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Corao reconectado
Equipe do Instituto do Corao identifica possvel marcador gentico da durabilidade da ponte de safena
Ricard o Zorzet to | ilustraes Marcos Garuti

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o laboratrio do 10 andar do Instituto do Corao (InCor) da Universidade de So Paulo, de onde se tem uma vista privilegiada da capital paulista, a equipe do mdico Jos Eduardo Krieger comea a desvendar as origens de um fenmeno que limita a cerca de uma dcada a durabilidade de parte das pontes de safena: o entupimento, ainda que parcial, do implante de segmentos dessa veia retirada da perna usado para restabelecer o suprimento de sangue do corao, reduzido pelo acmulo de placas de gordura no interior das artrias que o irrigam. Em uma srie de experimentos com ratos e vasos sanguneos humanos, o grupo do InCor vem descobrindo como fatores fsicos alteram a programao das clulas de veias submetidas s condies de funcionamento das artrias. Essa reprogramao pode causar o espessamento excessivo da veia e o bloqueio da ponte alguns anos depois da cirurgia de revascularizao do corao. Essa busca j resultou na identificao de vrias protenas envolvidas no espessamento dos implantes, duas delas caracterizadas completamente. Acreditamos que, com esse tipo de investigao, chegaremos a uma ou mais protenas que podero ser usadas como indicadores da durabilidade da ponte de safena ou como alvos para ampliar a eficincia do enxerto, afirma Krieger. Ele espera em alguns anos produzir um teste gentico capaz de predizer se o candidato cirurgia apresenta tendncia a desenvolver ocluso da safena e desenvolver tratamentos para minimizar o problema. Estamos trabalhando para descobrir quando e como intervir, diz.

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PESQUISA FAPESP 160

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Direto no alvo

Criada em 1967 pelo mdico argentino Ren Favaloro, a ponte de safena revolucionou a cirurgia cardaca. Em uma longa operao na qual foi feito um corte de 30 centmetros no peito do paciente e as costelas foram afastadas, Favaloro conectou uma extremidade de um segmento da safena com quase um palmo de comprimento artria aorta e a outra extremidade regio do corao privada de sangue. Assim conseguiu fazer o sangue contornar o bloqueio e voltar a alimentar o msculo mais forte e resistente do corpo, que se contrai em mdia 100 mil vezes por dia enviando nutrientes e oxignio para todos os tecidos do organismo. Nesses 42 anos esse procedimento foi aperfeioado e vem sendo repetido diariamente no mundo todo, prolongando a vida de milhes de pessoas estima-se que a cada ano sejam feitas 47 mil cirurgias de revascularizao cardaca no Brasil e 450 mil nos Estados Unidos. ssa soluo, porm, no perfeita e muitas vezes paga-se um preo alto por fazer uma veia, vaso especializado no transporte de volumes pequenos de sangue sob baixa presso, funcionar como artria, com fluxo cerca de dez vezes maior e presso mais de 20 vezes mais elevada. A mudana nas condies em que atua causa o espessamento exagerado da camada de clulas mais interna do vaso. Como consequncia, as placas de gordura que em geral levam de quatro a cinco dcadas para comprometer a passagem de sangue nas artrias do corao (coronrias) se formam bem mais rapidamente e obstruem cerca de 10% das pontes de safena em apenas dez anos, exigindo a realizao de uma nova cirurgia. Essa proporo de entupimentos, que j alcanou quase 50% at o incio dos anos 1990 e diminuiu com as alteraes na dieta e o uso de medicamentos para baixar o colesterol, ainda considerada elevada. Embora na maioria dos pacientes seja possvel usar artrias como as mamrias para revascularizar o msculo cardaco, a veia safena uma opo muito adotada, por18
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que exige um procedimento menos invasivo e a safena um vaso extenso, que permite obter vrios enxertos, explica Lus Alberto Dallan, cirurgio do InCor que colabora com a equipe de Krieger. Se resolvermos o problema de ocluso da ponte de safena, solucionaremos a principal questo da cirurgia cardiovascular. Foi quase ao acaso que cinco anos atrs o grupo do InCor comeou a investigar o espessamento das pontes de safena. Na poca a biomdica Ayumi Miyakawa trabalhava com Krieger na identificao de genes acionados nas clulas da camada mais interna dos vasos sanguneos o endotlio pela passagem do sangue. Assim como a gua de um rio lambe suas margens como se quisesse arrast-las com a corrente, o fluxo de sangue tenta levar consigo as clulas que recobrem internamente veias e artrias. Essa fora fsica, conhecida como fora de arrasto, ativa a maquinaria das clulas do endotlio e modifica a produo de uma protena que controla o funcionamento do vaso e a presso arterial, a enzima conversora de angiotensina. No Laboratrio de Gentica e Cardiologia Molecular, Ayumi dispunha de um aparelho que simulava o arrasto, mas no estava satisfeita. Faltava representar uma segunda fora a que esto submetidas as clulas dos vasos sanguneos: a presso que o sangue exerce contra a parede de veias e artrias, fazendo-os dilatar cada vez que o corao pulsa. Ayumi pediu equipe de bioengenharia do InCor que a ajudasse a desenvolver um equipamento capaz de reproduzir as duas foras tanto de modo independente como simultneo. Com o aparelho pronto, ela percebeu que poderia testar os enxertos de safena em condies semelhantes s que enfrentam quando implantados no corao. To logo o cirurgio termina a sutura e libera a passagem do sangue, o pedao de veia que passa a trazer sangue rico em oxignio da artria aorta para o msculo cardaco sofre um impacto brutal. Formada por trs camadas delgadas de clulas, a veia, que antes transportava sangue rico em gs carbnico e suportava presses va-

