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TESTE DE PIROGÊNIO

Escolher 3 coelhos sadios para cada amostra a ser ensaiada. Pesar e colocá-los nos contendores. Deixá-los ambientar por 30 minutos. Decorrido este período, medir a temperatura retal pela introdução de termômetro veterinário numa profundidade de 7,5 cm. Deixar por pelo menos 1 minuto. Manter novamente os animais em repouso durante 30 minutos e repetir a leitura de temperatura. Anotar os pesos, temperaturas basais em fichas próprias. Calcular a média das temperaturas basais, iniciar a administração da amostra pela injeção na veia marginal da orelha do animal. Injetar lentamente o volume. Deixar o animal em repouso e medir a temperatura dos animais após 1 h; 2h e 3 horas após a injeção. Anotar os valores da temperatura, calcular as elevações de temperatura e emitir o resultado da análise da amostra.

Exigências

Peso dos coelhos = 2,0 a 3,5 Kg Temperatura basal = 38,9.ºC a 39,8.ºC Ambientados em laboratório climatizado e controlado.

Aprovado : Se a diferença das temperaturas for inferior a 0,6.ºC em um dos animais, e se a somatória das temperaturas for inferior a 1,4.ºC. Reteste : Se a diferença das temperaturas for superior a 0,6.ºC em um dos animais, e se a somatória das temperaturas for superior a 1,4.ºC. Testar com 5 novos coelhos; Aprovado : Se a diferença das temperaturas dos oito animais for superior a 0,6.ºC em até dois animais, e se a somatória das temperaturas dos oito animais for inferior a 3,7ºC. Reprovado : Não atender as exigências descritas acima.

TESTE DE INOCUIDADE

Este teste tem por objetivo a detecção de elementos tóxicos proveniente do material empregado na elaboração do produto.

1. Material necessário

• Pool de amostra do produto;

• Seringas de 1 e 5 ml; agulhas de 15x5 mm( para via intraperitoneal ou endovenosa); 10x5 mm (subcutânea) e sonda gástrica (via oral), esterilizados;

• Camundongos pesando entre 17 a 23 g ;

• Cobaias de 250 a 350 g ( teste de sensibilidade cutânea, imunoterápicos);

• Balança

3.

Registrar os pesos iniciais;

4. Inocular 0,5 ml do produto (3 vezes a dose terapêutica proporcional por Kg) em 5 camundongos. Para via subcutânea inocular 0,2 ml.

5. Observar os animais por 48 horas após inoculação

Para teste com imunoterápicos

• Inocular 0,2 ml via subcutânea em 5 camundongos

• Inocular 0,5 ml via subcutânea do mesmo produto em 2 cobaias;

• Proceder o teste controle inoculando-se salina;

• Observar os animais por 7 dias e registrar o peso final no 7 0 dia do teste

3.

Interpretação do Teste

O

teste é considerado satisfatório quando:

1. Todos os animais sobrevivem ao período mínimo de 48 horas, ou 7 dias para imunoterápicos;

2. nenhum animal apresentar qualquer resposta inespecífica e/ou inesperada;

3. O peso final dos animais (para imunoterápicos) for igual ou superior ao peso inicial.

Se

o produto em teste não preencher os requisitos acima citados, o teste deverá ser repetido com

o dobro do número de animais.

TESTE DE ESTERILIDADE

1.

Introdução

O

termo Esterilidade é utilizado para designar um produto livre de qualquer microrganismo

viável, excetuando-se os casos de produtos, como certas vacinas (BCG, sarampo, poliomielite e

outra), que possuem microrgansimos vivos, em sua constituição. Neste caso, o teste de esterilidade visa a detecção de microrganismos viáveis estranhos aos constituintes da vacina.

O teste de esterilidade é feito segundo as farmacopéias indicadas para comprovar ausência de

microrganismos, aeróbios e anaeróbios, capazes de se reproduzir em um número definido de

amostras de um lote. A probabilidade de detectar microrganismos viáveis no teste de esterilidade aumenta com o número de organismos presentes numa determinada quantidade da preparação a ser testada e varia de acordo com a espécie de microrganismo.

A amostragem, ao acaso, de um lote não pode detectar, com certeza, níveis muitos baixos de

contaminação que seja uniforme em todo o lote e por conseguinte, o teste de esterilidade por

si só não fornece segurança absoluta sobre a ausência de contaminação microbiana em todas as

amostras do lote. O teste de esterilidade é destinado a revelar a presença de microrganismos nas amostras utilizadas no lote . A interpretação dos resultados é baseada na suposição de que o conteúdo de cada recipiente do lote, se testados, também teriam resultado equivalente. Como é evidente que cada recipiente do lote não pode ser testado, um número suficiente de recipientes deve ser analisado, de modo a fornecer um grau adequado de confiança no resultado do teste. Deve-se ter como avaliação que os resultados obtidos sem controles prévios não podem ser levados em conta.

2.

Amostragem

Quando um teste de esterilidade é realizado em amostras cujo número não representa estatisticamente um dado lote, os resultados obtidos com as mesmas, não podem ser extrapolados com segurança para caracterizar a condição de esterilidade do lote. Isto significa que um número excessivamente pequeno de amostras serviriam apenas para detectar um alto índice de unidades contaminadas. Em vista disso, o número de amostras a serem ensaiadas, deve representar uma porção estatisticamente significativa do lote final. Para cada processo de enchimento (ou envase) de cada lote, deverá ser testado um número de amostras correspondente à fórmula empírica 0,4Ö n , onde n representa o número total de envase do lote. Casos em que o lote apresenta número inferior a 100 frascos envasados, a amostragem deve ser correspondente a 10% do total, não podendo ser inferior a cinco. A tabela I mostra valores de amostragem s serem recolhidos para os teste de esterilidade, para o controle do lote produzido.

Tabela I

Número de amostras necessárias para teste de Esterilidade

Número de frascos envasados no lote final

Quantidade de amostras

n o de frascos

100

5

100-500

10

501- 1.000

13

1.001- 5.000

28

5.001 -10.000

40

10.001- 20.000

56

> 20.000

63

3. Tipos de medicamentos submetidos ao ensaio de esterilidade

• Medicamentos de uso parenteral;

• Oftálmicos;

• Medicamentos empregados nos tratamentos de queimaduras e feridas abertas; Materiais com aplicação em cirurgia, ginecologia e urologia.

4. Descrição de uma sala asséptica

A primeira exigência para execução de trabalhos assépticos é uma sala propriamente estruturada

e designada para funcionar corretamente para tal atividade. Isto envolve condições adequadas de

paredes e pisos que possam ser de fácil limpeza e desinfetados, pré-camaras para troca de roupas da equipe, filtros biológicos de ar e pressão positiva, havendo ainda diferença de pressão entre a câmara e a antecâmara, esta devendo possuir pressão inferior à primeira. O fluxo de ar deve ser

o mais direcionado possível de modo a eliminar a turbulência na sala. A eficiência do processo

é elevada através do uso de cabines de fluxo laminar. Para testes de esterilidade pelo método de

filtração por membrana é recomendado uso de cabine de fluxo laminar vertical e para o método de inoculação direta, o horizontal. o uso de lâmpadas U.V. nas salas assépticas, embora seja um ponto bastante discutível com relação à eficácia nos processos de descontaminação ambiental, constituem material de apoio para a redução nos níveis de contaminação, e principalmente são

de extrema importância para o processo de descontaminação externa dos materiais que serão introduzidos nas salas assépticas, através de túneis de lâmpadas U.V.

O uso de lâmpadas U.V. deve ser controlado através de registros periódicos, quer seja de radiação

emitida ou do n o de horas de utilização. É importante também manter as lâmpadas sempre limpas,

pois a deposição de películas de poeira irá funcionar como barreiras para a radiação. A limpeza deve ser feita com gaze embebida em álcool, suavemente e com freqüência semanal.

