ANALISIS PROTEIN

Pendahuluan
Protein adalah merupakan komponen yang banyak terdapat didalam semua sel, dan hampir semuanya, kecuali protein storan, adalah penting untuk fungsi dan/atau struktur sel. Protein didalam makanan adalah sangat kompleks. Protein berbeza sekali berat molekulnya, berkisar dari 5,000 dalton hingga lebih dari satu juta dalton. Analisis protein agak rumit kerana beberaoa komponen makanan mempunyai sifat-sifat fisiologi yang serupa. Nitrogen bukan protein boleh berpunca dari asid amino, peptid kecil, asid nukleik, fosfolipid, gula amino, porfirin, dan beberapa vitamin, alkaloid, asid urik, urea, dan ion amonia. Oleh yang demikian, nitrogen organik jumlah yang terdapat didalam makanan adalah mewakili terutamanya protein dan sedikit sebatian bukan nitrogen organik keseluruhannya. Bergantung kepada kaedah yang digunakan, lain-lain komponen makanan makro, termasuklah lipid dan karbohidrat, boleh mengganggu secara fizikal analisis protein makanan. Beberapa kaedah telah dibangun untuk mengukur kandungan protein. Prinsip asas kaedahkaedah ini termasuklah penentuan nitrogen, ikatan peptid, asid aromatik, kedayaserapan (absorptivity) UV protein, kumpulan amino bebas, sifat-sifat serakan (scattering) cahaya, dan keupayaan mengikat pencelup (dye binding).

Kepentingan Analisis
Analisis protein penting untuk: 1. 1. Penentuan aktiviti biologi. Sesetengah protein, termasuklah enzim atau perencat enzim mempunyai kaitan dengan sains makanan dan pemakanan: misalnya enzim proteolitik dalam perlembutan daging, pektinase dalam kemasakan buah, dan perencat tripsin didalam biji kekacang adalah kesemuanya protein. 2. 2. Kajian ciri-ciri kefungsian. Protein yang terdapat didalam berbagai jenis makanan mempunyai sifat-sifat kefungsian makanan yang unik: contohnya gliadin dan glutenin didalam tepung gandum untuk pembuatan roti, kasein didalam susu untuk koagulasi menjadi produk keju, dan albumin telur untuk pembusaan (foaming). 3. 3. Pelabelan pemakanan. Analisis protein diperlukan apabila kita hendak mengetahui :

1. 2. 3. 4. 5. 6.

1. Kandungan protein jumlah 2. Komposisi asid amino 3. Kandungan protein tertentu didalam sesuatu campuran 4. Kandungan protein semasa pengasingan dan penulinan sesuatu protein 5. Nitrogen bukan protein 6. Nilai pemakanan (ketercernaan, nisbah kecekapan protein, atau kesaimbangan nitrogen) sesuatu protein

Kandungan Didalam Makanan

Kandungan protein didalam makanan berbeza-beza dengan luasnya. Makanan dari sumber haiwan dan kekacang adalah merupakan sumber protein yang terbaik.Kandungan protein bagi beberapa makanan pilihan ditunjukkan didalam Jadual 1. Jadual 1. Kandungan protein makanan pilihan Barang Makanan Makanan tenusu Susu penuh Susu skim Susu kering tanpa lemak Keju Cheddar Daging Lembu, chuck tanpa tulang, kurus (lean) berlemak Lembu, stik bulat, kurus berlemak Lemby, kering, disiat (cgipped) Khinzir, daging batang pinang (loin), kurus berlemak, Ayam, dada Telur, mentah, penuh Ikan Kod, dimasak Tuna, ditin dalam minyak Bijirin Beras, perang, mentah Beras, diceruh (polished), mentah Tepung, gandum, penuh, verieti keras Tepung, jagong Spaghetti, kering Kanji, jagong Kentang, penuh, mentah, bulat Ubi kayu Peratusan Protein (asas berat basah) 3.5 3.6 35.9 25.0 18.7 28.6 34.3 17.1 27.3 12.9 28.5 24.2 7.5 6.7 13.3 7.8 12.5 0.3 1.6 0.6

tanpa tulang

Kekacang Kacang, kering, semua varieti Soya, kering Soya, tauhu Buah-buahan dan sayuran Epal, mentah, penuh Asparagus, hijau Badam, penuh

22.3 34.1 7.8 0.2 2.5 18.6

Kaedah
Berikut adalah prinsip, tatacara umum dan kegunaan beberapa kaedah penentuan protein.

