158 Parte2 fstrutura e Estudo de Macromoléculas ‘oro ogueade ‘peroM / our—0- peénima etapa, © DNA € novarente desnaturado, ¥ ‘aage oo: tidorseutladocome mole Taree para um novo ciclo de sintese de DNA. Observa- a va gu. ste segundo ao os adores pode ‘iar sets apr ds as de DNA receni 2 wedatmase wees ben me pr So DNA mole oil Quando a DNApolmerase a festendeo inicador marcado em verde que anos eetgenrts to farlde rect sntetzada (marca am cor Ge arn patr do lode sintese de DNA an {ior ovo cede: mateado em cord an male marcado em verde a poeraeprossoque fer todas extensto aé 0 fim do roi, eto, soo ass esconeto se a fir parte frie 3 pole: sm TTT os tase aida no akango afm ds males) Assim, ‘este sequndo clo, 0 DNA que sed sneizado sccenant erepetno So que cobe precsamente a sequenda de ONA 2 ser amplfcada, A segues aciconais de cae) desnaturagdo, anclamerto esntse de DNA (nso, ‘mostradar) produaitao segreertos de DNA que Taree etree ‘cotrespondem ao intenvalo de sequéncia delimita {0 pelos dois niadores. Ese DNA aumentars er AA — bundanci segindo uma progessio geomética | ansloment de icadores 1 ca ceo subsequent de reacio de cada ‘songs juntos de fragmentos de DNA revelam \cias de nucleotideos a seguir, como as sequéncias de nucleotideos sto determinadas, mente, serdo descritos métodos “clissicos” de sequenciamento de foram utilizados para determinar a sequéncia de nucleotideos de ais. Em seguida, era discutido como este método foi automat!- ‘o sequenciamento de genomas inteitos. Finalmente, serao conside- s de sequenciamento de “altima geracio" (next-generation) que atualmente para gerar genomas personalizados. € possivel determinar a sequéncia inteira de nucleotideos de um ‘comno fol feito para organismos que variam em complexidade, desde até 0 sec humano. Isso permite que sejam encontradas sequéncias160 Parte 2. Estrutura e Estudo de Macromoléculas En Quadro 7-1 Anise forense ea reagéo em cadeia da Imagine que voct est em um laboratorio forensee tem uma Uonta de DNA de ui suposto criminaso, Voc8 desea de- {termina se 0 DNA do Suspeto contém um polimorfsmo pre Sorte no DNA encontrado na cena do crime. Os polimorts. thor so sequéncasalterativas de DNA (aels) encontrados {im ume populagto de orgarismas, em uma reido comum {ie cromassomos homdloges, como um gene. Um polimer- fismo pode ser simples, com diferenca de wm dno par de paver ha mesme siti do cromossomo entre membros dif antes da populagbo, ow mais complex, com diflerengas no ‘Comprimento de uma sequéncia nuceotidica repetitive sim fen, como CA ver Cap, 9} € preciso ampliicar um segmento ‘ie ONA que inelua @ sito da polimorfisme, de forma que Se possa submeté-lo 20 sequenciamento (dscutido a seauit) fc determinar se existe uma corrlaglo com a sequencia en contrada na cena do crime. A sequéncia de nuceotieos do ‘DNA ampliicado eusia a determinar (untamente com ver feacoes de polimorfsmos adiionas) seas duas amostra de DNA sao identics. Esta abordagem para defini a sequincia {Be DNA é chamada de "pert de DNA ou “fingerprinting de DNA", uma anelogia entre a identicacso que utiliza ONA e 1 identifcagio que utiliza ténicas convencionais de impres oes dias fingerprints), 0 peril de DNA fo primeiramente ‘ltzado em 1985 (nos Estados Unidos, oF [Federal Bureau lof investigation] comesou a usar a técnica em 1988) e desde tnlgo se tornou amplamente utlizado na andlise de evidén- ‘ase cenas deerme, tanta para condenar como para ino- ‘Gemtarindviduos suspeitos (er, p- ex, The Innocence Project ‘nw innocenceproect. ora) cespecificas com grande rapideze precisio (como ser discutido posterlormen teneste capitulo) (0 principio bésico do sequenclamento de DNA consiste na separagio, pat tamanho, de subconjuntos de moléculas de DNA. Cada uma dessas motéculas de DNA inicia em uma mesma extremidade S' comum e termina em um de vats ppontes finas alternativos em 3", Todos o$ membros de um determinado com Junto apresentam um tipo particular de base em suas extremidlades 3 Assim para uin mesmo subconjunto, todas as moléculas terminardo com um G, pad Patra com C, para um terceiro com A e para 0 subconjunto