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1,5 cm

TAT-GFP
cateter

2 cm

segmento do vaso analisado

Artria cartida de rato tratado com protena geneticamente alterada para penetrar mais facilmente nas clulas (pontos brilhantes na imagem ao lado) e de roedor que recebeu verso normal da mesma protena ( esquerda)

riando de 5 a 20 milmetros de mercrio (mmHg), passa a trabalhar sob uma presso 25 vezes maior (cerca de 120 mmHg) se quem recebeu o implante no for hipertenso. J se sabia que, sob as novas condies, a veia se torna mais espessa depois de algum tempo. Mas no se conheciam quais fatores fsicos nem quais genes disparavam essa transformao, que, exacerbada, pode ser danosa e prejudicar o funcionamento da ponte. urante quatro dias Ayumi cultivou segmentos de 2 centmetros de safenas de pessoas operadas por Dallan sob dois regimes de fluxo e presso o de veia, em que 5 mililitros de um composto rico em nutrientes e oxignio atravessavam o vaso a cada minuto com presso mdia de 5 mmHg, e o de artria, com fluxo de 50 mililitros por minuto e presso de 80 mmHg. J no primeiro dia ocorreram transformaes. As clulas de veias submetidas s condies de artria comearam a apresentar sinais de apoptose (morte programada), enquanto as das veias mantidas sob baixa presso e baixo fluxo se mantiveram vivas. Era um resultado interessante que despertava ainda mais a curiosidade. O que aconteceria com a ponte de safena depois de mais tempo? As mudanas observadas nessas condies artificiais seriam semelhantes s que ocorrem em seres vivos? Ante essas dvidas, Ayumi e Krieger decidiram desenvolver um experimento que refletisse melhor o que acontece com safenas implantadas no corao humano. Como obviamente muito complicado obter amostras dessas veias depois que a ponte est conectada ao corao e a pessoa deixou a sala de cirurgia, os pesquisadores bolaram uma operao em ratos na qual uma das artrias cartidas, que levam sangue do corao para a cabea, conectada a uma veia jugular, que drena o crebro. Em seguida, acompanharam por at trs meses as alteraes apresentadas pelas jugulares mantidas sob o regime de alto fluxo e presso elevada caracterstico das artrias.