Kaedah Kjeldahl
Prinsip Didalam tatacara Kjeldahl, protein dan lain-lain komponen organik makanan didalam sampel dihadamkan dengan asid sulfurik dengan kehadiran katalis. Nitrogen organik jumlah ditukarkan kepada amonium sulfat. Hadaman (digest) tadi kemudiannya dineutralkan dengan alkali dan disuling kedalam larutan asid borik. Anion borat yang terbentuk dititrat dengan asid piawai, yang mana ditukarkan sebagai nitrogen didalam sampel. Hasil analisis menggambarkan kandungan protein kasar kerana nitrogen juga boleh datang dari komponen bukan nitrogen.

Latar Belakang Sejarah Kaedah Asal: Dalam tahun 1883, Johann Kjeldahl membangunkan proses asas untuk menganalisis nitrogen, yang sekarang ini dikenali sebagai kaedah Kjeldahl. Langkah-langkah umum didalam kaedah asal tersebut termasuklah: 1. 1. Penghadaman dengan asid sulfurik, dengan penambahan serbuk potasium permanganat bagi menyempurnakan pengoksidaan dan penukaran nitrogen menjadi amonium sulfat. 2. 2. Peneutralan hadaman yang dicairkan, diikuti dengan penyulingan kedalam larutan asid piawai yang diketahui isipadunya, yang mengandungi potasium iodid dan iodat. 3. 3. Pentitratan iodin yang terbebas dengan larutan tiosulfat piawai. Pembaikan: Beberapa pengubahsuaian penting telah memperbaikki proses Kjeldahl yang asal: 1. 1. Katalis logam seperti raksa, tembaga dan selenium ditambahkan kepada asid sulfurik untuk menyempurnakan penghadaman. Raksa didapati paling memuaskan. Selenium

2. 3. 4. 5.

dioksid dan kuprik sulfat dalam nisbah 3:1 telah dilaporkan sebagai berkesan untuk penghadaman. Tembaga dan titanium dioksid juga digunakan sebagai katalis campuran untuk penghadaman. Penggunaan titanium dioksida dan tembaga kurang menimbulkan masalah persekitaran berbanding raksa semasa pembuangan sisa. 2. Potasium sulfat digunakan untuk meningkatkan titik didih asid sulfurik bagi mempercepatkan penghadaman 3. Sulfid atau sodium tiosulfat ditambahkan kedalam hadaman yang dicairkan bagi membantu melepaskan nitrogen dari raksa, yang cenderung mengikat amonium. 4. Amonia disuling terus kedalam larutan asid borik dan diikuti dengan pentitratan dengan asid piawai 5. Kaedah kolorimetrik, Nesslerization, dan kromatografi ion digunakan untuk menentukan kandungan nitrogen selepas penghadaman.

Tatacara Umum dan Tindakbalas Penyediaan Sampel: Bahan makanan pepejal dihancurkan agar boleh melalui penapis 20-mesh Sampel untuk analisis hendaklah homogen. Persediaan khusus tidak diperlukan. Penghadaman: Letakkan sampel (yang ditimbang dengan tepat) kedalam kelalang Keldahl. Masukkan asid dan katalis, hadamkan sehingga jernih untuk mendapatkan penghuraian sempurna kesemua bahan organik. Amonium sulfat yang tak meruap terbentuk hasil dari tindakbalas diantara nitrogen dengan asid sulfurik.

Asid Sulfurik

Protein

. Semasa penghadaman, nitrogen protein dibebaskan untuk membentuk ion amonium; asid sulfurik mengoksid bahan organik dan bergabung dengan amonium yang terbentuk; unsur karbon dan hidrogen ditukarkan kepada karbon dioksid dan air.
Haba, katalis

(NH 4 ) 2 SO4 ....................(1)

Peneutralan dan Penyulingan: Hadaman seterusnya dicairkan dengan air. Alkali yang mengandungi sodium tiosulfat ditambahkan untuk meneutralkan asid sulfurik. Amonia yang terbentuk disuling kedalam larutan asid borik yang mengandungi penunjuk metilen biru dan metil merah.