final com um TAs tholeculas produzidas em um determinado conjunto (p. ex., 0 conjunto de G) ‘arian em/comprimento, dependendo de onde um G especial ¢ incorporado mi Cntremidade 3' da sequéncia, Cada segmento deste conjunto, portanto, india ‘nde hd um G na moléeula de DNA a partir da qual eles foram gerados. Coma fuses fragmentos sao gerados se explicado a seguir (€ ilutrado na Fig. 7-15). ‘0 procedimento mais comumente utilizado, que emprega nucleotideos terminadores de cadeia e sintese de DNA in vitro, €a base para a automat acto original do sequenciamento de DNA. No método de terminacio de Gola, o DNA é sintetizado pela DNA-polimerase a partir de urn molde de DNA € iniclado a partir de uma posigao fixa,especificada por um oligonucleotide Inieiador. A DNA:polimerase usa 2-desoxinucleotideos trifosfatos como sub tratos para sintese de DNA, esta ocorte pela extensio da extremidade {Ométodo de terminagao de cadeia baseia-se nos principios da sintese enim tiea de DNA, diseutida no Cap, 9.) O método de terminacao de cadeia empress Substratos especiais modificados, 0s 2',3'«idesoxinucleotideos (ANP), que ndo possuem o grupo 3 -hidroxila na sua porcto agécaralém de nao possutel O grupo 2-hidroxila (Fig. 7-13). A DNA-polimerase € capaz de incorporar un 2p niidesoxinucleotideo na extremidade 3° de uma cadeia polinucleotiica fe crescimento, mas, uma vez ineorporado, a auséncia do grupo 3'-hidroxil FIGURA 7-13 Didesoxinucleot tdeos utilizados no sequenciamento {de DNA, 0 2'-deox ATP ext mostrade 3 jer, Ee nucleotide pode serinco potao em ura cade cescente de ONA E peimite 9 inorporesdo subsequente fie um outro naleotdeo. A dra, ests 2 3-dideson ATP Ese nucleatieo pode Ser incrporada emma cade crescent de ONA, mas, uma vee incorporado, i pede @ adigho de outros nudztieos & 5 0-0-6 0c eee dea adicao de novos nucleotideos, o que provoca o término do alonga- (Fig. 7-14). , agora, que fol adicionado um coquetel de substratos de nucleo om um Unico substrato modificado 2'3"-didesoxiguanosina trifosfato jem uma proporeao de uma molécula de ddGTP para 100 moléculas ¢esox!-GTP (UGTP). Isso fazasintese de DNA ser interrompida a uma fre de :100 veres que a DNA-polimerase encontra um C na fta-molde (Fig, {Como todasas cadeias de DNA iniciam o crescimento a patir do mesmo os nuceotideos terminadores de cadeia gerardo um subconjunto de fag- polinucleoticicos, todos compartilhando a mesma extremidade 5’, mas $ nos comprimentos pelas sas extremidades 3. 0 comprimento dos portato, expecifica a posigdo de Cs na fita-molde. Os fragmentos et marcados em suas extremidades 5’ pelo uso de um iniciadorradioa- ‘marcado ou por umn iniciador que fo! ligado a um aduto fluorescente, extremidades 3° com derivados de ddGTP fluorescentemente marca: pis uma eletzoforese em gel de poliacrilamida, o conjunto de fragmentos “ftaenole™ > ° 230s ome sma 2 ee — 2 ® eomerinanto 8 ‘onuceeteos 7 —m Sor ® Sequenciamento de DNA pelo método de terminagio de cadeia, Come seas de diferentes compriments S30 snetzadas na presena de desou prec das ads produrds dpende da equénda do DNA mode ee da encima reagto (pte superior Seaudncla do molde Nesta Shue esto precetes como dexorcleciecs, mat Get pesante amber na ued cada que est send alongadaakcanga ur Co mole, daw pla fara demoleuas,o dGTP em ver do dGTP Nests ass, 35 cadeas 0. (9) Fagen seprecos em ge de pollard, O comprmento dos jg rela as pskses de cicsnas no DNA‘molde que eta Sendo Sequenci Capitulo 7 Técnicas de Biologia Molecular 161 FIGURA 7-14 Terminagao de ex dela na presenca de didesoxinucleo- ‘deos. 4 lustracao na parte superior ‘mosta uma cade de DNA serdo een ida na exremidade 3 pa ag30 de ruuceotiseo de adenina em um mils ‘eo de ctosna prevamenteineorporado, A presenca de ddesoictosina na cea fom cresimentoflusragio apart in Feri bloquels uma nova ado de ni: sleotideos, terminande 2 ead, como ‘descita ro teva,162 Parte 2 Estrutura e Estudo de Macromoléculas « 9/7 _ FIGURA 7-16 Gel de sequencia- mento de DNA. Os comprimenton das fade de DNA, termina patos de ‘xinilstdeosindcadoe na pats ype fede cada tna, so determinados ela rmigragzo