A temperatura e umidade da sala asséptica devem ser devidamente controladas, pois o excesso de

umidade e altas temperaturas facilitam a proliferação de microrganismos, enquanto que umidade e temperaturas baixas são prejudiciais aos operadores que trabalharão nestas áreas. Recomenda-se manter a sala em torno de 20 o C e 53% de umidade relativa.

5. Constituição dos meios de cultura

• Caldo de caseína e soja : proteínas e carbohidratos

• Caldo de tioglicolato: proteinas, carbohidratos, ácido tioglicólico, cisteína, resazurina e ágar em baixa concentração. Os agentes redutores (ácido tioglicólico e cisteína) tendem a diminuir a concentração de oxigênio.

O ágar também contribui para diminuição da tensão de oxigênio, propiciando a anaerobiose. A

parte superior em contato com o ar é oxidado apresentando coloração avermelhada e a parte inferior é reduzida, apresentando coloração amarela.

6. Controles Prévios ao teste de Esterilidade

6.1. Meios de Cultura Os meios de cultura utilizados nas provas de esterilidade bacteriana e fúngica deverão ser testados preliminarmente quanto à sua esterilidade e viabilidade.

A. Controle negativo: Para satisfazer os critérios de esterilidade, utiliza-se o meio líquido de tioglicolato, incubado na faixa de temperatura de 30 a 37 o C por 7 dias, para evidenciar o crescimento de bactérias aeróbias e anaeróbias, e o meio de caseina e soja, incubado na faixa de temperatura de 20 a 27 o C para evidenciar o crescimento de fungos. Pode-se utilizar qualquer outro meio com propriedades nutritivas equivalentes. Não deve haver crescimento microbiano.

B. Controle Positivo. O teste de viabilidade é avaliado utilizando-se um pequeno inóculo ( menos de 100 germes) de microrganismos apropriados. O meio deverá ser incubado nas temperaturas utilizadas na realização do teste propriamente dito (Tabela II).

Tabela II

Microrganismos usados nos testes de fertilidade dos meios para teste de esterilidade

Meio de

Metabolismo

Cultura

Respiratório

aeróbio

Microrganismo

B. subtilis (

6633) Tioglicolato

ATCC

B. vulgatus

(ATCC

8482) Tioglicolato

C. albicans (

Caseina e

ATCC10231)

soja

A. niger

Caseina e

soja

anaeróbio

aeróbio

aeróbio

No caso destes testes resultarem positivos, o meio é viável para o teste e pode ser utilizado para o teste de rotina. 6.2. Material de Ensaio Todo material desconhecido deverá ser feito exame prévio quanto à ausência de atividade bacteriostática ou fungistática, fazendo-se a comparação:

• Meio sem inóculo + material de análise

• Meio com inóculo + material de análise

Caso não haja crescimento, elege-se um dos seguintes métodos:

a) Dilui-se o material de análise no meio de cultura até uma concentração inativa do inibidor;

b) Adiciona-se um inativante apropriado (Tabela III);

c) Utiliza-se o processo de filtração.

Tabela III

Substâncias Inibidoras

Penicilina

Inativantes

de

hidroxilamônio cisteína, cloreto de hidroxilamônio,

Penicilinase,

cloreto

Estreptomicina

penicilinase Compostos de mercúrio compostos

com

-SH

(

cisteína,

e chumbo

glutation, dimercaptol)

Sulfonamidas

PABA

Compostos

4 ario

Compostos de Arsênio

de

amônio

lecitina, polisorbato 80

cisteína e tioglicolato

TESTE DE ESTERILIDADE – Prática

1.

Introdução

O

teste de esterilidade tem como finalidade comprovar a ausência de microrganismo capazes de

se

reproduzirem em um número definido de amostras de um determinado lote.

2.

Técnicas Empregadas

3.

Método Indireto; este método consiste na filtração de uma amostra líquida através de uma membrana filtrante e esta é inoculada no meio de cultura apropriado.

4.

Método Direto: Consiste na inoculação direta da amostra diretamente no meio de cultura

apropriado.

3.

Material Necessário

4.

Caldo de tioglicolato: preparar segundo o fabricante

5.

Caldo caseina e soja; preparar segundo o fabricante.

6.

Solução peptonada a 0,15 (para lavagem): Dissolver quantidade de peptona

correspondente a 0,1% em água destilada; distribuir em erlenmeyer ou frasco de 100 ml e esterilizar em autoclave a 121.ºC por 20 minutos. Esfriar e incubar em estufa a 35.ºC por 48 horas para certificar que o material está estéril.

7.

Solução de cloreto de benzalconeo: Dissolver quantidade de cloreto de benzalconeo equivalente a 0,4g com 5 ml de etanol 96.º G.L. Completar com água destilada para 100

ml.

8.

Aparelhagem de filtração: lavar cuidadosamente todos os componentes da aparelhagem, enxaguar em água corrente e secar ao ar ou estufa a 40.ºC. Montar o aparelho de filtração colocando uma membrana de porosidade de 0,22 mm. Embrulhar o conjunto em folha de papel Kraft formolizado e esterilizar em autoclave por 30 minutos a 121.ºC.

9.

Acessórios; os acessórios como pinças, agulhas hipodérmicas e seringas devem ser embrulhadas em papel alumínio individualmente e colocados em um único envelope de papel Kraft. Esterilizar em autoclave.

10.

Avental, gorros, luvas, máscaras e gaze: As luvas devem ser limpas, secas e polvilhadas com talco; o avental, a gaze, máscaras, luvas e gorrosdevem ser embrulhados em envelopes de papel kraft, e esterilizar em autoclave.

4.

Preparo da Sala Asséptica

Deve-se proceder a desinfeção da sala com solução de cloreto de benzalconeo a 0,4% (piso,parede) no mínimo 2 horas antes do teste. Limpar o fluxo laminar e a bancada com solução

anti-séptica diferente do cloreto de benzalconeo.

5.

Preparo das Amostras

6.

Ampolas e Frasco-Ampolas: manter imersos em solução de cloreto de benzalconeo a 0,4%, 30 minutos antes do início do teste.

7.

Amostras a granel: Na sala asséptica, sob proteção do fluxo laminar, coletar as amostras em frascos estéreis e mantê-los fechados até o momento do teste.

6.

Preparo do Material para Teste

Colocar todo o material proveniente da autoclave, (já esterilizado), dentro da capela do fluxo laminar e dispor de forma adequada para a execução do teste.

7. Procedimento

9.

Montagem do aparelho de filtração: Conectar a mangueira da bomba à vácuo, devidamente desinfectada, ao copo de filtração;

10. Filtração das Amostras

Ampolas: com auxílio de uma gase estéril, quebrar as ampolas e retirar o líquido com o auxílio de uma seringa e verter no copo de filtração. Frasco-Ampola: retirar a tampa com auxílio de um alicate e colocar a amostra em erlenmeyer contendo água peptonada; dissolver e verter no copo de filtração. No caso de amostras líquidas ou preparações extemporâneas não há necessidade de retirar as tampas. Retirar a amostragem com auxílio de uma seringa com agulha estéril e perfurar a tampa de borracha. Para amostras extemporâneas, injetar água destilada estéril ou diluente adequado, dissolver e retirar a amostra com seringa. Matéri-prima: colocar uma quantidade representativa da amostra no erlenmeyer contendo água peptonada, dissolver bem e verter no copo de filtração. Reservar sempre um copo de filtração para o controle negativo, realizando a filtração de água peptonada estéril. Todos os copos de filtração contendo a membrana filtrante (durante a execução do teste) devem ser lavados com água peptonada. Retirar, assépticamente, a membrana com auxílio de uma pinça estéril. Cortar a membrana e inocula-la em caldo de tioglicolato (pesquisa de bactérias) e caldo caseína e soja (pesquisa de fungos). Identificar os tubos, colocando nome, lote e data de execução do teste. Incubar em estufa.