(NH 4 ) 2 SO4 + 2 NaOH 2NH 3 + Na 2SO4 + 2H 2 O...................(2) NH 3 + H 3BO3 (asid borik) NH 4 + H 2 BO3 (ion borat)............(3)
+

Pentitratan : Anion borat (berkadaran dengan banyaknya nitrogen) dititrat dengan HCl piawai.
H 2 BO- 3 + H + H 3BO3 ................................................(4)

Perkiraan: Mol HCl = Mol NH3 = Mol N didalam sampel.(5) Satu pengosong reagen perlu dijalankan untuk menolak nitrogen reagen dari nitrogen sampel.

% N = N HCl X

Isipadu asid diperbetul 14 g N X X 100.................(6) g sampel mol

dimana: N HCl = Kenormalan HCl, dalam mol/1000 ml Isipadu asid diperbetul = (ml asid piawai untuk sampel) - (ml asid untuk pengosong 14 = berat atom nitrogen Satu faktor digunakan untuk menukarkan peratusan N menjadi peratusan protein kasar. Kebanyakan protein mengandungi 16 peratus N, oleh itu faktor penukaran ialah 6.25 (100/16).

%N = % prtein 0.16 atau % N X 6.25 = % protein.......................(7)

Faktor penukaran bagi beberapa jenis bahan makanan ditunjukkan didalam Jadual 2. Jadual 2. Faktor Penukaran Nitrogen kepada Protein bagi Beberapa Jenis Makanan Bahan Makanan Telur dan daging Susu Gandum Jagung Ot Kacang soya Peratusan N didalam Protein 16.0 15.7 18.0 16.0 17.15 17.51 Faktor 6.25 6.38 5.70 6.25 5.83 5.71

Tatacara Gantian: Bagi menggantikan penyulingan dan pentitratan dengan asid, amonia atau nitrogen boleh ditentukan kuantitinya melalui: 1. 1. Nesslerization NH4OH + 2HgI2 + 2KI + 3KOH NH4Hg2I + 7KI + 4H2O .(8) merkurik iodid amonium dimerkurik iodid, merah-oren, 440 nm Kaedah ini cepat dan sensitif, tetapi amonium dimerkurik iodid berbentuk koloid dan warna tak stabil.
2. 2. NH3 + fenol + hipoklorit OH - indofenol (biru, 630 nm) ..(9) 3. 3. Pengukuran pH selepas penyulingan kedalam asid borik yang diketahui isipadunya

4. 4. Pengukuran terus amonia, menggunakan kaedah kromatografi ion.

Aplikasi Kelebihan: 1. 2. 3. 4. 5. 1. Boleh digunakan untuk semua jenis makanan 2. Secara relatifnya mudah 3. Murah 4. Tepat; kaedah resmi untuk kandungan protein kasar 5. Telahpun diubahsuai (kaedah mikro Kjeldahl) untuk mengukur kuantiti protein sehingga mikrogram

Kelemahan: 1. 2. 3. 4. 1. 2. 3. 4. Mengukur nitrogen organik jumlah, bukan semata-mata protein Memakan masa (sekurang-kurangnya 2 jam untuk selesai) Kurang kejituan berbanding kaedah biuret Reagen yang mengaratkan (corrosive)

Kaedah Biuret
Prinsip Warna ungu-delima (violet-purplish) terbentuk apabila ion kuprik dikomplekkan dengan ikatan peptid (bahan yang mengandungi sekurang-kurangnya dua ikatan peptid, yakni, biuret, peptid besar, dan semua protein) didalam keadaan beralkali. Daya serapan (absorbance) warna yang dihasilkan dibaca pada 540 nm. Keamatan warna (daya serapan) adalah berkadaran dengan kandungan protein didalam sampel.

