallo-b-lactamases produced by carbapenem-resistant Pseudomonas
aeruginosa in a Brazilian hospital. Clin Microbiol Infect, v.11, p.73–76, 2005.
SAIER, M. H. Jr.; PAULSEN, I. Phylogeny of multidrug transporters. Semin Cell Dev Biol,
v.12, p.205 – 213, 2001.
SANCHEZ, C. J. JR.; MENDE, K.; BECKIUS, M. L.; AKERS, K. S.; ROMANO, D. R.;
WENKE, J. C.; MURRAY, C. K. Biofilm formation by clinical isolates and the implications
in chronic infections. BMC Infect Dis, v.13, p.1-12, 2013.
SMITH, K.; HUNTER, I. S. Efficacy of common hospital biocides with biofilms of multi-
drug resistant clinical isolates. J Med Microbiol, v.57, p.966-973, 2008.
TAM, V. H.; KABBARA, S.; VO, G.; SCHILLING, A. N.; COYLE, E. A. Comparative
pharmacodynamics of gentamicin against Staphylococcus aureus and Pseudomonas
aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother, v.50, p.2626–2631, 2006.
TOLEMAN, M. A.; SIMM, A.M.; MURPHY, T. A.; GALES, A.C.; BIEDENBACH, D. J.;
JONES, R.N.; WALSH, T. R. Molecular characterization of SPM-1, a novel metallo-beta-
lactamase isolated in Latin America: report from the SENTRY antimicrobial surveillance
programme. J Antimicrob Chemother, v.50, p.673-679, 2002.
TOSH, P. K.; DISBOT, M.; DUFFY, J. M.; BOOM, M. L.; HESELTINE, G.; SRINIVASAN,
A.; GOULD, C. V.; BERRÍOS-TORRES, S. I. Outbreak of Pseudomonas aeruginosa surgical
site infections after arthroscopic procedures: Texas, 2009. Infect Control Hosp Epidemiol,
v.32, p.1179-86, 2011.
TOTÉ, K.; HOREMANS, T.; VANDEN BERQHE, D.; MAES, L.; COS, P. Inhibitory effect
of biocides on the viable massas and matrices of Staphylococcus aureus and Pseudomonas
aeruginosa biofilms. Appl Environm Microbiol, v.76, p.3135-3142, 2010.
VAN BELKUM, A.; TASSIOS, P. T.; DIJKSHOORN, L.; HAEGGMAN, S.; COOKSON,
B.; FRY, N. K.; FUSSING, V.; GREEN, J.; FEIL, E.; GERNER- SMIDT, P.; BRISSE, S.;
STRUELENS, M.; Europenan Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases
(ESCMID) Study Group on Epidemiological Markers (ESGEM). Guidelines for the
validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology. Clin
Microbiol Infect, v.13, p.1-46, 2007.
84
VANCE, R. E.; RIETSCH, A.; MEKALANOS, J. J. Role of the type III secreted exoenzymes
S, T, and Y in systemic spread of Pseudomonas aeruginosa PAO1 in vivo. Infect Immun,
v.73, p.1706-1713, 2005.
VENTRE, I.; GOODMAN, A. L.; VALLET-GELY, I.; VASSEUR, P.; SOSCIA, C.;
MOLIN, S.; BLEVES, S.; LAZDUNSKI, A.; LORY, S.; FILLOUX, A. Multiple sensors
control reciprocal expression of Pseudomonas aeruginosa regulatory RNA and virulence
genes. Proc Natl Acad Sci USA, v.103, p.171–176, 2006.
VIEDMA, E.; JUAN, C.; VILLA, J.; BARRADO, L.; ORELLANA, M. A.; SANZ, F.;
OTERO, J. R.; OLIVER, A.; CHAVES, F. VIM-2-producing multidrug-resistant
Pseudomonas aeruginosa ST 175 clone, Spain. Emerg Infect Dis, v.18, p.1235-1241, 2012.
VOURLI, S.; GIAKKOUPI, P.; MIRIAGOU, V.; TZELEPI, E.; VATOPOULOS, A. C.;
YANG, L.; HU, Y.; LIU, Y.; ZHANG, J.; ULSTRUP, J.; MOLIN, S. Distinct roles of
extracellular polymeric substances in Pseudomonas aeruginosa biofilm development.
Environ Microbiol, v.13, p.1705–1717, 2011.
YU, F.; YING, Q.; CHEN, C.; LI, T.; DING, B.; LIU, Y.; QIN, Z.; PARSONS, C.;
SALGADO, C.; QU, D.; PAN, J.; WANG, L. Outbreak of pulmonary infection caused by
Klebsiella pneumoniae isolates harbouring blaIMP-4 and blaDHA-1 in a neonatal intensive
care unit in China. J Med Microbiol, v.61, p.984-989, 2012.
ZAVASCKI, A. P.; GOLDANI, L. Z.; LI, J.; NATION, R. L. Polymyxin B for the treatment
of multidrug-resistant pathogens: a critical review. J Antimicrob Chemother, v.60, p.1206–
1215, 2007.