2. Método por Inoculação Direta em Meio de Cultura

3. Mostras insolúveis ou líquidos: Se a amostra é solúvel (pó), dissolver previamente em solução peptonada estéril. Se for líquida, com auxílio de seringa e agulha estéril, transferir a amostra diretamente no tubo contendo meio de cultura, nunca excedendo 15 ml por tubo.

4. Amostras Insolúveis: Sob proteção de fluxo laminar, retirar cuidadosamente uma amostragem média e transferir para os tubos com meio de cultura.

Na preparação dos meios de cultura para substâncias insolúveis, incorporar 0,25% de polisorbato 80 antes da autoclavação. No caso de amostras com inibidores, adicionar agente inativante adequado . Ex: Penicilina - penicilinase. Após 7 dias de incubação ou no caso de dúvidas, realizar sub-cultivo em 10 tubos, inoculando-se 1,0 ml do tubo duvidoso e incubar.

8. Incubação Leitura e Interpretação dos Resultados

Incubar os tubos contendo caldo de tioglicolato em estufa a 35.ºC e os tubos contendo caldo

caseína e soja em estufa a 25.ºC. Observar diariamente os tubos.

APROVADO: Decorrido 14 dias de observação, não houve formação de filamentos, turvação ou crescimento microbiano.

RETESTE: No decorrer de 14 dias houve crescimento ou turvação, realiza-se o teste com o dobro do número de amostras do teste original. Realiza-se identificação pelo método de Gram. Após reteste, se houver nova contaminação realiza-se nova coloração de Gram e se o microganismo

identificado for diferente do teste original, realiza-se um novo reteste. Caso o microrganismo identificado no primeiro reteste seja o mesmo do teste original, a amostra é considerada reprovada. No segundo reteste se a amostra não apresentar turvação, ela é considerada aprovada.

REPROVADO: Após sucessivos retestes a amostra apresentou turação ou crescimento.

CONTAGEM MICROBIANA

(ANÁLISE QUANTITATIVA E QUALITATIVA)

INTRODUÇÃO:

Este método destina-se a indicar o nível de contaminação microbiana (viáveis) existentes nas áreas produtivas, laboratório de controle biológico, no pessoal envolvido diretamente com o processo produtivo, matérias-primas, produtos acabados, águas de diversas fontes, assim como pesquisa e identificação de microrganismos existentes.

MATERIAL NECESSÁRIO:

1. Meio de Cultura:

• Ágar Caseína e soja (TSA) ou PCA ( Plate Count Agar) - preparar segundo o fabricante.

• Ágar Sabouraud: prepara segundo o fabricante.

Preparar para cada placa de Petri de 100x20mm de dimensões, o equivalente a 15 ml de meio, ou 35 ml para placas de 200x20mm. Esterilizar os meios em autoclave a 121 o .C por 15 minutos.

2.

Diluente:

Água peptonada a 0,1 % : Pesar 0,09g de peptona, em erlenmeyer ou balão de fundo chato, e diluir em 90 ml de água destilada.

Água peptonada a 0,1% com agente neutralizante para parabenos: Preparar a água peptonada conforme descrito acima e adicionar 0,7 g de lecitina e 8g de Tween 80.

Tampão fosfato pH=7,4 : Dissolver 0,5g de hidrogênio fosfato dipotássio com 0,302g de dihidrogênio fosfato de potássio em quantidade suficiente para 1000 ml.

3.

Vidraria e Acessórios:

Placas de Petri estéril ;

Erlenmeyer ou balão de fundo chato;

Pipetas estéreis;

PROCEDIMENTO:

• Limpar o fluxo laminar com solução de cloreto de benzalcôneo a 0,4%;

• Limpar todos os materiais com álcool 70% e colocar dentro da capela de fluxo laminar.

• Caso as amostras contenham conservantes utilizar erlenmeyer contendo água peptonada e neutralizante. Realizar assepsia externa dos frascos do mesmo lote e realizar um “pool ” da amostra em frasco estéril.

Amostras Líqudas Pipetar um volume de 10,0 ml do pool da amostra e diluir em erlenmeyer contendo 90 ml de água peptonada. Homogeneizar, e pipetar 3 ml da amostra diluída, sendo que 1ml será distribuído em um tubo contendo 9,0 ml de água peptonada 0,1%, os outros 2 ml restantes serão distribuídos em duas placas de Petri, onde cada placa receberá apenas 1 ml. Diluição 10 -1 Realizar diluição subsequente para 10 -2 e 10 -3 .

Amostras Sólidas Pesar em torno de 10,0 g da amostra e dissolver em 90 ml de água peptonada 0,15 e seguir da mesma forma para amostras líquidas. No caso de comprimidos ou drágeas, deve-se pulverizar, assépticamente, os comprimidos utilizando gral e pistilo estéril. Seguir o mesmo procedimento das amostras líquidas.

INCUBAÇÃO E RESULTADO Contagem Microbiana:

• As placas contendo TSA + amostra devem ser incubadas em estufa a 35 o .C durante 48 horas;

• As placas contendo SAB = amostra devem ser incubadas em estufa a 25 o .C durante 120 horas.

Contar as colônias formadas, anotar o número e multiplicar pela diluição realizada (vide exemplo abaixo). Calcular a média de colônias por placas e reportar o resultado final

Exemplo:

Diluição = 10 -1 Diluição = 10 -2 Diluição = 10 -3

Número de colônias formadas (UFC) = 290 Número de colônias formadas (UFC) = 30 Número de colônias formadas (UFC) = 1

Resultado: (290 x 10 1 ) + (30 x 10 2 ) = 2950

2

Total de UFC/ml ou g de produto = 2950

Pesquisa de Microrganismos

Caldo Lactosado e TSB: incubar os erlenmeyers durante 48 horas e prosseguir à pesquisa em meios específicos para identificação de cada microrganismo segundo metabolismo de cada um.

LIMITES ACEITÁVEIS DE CONTAGEM MICROBIANA

Material

Limites Microbianos (UFC / ml ou g )

Bactérias Fungos Pesquisa (ausência)

< 1000

< 100

E. coli; Salmonella;, S.aureus; P. aeruginosa; C. albicans; A. niger; Clostridium

Matéria-Prima vegetal e animal Produto Uso Tópico - Sólidos Produto Uso Tópico -

< S.aureus; Gram negativos; Enterobacteriacea

1000

< 100

< S.aureus; Gram negativos; Enterobacteriacea

500

< 50

líquidos Uso Oral - Sólidos

< 1000

<100

E. coli; Salmonella; Enterobacteriacea

Uso Oral - Líquidos < 500

< 50

E. coli; Salmonella; Enterobacteriacea

Oftálmicos

< 100

< 10

S.aureus; Paeruginosa; A. niger

Produtos para Bebês

<100

< 10

S.aureus; P. aeruginosa;Enterobacteriacea

Supositórios

< 1000

< 100

E. coli; Salmonella ; S.aureus

Cremes vaginais

< 1000

< 100

E. coli; C.albicans

Água potável

< 100

<10

E. coli; Salmonella

TÉCNICA DE CONTAGEM EM PLACAS - “POUR PLATE”

É um procedimento para estimar o número de bactérias viáveis em placas contendo meio de cultura sólido. As colônias podem surgir em pares, cadeias ou células simples, sendo que todas são denominadas como Unidades Formadoras de Colônias ( UFC).

1. Materiais Necessários

1.1. Vidrarias

• Pipetas graduadas de 10,0 ml e 5,0 ml e 1,0 ml: selecionar a quantidade necessária para o volume de análise, colocar algodão em todas as pipetas (na extremidade oposta ao bico da pipeta) e acondicionar em papel Kraft;

• Placas de Petri 100 x 20 mm de vidro - Acondicionar as placas individualmente com papel Kraft. Preparar um número suficiente para o volume de amostras a serem analisadas. Todos as vidrarias devem ser esterilizadas em autoclave por 15 minutos a 121 o C.