Tatacara 1. 1. Sebanyak 5 ml reagen biuret dicampurkan dengan 1 ml bahagian larutan protein (1 hingga 10 mg protein/ml). Reagen ini mengandumgi kuprik sulfat, NaOH, dan potasium sodium tartarat, yang digunakan untuk menstabilkan ion kuprik didalam larutan alkali. 2. 2. Selepas dibiarkan pada suhu bilik selama 15 minit atau 30 minit, daya serapan dibaca pada 540 nm terhadap satu pengosong reagen.

3. 3. Sekiranya campuran tindakbalas tidak jernih, maka penurasan atau pengemparan perlu dilakukan terlebih dahulu. 4. 4. Satu lengkuk piawai kepekatan melawan daya serapan di buat menggunakan bovine serum albumin (BSA) Aplikasi Kaedah biuret telah digunakan untuk menentukan protein didalam bijirin, daging, protein kacang soya, dan sebagai ujian kualitatif makanan haiwan. Kaedah biuret juga digunakan dengan meluas untuk mengukur kandungan protein dalam protein yang diasingkan.

Kelebihan: 1. 1. Lebih murah daripada kaedah Kjeldahl; cepat (boleh disiapkan dalam tempoh 30 minit); kaedah analisis protein yang paling mudah. 2. 2. Terbitan warna jarang ditemui berbanding kaedah Lowry, penyerapan ultralembayung (UV atau kaedah turbidimetri (diterangkan dibawah) 3. 3. Sangat sedikit sebatian selain dari protein didalam makanan yang boleh mengganggu tindakbalas biuret 4. 4. Tidak mengesan nitrogen dari bukan-peptid atau sumber bukan-protein Kelemahan: 1. 1. Tidak bagitu sensitif berbanding kaedah Lowry; memerlukan sekurang-kurangnya 2 hingga 4 mg protein untuk menjalankan esei 2. 2. Daya serapan boleh datangnya dari pigmen hempedu sekiranya wujud 3. 3. Kesensitiftan garam amonium yang tinggi mengganggu tindakbalas 4. 4. Warna berubah-ubah mengikut jenis protein; gelatin memberikan warna delima-merah jambu (pinkish-purple)

5. 5. Kelegapan (opalescence) boleh berlaku didalam larutan akhir sekiranya banyak terdapat lipid dan karbohidrat 6. 6. Bukan satu kaedah yang mutlak: warna perlu dipiawaikan terhadap protein yang diketahui (misalnya, BSA) atau terhadap kaedah nitrogen Kjeldahl.

Kaedah Lowry
Prinsip Kaedah Lowry menggabungkan kaedah tindakbalas biuret dengan penurunan reagen fenol Folin-Ciocalteau (asid fosfomolibdik-fosfitunngstik) oleh residu tirosin dan triptofan didalam protein. Warna kebiruan yang terbentuk diukur pada 750 nm (kesensitifan tinggi untuk kesensitiftan protein rendah) atau 500 nm (kesensitifan rendah untuk kesensitiftan protein tinggi). Tatacara yang asal telah diubahsuai oleh Miller dan kemudian oleh Hartree untuk memperbaikki kelinearan respons warna terhadap kesensitiftan protein.

Tatacara Tatacara berikut adalah berasaskan tetecara terubahsuai mengikut Hartree: 1. 1. Protein yang hendak dianalisis dicairkan agar mencapai julat yang sesuai (20 hingga 100 mg) 2. 2. Larutan Na K tartarat-Na2CO3 ditambahkan selepas penyejukan dan dieram pada suhu bilik selama 10 minit. 3. 3. Larutan CuSO4 - K Na tartarat - NaOH ditambahkan selepas penyejukan dan dieram pada suhu bilik selama 10 minit 4. 4. Reagen Folin yang baru disediakan ditambah, kemudian dicampur dan dieram pada 50 o C selama 10 minit 5. 5. Daya serapan dibaca pada 650 nm 6. 6. Satu lengkuk piawai BSA disediakan dengan berhati-hati untuk menganggarkan kesensitiftan protein yang tak diketahui. Aplikasi Disebabkan ianya bagitu mudah dan sensitif, kaedah ini telah digunakan dengan luas dalam biokimia protein. Walau bagaimanapun, ia tidaklah digunakan dengan meluas untuk menentukan protein didalam sistem makanan tanpa mengekstrak terlebih dahulu protein itu dari campuran makanan. Kelebihan: 1. 1. Sangat sensitif a) a) 50 hingga 100 kali lebih sensitif dari kaedah biuret b) b) 10 hingga 20 kali lebih sensitif dari kaedah penyerapan UV 280 nm (dihuraikan dibawah)