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Os prOjetOs
1. Identificao de genes com expresso diferenciada em veia safena submetida ao regime arterial 2. Genes diferentemente expressos em modelo de arterializao de enxerto venoso no rato 3. Estudo da hipertenso arterial: caracterizao molecular e funcional do sistema cardiovascular 4. Identificao e caracterizao de genes ligados arterializao do enxerto venoso humano

modAlIdAdES

1. Bolsa ps-doutorado (Ayumi Miyakawa) 2. Bolsa de doutorado (Thaiz Ferraz Borin) 3. Projeto Temtico 4. Auxlio pesquisa
CoordEnAdorES

1, 2 e 4. Jos Eduardo KriEgEr InCor 3. Eduardo Moacyr KriEgEr - InCor


InvEStImEnto

1. r$ 195.776,52 (FAPESP) 2. r$ 98.222,52 (FAPESP) 3. r$ 6.111.202,31 (FAPESP) 4. r$ 50.000, 00 (CnPq)

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Entre o primeiro e o terceiro dias houve um intenso aumento na taxa de morte de clulas da jugular dos roedores ligada cartida. Depois da primeira semana, no entanto, a situao mudou: as clulas mortas passaram a ser substitudas por clulas musculares caractersticas das camadas mais externas dos vasos sanguneos. Tambm comeou a se formar o anel de fibras elsticas observado apenas em artrias, separando a primeira da segunda camada de clulas. So sinais de que as veias esto tentando se adaptar s condies do novo ambiente, explica Ayumi. O problema que em muitos casos essa adaptao foge ao controle e, em vez de deixar a veia mais robusta, termina por entupi-la. Ao microscpio, Ayumi e Thaiz Borin notaram que a camada mais interna da jugular, em geral formada por uma fileira de clulas, tornara-se cem vezes mais espessa, enquanto as duas camadas mais externas, compostas por clulas musculares contrteis, haviam apenas dobrado. Nesse perodo de transformao celular o nvel de atividade de alguns genes chamou a ateno de Krieger e Ayumi. Um deles o que contm a receita da p21, uma das protenas que inibe a reproduo celular. Uma semana depois que a cartida dos roedores havia sido conectada jugular, o nvel da p21 nas clulas da veia caiu para quase a metade do normal e continuou baixo at o final do experimento sinal de que o gene havia sido desativado pela mudana de ambiente. Ao mesmo tempo, o gene responsvel pela produo da protena CRP3, em geral ativo apenas nas artrias, foi acionado logo aps a jugular dos roedores passar a funcionar sob presso elevada transportando grandes volumes de sangue esse gene tambm apareceu ativo em safenas humanas submetidas condio de artrias. J no primeiro dia a CRP3, protena componente da estrutura que d forma s clulas, o citoesqueleto, passou a ser produzida na jugular em nveis semelhantes aos em que encontrada nas artrias. Sua produo diminuiu um pouco depois do primeiro ms, mas permaneceu elevada durante todo o experimento. Aparentemente foi o aumento de presso, e no o da fora de arrasto, que acionou a maquinaria celular e estimulou a produo dessa protena, relata Luciene Gastalho Campos em artigo publicado em abril deste ano na Cardiovascular Research. Acreditamos que a produo dessa protena seja importante para a remodelagem inicial das veias que tm de suportar o regime hemodinmico das artrias porque refora a estrutura celular, diz Ayumi. utro gene que apareceu ativo alm do normal tanto na jugular de roedores conectada cartida quanto nas veias usadas em pontes de safena o da interleucina-1 beta, protena do sistema de defesa do organismo produzida em inflamaes. Logo aps a cirurgia, as clulas da jugular dos ratos passaram a fabricar cerca de 20 vezes mais interleucina-1 beta do que essa veia mantida sob presso e fluxos baixos de sangue. Esse ambiente favorece o desenvolvimento de aterosclerose [acmulo de placas de gordura nas paredes dos vasos], que pode ser agravado quando as taxas de glicose e colesterol no sangue esto elevadas, diz Ayumi. Durante os trs meses do estudo os nveis dessa protena se mantiveram cinco vezes superior ao normal. Ayumi mediu ainda a taxa de interleucina-1 beta em pontes de safena de pessoas que haviam morrido de outras causas na primeira semana