1.2. Meios de Cultura e Diluentes

Caldo de peptona a 0,1 % (Diluente): Pesar 0,1 g de peptona desidratada e dissolver em 100 ml de água recém destilada e dispor 9,0 ml em tubos. Fechar com tampão de algodão e autoclavar por 15 minutos a 121 o C.

Agar Caseina e soja (TSA ou Agar Casoy): Preparar (segundo indicação do fabricante) quantidade de meio de cultura suficiente para o volume de amostras a serem analisadas. Esterilizar em autoclave a 121 o C por 15 minutos

Ágar Sabouraud: Preparar (segundo indicação do fabricante) quantidade de meio de cultura suficiente para o volume de amostras a serem analisadas. Esterilizar em autoclave a 121 o C por 15 minutos.

2. Procedimento

2.1. Procedimento de Análise para Contagem de Bactérias Viáveis ( Figura 1)

Identificar em cada placa de Petri, o nome da amostra, lote, data, meio de cultura e temperatura de incubação. Preparar as placas em duplicata para cada diluição. Realizar assépticamente as

diluições de 10 -1 , 10 -2 e 10 -3 .

- Matéria-Prima: Pesar 10,0g da amostra sólida finamente pulverizada e dissolver em erlenmeyer

contendo 90 ml de água peptonada a 0,1%.

- Produto: Utilizando-se pipeta ou espátula estéril, dispor uma quantidade de 10,0 ml ou g de amostra em um erlenmeyer contendo 90 ml de caldo Letheen, homogenizar e deixar em repouso por 15 minutos para que possa ocorrer a neutralização do agente conservante. Assépticamente, pipetar 2,0 ml de amostra e dispor 1,0 ml em 2 placas de petri estéreis identificadas como diluição de 10 -1 . Pipetar 1,0 ml do erlenmeyer com a amostra para um tubo contendo 9 ml de água peptonada.

Homogenizar e dispor 1,0 ml da amostra nas placas de petri identificadas como diluição 10 1,0 ml para um tubo de ensaio contendo 9,0 ml de água peptonada 0,1%.

Homogenizar a diluição do tubo de ensaio e transferir 1,0 ml para as placas identificadas como

diluição 10 -3 .

Utilizando o diluente como controle negativo, pipetar 2,0 ml do diluente e dispor 1,0 ml em 2 placas de petri estéreis. Resfriar o meio de cultura de Caseina e soja (TSA ou Ágar Casoy) esterilizado à temperatura entre 44 a 48 o C e verter sobre as placas num volume aproximado de 12 a 15 ml. Homogenizar cuidadosamente a amostra e o meio de cultura por rotação em forma 8. Deixar as placas em repouso durante 10 a 15 minutos e inverte-las após completa solidificação do meio de cultura. Incubar em estufa.

, e

-2

2.2. Procedimento de Análise para Contagem de Bolores e Leveduras:

Proceder segundo descrita acima, conforme figura 1. Ass&eacute;pticamente, pipetar 2,0 ml de amostra dissolvida e dispor 1,0 ml em 2 placas de petri estéreis identificadas como diluição de 10 -1 . Resfriar o meio de cultura Sabouraud esterilizado à temperatura entre 44 a 48 o C e verter sobre as placas num volume aproximado de 12 a 15 ml. Homogenizar cuidadosamente a amostra e o meio de cultura por rotação em forma 8. Deixar as placas em repouso por 10 a 15 minutos e inverte-las após completa solidificação do meio de cultura. Incubar em estufa. Checar esterilidade do diluente e meio de cultura pipetando-se 2,0 ml do diluente em 2 placas de petri estéreis. Recobrir as placas com meio de TSA ou Sabouraud. Observação: Caso haja suspeita de alta contagem microbiana na amostra, realizar diluições maiores.

3.

Condições de Incubação

Para contagem total de bactérias incubar as placas contendo as amostras e meio de cultura à temperatura de 35-37 o C, durante um período de 24 a 48 horas. Para contagem total de fungos (bolores e leveduras) incubar as placas contendo as amostras com Sabouraud à temperatura de 22-25 o C, durante um período de 120 horas ou 5 dias.

4. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Contar o número de colônias formadas nas placas, multiplicar pela diluição realizada e calcular

a média de colônias por ml de amostra. Reportar na ficha de análise a média da contagem

total. Contar somente as placas que tiverem número de colônias entre 30 a 300 colônias. Caso a contagem dê menor que 30 reportar o valor encontrado.

Análise Microbiológica de Água

Referência Bibliográfica:

U.S. Pharmacopoeia XXIII Farmacopéia Brasileira 4 a . Edição Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 17 ed. , 1989.

1. AMOSTRAGEM

1.1. Frasco de Coleta

Os frascos de coleta para análise microbiológica da água devem ser de vidro ou Nalgene Ò e capacidade mínima de 500 ml. Lavar cuidadosamente, sendo o último enxague feito com água destilada. Esterilizar o frasco de vidro por calor seco a 170 o C por 60 minutos (ou 105 o C por no mínimo 4 horas), ou por calor úmido em autoclave a 121 o C por 15 minutos o frasco de vidro ou Nalgene Ò .

1.2. Remoção do Cloro ativo:

Para amostras cloradas adicionar quantidade suficiente de tiosulfato de sódio (Na 2 S 2 O 3 ) para obter uma concentração final de 100 mg/L na amostra, ou seja, adicionar 0,1 ml de tiossulfato de sódio a 10% para cada 100 ml de amostra.

1.3. Procedimento de Coleta de Amostra:

-Antes de iniciar o trabalho, limpar as superfícies externas da torneira com solução antisséptica

(álcool 70 % ou Hipoclorito de sódio 0,1%); -Abrir a torneira e deixar escorrer durante 2-3 minutos ou em torno de 500 ml de água; - Reduzir o fluxo de saida de água, abrir o frasco de coleta somente no momento em que for colher a amostra;

-Coletar a amostra de água (em torno de 300 ml) em frasco de 500 ml e fechar imediatamente com

o lacre de alumínio ou tampa;

-Anotar o ponto, data e horário de coleta, volume amostrado, nome do amostrador e levar ao laboratório para análise;

Observação: A amostra deve ser submetida à análise dentro de um período de 8 horas após a coleta. Caso não seja possível, armazenar a amostra em geladeira a 10 o C. Não exceder o período máximo de 24 horas para a condução da análise.

2. PROCEDIMENTO GERAL DE ANÁLISE -Abrir uma ficha de análise preenchendo os dados da amostra a ser analisada (assegurar que a ficha de análise seja preenchida em duplicata utilizando folha de carbono); -Limpar a bancada ou a capela de Fluxo laminar com solução antiséptica onde será executada o ensaio;

- Realizar a assepsia externa do frasco contendo a amostra e de todo material não estéril que será utilizado para análise; -Executar as análises assépticamente, sob a proteção de chama (Bico de Bunsen) ou dentro da capela de Fluxo laminar;

2.1. Técnicas analíticas:

A. Método de Tubos Múltiplos ou Número Mais Provável (NMP) Consiste na inoculação de amostras em 3 séries de diluições em triplicata contendo meio de cultura líquido estéril, onde o resultado é dado pela turvação ou formação de gás nos tubos devido ao crescimento microbiano.

A.1. Materiais Necessários:

A.1.1. Vidraria

• Pipetas graduadas de 10,0 ml e 5,0 ml e 1,0 ml: selecionar a quantidade necessária para o volume de análise, colocar algodão em todas as pipetas (na extremidade oposta ao bico da pipeta) e acondicionar em papel Kraft; Esterilizar em autoclave por 15 minutos a 121 o C.

• Preparar o caldo lauriltriptose segundo fabricante e distribuir o meio de cultura em tubos da seguinte forma:

1 a . série: 18 ml de caldo lauriltriptose em dobro da concentração normal indicado pelo

fabricante e dispor 5 ml em 3 tubos de 150 x 20 mm.