c) c) Beberapa kali lebih sensitif dari kaedah ninhydrin (dihuraikan dibawah) d) d) Sama sensitivitinya dengan Nesslerization; namun lebih senang dari Nesslerization 2. 2. Kurang dipengaruhi oleh kekeruhan sampel 3. 3. Lebih spesifik daripada kebanyakan kaedah 4. 4. Secara relatifnya mudah; boleh dilakukan dalam masa 1 hingga 1.5 jam Kelemahan: Untuk sebab-sebab berikut, tatacara Lowry memerlukan pempiawaian yang berhati-hati untuk aplikasi tertentu: 1. 1. Perbezaan warna mengikut protein yang berlainan lebih besar dari kaedah biuret 2. 2. Warna tidak semestinya berkadaran dengan kepekatan protein 3. 3. Tindakbalas diganggu secara berbeza-beza oleh sukros, lipid, penimbal fosfat, monosakarid dan heksoamin 4. 4. Kepekatan gula penurun, amonium sulfat yang tinggi, dan sebatian sulfidril mengganggu tindakbalas

Kaedah Asid Bisinkoninik (Bicinchoninic Acid (BCA)

Prinsip Smith et al. (1985) telah mencadangkan bahawa protein menurunkan ion kuprik kepada ion kuprus dibawah keadaan beralkali. Ion kupruos berkompleks dengan reagen BCA yang berwarna hijau-epal lalu bertukar menjadi warna delima (purplish). Warna yang terbentuk ini berkadaran dengan kepekatan protein.

Tatacara 1. 1. Campurkan (satu langkah) larutan protein dengan reagent BCA, yang mengandungi garam sodium BCA, sodium karbonat, NaOH, kuprik sulfat, pH 11.25 2. 2. Eram pada 37 oC selama 30 minit, atau pada suhu bilik selama 2 jam, atau 60 oC selama 30 minit. Pemilihan suhu bergantung kepada sensitiviti yang dikehendakki. Suhu yang lebih tinggi memberikan respons warna yang lebih besar 3. 3. Baca daya penyerapan pada 562 nm terhadap satu pengosong reagent. 4. 4. Buatlah satu keluk piawai menggunakan BSA Aplikasi Kaedah BSA telah digunakan dalam pengasingan dan penulinan protein. Kesesuaian kaedah ini untuk mengukur protein didalam sistem makanan yang kompleks belum lagi dilaporkan. Kelebihan:

1. 1. Sensitiviti setanding dengan kaedah Lowry; sensitiviti kaedah BCA mikro (0.5 mg hingga 10 mg) baik sedikit dari kaedah Lowry. 2. 2. Pencampuran satu langkah lebih mudah dari kaedah Lowry. 3. 3. Reagent lebih stabil dari reagent Lowry 4. 4. Detergen bukai ionik dan garam penimbal tidak mengganggu tindak balas. 5. 5. Pemekatan media yang mengandungi reagen yang menyah-aslikan (4M guanidinHCl atau 3M urea) tidak mengganggu.

Kelemahan: 1. 1. Warna tidak stabil mengikut masa. Juru analisis perlu mengawal masa untuk membaca daya serapan 2. 2. Gula penurun mengganggu lebih banyak dari kaedah Lowry. Amonium sulfat yang tinggi kepekatannya juga mengganggu. 3. 3. Variasi warna dikalangan protein yang berbeza serupa seperti kaedah Lowry. 4. 4. Respons daya serapan terhadap kepekatan tidak linear.