depois da cirurgia de revascularizao do corao ou entre um e cinco anos mais tarde. Verificou nveis mais elevados dessa protena inflamatria, em especial na primeira semana aps a operao. Analisando o material gentico desses indivduos, ela e Krieger descobriram que os nveis mais elevados foram produzidos pelas pessoas que apresentavam uma alterao a troca de uma nica base nitrogenada, os tijolos da molcula de DNA na posio -511 das duas cpias do gene da interleucina. Quem tinha um gene normal e um alterado fabricava nveis intermedirios e pessoas com duas cpias saudveis, nveis baixos de interleucina. Por modularem o nvel de interleucina em safenas humanas usadas na funo de artrias, essas variantes talvez sirvam como um marcador gentico da evoluo da ponte de safena, afirma Krieger. pesar desses resultados promissores, ainda sero necessrios anos de trabalho at que se obtenha um teste gentico capaz de indicar a durabilidade da ponte de safena. Enquanto avanam os experimentos para verificar a viabilidade do teste, a equipe do InCor pensa formas de controlar o funcionamento dos genes e prolongar os benefcios da cirurgia que usa a veia safena para substituir a funo das coronrias doentes, problema que mata 7,2 milhes de pessoas por ano no mundo. Eles j demonstraram que ao menos uma delas funciona. Usando bactrias, a equipe de Krieger conseguiu fabricar uma verso recombinante da p27, protena da famlia da p21 tambm capaz de frear a reproduo celular. Em um experimento feito em parceria com as equipes de Ana Maria de Oliveira e Leandra Ramalho, da USP de Ribeiro Preto, o grupo do InCor implantou ao redor da cartida de ratos um anel de silicone que liberava lentamente a protena alterada para penetrar mais facilmente nas clulas. Duas semanas aps a cirurgia a multiplicao celular foi menor na artria dos animais tratados com p27 recombinante do que na daqueles que receberam uma protena incua, de acordo com os dados apresentados em artigo na Therapeutic Advances in Cardiovascular Disease. Essa uma estratgia de interveno que se mostrou capaz de controlar a reproduo celular apenas na regio em que ela precisava ser bloqueada, conta Krieger. A equipe do InCor planeja ainda usar protenas associadas a stents, uma espcie de mola implantada no interior do vaso sanguneo para mant-lo aberto, ou bales como os usados em cateterismo para, se necessrio, estimular ou inibir a reproduo celular e aumentar a durabilidade das pontes de safena. n
> Artigos cientficos 1. CAMPOS, L.C. et al. Induction of CRP3/MLP expression during vein arterialization is dependent on stretch rather than shear stress. Cardiovascular Research. abr. 2009. 2.NEUKAMM, B. et al. Local TAT-p27Kip1 fusion protein inhibits cell proliferation in rat carotid arteries. Therapeutic Advances in Cardiovascular Disease. v. 2, p. 129-136. jun. 2008. 3. BORIN, T. F. et al. Apoptosis, cell proliferation and modulation of cyclin-dependent kinase inhibitor p21cip1 in vascular remodelling during vein arterialization in the rat. International Journal of Experimental Pathology. v. 90, p. 328-337. jun. 2009.

Presso elevada e Produo de altos nveis de Protenas ligadas multiPlicao celular favorecem o bloqueio de Ponte de safena usada Para restaurar o fluxo de sangue Para o corao