2 a . série: 40 ml de caldo lauriltriptose na concentração indicada pelo fabricante e dispor 9 ml

em 3 tubos de 150 x 20 mm. 3a. série: 40 ml de caldo lauriltriptose na concentração indicada pelo fabricante e dispor 9,9 ml em 3 tubos de 150 x 20 mm

-

O volume restante de meio de cultura da 2 a e 3 a série deverão ser distribuidos em tubos de 150

x

20 mm para realização do controle negativo

(1 ml);

-

Em todos os tubos introduzir tubos invertidos de Durhan;

-

Fechar com tampão de algodão e autoclavar por 15 minutos a 121 o C.

Observação: Caso não tenha disponível todos os componentes do meio de cultura Lauriltriptose, substituir pelo Caldo Lactosado, preparado segundo descrição a seguir:

A.2. Procedimento A.2.1. Procedimento de Análise para Contagem de Bactérias Viáveis:

- Com pipeta estéril, dispor um volume de 10,0 ml de amostra em cada tubo da 1 a série de tubos contendo caldo de lauriltriptose, obtendo-se assim a diluição de 10 1 ;

- Com pipeta de 5 ml, dispor 1,0 ml de amostra em cada tubo da 2 a série, obtendo-se assim a

diluição 10 0 ;

- Com pipeta estéril de 1,0 ml , dispor um volume de 0,1 ml em cada tubo da 3a série, obtendo-se assim a diluição de 10 -1 ;

- Homogenizar todos o tubos e incubar em estufa ou banho-maria.

A.2.2 Procedimento de Análise para Contagem de Bolores e Leveduras:

- Identificar em cada placa o nome da amostra, lote, data, meio de cultura e temperatura de incubação. Preparar as placas em duplicata para cada diluição utilizada; - Assépticamente, pipetar 2,0 ml de amostra e dispor 1,0 ml em 2 placas de petri estéreis identificadas como diluição de 10 0 ;

- Resfriar, o meio de cultura Sabouraud esterilizado, à temperatura entre 44 a 48 o C e verter sobre as placas num volume aproximado de 12 a 15 ml;

- Homogenizar cuidadosamente a amostra e o meio de cultura por rotação em forma 8, evitando a

formação de bolhas;

- Deixar as placas em repouso por 10 a 15 minutos e inverte-las após completa solidificação do

meio de cultura;

- Incubar em estufa;

- Checar esterilidade do diluente e meio de cultura pipetando-se 2,0 ml do diluente em 2 placas de

petri estéreis. Recobrir as placas com meio de TSA ou Sabouraud; Observação: Caso haja suspeita de alta contagem microbiana na amostra, realizar diluições maiores.

3. CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO

- Para contagem total de bactérias incubar as placas ou os tubos contendo as amostras e meio de cultura à temperatura de 35-37 o C, durante um período de 24 a 48 horas;

- Para contagem total de fungos (bolores e leveduras) incubar as placas contendo as amostras com Sabouraud à temperatura de 22-25 o C, durante um período de 120 horas ou 5 dias;

4. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

4.1. Método de NMP Decorrido o período de incubação de 24h, verificar os tubos turvos ou com filamentos e anotar o número de tubos positivos na ficha de análise, comparar na tabela de NMP e calcular o número

total de colônias, segundo a fórmula a seguir:

NMP tabelado x diluição do tubo médio

100

Se houver formação de gás ou turbidez nos tubos dentro de 24h, deve-se proceder imediatamente à pesquisa para coliformes totais e fecais. Proceder o mesmo teste caso ocorra turbidez, formação

de gás ou ácido após 48 h de incubação.

O grupo coliforme inclui todas as bactérias aeróbias, anaeróbias facultativas, gram-negativas,

formas não esporuladas, com formato circular que fermentam lactose com produção de gás e formação de ácido após incubação por 48 h à 35 o C.

Teste Presuntivo: O teste de tubos múltiplos utilizado em rotina pode ser considerado como teste presuntivo.

Procedimento:

- Pipetar 10,0 ml de amostra em 5 tubos contendo lauriltriptose e tubos invertidos de Durhan,

incubar por 48 h a 35 ± 0,5 o C;

- Decorrido este período, caso haja produção de gás ou formação de ácido, considera-se reação presuntiva positiva para coliformes. Deve-se proceder ao teste confirmatório;

Teste Confirmatório:

Usar

confirmatória.

tubos

de

fermentação

Procedimento

contendo

caldo

de

lactose-bile-verde

brilhante

para

a

fase

- Introduzir os tubos invertidos de Durhan e quantidade de meio BGLBB suficiente para cobrí-los. Esterilizar em autoclave a 121 o C por 15 minutos;

- Submeter todos os tubos (tubos positivos) do teste presuntivo que mostraram formação de gás

ou ácido ao teste confirmatório;

- Agitar levemente o tubo positivo para ressuspender os organismos. Com uma alça de Coli estéril,

transferir uma alçada da cultura para o meio de fermentação contendo BGLBB;

- Repetir este procedimento com todos os tubos positivos;

- Incubar os tubos de fermentação BGLBB por 48 ± 3 h a 35 ± 0,5 o C;

- A formação de gás em qualquer tubo de fermentação dentro de 48 horas consiste em resultado positivo para o teste confirmatório;

6. LIMITES MICROBIANOS:

• Água

Destilada:

contagem

bacteriana

menor

que

fungos.Ausência de Coliformes totais e fecais

1,5

CFU/ml

e

ausência

total

Água Potável : contagem bacteriana menor que 2,2 CFU de coliformes / ml, e contagem de fungos menor que 10 CFU/ml. Aprovado: As amostras que apresentarem contagem inferior aos limites acima serão aprovadas e a ficha de análise orignal deve ser encaminhada ao Controle fisico-químico, a ficha carbonada deve ser arquivada Reprovado: As amostras que apresentarem contagem superior aos limites acima devem ser realizada reanálise. reanálise Caso a contagem de bactérias ou de fungos seja superior aos limites permitidos, realizar uma nova amostragem. Verificar todos os controles ambientais e os controles negativos.

Tabela de Contagem do Método de Tubos Múltiplos (NMP) 95% de confiação

Número de Combinações observadas de tubos apresentando turvaçãoem cada série. Número de mg ( ou mL) de espécies por tubo

100 mg ou 100 mL

10 mg ou10 mL

1mg ou 1 mL

Número mais provável de microrganismos

por grama ou mL

0

0

0

<3

0

0

1

3

0

1

0

3

1

0

0

4

1

0

1

7

1

1

0

7

1

1

1

11

1

2

0

11

2

0

0

9

2

0

1

14

2

1

0

15

2

1

1

20

2

2

0

21

2

2

1

28

3

0

0

23

3

0

1

39

3

0

2

64

3

1

0

43

3

1

1

75

3

1

2

120

3

2

0

93

3

2

1

150

3

2

2

210

3

3

0

240

3

3

1

460

3

3

2

1.100

3

3

3

> 2.400

PRODUTO: SOLUÇÃO ORAL - GOTAS

1.

AMOSTRAGEM

Recolher durante a fase de envase 10 frascos dos produtos a serem analisados. Caso haja histórico

de contaminação, realizar amostragens nas etapas de início, meio e fim de envase, recolhendo 10

frascos em cada etapa.

2. PROCEDIMENTO GERAL

Abrir uma ficha de análise, registrar o número de análise segundo a sequência de codificação e preencher os dados da amostra a ser analisada (assegurar que a ficha de análise seja preenchida em duplicata utilizando folha de carbono).

3. PROCEDIMENTO DE ANÁLISE

Seguir técnica descrita no Procedimento Geral de Contagem Microbiana para amostras líquidas.

4.

PESQUISA DE COLIFORMES TOTAIS E FECAIS

O

grupo coliforme inclui todas as bactérias aeróbias, anaeróbias facultativas, gram-negativas,

formas não esporuladas, com formato circular que fermentam lactose com produção de gás e

formação de ácido após incubação por 48 h à 35 o C.