Kaedah Penyerapan Ultralembayung (UV) 280 nm

Prinsip Protein menunjukkan penyerapan yang kuat pada 280 nm UV, terutamanya disebabkan oleh residu triptofan dan tirosin didalam protein. Oleh kerana kandungan triptofan dan tirosin didalam setiap protein agak tetap, maka daya serapan pada 280 nm boleh digunakan untuk menganggar kepekatan protein, menggunakan hukum Beer. Disebabkan setiap protein mempunyai komposisi asid amino aromatik yang unik, maka pekali pemupusan (extinction coefficient, E 280) atau kedaya serapam molar (molar absorptivity, E M) hendaklah ditentukan untuk setiap protein sekiranya kita hendak menganggarkan kandungan protein. Tatacara 1. 1. Protein terlebih dahulu dilarutkan didalam penimbal atau alkali 2. 2. Daya serapan larutan protein dibaca pada 280 nm terhadap satu pengosong reagen. 3. 3. Kepekatan protein dikira mengikut persamaan: A = abc dimana: A = daya serapan a = kedaya serapan b = tebal sel atau lintasan kuvet c = kepekatan

Aplikasi Kaedah UV 280 nm telah digunakan untuk menentukan kandungan protein didalam susu, dan produk daging. Kaedah ini tidak digunakan dengan meluas didalam sistem makanan. Teknik ini boleh digunakan dengan baik dalam sistem protein yang tulin, ataupun protein yang telah diekstrak didalam alkali, atau reagen yang menyah-aslikan seperti 8 M urea. Walaupun ikatan peptid didalam protein menyerap dengan kuat pada 190 - 120 nm daripada 280 nm, kawasan UV rendah ini sukar diukur. Kelebihan: 1. 1. Cepat dan secara relatifnya sensitif (beberapa kali lebih sensitif dari kaedah biuret) 2. 2. Tiada gangguan dari amonium sulfat dan garam penimbal. 3. 3. Bukan destruktif; sampel boleh digunakan untuk analisis lain selepas penentuan protein; digunakan dengan meluas dalam pengesanan protein selepas keluar dari turus kromatografi. Kelemahan: 1. 1. Asid nukleik juga menyerap pada 280 nm. Nisbah penyerapan 280 nm/260 nm untuk protein tulin dan asid nuklein ialah masing-masing 1.75 dan 0.5. Sesaorang boleh membetulkan penyerapan asid nukleik pada 280 nm sekiranya nisbah penyerapan pada 280 nm/260 nm diketahui. Asid nukleik juga boleh diperbetul menggunakan suatu kaedah berdasarkan perbezaan penyerapan diantara 235 nm dan 280 nm. 2. 2. Kandungan asid amino aromatik didalam berbagai protein adalah berbeza-beza dengan banyaknya. 3. 3. Larutan hendaklah jernih dan tak berwarna. Kekeruhan akibat dari zarahan (particulates) didalam larutan akan meningkatkan daya serapan secara silap. 4. 4. Sistem yang agak tulin diperlukan sekiranya kaedah ini digunakan.

Kaedah Pengikatan Pencelup

Pengikatan Pencelup Anion
Prinsip Sampel yang mengandungi protein dicampurkan dengan pencelup anion secara berlebihan yang diketahui banyaknya didalam larutan berpenimbal. Protein mengikat pencelup tersebut lalu membentuk kompleks yang tak larut. Pencelup larut yang tak terikat diukur selepas

kesaimbangan tindakbalas dan komplek yang tak larut itu diasingkan secara pengemparan atau penurasa.

protein + pencelup berebihan komleks ak laut prtein - pencelup + penceluplarut tak te rikat .......... .......... .......... (1