em gel de poacramida, como ‘mostodo. lature do gel. de bab para ima, evel a sequencia 8 "par 3 sera um padrao semethante a uma escada de bandas, cada degrau representa: do um C na fita-molde (Fig. 7-15b). Se, de forma semelhante, ddCTP, ddATPe AAITTP forem adicionados 3 reagbes de sintese de DNA, um a cada subconjunta de reagdo, entdo, no total, serdo gerados quatro conjuntos de fragmentos de {érmino, que, juntos, fornecerdo a Sequencia completa le nucleotideos do DNA Para permitis a leitura da sequénca, os fragmentos gerados em cada uma 6 {quatro reagdes sto resolvidos em gel de poliacilamida (Fg. 7-16). Como sera visto a seguir, essa abordagem conceitualmente simples, de senvolvida inicialmente para sequenciar pequenos fragmentos de DNA def nds, sofreu uma série de adaptacdes ¢ aperfelgoamentos técnicos, que pe _mitiram a anélise de genomas inteios (ver Quadro 7-2, Os sequenciadores so utilzados para o sequenciamento em larga escala). ‘Sequenciamento de um genoma bacteriano pelo método de shotgun Abactérla Haemophilus inluenzae foi 0 primeiro organismo de via livre att sua sequéncia genomica determinada ce forma completa ¢ anotada. Foi umz cescolla ldgica, uma vez que essa bactéria tem tum genoma compacto e peque no, formado por apenas 1,8 milhao de pares de bases (Mb) de DNA (mens de 11,000" do tamanho do genoma humane), © genoma de H. influenase ft digerido em varios fragmentos aleatorios com tamanho médlio de 1 kb. Ess porcdes de DNA gendmico foram clonados em um vetor de DNA plasenid para criar uma biblioteca. O DNA foi preparado a partir de coldnias de DNA. recombinantes individuals e sequenclado separadamente em Sequenciadors, utilizando-se 6 método dos terminadores, discutido anteriormente neste ci pitulo. Esse método & chamado de sequenciamento por "shotgun", Col6nis aleat6rias de DNA recombinante sao coletadas, processadas e sequenciadas Para assegurar que cada nucleotideo do genoma fol incluido na organizagio final do genoma, algo em tomo de 30 mil a 40 mil clones recombinantes Prados foram sequenciados. No total, cerca de 20 Mb de sequéncia gendmica Druta foram sequenciadas (600 pb de sequéncia sao obtidos em média par reagio, e 600 pb X 33.000 colénias diferentes = 20 Mb de sequéncia de DNA. total). Essa & chamada de uma cobertura de sequéncia de 10 x. 4 princ pio, isso significa que cada nucleatideo no genoma fot sequenciado 10 vers. Esse métoco pode parecer enfadonho, mas é consideravelmente mas ripido e menos oneroso do que as técnicas originalmente desenvalvidis. ‘Uma estratégia inicial necessitava do sequenciamento sistemitico de cada fragmento de restrigio de DNA definido em um mapa fisico do eromosso- ‘mo bacteriano. Uma desvantagem desse procedimento € que a maioria da fragmentos de restrigdo conhecidos era maior do que a quantidade de in: formacio de sequéncia de DNA que podia ser gerada por uma tnica reac. ‘Consequentemente, seriam necessirios cilos adiclonals de digestao, mapes- ‘mento e sequentciamento para que fosse obtida uma sequencia completa de ‘qualquer regido determinada do genoma, Estas tapas adicionais de clonagem ‘e mapeamento de restrigio sto consideravelmente mais demoradas do que 9 Ssequenciamento automatizado repetitivo de fragmentos aleat6rios de DNA. Em outras palavras, o computador & muito mais rapido na organizagao das _quencias aleatorias da que o tempo necessirio para realizar um mapeamenta ‘de restricdo em pequena escala do cromossomo bacteriano. ‘As cerca de 30.000 leituras de sequenciamento derivadas de fragmentas aleat6rios de DNA gendmico sio diretamente inseridas no computador, e sa, tufilizacos programas para unit sequencias de DNA sobrepostas. Esse process conceitualmente semelhante a montagem de um gigantesco jogo de palavas ‘eruzadas denso no qual as palavras determinadas dao pistas acerca das pal vras sobrepostas, porém,desconhecidas. Os fragmentos aleatorios de DNA sa ‘encaixados” de acordo com as sequéncias que se emparelham. A montage Ssequencial dessas pequenas sequencias de DNA finalmente resulta em Uma ‘montagem continua dnica, também chamada de contig (ver Fig. 7-18).