Teste Presuntivo: O teste de tubos múltiplos utilizado em rotina pode ser considerado como teste presuntivo.

Procedimento:

Pipetar 10,0 ml de amostra em 5 tubos contendo lauriltriptose e tubos invertidos de Durhan, incubar por 48 h a 35 ± 0,5 o C. Decorrido este período, caso haja produção de gás ou formação de ácido, considera-se reação presuntiva positiva para coliformes. Deve-se proceder ao teste confirmatório.

Teste Confirmatório:

Usar

confirmatória.

tubos

de

fermentação

contendo

caldo

de

lactose-bile-verde

brilhante

para

a

fase

Composição do caldo lactose-bile-verde brilhante (BGLBB):

• Peptona

10,0

g

• Lactose

10,0

g

• Oxgall

20,0

g

• Verde Brilhante

0,0133

g

• Água destilada

1

L

pH final de 7,2 ± 0,2 após esterilização.

Procedimento Introduzir os tubos invertidos de Durhan e quantidade de meio BGLBB suficiente para cobrí-los. Esterilizar em autoclave a 121 o C por 15 minutos. Submeter todos os tubos (tubos positivos) do teste presuntivo que mostraram formação de gás ou ácido ao teste confirmatório.

Agitar levemente o tubo positivo para ressuspender os organismos. Com uma alça de Coli estéril, transferir uma alçada da cultura para o meio de fermentação contendo BGLBB. Repetir este procedimento com todos os tubos positivos. Incubar os tubos de fermentação BGLBB por 48 ± 3 h a 35 ± 0,5 o C. A formação de gás em qualquer tubo de fermentação dentro de 48 horas consiste em resultado positivo para o teste confirmatório.

5. LIMITES MICROBIANOS

Solução oral : contagem bacteriana menor que 100 CFU/ml e 10 CFU/ml de fungos. Ausência de Coliformes totais e fecais. Aprovado: As amostras que apresentarem contagem inferior aos limites acima serão aprovadas

e a ficha de análise orignal deve ser encaminhada ao Controle fisico-químico, a ficha carbonada

deve ser arquivada Reprovado: As amostras que apresentarem contagem superior aos limites acima devem ser realizada reanálise. reanálise Caso a contagem de bactérias ou de fungos seja superior aos limites permitidos, realizar uma nova amostragem com o dobro de frascos da amostragem inicial. Verificar todos os controles ambientais e os controles negativos.

CONTROLE DE PROCESSO ESTERILIZANTE

1. Filtração : Remoção e separação de partículas de uma solução ou gás que dependem da natureza dos materiais.

• Amostragem antes e depois dos processos (Teste de Caldo ou média fill) para verificar todo o percurso do líquido - máximo 0,1 %. Para 3000 unidades = 14 dias

• Ponto de Bolha = Quanto > pressão < porosidade P= k.4v.cós.j

j=ângulo líquido/parede do capilar

k= fator de correção

2 litros de água destilada

N 2 = 3,5 kg/cm 2 = 5 min

v= tensão superficial

d = diâmetro

D

2.

Autoclavação: Alteração da estrutura genética, inativação de enzima, coagulação de proteína.

Controle de pressão

Indicadores Químicos: induz alteração de cor, entretanto não garante por quanto tempo se mantém a exposição.

Indicadores Biológicos: cepa B.stearothermophillus.

3.

Esterilização Química

Gasosa por Óxido de Etileno (pode deixar resíduos), extremamente explosivo, é misturado à um gás inerte (10-12 %) com gás freon ou dióxido de carbono.

Indicadores Físicos { Temperatura 55 o C ( t=0 ) Umidade Relativa = 60-70 %}

Indicadores Químicos: substâncias submetidas ao efeito alquilante muda de cor.

Indicador Biológico: B. subtilis

4.

Radiação { g , cobalto, elétron acelerado): Absorve energia radiante, altera a molécula do DNA. Dose de radiação 2,5 Mrad

Indicadores Químicos

Indicadores Biológicos : Bacillus pumilus

Esporos

Condição

Tempo

B.

stearothermophilus

Vapor saturado, 121 o .C

15 minutos

 

121 o .C

60 minutos

B.

subtilis

 

171

g - via úmida

o .C

1

0,2 Mrad

minuto

B.

pumilus

Via seca

0,15 Mrad

 

vapor saturado 112 o .C

3,5 minutos

C.

sporogens

vapor saturado 121 o .C ETO 54 o .C

0,7 minutos

B.

subtilis

3

minutos

Brevundimonas diminuta

600 mg/L 50%U.R.

Filtração

7

10

filtrante

cel/

cm 2

area

MONITORAMENTO AMBIENTAL

1. Introdução

Desenho de Instalação de Processos Assépticos - salas limpas Processamento Asséptico (Manter fora da barreira primária - fonte de contaminação)

2. Monitoramento do Ar: microrganimos aeróbios ( bactérias e fungos)

Partículas viáveis:

1. Passivo (Ensaio qualitativo): periodicidade diária, quando há produção

Classe 100 = número de partículas viáveis de 0,1 CFU/ft Tempo de exposição 30 minutos a 60 minutos incubação em estufa e leitura após 48 horas

3

.

2. Ativo (Ensaio quantitativo): Captação ativa de ar (mensalmente)

A . Impacto com líquido “liquid Impingement” : captação do ar através de orifício limitado sobre

a unidade de vácuo. Contagem = n º de CFU / volume de ar amostrado Volume do ar amostrado = tempo de amostragem / fluxo de ar através do orifício Contagem Microbiana = Microscopia, Ensaio de ATP ; Impedância; filtração em membrana

B. Impacto com o ágar: impacto de microrganismos sobre o ágar:

3

• Slit to Agar (1ft /min = 28L/min) impacto rotatório sobre a placa a uma velocidade constante. Risco de ressecamento a períodos longos

• Amostrador Centrífuga (Reuter Centrifugal Sampler): Impactação de ar diretamente em

meio de cultura por sistema de centrifugação. Sistema portátil a bateria. Contagem Microbiana - Incubação em estufa durante 48 horas e contagem/ m 2 ou volume de ar

amostrado.

C. Impacto em Membrana Filtrante ( Sistema de rotâmetros)

Contagem Microbiana - meio sólido- incubação em estufa durante 48 horas meio líquido - Microscopia, Ensaio de ATP, impedância

III. Monitoramento de Superfícies ( Após manutenção e limpeza )

1. Placas de Contato (RODAC)

2. Swabb : esfregar um quadrante de 2,54 cm aproximadamente de uma polegada, primeiro lado a lado, acima e abaixo e novamente, lado a lado. Embeber em 1 ml de salina estéril.

IV. Monitoramento de Pessoal

A. Placas de Contato (RODAC): periodicidade mensal e quinzenal para o pessoal envolvida

diretamente na área asséptica.

B. Swabb

TÉCNICAS RÁPIDAS DE DETERMINAÇÃO DE MICRORGANISMOS VIÁVEIS

1. Microscopia: Contagem direta com alaranjado de acridina (1:60 diluido de 300 mg/ml de solução de alaranjado de acridina em tampão fosfato pH=8,2. Lente de aumento de 1000 , microscópio de epifluorescência (melhor para superfícies).

2. Ensaio de ATP ou bioluminescência

ATP + D-luciferina + O 2

Oxiluciferina + AMP + CO 2 + LUZ

Contagem image de 1000 Células aproximadamente

3. Impedância

A resistência de uma corrente em um líquido contendo microrganismo viável é medida conforme as células respiram e se reproduzem, alterando a resistência pela formação de ácidos orgânicos. Medição pela introdução de dois eletrodos.