Pencelup asid sulfonik anion, termasuklah acid orange 12, orange G dan Amido black 10B, mengikat kumpulan kation pada residu asid amino bes (imidazol pada histidin, guanidin pada arginin, dan kumpulan -amino pada lisin) dan kumpulan hujung amino bebas. Pencelup yang tak terikat adalah berkaitan secara songsang dengan kandungan protein sampel. Tatacara: 1. 1. Sampel dikisar halus (saiz 60-mesy atau lebih kecil) dan dimasukkan kedalam larutan pencelup yang berlebihan. 2. 2. Kandungan tadi digoncang dengan kuat, bagi menyaimbangkan tindakbalas pengikatan pencelup dan kemudian dituras atau diempar bagi membuang bahan yang tak larut. 3. 3. Daya serapan larutan pencelup yang tak terikat didalam turasan (filtrate) diukur dan kepekatan kepekatan pencelup dianggarkan dari lengkuk piawai pencelup. 4. 4. Satu lengkuk garis lurus boleg diperolehi dengan memplotkan kepekatan pencelup yang tak terikat terhadap nitrogen jumlah (yang ditentukan mengikut kaedah Kjeldahl) bagi makanan tertentu yang meliputi kandungan protein yang luas julatnya. 5. 5. Kandungan protein dari sampel yang sama jenis proteinnya boleh dianggarkan dari keluk pengkalibrasian atau dari persamaan regresi yang dikira mengikut kaedah gandadua terkecil (least square method). Aplikasi Pengikatan pencelup anion telah digunakan untuk menganggarkan protein didalam susu, tepung gandum, produk soya, dan daging.

Kelebihan 1. 1. Cepat (15 minit atau kurang), murah, dan secara relatifnya tepat untuk menganalisis kandungan protein didalam komoditi makanan. 2. 2. Boleh digunakan untuk menganggarkan perubahan dalam kandungan lisin tersedia ada didalam produk bijirin semasa pemprosesan kerana pencelup tidak akan mengikat lisin yang terubah atau tak tersedia ada. Oleh kerana lisin adalah asid amino penghad didalam produk bijirin, kandungan lisin tersedia ada menggambarkan nilai pemakanan protein didalam produk bijirin. 3. 3. Tiada reagen yang mengkakiskan. 4. 4. Tidak mengukur nitrogen bukan protein 5. 5. Lebih tepat dari kaedah Kjeldahl. Kelemahan: 1. 1. Tidak sensitif; memerlukan kuantiti protein dalam julat mg. 2. 2. Protein berbeza dalam kandungan asid amino bes, justeru berbeza keupayaan mengikat pencelup. Oleh sebab itu, lengkuk pengkalibrasian untuk komoditi makanan tertentu diperlukan. 3. 3. Banyak komponen bukan protein mengikat pencelup (misalnya kanji) dan/atau protein (misalnya kalsium atau fosfat) dan ini menyebabkan ralat didalam keputusan akhir. Masalah dengan kalsium dan ion logam berat boleh diatasi dengan menggunakan reagen yang berpenimbal mengandungi asid oksalik.

Kaedah Bradford
Prinsip Apabila Coomassie Brilliant Blue G-250 mengikat protein, pencelup itu bertukar dari warna kemerahan kepada warna kebiruan, dan penyerapan maksimum pencelup itu beranjak dari 465 nm ke 595 nm. Perubahan penyerapan pada 595 nm adalah berkadaran dengan kepekatan protein didalam sampel.

Tatacara 1. 1. Coomassie Brilliant Blue G-250 dilarutkan didalam 95% etanol dan diasidkan dengan 85% asid fosforik. 2. 2. Sampel yang mengandungi protein (1 - 100 g per ml) dan larutan BSA piawai dicampur dengan reagen Bradford. 3. 3. Daya serapan pada 595 nm dibaca terhadap satu pengosong reagen. 4. 4. Kepekatan protein didalam sampel dianggarkan dari keluk piawai BSA. Aplikasi Kaedah Bradford telah digunakan dengan jayanya untuk menentukan kandungan protein didalam worts dan produk bir dan didalam kentang. Kaedah ini telah diperbaikki untuk mengukur sehingga kuantiti protein dalam julat mikrogram. Disebabkan kepantasan, sensitiviti, dan kurang gangguan berbanding kaedah Lowry, maka kaedah Bradford telah digunakan dengan meluas dalam penulinan protein. Kelebihan: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 1. Cepat; tindakbalas boleh diselesaikan dalam tempoh 2 minit. 2. Boleh ulang (reproducible) 3. Sensitif; beberapa kali lebih sensitif dari kaedah Lowry. 4. Tidak ada gangguan dari kation seperti K+, Na+, dan Mg+2 . 5. Tidak ada gangguan dari amonium sulfat 6. Tidak ada gangguan dari polifenol dan karbohidrat seperti sukros. 7. Mengukur protein atau peptid dengan berat molekul kira-kira sama dengan atau lebih besar dari 4,000 dalton.