4. Contagem Direta do Número de Colônias em Placas

Eficiência de Conservantes

Microrganismo : S. aureus

Preparo do Inóculo : Semear em estrias em tubo inclinado contendo Antibiotic Medium 1 (AM1). Incubar por 48 horas em estufa a 35 0 C. Recolher o crescimento com 3 ml de água peptonada 0,1% . Ressuspender para 10 ml em tubo e diluir até turbidez 0,5 da Escala de MacFarland (10 6 UFC). Adicionar para cada 20 ml de produto ou controle, um volume de 0,2 ml de inóculo.

Amostra:

• Selecionar os frascos do produto na embalagem final.

• Identificar cada frasco com o tempo a que será submetido o contato do microrganismo com o conservante.

• Tempos a serem pesquisados : 0 h de contato, 6 horas, 24 horas, 48 horas, 7 dias, 14 dias e 28 dias.

• Armazenar os frascos em estufa a 22 - 25 0 C

• Realizar o mesmo procedimento com amostra sem conservante e com diluente como controle positivo.

• Realizar contagem pelo método “Pour Plate”, utilizando Caldo Letheen para neutralizar o conservante, água peptonada 0,1% como diluente e Ágar Caseína e Soja para o plaqueamento.

• Incubar as placas em estufa a 35 0 C durante 48 horas.

Teste de Eficácia de Conservantes

Critério

USP XXII

CTFA

 

C.

albicans (# 10231)

 

C.

albicans (# 10231)

A.

niger (# 9642)

A.

niger (# 16404)

E.

coli (# 8739)

Organismo Teste

E.

coli (# 8739)

P.

aeruginosa (# 15442)

P.

aeruginosa (# 9027)

S.aureus (# 8538)

S.aureus (# 6538)

P. luteum # 9644

B.subtilis # 6633 Agar Caseína e Soja

Células 32-37 0 C

fungos

Meio de Cultura Agar Caseína e Soja

Crescimento de Inóculo

preparação

Bactéria: 37 0 C, 18 a 24 h

em

para

produtos

bactéria

sem

e

conservantes:

para

e

densidade C.albicans: 25 0 C, 48h

25-30 0 C

final de inóculo

A.

niger: 25 0 C, 1 semana 1x 10 -8

Conduzir o teste, se possível, em 5

Procedimento do Teste

frascos originais. Por outro lado, transferir 20 ml para cada 5 tubos

estéreis. Cada frasco ou tubo inoculado com 10 5 -10 6 org/ ml. Incubar a 20-25 0 C Não aumentar em C.albicans ou A. Resultado requerido para niger.

aprovação

inicial permanecendo por 14 dias e

£ 0,1%

da

concentração

10 6 org./ ml de produto (20 ml)

Usar

Triton-X-100

neutralizantes:

Tween

80,

lecitina,

Amostragem em 0, 1-2, 7, 14, 28, > 28 dias;

bacteriana Efetividade em 7 dias e reinocular.

manter ou abaixar os níveis durante o período do teste.

Condições de Teste para Método de Eficácia de Conservantes

Condição de Teste Tamanho do Inóculo (CFU/ml ou g) Volume de Inóculo Armazenamento do produto

Britanica

10

6

£ 1% 20-25 0 C

Alemã

10 5 -10 6

£ 1% 25 0 C± 1 0 C

Americana

10 5 -10 6

£ 1% 20-25 0 C

Italiana

10 5

£ 1% 25 0 C± 1 0 C

Microrganismos Desafiados para Produtos Tópicos com Conservantes

Produto Microrganismo Cremes e Loções P. aeruginosa, Klebsiella, S.faecalis, S.aureus, coliformes, Aspergillus, cladosporium, Candida Pasta de dente Streptococci, Pseudomonas, Herpes virus, enterovirus Shampoos Pseudomonas, Klebsiella, coliformes, Proteus, Alcaligens, Acinetobacter, Cladosporium

Cosméticos para os P. aeruginosa, P.stutzeri, P.putida, S.aureus, S. faecalis, Aspergillus, Penicilium,

olhos e pomadas

Produtos vaginal P.aeruginosa, Pseudomonas KO-1, E.coli, E.faecalis, Klebsiella, Proteus, Candida

cladosporium

albicans

Critérios para Interpretação do Resultado do Teste de Eficácia de Conservantes

Tipo

produto

de

Parenterais

e

Oftálmicos

Farmacopéia Alemã (1986)

Organismo

P.aeruginosa

S.aureus

Hora Redução de contagem

24

7 d

28

h

d

10

10

10

2

3

3

C.

A.

albicans

niger

Formulação P.aeruginosa

Tópico

S.aureus

14

28

14

28

d

d

d

d

1

1

10

10

3

10

10 3

Farmacopéia Britânica (1988)

 

Redução

Organismo

Hora

de

 

contagem

P.aeruginosa

6

h, 24 h, 7d;

10

3 (6h)

 

ND

S.aureus

14

d; 28d

 

ND

 

7

d

10

2

C.

albicans

 

14

d

NA

A.

niger

28

d

NA

P.aeruginosa

48

h; 7d; 14d; 28d

10 3 (48h)

S.aureus

 

ND

 

C. albicans

14

d

10

1

 

28

d

10

1

 

A. niger

Solução

P.aeruginosa

14

d

10

3

Oral

S.aureus

28

d

10

3

C. albicans

14

d

10

A. niger

28

d

10

Farmacopéia Americana (1990)

C.

albicans

14

d;

10

2

A.

niger

28

d

NA

P.aeruginosa

7 d; 14 d; 28 d

10 2

S.aureus

 

NA

C.

albicans

 

14 d; 28 d

NA

A. niger

Farmacopéia Italiana (1985)

Tipo de

Redução de

 

Redução de

 

Organismo

Hora

Organismo

Hora

produto

contagem

 

contagem

Parenterais

e

P.aeruginosa

14

d

10

3

P.aeruginosa

6 h, 24 h, 7d;

10 2 ; 10 3 e 10 5

S.aureus

28

d

NA

S.aureus

 

Oftálmicos

 

C. albicans

 

24

h

NA

 

14

d

NA

C.

albicans

7

d

10

2

 

A.

niger

28

d

NA

A.

niger

14

d

NA

Formulação

Nenhuma

P.aeruginosa

48

h; 7d; 14d;

NA,10 2 ; 10 3 NA

Tópico

recomendação

S.aureus

 

28d

 
 

C.

albicans

7

d;

10

2

A.

niger

28

d

NA

Solução

Nenhuma

P.aeruginosa

48

h; 7 d; 21d;

10

2 ; 10 3

 

S.aureus

 

Oral

recomendação

42d

NA,NA

 

E.coli

 

C.

albicans

 

10 1

 

21

d; 42 d

 

A.

niger

NA

MÉTODO DE TURBIDIMETRIA - DOSEAMENTO DE TETRACICLINA

Padrão de Tetraciclina = Teor declarado = 968 mg/mg Tomada de ensaio = 103,3 mg = 968 x 103,3 = 100.000 mg Amostra de cápsula de Tetraciclina = 250 mg de princípio ativo Peso médio cápsula cheia = 365,7 mg Peso médio capsula vazia = 55,2 mg Tomada de ensaio = 310,5 mg de pó (250 mg de p.a)

Diluição do Padrão

Diluição da Amostra

103,3 mg (100 mg) / 100 ml = 1 mg / ml 1 ml (1000mg) / 100 ml = 10 mg/ ml 10 ml (10 mg) /100 ml = 1mg / ml P1= 1,0 ml (1mg) / 20 ml = 0,05 mg / ml P2= 2,0 ml (1mg) / 20 ml = 0,10 mg / ml P3= 3,0 ml (1mg) / 20 ml = 0,15 mg / ml P4= 4,0 ml (1mg) / 20 ml = 0,20 mg / ml P5= 5,0 ml (1mg) / 20 ml = 0,25 mg / ml

Curva Padrão

310,5 (250 mg) / 250 ml = 1mg / ml 1 ml (1000 mg) / 100 ml = 10 mg / ml 10 ml (10mg) / 100 ml = 1m / ml

A2= 2,0 ml (1mg) / 20 ml = 0,10 A3= 3,0 ml (1mg) / 20 ml =0,15 A4= 4,0 ml (1mg) / 20 ml = 0,20

Concentração (mg/ml)

Leitura a 580 nm

Média

P1 = 0,05

45,0

44,0

45,0

44,67

P2 = 0,10

52,0

52,5

53,0

52,50

P3 = 0,15

60,0

61,0

59,0

60,00

P4 = 0,20

70,0

71,5

70,5

70,33

P5 = 0,25

80,0

81,0

80,5

80,5

Concentração (mg/ml)

Amostra Leitura a 580 nm

Média

A1 = 0,10

53,0

51,5

52,0

52,17

A2 = 0,15

62,0

61,0

60,5

61,17

A3 = 0,20

71,0

70,8

70,5

70,77

Relação Leitura vs Concentração

A1 = 0,09875= 0,9875

0,1

0,15

A2 = 0,1508 = 1,0053

0,20

A3= 0,2016 = 1,008

Média

L vs C ( Fc ) = (0,985 + 1,0053 + 1,008) = 1,003

3

Potência da Amostra = Potência P x LvsC x PP x DA x 100 = DP x PA onde,

Potência P = Potência declarada do Padrão L vs C (Fc) = Média Fc PP = Peso do Padrão PA = Peso da amostra DP = Diluição do Padrão DA = Diluição da Amostra

Potência da Amostra

= 968 x 1,008 x 103,3 x 1

x

10 x 250 x 100 x 100 = 999,9 mg/ml

100 x 100 x 100 x 250 x 1 x 10

FICHAS DE ANÁLISE E CONTROLES DE PROCESSOS

Produto:

TESTE DE PIROGÊNIO Lote:

 

N.º Análise:

Data de análise:

N.º coelho

Peso

Volume

1.ª T.ºC

2.ª T.ºC

 

1 h

2 h

3

h

D t

1

2

3

Observação:

Resultado:

Data de saída:

Analista:

Chefe:

 

Protocolo para Teste de Inocuidade Produto:

Lote n 0

 

N.º

Análise:

 

Volume de inóculo para

cobaias:_

_mL/ Via:

 

Volume de inóculo para camundongos: ml/ Via:

Data de Início:

/

/

Data de término:

/

/

Lote N.º:

Caixa

N.º:

Controle N.º :

 

Caixa N.º

 

CONTROLE DE ÁREA ASSÉPTICA - PROCESSO PASSIVO

 

PRODUÇÃO

 

Pontos de Amostragem

 
 

Dia/Mês

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

HISTÓRICO DAS ÁREAS ASSÉPTICAS - SLIT TO AGAR PRODUÇÃO

Data:

Área:

PLACA

HORÁRIO

N COLÔNIAS

COLÔNIA / M3

GERMES IDENTIFICADOS

OBSERVAÇÕES

Meio:

 

Incubação:

Temp. Ambiente:

Umidade Ambiente:

No. Pessoas:

 

Analista:

Data:

/

/

CONTROLE BIOLÓGICO - PROCESSO PASSIVO

BIOLÓGICO

Data:

Período:

No. da Placa

T.exposição

No. Colônias

Germes Identificados - Gram

MEIO:

 

T°C Incubação

Tempo Incubação:

Umidade Relativa:

No.Pessoas Total de Colônias:

Resultados:

HISTÓRICO DAS ÁREAS ASSÉPTICAS - SLIT TO AGAR BIOLÓGICO

Data

Área

PLACA

HORÁRIO

N COLÔNIAS

COLÔNIA / M3

GERMES IDENTIFICADOS

OBSERVAÇÕES

Meio:

Incubação:

 

Temp. Ambiente:

Umidade Ambiente:

 

No. Pessoas:

 

Analista:

Data:

/

/

CONTROLE DE AUTOCLAVE

PRODUÇÃO x CONTROLE Bioindicador:B. stearothermophillus

Lote N o :

Tempo de Exposição:

Temperatura de Exposição:

Tempo de incubação:

Temperatura de incubação;

Data:

Horário:

PONTOS AMOSTRADOS

RESULTADOS

PRODUÇÃO CONTROLE x Bioindicador: B. stearothermophillus

Lote N o :

Tempo de Exposição:

Temperatura de Exposição:

Tempo de incubação:

Temperatura de incubação;

Data:

Horário:

PONTOS AMOSTRADOS

RESULTADOS

TREINAMENTO DE PESSOAL: NORMAS HIGIÊNICAS

CONTROLE DE PESSOAL - TÉCNICA DE SWAB

CONTROLE DOS SUBSTRATOS NUTRITIVOS PARA O TESTE DE ESTERILIDADE

Substrato:

Controle Negativo

Data

Lote

UFC

Crescimento

Controle Positivo

Data

Germe

Diluição

UFC/ crescimento

AFERIÇÃO DE TEMPERATURA E UMIDADE RELATIVA

PRODUÇÃO

Aparelho: Termohigrômetro SUNDO

Modelo: 4463 HT - 100 mm diâmetro

Data Hora

T O C

UR %

Responsável

 

BIOLÓGICO

Aparelho: Termohigrômetro SUNDO

Modelo: 4463 HT - 100 mm diâmetro

Data Hora

T O C

UR %

Responsável

CONTROLE DO BANHO AZUL

Data da Preparação:

Temperatura do Banho:

Data da Coleta:

Data do Ensaio:

Horário de Coleta:

Analista:

RESULTADOS:

Bactérias:

 

Patogênicos: P.aeruginosa:

E. coli:

Salmonella:

Fungos:

OBSERVAÇÃO:

Troca do Banho:

Quando apresentar microrganismo patogênico; Quando apresentar contagem microbiana acima do especificado; Após fabricação de hormônios

TESTE DE CALDO: EFICIÊNCIA DE FILTRAÇÃO

Inóculo:Pseudomonas diminuta Caldo Nutriente: TSB Temperatura de Incubação: 35.ºC Volume Envasado: 20 ml Data:

Resultado:

TESTE DE CALDO: ENVASE ESTÉRIL

Caldo Nutriente: TSB Temperatura de Incubação: 35.ºC Volume Envasado: 20 ml

Bioburden: 10 7 CFU Volume Total: 30 L Tempo de Incubação: 48 horas Número de frascos: 1500 Analista:

Nenhum frasco contaminado

Volume Total: 30 L Tempo de Incubação: 48 horas Número de frascos: 1500

Data:

Analista:

Resultado:

Nenhum frasco contaminado

TESTE DE ESTERILIDADE

Produto:

Lote:

N.º Análise:

Data de análise:

Bactérias Meio de cultura:

Bolores e Leveduras Meio de Cultura:

Tempo de incubação:

Tempo de incubação:

Temperatura de incubação:

Temperatura de incubação:

1

o . Teste:

1 o . Teste:

Coloração de Gram:

Coloração de Gram:

2

o . Teste

2 o . Teste:

Coloração de Gram:

Coloração de Gram:

Resultado:

Resultado

TESTE BIOLÓGICO

Produto:

Lote:

N.º Análise:

Data de análise:

TESTE DE PIROGÊNIO

RESULTADO

Água para injeção (“In vitro”)

Negativo

Água para injeção ( ‘In vivo”)

Negativo

Produto envasado ( “In vivo”)

Negativo

TESTE DE INOCUIDADE

RESULTADO

Produto envasado ( camundongos )

Negativo

CONTROLE DOS FILTROS (FLUXO LAMINAR) :

Controle de partícula: DOP Velocidade de fluxo: 90 ft/min Classe : 100 Data:

Tamanho poros: 0,3 mm Temperatura de dispersão: 398,89 º C ou 750 F Temperatura da sala asséptica: 21,0 º C ou 70F Periodicidade: 3 meses

APOSTILA DE CONTROLE MICROBIOLÓGICO UEM– DFF -KIMURA