Kelemahan: 1. 1. Terganggu oleh kedua-dua detergen bukan berionidan berion, seperti Triton X-100 dan sodium dodesil sulfat. Namun ralat daripada jumlah detergen yang sedikit (0.1%) boleh diperbetul dengan menggunakan kawalan yang betul. 2. 2. Komplek protein-pencelup boleh mengikat kuvet kuarza. Maka juru analisis perlu menggunakan kuvet glas atau plastik. 3. 3. Warna berubah mengikut jenis protein. Protein piawai mestilah dipilih dengan berhati-hati.

Kaedah Ninhidrin
Prinsip Asid amino, amonia, dan kumpulan amino primer didalam suatu protein, apabila dipanaskan didalam penimbal pH 5.5 dengan kehadiran ninhidrin dan hidrindantin, membentuk warna ungu (purple) Ruhemann. Tatacara 1. 1. Campurkan 1 ml larutan sampel dengan 1 ml larutan ninhidrin didalam tabung uji. 2. 2. Panaskan didalam kukus mendidih selama 15 minit. 3. 3. Tambahkan 5 ml etanol atau propanol sebagai pencair (diluent), goncang, dan sejukkan. 4. 4. Bacalah daya serapan pada 570 nm terhadap pengosong air. Aplikasi Kaedah Ninhidrin tidaklah digunakan dengan meluas untuk penentuan kuantiti protein didalam makanan. Namun demikian, ia boleh digunakan untuk menentukan hidrolisis ikatan peptid semasa pemprosesan makanan. Kelebihan: 1. 1. Secara relatifnya lebih cepat dari kaedah Kjeldahl. Kelemahan: 1. 1. Kehadiran sedikit asid amino, peptid, amin primer, dan amonia boleh menyebabkan terlebih anggaran kandungan protein. 2. 2. Kejituan (precision) rendah 3. 3. Warna berubah-ubah mengikut komposisi asid amino yang berbeza-beza. Prolin menyerap maksimum pada 440 nm; asid amino lain pada 570 nm. 4. 4. Keluk pengkalibrasian piawai perlulah disediakan setiap kali penentuan.

Kaedah Kekeruhan (Turbidity)

Prinsip Asid trikloroasitik (3 - 10%, asid sulfosalisilik, dan potasium ferisianid dalam asid asetik pada kepekatan yang rendah boleh digunakan untuk memendakkan protein yang terekstrak untuk membentuk ampaian zarah protein yang keruh. Kekeruhan ini boleh diukur daripada penyususan transmisi radiasi. Penyusutan dalam transmisi radiasi adalah disebabkan oleh penyerakan (scaterring) radiasi oleh zarah protein. Intensiti penyusutan radiasi boleh dikaitkan dengan kepekatan protein didalam larutan.

Tatacara Tatacara umum mengukur protein gandum dengan kaedah asid sulfosalisilik adalah seperti berikut: 1. 1. Tepung gandum diekstrak dengan 0.05N NaOH 2. 2. Protein yang terlarut didalam alkali diasingkan daripada bahan yang tak larut melalui pengemparan. 3. 3. Asid sulfosalisilik dicampurkan kedalam larutan protein 4. 4. Darjah kekeruhan diukur dengan membaca transmitans cahaya pada 540 nm terhadap satu pengosong reagen. 5. 5. Kandungan protein boleh dianggarkan dari lengkuk pengkalibrasian, yang dibuat menggunakan kaedah nitrogen Kjeldahl.

Aplikasi Kaedah kekeruhan telah digunakan untuk mengukur kandungan protein didalam tepung gandum dan jagung. Kelebihan: 1. 1. Cepat; boleh disiapkan dalam tempoh 15 minit 2. 2. Tidak mengukur nitrogen bukan protein selain dari asid nukleik Kelemahan: 1. 1. Protein yang berbeza memendak pada kadar yang berbeza 2. 2. Kekeruhan berbeza mengikut kepekatan reagen asid ynang berlainan 3. 3. Asid nukleik juga termendak oleh reagen asid.
http://pkukmweb.ukm.my/~mamot/STKM1022/AnalProt.htm